BOLTEC 21(2): 15-23. 1988 COMUNICACIÓN CONSIDERACIONES SOBRE SEMILLAS RECALCITRANTES Jorge A. Morera M.* INTRODUCCION El objetivo de esta breve reseña es discutir, de acuerda a la literatura, algunos de los problemas con- cernientes a semillas recalcitrantes. Probablemente la forma más económica y menos laboriosa de mantener germaplasma sea a través del almacenamiento de semillas. Roberts y Roberts (1972), señalan que bajo condiciones adecuadas, las se- millas de muchas especies puede permanecer viables por más de cien años, pero condiciones adecuadas incluye, tanto técnicas óptimas de preparación de semillas así coma un ambiente óptimo de almacenamien- to. Aún así, las semillas de algunas especies no sobreviven por largos periodos bajo ningún régimen de al- macenamiento conocido. Hace 14 años Roberts (1973a) reconoció y separó dos clases de semillas de acuerdo a su comporta- miento de almacenamiento. La gran mayoría de especies poseen semillas que pueden ser secadas a un con- tenido de humedad del 5% sin daño alguno y luego almacenadas a bajas temperaturas por largos periodos. Tales semillas han sido llamadas "ortodoxas"; es decir, la longevidad puede ser prolongada bajando el con- tenido de humedad y la temperatura (Roberts, 1981). En contraste, hay muchas otras semillas, especial- mente semillas de mayor tamaño de especies tropicales, que no pueden ser secadas a un contenido de hu- medad entre 12% y 31% sin causar un daño inmediato. Esas semillas fueron llamadas "recalcitrantes"; las cuales deben almacenarse húmedas y en la actualidad no pueden conservarse por largos periodos (King y Roberts. 1979; Roberts 1981; Roberts-1983). Tipos de semillas recalcitrantes Las especies que producen semillas recalcitrantes parecen ser de dos tipos: * Ph.D. Encargado del Programa de Mejoramiento Genético en Frutales Tropicales, Estación Experimental Fabio Baudrit, Universidad de Costa Rica. 16 Bol. Téc. Est. Exp. Fabio Baudrit 21 (2): abril - junio 1988 a) Especies de hábitos acuáticas Harrington 1972; b) Especies perennes Roberts 1973a. En la segunda categoría existe un número considerable de cultivos tropicales tales como: Hevea bra- siliensis (hule), Theabroma cacao (cacao), Coccus nucifera (coco), Coffea spp. (café), Elaeis quinensis (palma aceite), Bixa orellana (achice) Goldbach 1979a y probablemente muchas frutas tropicales: Persea americana (aguacate), Mangifera indica (mango), Garcinia mangostana (mangostán), Durio zibethinus (durián), Nephelium lappaceum (rambután), Lansium domesticum (langsat), Citrus spp., Arthocarpus in- tegrifolia (fruta de pan), y Melicoccus bijugatus (mamón) Goldbach 1979b. Además, pueden ser inclui- das varias especies maderables tropicales Roberts 1975. Generalmente, los métodos de propagación de es- tas especies se realizan vegetativamente, dado que la mayoría son de polinización cruzada y sólo así se puede conservar su “identidad genética”; excepto, en algunos casos se usan las semillas directamente pa- ra la producción de patrones. Con las limitantes que presentan el almacenamiento de semillas recalcitrantes, se hace indispensable continuar estudios para formular alternativas que promuevan la conservación de éstos recursos genéticos en forma más eficiente y económica. Al respecto, la literatura indica que debido a la sensibilidad de las se- millas recalcitrantes a la desecación, el almacenamiento a largo plazo no muestra posibilidad alguna. Viabilidad de semillas versus contenido de humedad González 1973 y Valio 1976, informaron que la viabilidad de las semillas de café (Coffea arabica), fue afectada por secamiento acelerado. Benda 1962 indicó que el secamiento severo de Coffea arabica, bajo el 8 o 9% de humedad fue detrimental. Sin embargo, un estudio reciente de Vossen 1979, indicó que la mayor parte de la pérdida en la