Caracterización del extracto acuoso de Lomariopsis japurensis y de la actividad antiespasmódica, mediante un sistema de baño de órganos y su validación en un modelo murino Hsd:ICR

Abstract

La Organización Mundial de la Salud ha avalado la implementación de la medicina tradicional en los servicios de atención primaria de salud. Actualmente muchos países trabajan en su implementación (OMS, 2013). Algunas naciones como México han logrado la integración de este tipo de medicina con éxito (Duarte et al, 2004). La medicina tradicional también recibe el nombre de medicina complementaria; uno de sus componentes es la medicina herbal, la cual no solo se utiliza en países en vías de desarrollo, sino en países desarrollados como Alemania (Welz et al, 2018). Las terapias a base de hierbas juegan un papel muy importante como medicina complementaria y alternativa y puede ser una opción adecuada en pacientes refractarios. El desarrollo de medicamentos a base de hierbas con potencial farmacológico sobre el tracto gastrointestinal puede brindar una excelente alternativa en un futuro próximo, mejorando la calidad de vida de los pacientes con alteraciones del tracto gastrointestinal (TGI). (Kim et al, 2020) Actualmente se realizan esfuerzos para encontrar plantas medicinales que puedan utilizarse en el tratamiento de diversas enfermedades en la atención primaria. Aunado a esto, se continúa caracterizando fitoquímicamente diferentes especímenes con el objetivo de encontrar metabolitos secundarios que puedan utilizarse en el desarrollo de nuevos medicamentos (Kabera et al, 2014). Uno de los problemas de salud en el que se enfoca un gran interés en caracterizar el potencial de las plantas medicinales es el tratamiento de las enfermedades diarreicas, como una alternativa complementaria y accesible a muchas poblaciones con dificultades sociales y económicas. En este grupo de afecciones, la enfermedad diarreica aguda (EDA) es una de las causas de mayor morbilidad y mortalidad en niños menores de 5 años (Vázquez-Rojas et al, 2020). Algunos helechos han sido utilizados para tratar este problema de salud; entre ellos se encuentra la especie Lomariopsis japurensis, que ha sido utilizado etnofarmacológicamente como terapia antidiarreica en varias comunidades indígenas de América del Sur. En la presente investigación se estudió el efecto del conjunto de metabolitos secundarios de los extractos acuosos de fronda y rizoma de L. japurensis sobre la contractibilidad del músculo liso intestinal utilizando la técnica o sistema de baño de órganos (ex vivo) y el modelo in vivo. El interés en el estudio de esta planta con extractos preparados tal como etnofarmacológicamente se usa en algunas poblaciones, radica en la ausencia de estudios científicos que reporten sus propiedades antiespasmódicas y antidiarreicas. El primer ensayo fundamental para la presente investigación fue la determinación de la toxicidad oral aguda (TOA). Este ensayo se realizó utilizando ratas hembras nulíparas certificadas de la cepa HsdBrIHan:WIST. EL TOA es una técnica validada por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OECD N° 423) y ampliamente usada por el Laboratorio de Ensayos Biológicos de la Universidad de Costa Rica donde se desarrolló la presente investigación. Los resultados de este ensayo evidenciaron la inocuidad de los extractos acuosos de fronda y rizoma de L. japurensis en dosis de 2 000 mg/kg p.c. y menores. Entre los objetivos de esta investigación se planteó determinar el perfil fitoquímico de los metabolitos secundarios en los extractos acuosos de L. japurensis. Se logró evidenciar la presencia de cumarinas, saponinas y taninos. Además se realizó una cromatografía en capa fina, que permitió inferir que la cumarina presente en dichos extractos acuosos es la denominada umbeliferona con efectos antiespasmódicos conocidos. El sistema de baño de órganos utilizado en esta investigación para el estudio ex vivo de los extractos acuosos es una técnica muy valiosa porque permite mediante la utilización de métodos alternativos, cumplir con las 3 R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento), postulados éticos fundamentales de la experimentación con animales propuestos por los científicos W.M.S. Russel y R.L. Burch. Existen varios modelos animales que se utilizan en este sistema, pero con muy poca frecuencia en la literatura se ha reportado el uso del modelo murino (Mus musculus). Mediante el sistema de baño de órganos RADNOTI y software LabChart utilizando ratones de la cepa certificada Hsd:ICR (CD-1®️), se comprobó la actividad antiespasmódica del extracto acuoso de rizoma de L. japurensis y una tendencia a disminuir la contractibilidad del músculo intestinal en el caso del extracto acuoso de fronda de la misma especie. En la presente investigación se pudo dilucidar que los metabolitos de los extractos acuosos de esta especie inducen a una