Estudio de las comunidades microbianas del veneno de serpientes terciopelo (Bothrops Asper) y su susceptibilidad a antibióticos de relevancia clínica

Abstract

El envenenamiento por mordedura de serpiente constituye un importante problema de salud pública en regiones tropicales, incluida América Latina. En Costa Rica, la serpiente crotalina venenosa Bothrops asper representa la principal especie de importancia médica, con más de 300 mordeduras reportadas anualmente. Tradicionalmente, la investigación en ofidismo se ha centrado en la caracterización de las toxinas del veneno y el desarrollo de antivenenos; sin embargo, la microbiota asociada al veneno y su posible contribución a infecciones secundarias ha recibido escasa atención. En este estudio se caracterizó la microbiota asociada a la mordedura de B. asper mediante una estrategia integrada que combinó métodos independientes de cultivo (metabarcoding del gen 16S rRNA) y dependientes de cultivo. Las muestras se obtuvieron a partir de hisopados bucales y de colmillos, así como de veneno obtenido por estimulación y mediante extracción directa de la glándula venenosa. Además, se evaluó la susceptibilidad antimicrobiana de 90 aislamientos bacterianos frente a 25 antibióticos clínicamente relevantes utilizando el sistema VITEK® 2. Un subconjunto de aislamientos fue sometido a secuenciación genómica Illumina para identificar genes asociados a resistencia antimicrobiana y virulencia. Los resultados mostraron que la boca, el veneno y el sistema de inoculación de B. asper, incluida la glándula venenosa, albergan comunidades microbianas moderadamente diversas (índices de Shannon entre 0.25 y 3.75), dominadas por bacterias de los filos Pseudomonadota, Bacillota y Actinomycetota. Entre los géneros predominantes se identificaron Providencia, Stenotrophomonas, Morganella y Aeromonas, todos de reconocida relevancia clínica. La mayoría de los aislamientos presentó baja susceptibilidad a penicilinas, cefalosporinas de primera y segunda generación, aminoglucósidos, macrólidos, tetraciclinas, glicopéptidos, nitrofuranos y trimetoprima–sulfametoxazol. En contraste, se observó alta susceptibilidad a ciprofloxacina y a cefalosporinas de tercera y cuarta generación. El análisis genómico reveló un amplio repertorio de genes asociados a resistencia antimicrobiana, incluyendo bombas de eflujo, reguladores transcripcionales y determinantes relacionados con resistencia a β-lactámicos, aminoglucósidos y fluoroquinolonas, incluso en aislamientos fenotípicamente susceptibles. Asimismo, se identificaron múltiples genes de virulencia, como proteasas, adhesinas, fimbriae, sistemas de adquisición de hierro y de secreción, los cuales podrían favorecer la invasión tisular, la formación de biopelículas y la persistencia bacteriana en lesiones por mordedura. En conjunto, estos resultados demuestran que el veneno de B. asper no solo es un fluido rico en toxinas, sino también un reservorio y potencial vector de bacterias multirresistentes y portadoras de factores de virulencia. La evidencia presentada respalda el uso de ciprofloxacina y cefalosporinas de tercera y cuarta generación como opciones efectivas frente a estas bacterias y confirma la presencia de comunidades microbianas en la glándula venenosa, desafiando la noción del veneno como un ambiente estéril y abriendo nuevas preguntas sobre su relevancia clínica.Snakebite envenomation is a major public health problem in tropical regions, including Latin America. In Costa Rica, the venomous crotaline snake Bothrops asper represents the species of greatest medical importance, with more than 300 snakebite cases reported annually. Research on snakebite envenomation has traditionally focused on venom toxins, their pathophysiological effects, and antivenom development; however, the bacterial communities associated with venom and their potential contribution to secondary infections remain poorly explored. In this study, the microbiota associated with B. asper snakebites was characterized using an integrated approach combining culture-independent (16S rRNA gene metabarcoding) and culture-dependent methods. Samples were obtained from oral and fang swabs, venom collected by gland stimulation, and venom directly extracted from the venom gland via surgical procedures. In addition, antimicrobial susceptibility testing was performed on 90 representative bacterial isolates against 25 clinically relevant antibiotics using the VITEK® 2 system. Whole-genome sequencing using Illumina technology was conducted for a subset of isolates to identify antibiotic resistance and virulence-associated genes. The oral cavity, venom, and inoculation system of B. asper, including the venom gland, harbored moderately diverse microbial communities (Shannon indices ranging from 0.25 to 3.75), dominated by members of the phyla Pseudomonadota, Bacillota, and Actinomycetota. Predominant genera included Providencia, Stenotrophomonas, Morganella, and Aeromonas, all of recognized clinical relevance. Most isolates exhibited low susceptibility to penicillins, first- and second-generation cephalosporins, aminoglycosides, macrolides, tetracyclines, glycopeptides, nitrofurans, and trimethoprim/sulfamethoxazole, whereas high susceptibility to ciprofloxacin and third- and fourth-generation cephalosporins was observed. Genomic analyses revealed a broad repertoire of antimicrobial resistance genes, including efflux pumps, transcriptional regulators, and determinants associated with resistance to beta-lactams, aminoglycosides, and fluoroquinolones, even among phenotypically susceptible isolates. Numerous virulence-related genes, such as proteases, adhesins, fimbriae, iron acquisition systems, secretion systems, and global regulators, were also identified, suggesting a potential role in tissue invasion, biofilm formation, and bacterial persistence following snakebite. Overall, these findings demonstrate that B. asper venom is not only a toxin-rich fluid but also a reservoir and potential vector of multidrug-resistant bacteria carrying virulence factors. The results support ciprofloxacin and third- and fourth-generation cephalosporins as effective options against bacteria associated with B. asper venom and oral microbiota, and provide strong evidence for bacterial colonization of the venom gland. This challenges the concept of venom as a sterile environment and highlights the need for further studies on venommicrobiota interactions and their clinical relevance.