viabilidad de las semillas fue asociado con un contenido de humedad entre 20 y 30%. Villers 1975 comparó la viabilidad de café después de cinco meses a 30 °C con semillas de lechuga (especie ortodoxa) a un 40% de humedad y concluyó que el patrón fue aproximadamente si- milar. Así, el porcentaje de viabilidad decreció conforme se aumentó el contenido de humedad. Además, la comparación con lechuga sugirió que Coffea arabica no es realmente recalcitrante. Swarbrick 1965 indicó que las semillas de cacao perdieron rápidamente la viabilidad cuando se so- metieron a un contenido de 38% de humedad. Hunter 1959 recomendó, que para una mayor seguridad en el almacenamiento, un contenido de 50% de humedad, y una temperatura moderada entre 18 y 30 °C co- mo óptimo. Así, temperaturas bajo 15 °C se han informado como perjudiciales Boroughs; Hunter 1963. En otro estudio King y Roberts 1982 obtuvieron en semillas de cacao almacenadas a 40,6% de humedad y 98 % de humedad relativa controlada,. sólo un 24% de sobrevivencia, después de ocho meses. Hor et al. 1984 mostraron que las semillas de cacao pierden su viabilidad rápidamente a un contenido de humedad Bol. Téc. Est. Exp. Fabio Baudrit 21 (2): abril - junio 1988 17 de 27% y temperatura de 17 °C. El ámbito para un mejor almacenamiento debe es.tar entre 33 y 35% de humedad y entre 17 y 30 °C de temperatura. Bajo esas condiciones se obtuvo un 67% de germinación a los setenta días. Sonwalkar 1951 indica que las semillas más pesadas de fruta de pan, colocadas en bolsas de papel hu- medecida, presentaron mejor condición de almacenamiento que las semillas más livianas, y se mantuvo una alta viabilidad durante un mes Las semillas de aguacate sobreviven muy pocos días después de que lasemilla ha sido removida del fruto, aunque, ellas, pueden sobrevivir por varios meses, en turba húmeda o bolsas plásticas a baja tempe- ratura Bergh 1975. Resultados similares fueron obtenidos por Spalding et al. 1976 quienes observaron que semi1las almacenadas a 4 °C en bolsas plásticas selladas durante cinco meses conservaron el 100% de ger- minación. Semillas de mangostán mostraron una prolongada longevidad cuando fueron almacenadas entre 2,1 y 29 °C en carbón vegetal humedecido. Y su viabilidad Se mantuvo alta por aproximadamente dos meses. Finalmente, cabe destacar que un buen número de semillas recalcitrantes tropicales también son sus- ceptibles al frío. Según lo indica King y Roberts 1979 a todas las semillas de cacao, rambután y alcanfor expuestas a 10 °C se les afectó la germinación. Germinación versus Secamiento Las semillas de cítricos han sido temporalmente clasificadas como reca1citrantes, debido a que algu- nos informes indican que ellas son severamente afectadas por secamiento Button; Borman; Hack1and 1971; Mumford; Panggabean 1982; Mungomery; Agnew; Prodonoff 1967; Soost; Cameron 1975. No obstante Soestisma; King; Roberts 1985, mencionaron que semillas de limóm (Citrus limon), lima (Ci- trus aurantifolia), naranja dulce (Citrus aurantium) y otros cítricos presentan comportamiento ortodoxo. Esas contradictorias conclusiones, ocurren debido a que las semillas de cítricos cuando son sometidas a secamiento, necesitan más tiempo para su rehidratación y germinación, comparado con la mayoría de las semillas, y el decrecimiento en la germinación es provocado por la testa Mumford; Panggabean 1982. En limón y lima, por ejemplo, es probable incrementar el porcentaje de germinación realizando las pruebas a 30 °C, sin embargo, la prueba al menos necesita seis semanas para permitir a todas las semillas viables un tiempo suficiente para germinar Soetisma et al. 1985. 