Reseña Científica Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2: 67 - 90, abril - junio, 2009 ISSN 1609-1841 (Versión impresa) ISSN 2074-8647 (Versión electrónica) Identificación y selección de híbridos somáticos obtenidos mediante fusión de protoplastos Wayner Montero-Carmona1 y Víctor M. Jiménez2*. *Autor para correspondencia. 1Centro de Investigación y Desarrollo Agrícola Sostenible para el Trópico Húmedo, Escuela de Agronomía, Instituto Tecnológico de Costa Rica, Sede Regional San Carlos, Costa Rica. 2Centro para Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS), Universidad de Costa Rica, 2060 San Pedro, Costa Rica. e-mail: victor.jimenez@ucr.ac.cr RESUMEN El poder seleccionar eficientemente las plantas híbridas producidas a partir de fusión de protoplastos es fundamental. Se han logrado muchos avances en el tema en las últimas décadas. Entre los métodos utilizados para la identificación de híbridos somáticos se encuentran la selección por características morfológicas (tipo de crecimiento, tipo de hoja, tallo, flor o fruto, color de la flor o tipo de inflorescencia), la selección mediante micromanipulación (o manual), la citometría de flujo, la complementación, el conteo de cromosomas, la detección por isoenzimas y la utilización de marcadores moleculares, tales como el polimorfismo mediante amplificación al azar o RAPD, la hibridación genómica in situ (GISH), las secuencias repetitivas simples (SSR) o microsatélites, las secuencias intergénicas repetitivas simples (ISSR), los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y los polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP). También, el análisis isoenzimático ha sido uno de los métodos de selección más utilizados por muchos años. Aunque las técnicas moleculares basadas en el ADN se han convertido en métodos confiables para la detección de híbridos somáticos, la citometría de flujo ofrece la alternativa más rápida y sensible para la selección de las células híbridas. No obstante, los equipos necesarios para su aplicación son de un precio muy elevado. La aplicación de más de un método de detección temprana de híbridos somáticos permite aumentar la eficiencia en su selección. En esta reseña bibliográfica se describen los métodos más utilizados para la detección de híbridos somáticos y se hace un listado exaustivo, con ejemplos de su utilización a partir de 1974. Palabras clave: isoenzimas, técnicas moleculares ABSTRACT Efficient selection of hybrid plants produced by protoplast fusion is very important. Several advances have been made on the subject in recent decades. The methods used for the identification of somatic hybrids include selection by morphological characteristics (growth, leaf, stem, flower or fruit type, flower color or type of inflorescence), micromanipulation (or manual selection), flow cytometry, complementation, chromosome counting, isozyme detection and the use of molecular markers, such as random amplification of polymorphic DNA (RAPD), genomic in situ hybridization (GISH), simple sequence repeats or microsatellites (SSR), the inter-simple sequence repeats (ISSR), restriction fragment length polymorphisms (RFLP) and amplified fragment length polymorphisms (AFLP). Isozyme analysis was a very common selection method for many years. Although, molecular techniques based on DNA have become reliable methods to detect somatic hybrids. Flow cytometry offers a more rapid and sensitive method for the selection of hybrid cells. However, the equipment needed for its implementation is very expensive. Use of more than one method for early detection of somatic hybrids increases the selection efficiency. This review describes the methods used for detection of somatic hybrids and presents a list of examples on their use from 1974 on. Key words: isozymes, molecular techniques Contenido INTRODUCCIÓN MÉTODOS PARA LA SELECCIÓN DE HÍBRIDOS SOMÁTICOS - Selección morfológica - Selección manual - Citometría de flujo - Complementación - Conteo de cromosomas - Isoenzimas - Marcadores moleculares de ácido desoxirribonucleico (ADN) CONSIDERACIONES FINALES 68 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 INTRODUCCIÓN el tema de selección e identificación de híbridos somáticos. