Caracterización Molecular de Aislamientos de Beauveria spp. y Metarhizium spp. y Detección de ARNS Asociados a Mycovirus

Abstract

En este estudio se realizó la caracterización molecular de los aislamientos de una colección de hongos entomopatógenos y la detección de ARNs asociados a micovirus en esta colección, donada a la Escuela de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional (EFC-UNA) por el Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE). De la colección original se recuperaron 32 aislamientos de Beauveria spp. y 15 de Metarhizium spp., a los que se realizó cultivos monospóricos. Se realizó la extracción de ADN de cada cultivo y se identificó la especie de cada aislamiento por medio de la amplificación por PCR y secuenciación de genes parciales y regiones intergénicas. Estos análisis moleculares permitieron determinar la presencia de B. bassiana (29) y B. caledonica (3) en la colección. De la especie B. bassiana se identificaron aislamientos de tres diferentes linajes y además se seleccionaron ocho de los 29, para obtener la secuencia del genoma completo. Los análisis genómicos confirmaron las diferencias observadas de acuerdo al linaje de los aislamientos y profundizaron nuestro entendimiento de los genes asociados a la patogenicidad y a la producción de metabolitos secundarios, entre otros. En el caso de Metarhizium, se identificaron tres especies, M. anisopliae (9), M. bruneum (5) y M. robertsii (1). También se utilizaron microsatélites específicos de cada género para analizar la variabilidad genética en ellos. Los análisis revelaron que cada aislamiento de Beauveria spp. representaba un genotipo distinto. Lo mismo en el caso de los aislamientos de M. anisopliae, mientras que los cinco de M. brunneum se agruparon en cuatro genotipos diferentes. Adicionalmente, se realizó la extracción de ARN de doble cadena (dsRNA, por sus siglas en inglés) para identificar la presencia de posibles micovirus en los aislamientos estudiados. La presencia de dsRNA fue identificada en diez y seis aislamientos de Beauveria y Metarhizium, respectivamente. Además, se realizó una secuenciación parcial de estos elementos en los aislamientos BV-ECA12 (B. bassiana) y MTR-ECA16 (M. anisopliae), en los cuales se identificaron los virus Beauveria bassiana victorivirus 1 (BbVV1), Beauveria bassiana partitivirus 3 (BbPV3), Metarhizium anisopliae victorivirus 1 (MaV-1) y una especie de chrysovirus. Finalmente, el genoma completo de un grupo de ocho aislamientos de B. bassiana de distintos países que pertenecían a la colección (5 Costa Rica, 1 Honduras y 2 de Puerto Rico), fue secuenciado y se realizaron análisis de genómica comparativa entre ellos. Estos son los primeros genomas de B. bassiana de la región de Centroamérica y el Caribe depositados en la base de datos internacional GenBank.

In this study, were carried out the molecular characterization of isolates from a collection of entomopathogenic fungi and the detection of micovirus-associated RNAs in this collection, donated to the School of Agricultural Sciences of the National University (EFC-UNA) by the Tropical Agricultural Research and Higher Education Center (CATIE). Thirty-two isolates of Beauveria spp. and 15 isolates of Metarhizium spp. were recovered from the original collection and monosporic cultures were performed. DNA was extracted from each culture and the species of each isolate was identified by PCR amplification and sequencing of partial genes and intergenic regions. These molecular analyses allowed determining the presence of B. bassiana (29) and B. caledonica (3) in the collection. Isolates from three different lineages of the species B. bassiana were identified and eight of the 29 were selected to obtain the complete genome sequence. Genomic analyses confirmed the differences observed according to isolate lineage and deepened our understanding of genes associated with pathogenicity and secondary metabolite production, among others. In the case of Metarhizium, three species were identified, M. anisopliae (9), M. bruneum (5) and M. robertsii (1). Genus-specific microsatellites were also used to analyze genetic variability within each genus. The analyses revealed that each isolate of Beauveria spp. represented a distinct genotype. The same was true for the M. anisopliae isolates, while the five M. brunneum isolates were grouped into four different genotypes. Additionally, double-stranded RNA (dsRNA) extraction was performed to identify the presence of possible micoviruses in the isolates studied. The presence of dsRNA was identified in ten and six isolates of Beauveria and Metarhizium, respectively. In addition, partial sequencing of these elements was performed in isolates BV-ECA12 (B. bassiana) and MTR-ECA16 (M. anisopliae), in which Beauveria bassiana victorivirus 1 (BbVV1), Beauveria bassiana partitivirus 3 (BbPV3), Metarhizium anisopliae victorivirus 1 (MaV-1) and a chrysovirus species were identified. Finally, the complete genome of a group of eight B. bassiana isolates from different countries that belonged to the collection (5 Costa Rica, 1 Honduras and 2 from Puerto Rico) was sequenced and comparative genomic analyses were performed among them. These are the first B. bassiana genomes from the Central American and Caribbean region deposited in the international GenBank database.