18 Bol. Téc. Est. Exp. Fabio Baudrit 21 (2): abril - junio 1988 Actualmente, las evidencias indican que semillas de otras especies que inicialmente fueron afectadas por secamiento reaccionan en forma similar a las especies de cítricos. Tompsett 1984 informó que la lon- gevidad de Araucaria columnaris se incrementó conforme la temperatura y humedad de almacenamiento fueron reducidas de 36 a 21°C y de 22 a 7%, respectivamente. Esto indica que las semillas de Araucaria son básicamente ortodoxas en su fisiología de almacenamiento, a pesar de la pérdida parcial en su capa- cidad de germinación, factor que puede ser ocasionado por desecación. Las semillas de hule también han sido clasificadas como recalcitrantes Roberts 1973a. Estas semillas presentan varios problemas en produc- ción y almacenamiento Chin 1978. Así, Chin y Aziz 1981 informaron que semillas de hule, recién cose- chadas a 36 % de humedad fueron secadas por diferentes métodos y algunas mantenidas húmedas por un periodo de noventa y seis horas. El ámbito crítica usado en contenido de humedad fue entre 15 y 20 % y en temperatura entre 22 y 23 ºC. Además, les semillas se almacenaron a 45 °C, resultando en todos los ca- sos un pérdida total de la viabilidad. Cambios Genéticos Adícionalmente a los cambios fisiológicos, también existen evidencias de daños en los cromosomas y mutaciones genéticas durante el almacenamiento Roberts 1978. Desde que la mayoría de las mutaciones son recesivas, la mayor parte de las anormalidades genéticas no son manifestadas sino hasta en las siguien- tes generaciones, cuando las mutaciones han tenido la oportunidad de segregar Roberts 1981. De esta ma- nera, ha sido concluido, que en cualquier lote de semillas, los daNos visibles en los cromosomas empie- zan a ocurrir tan pronto como el porcentaje de viabilidad empieza a decrecer Abdalla; Roberts 1968. Esto tiene apreciables implicaciones para la conservación de recursos genéticas a largo plazo IBPGR 1976; Ro- berts 1975. En la mayoría de los sistemas biológicos existe una alta correlación entre aberración cromosómica y mutaciones Roberts 1973b. También se ha informado Ellis; Roberts 1981 que existe una fase durante la cual hay muy poca pérdida en la viabilidad y aberración cromosómica. Ciertamente el fenómeno de acu- mulación de daños cromosómicos en el tiempo, no es característica de semillas, más bien, parece ser una característica de aquellos tejidos animales en los cuales las aberraciones no pueden ser removidas median- te selección diplóntica Curtis 1963. Bol. Téc. Est. Exp. Fabio Baudrit 21 (2): abril - junio 1988 19 Semillas recalcitrantes versus Comportamiento de almacenamiento Las características de almacenamiento de semillas recalcitrantes son muy poco conocidas. Así, para que almacenamiento de semillas, sirva como una técnica apropiada para conservar germoplasma (especialmente semillas recalcitrantes) se requiere que este método conserve la viabilidad de las semillas por la menos durante el ciclo normal de la planta Roberts; King 1980. Todas las especies con semillas recalcitrantes son perennes, a menudo con fases de juvenilidad de considerable duración. Las técnicas disponibles hoy día para el almacenamiento de semillas recalcitrantes, no presentan pro- mesa alguna como un medio de conservación genética, desde que ninguna de los métodos asegura una viabilidad por más de seis meses King; Roberts 1980b. De esta manera, si el almacenamiento de semillas se intenta como un medio para conservar especies recalcitrantes, nuevos estudios deberán ralizarse con el objeto de incrementar,los periodos de viabilidad. Sobre este aspecto, King y Roberts 1980a indicaran que entre los alcances más promisorios porían ser la adaptación de algunos métodos criogénicos' existentes, los cuales han sido utilizados exitosamente para la conservación de algunas células y tejidos. Las semillas de tomate, de acuerdo'a la clasificación son ortodoxas, pero cuando son sometidas a una condición de humedad ellas