actividad antiespasmódica posiblemente por dos vías celulares: mediante mecanismos agonistas parciales sobre los receptores muscarínicos y mediante bloqueo de los canales de calcio. Un aporte más de esta investigación fue la validación del uso del modelo murino en el sistema de baño de órganos (ex vivo). La posibilidad de contar con protocolos validados en un mismo modelo animal (ratón de la cepa certificada Hsd:ICR (CD-1®️)) tanto ex vivo como in vivo, permitió obtener datos extrapolables de forma más fidedigna para una misma especie. La dificultad para poder hacer una revisión en investigaciones basadas en un mismo modelo animal ex vivo e in vivo fue muy alta. Los sesgos a la hora comparar los resultados obtenidos utilizando especies diferentes (usualmente, cobayo o conejo para ex vivo y rata para in vivo), no siempre logra el objetivo de evidenciar la utilidad de los datos de forma complementaria y extrapolable. Plantear de esta forma la investigación nos permitió comparar los resultados de la actividad antiespasmódica y antidiarreica de ambos extractos (ex vivo e in vivo) y la posibilidad de continuar con estudios más específicos en esta misma especie. Estos resultados podrían ser valiosos para los ministerios de salud de países donde se esté utilizando este helecho con posibilidad de que se integren a la medicina tradicional en sus servicios de salud, además se podría desarrollar una fórmula farmacéutica que permita una fácil dosificación al paciente y que se convierta en una alternativa terapéutica. La posibilidad de contar con diferentes medicamentos efectivos sobre el TGI es importante por la variabilidad genética que presentan los individuos. La eliminación de los efectos secundarios indeseables debidos a ciertos principios activos junto con el desarrollo de métodos bioquímicos y genéticos cada vez más accesibles, permitirán determinar el mejor medicamento para cada paciente (Meyer, 2000). En Costa Rica el helecho Lomariopsis japurensis puede ubicarse en diferentes zonas tanto del Pacífico como del Caribe por lo que su distribución en zonas geográficas diferentes tiene un potencial para que pueda ser cultivado con posibilidad de generación de microempresas y subproductos con potencial coadyuvante en el tratamiento de afecciones gastrointestinales. Este estudio es de gran importancia porque es el primero en dar información sobre los metabolitos secundarios hidrosolubles de esta planta, su inocuidad, la validación de su uso etnobotánico como una alternativa para el tratamiento de la diarrea y acciones antiespasmódicas y dilucidar algunos posibles mecanismos de acción de los extractos acuosos totales de fronda y rizoma de L. japurensis. Otro aporte fue la validación del modelo murino para el estudio de la actividad contráctil ex vivo de músculo intestinal.The World Health Organization has endorsed the implementation of traditional medicine in primary health care services. Many countries are currently working on its implementation (WHO, 2013). Some nations such as Mexico have successfully integrated this type of medicine (Duarte et al, 2004). Traditional medicine is also called complementary medicine; one of its components is herbal medicine, which is not only used in developing countries, but also in developed countries such as Germany (Welz et al, 2018). Herbal therapies play a very important role as complementary and alternative medicine and can be a suitable option in refractory patients. The development of herbal medicines with pharmacological potential on the gastrointestinal tract may provide an excellent alternative in the near future, improving the quality of life of patients with gastrointestinal tract (GI) disorders. (Kim et al, 2020) Efforts are currently being made to find medicinal plants that can be used in the treatment of various diseases in primary care. In addition, phytochemical characterization of different specimens continues with the aim of finding secondary metabolites that can be used in the development of new drugs (Kabera et al, 2014). One of the health problems in which great interest is focused on characterizing the potential of medicinal plants is the treatment of diarrheal diseases, as a complementary and accessible alternative to many populations with social and economic difficulties. In this group of conditions, acute diarrheal disease (ADD) is one of the causes of greatest morbidity and mortality in children under 5 years of age (Vázquez-Rojas et al, 2020). Some ferns have been used to treat this health problem; among them is the species Lomariopsis japurensis, which has been used ethnopharmacologically as an antidiarrheal therapy in several indigenous communities in South America. In the present investigation, the effect of the set of secondary metabolites of the aqueous extracts of frond and rhizome of L. japurensis on the contractibility of the intestinal smooth muscle was