Análisis de la variabilidad genética natural e inducida en accesiones de Coffea spp. y evaluación de la respuesta a la infección de roya (Hemileia vastatrix) en plantas de C. arabica L. Var. Catuaí desarrolladas mediante mutagénesis in vitro
Fecha
2022-01
Tipo
tesis de maestría
Autores
Bolívar González, Alejandro
Título de la revista
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Editor
Resumen
El café (Coffea arabica L.) es un cultivo ampliamente valorado en el mercado mundial. Toneladas de
producto son trasegadas entre los mercados internacionales y se ha convertido en un recurso
sumamente valioso. Sin embargo, la especie se ve amenazada por la alarmante diversidad genética
reducida que se ha caracterizado recientemente entre sus poblaciones silvestres y variedades
agronómicas. La baja diversidad genética dificulta el establecimiento de protocolos que faciliten una
caracterización molecular adecuada de un genotipo determinado
El desarrollo de métodos eficientes y escalables de identificación genotípica es necesario para acelerar
los estudios de caracterización genómica de las diferentes accesiones y la validación del germoplasma
de Coffea. En este trabajo se llevó a cabo un análisis de variabilidad nucleotídica en 22 loci del
genoma de 19 accesiones de café mediante el análisis de fusión de alta resolución (HRM por sus
siglas en inglés). Ciento tres posiciones mostraron variabilidad tanto a nivel interespecífico (15 loci)
como entre variedades de la especie arábica (4 loci). Así mismo, se detectaron variantes en regiones
no codificantes utilizando un marcador universal (ITS2) y en regiones codificantes en un gen
implicado en la acumulación de sacarosa en el grano (SUS2). La mayoría de las variaciones fueron
validadas por el análisis HRM, el cual demostró ser una técnica sensible y robusta para caracterizar
el germoplasma e identificar variantes en genes de interés como CaKO1, SUS2, CcOAOMT1, así
como establecer un método para aumentar la sensibilidad de identificación de variedades basado en
la región ITS2.
Es relevante explotar mecanismos para inducir variabilidad genética; y precisamente uno de ellos es
la mutagénesis química inducida en cultivos in vitro embriogénicos. En este trabajo se analizó una
población de 320 plantas de café (Coffea arabica L. var. Catuaí) mutagenizadas durante la
propagación de callos embriogénicos con EMS (185,2 mM / 120 minutos) o azida de sodio (5 mM /
15 minutos). Se extrajo el ADN de las plantas mutagenizadas, a partir del cual se amplificaron
mediante PCR anidado algunos genes de interés (CaKO, CaPOP, CaWRKY1, CCoAOMT1, ITS2,
LOX1, SUS2, ABC, FLC). Utilizando un protocolo para el enriquecimiento de posibles alelos
mutantes mediante COLD-PCR, se detectaron variaciones importantes en el perfil de fluorescencia
vs temperatura de algunos productos de PCR (CaKO2_HRM_2 y ABC) al analizarlos por HRM-
PCR. Sin embargo, no se detectaron variantes en las secuencias genómicas analizadas según la
confirmación por secuenciación Sanger. Resulta esencial ampliar el número total de pares de bases
analizadas o enfocar el escaneo en genes específicos.
La roya del café (Hemileia vastatrix) representa un obstáculo para el establecimiento de las
plantaciones del café en muchas regiones del planeta. Actualmente no existen fuentes de resistencia
natural en el acervo genético de C. arabica, lo que obliga a los programas de mejoramiento genético
a incorporar elementos genéticos externos de otras especies a través de la hibridación. Este fenómeno
lleva a la depreciación de las variedades genotípicamente puras del café arábica. En este trabajo se
establecieron ensayos de infección en segmentos foliares de plantas de café que derivaron de un
proceso de mutagénesis química (azida de sodio 5 mM durante 15 minutos o EMS 185,2 mM durante
120 minutos) aplicada a cultivos embriogénicos. Un total de 163 plantas se inocularon con
uredósporas del patógeno H. vastatrix. Los segmentos foliares fueron evaluados y analizados
mediante un algoritmo para clasificar la severidad de la enfermedad en cada planta. La severidad de
infección se comparó con los controles Catuaí y CR-95. Un grupo de once plantas mutagenizadas
presentó valores de severidad de infección similares a la variedad CR-95. Finalmente, plantas
candidatas fueron infectadas nuevamente para analizar la expresión génica de genes implicados en la
respuesta temprana a la infección por roya. Se identificaron cerca de diez plantas con una respuesta
diferencial a la infección del patógeno, mostrando menor severidad en el desarrollo de la enfermedad
dentro del periodo evaluado.
Descripción
Palabras clave
Café, Roya, Mutagénesis, Embriogénesis somática, High resolution melting, PCR tiempo real