pueden, ser consideradas como un magnífico modelo de semillas recalcitran- tes Growth 1980. Este autor estudió los efectos de grados de enfriamiento y el uso de varias concentracio- nes del crioprotector DMSO (dimetilsulfóxido); en semillas con diferentes contenidos de plántulas y hu- medad, las cuales fueron enfriadas a temperaturas del nitrógeno líquido. Con DMSO en una concentración del 15% encontró, que después de un rápido enfriamiento de -196 °C y 33,4% de humedad, el 86% de las semillas fueron capaces de germinar. Con el experimento citado, no cabe duda que es posible hacer futu- ros progresos con las técnicas criogénicas, porque ellas en una u otra forma podrían facilitar la labor de conservación de recursos genéticos. King y Roberts 1980b organizaron una lista detallada de los métodos de almacenamiento que han mostrado buenos resultados para varias semillas recalcitrantes. En general, los métodos más exitasos in- volucran tratamientos con semillas recién cosechadas son una breve exposición al agua caliente, fungici- da, o ambos, con el objeto de inhibir la actividad de los microorganismos; luego las semillas deben man- tenerse en un ambiente húmedo, creado en bolsas plásticas de polietileno, las cuales deben estar cerradas pero no selladas; con el propósito de permitir un buen intercambio de gases, lo cual es esencial para el mantenimiento de la viabilidad. En el banco de recursos genéticos (CATIE/GTZ) de Costa Rica, Goldbach (comunicación personal) recomienda, cuando se usan bolsas plásticas, incluir material inerte (carbón, ase- rrín, musgo) humedecido para ayudar a mantener las semillas con un alto contenido de humedad. Las,se- millas tamtién deben mantenerse en un ambLente frío, pero no demasiado como para causar dalos-perju- diciales en especies que son susceptibles. Finalmente, uno de los problemas de almacenamiento de semillas en una condición húmeda es que ellas son propensas a germinar. Una forma práctica de controlar el potencial de agua para prevenir la ger- 20 Bol. Téc. Est. Exp. Fabio Baudrit 21 (2): abril - junio 1988 minación podría ser el uso de los polietilenos. Sin embargo, usando ésta técnica no se mantiene la viabi- lidad por mucho tiempo King; Roberts 1982. CONCLUSIONES Hoy día, es claro que la conservación de semillas recalcitrantes con base en los métodos tradiciona- les de almacenamiento, no se vislumbra como una posibilidad práctica. El procedimiento tradicional de conservacíón ha sido el mantenimiento de germoplasma en colecciones vivas. Esto no cabe duda, presenta facilidades para la propagación vegetativa, hibridización artificial, des- cripción, evaluación e intercambio ágil. Sin embargo, este método en términos económicos (tierra, man- tenimiento, diseminación de pestes, etc.) representa un riesgo y un alto costo. Actualmente, muchas insti- tuciones dedicadas a la conservación de-recursos fitogenéticos están estudiando alternativas para reducir los costos de mantenimiento de colecciones. Así, un método efectivo de conservación sería de gran im- pacto y valor, aunque nunca deberá olvidarse que siempre serán necesarios árboles adultas de alta varia- bilidad genética para fines de mejoramiento. Vale la pena aprovechar los métodos convencionales de corta plazo desarrollados,con semillas, recal- citrantes, para facilitar los problemas en colecciones de campo. Sin embargo, no son de uso práctico co- mo método de conservación de germoplasma a largo plazo. Mucho más investigación sobre almacena- miento de semillas recalcitrantes será necesaria en el futura. Esta con el objeto de aumentar la eficiencia en conservación de muchas especies perennes tropicales que hoy día se encuentran en vías de erosión ge- nética. LITERATURA CITADA ABDALLA, F.H.; ROBERTS, E.H. 196B. 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