studied using the technique or organ bath system (ex vivo) and the in vivo model. The interest in the study of this plant with extracts prepared as ethnopharmacologically used in some populations, lies in the absence of scientific studies reporting its antispasmodic and antidiarrheal properties. The first fundamental assay for the present investigation was the determination of acute oral toxicity (AOT). This assay was performed using certified nulliparous female rats of the HsdBrIHan:WIST strain. The TOA is a technique validated by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD No. 423) and widely used by the Biological Assays Laboratory of the University of Costa Rica where the present investigation was carried out. The results of this trial showed the safety of aqueous extracts of frond and rhizome of L. japurensis at doses of 2 000 mg/kg b.w. and lower. Among the objectives of this research was to determine the phytochemical profile of secondary metabolites in the aqueous extracts of L. japurensis. The presence of coumarins, saponins and tannins was evidenced. In addition, thin layer chromatography was performed, which allowed inferring that the coumarin present in these aqueous extracts is the so-called umbelliferone with known antispasmodic effects. The organ bath system used in this research for the ex vivo study of aqueous extracts is a very valuable technique because it allows, through the use of alternative methods, to comply with the 3 Rs (Replacement, Reduction and Refinement), fundamental ethical postulates of animal experimentation proposed by the scientists W.M.S. Russel and R.L. Burch. There are several animal models used in this system, but the use of the murine model (Mus musculus) has been reported very infrequently in the literature. Using the RADNOTI organ bath system and LabChart software using mice of the certified strain Hsd:ICR (CD-1®️), the antispasmodic activity of the aqueous extract of rhizome of L. japurensis and a tendency to decrease the contractility of the intestinal muscle in the case of the aqueous extract of frond of the same species were verified. In the present investigation it was possible to elucidate that the metabolites of the aqueous extracts of this species induce an antispasmodic activity possibly by two cellular pathways: by partial agonist mechanisms on muscarinic receptors and by blocking calcium channels. A further contribution of this research was the validation of the use of the murine model in the organ bath system (ex vivo). The possibility of having validated protocols in the same animal model (mouse of the certified Hsd:ICR strain (CD-1®️)) both ex vivo and in vivo, allowed us to obtain more reliable extrapolable data for the same species. The difficulty to review research based on the same animal model ex vivo and in vivo was very high. The biases when comparing the results obtained using different species (usually guinea pig or rabbit for ex vivo and rat for in vivo), does not always achieve the objective of demonstrating the usefulness of the data in a complementary and extrapolable way. This approach allowed us to compare the results of the antispasmodic and antidiarrheal activity of both extracts (ex vivo and in vivo) and the possibility of continuing with more specific studies in this same species. These results could be valuable for the health ministries of countries where this fern is being used with the possibility of integrating it to the traditional medicine in their health services, in addition, a pharmaceutical formula could be developed that allows an easy dosage to the patient and that becomes a therapeutic alternative. The possibility of having different effective drugs on GIT is important due to the genetic variability of individuals. The elimination of undesirable side effects due to certain active ingredients, together with the development of biochemical and genetic methods that are increasingly accessible, will allow determining the best drug for each patient (Meyer, 2000). In Costa Rica, the fern Lomariopsis japurensis can be found in different areas of both the Pacific and the Caribbean, so its distribution in different geographical areas has the potential to be cultivated with the possibility of generating micro-enterprises and by-products with coadjuvant potential in the treatment of gastrointestinal disorders. This study is of great importance because it is the first to provide information on the water-soluble secondary metabolites of this plant, its innocuousness, the validation of its ethnobotanical use as an alternative for the treatment of diarrhea and antispasmodic actions, and to elucidate some possible mechanisms of action of the total aqueous extracts of fronds and rhizome of L. japurensis. Another contribution was the validation of the murine model for the study of the ex vivo contractile activity of intestinal muscle.