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo La hibridación de plantas por medio de la fusión de fue presentar, en forma resumida, una recopilación de protoplastos es una herramienta con gran potencial para los principales métodos de selección e identificación la generación de nuevas combinaciones genéticas entre de híbridos somáticos publicados en la literatura especies sexualmente incompatibles (Cocking, 1979; científica, relacionándolos con los casos particulares Li et al., 2004; Liu et al., 2005; Geerts et al., 2008). en que fueron utilizados. Esta fue referida por primera vez en 1972 por Carlson y colaboradores (Pauls, 2005). Los híbridos MÉTODOS PARA LA SELECCIÓN DE HÍBRIDOS somáticos son producto de la fusión química o SOMÁTICOS eléctrica de protoplastos (Bengochea y Dodds, 1987). Durante esta se da la coexistencia inicial de dos La caracterización de híbridos somáticos se ha núcleos y de los citoplasmas pertenecientes a las realizado mediante indicadores morfológícos, dos células somáticas fusionadas, que genera una selección manual, complementación, conteo de etapa de heterocariosis. Si se da la fusión de los cromosomas y pruebas bioquímicas o moleculares núcleos durante la mitosis, entonces la producción (Blackhall et al., 1994). de células híbridas está completa. Los productos de una fusión simétrica (ambos genomas se fusionan) Selección morfológica presentan características complementarias entre los padres o donadores (Sakomoto y Taguchi, 1991; Kirti La selección morfológica se basa en la detección de et al., 1992ab). variaciones fenotípicas en el híbrido somático al compararlo con los progenitores (Lindsay et al., 1995; Debido a la presencia de dos núcleos en una misma Cheng et al., 2004). Algunas características, como el célula, ocurre un cierto grado de inestabilidad que puede tipo de crecimiento (tallo erecto, tallo rastrero o causar la pérdida total o parcial de uno de los genomas. semirastrero) y color de la flor, han sido utilizadas para Las plantas regeneradas en este tipo de eventos suelen este fin (Mendis et al., 1991). Por otro lado, en la fusión parecerse más a uno de los donantes (Binding et al., de tomate (Lycopersicon spp.) y papa (Solanum 1988; Fahleson et al., 1988ab; Wijbrandi et al., 1990a; tuberosum L.), Lindsay et al. (1995) evaluaron Lindsay et al., 1995; Navrátilová, 2004). Muchas veces, características tales como la forma, el tamaño y los cuando ocurre pérdida de un cromosoma, también otros tipos de tricomas, así como la pigmentación de hojas, se pierden con gran rapidez. Cuando se eliminan todos tallos y flores. Iwamoto et al. (2007), por su parte, los cromosomas de uno de los donantes, se forman evaluaron características, como: altura, diámetro del cíbridos (mezcla de los citoplasmas de ambos tallo, tipo de hoja, color de la flor, tipo de inflorescencia donadores pero con solo el núcleo de uno de los dos y peso seco de la raíz, en fusionantes de Solanum. parentales). También se pueden formar cíbridos cuando Fenotípicamente, dichas plantas presentaron un ocurre división de células heterocariontes que no han desarrollo intermedio al de los parentales. El tipo de intercambiado su contenido nuclear, o bien inactivando hoja ha permitido, también, la identificación de el genoma nuclear de uno de los donantes con rayos X híbridos somáticos en cítricos (Grosser et al., o rayos ganma, produciendo así colonias que exhiben 1992ab; Tusa et al., 1992). Además, fusionantes de las características nucleares de uno de los protoplastos Lotus corniculatus con L. tenuis fueron parentales pero con organelas de ambos (Blackhall et caracterizados mediante su patrón de crecimiento, al., 1994; Navrátilová, 2004). tipo de hoja y color de flor (Aziz et al., 1990). Un aspecto crítico para el uso efectivo de la hibridación La identificación morfológica, sin involucrar otro tipo de somática es la selección de los fusionantes (Blackhall marcador, tiene el problema de que es necesario cultivar et al., 1994). La tasa de fusión en un evento típico es la mayor cantidad de plantas posible, junto con los muy baja. Aproximadamente 1-2% de fusionantes parentales, durante un período de tiempo considerable, pueden ser obtenidos durante el proceso de fusión de hasta que las características se manifiesten, para protoplastos, los cuales, al colocarse en condiciones luego realizar la selección al comparar los fenotipos. de selección apropiadas, pueden ser identificados y La selección en etapas tempranas de desarrollo, por seleccionados (Cocking, 1979; Lindsay et al., 1995). medio de metodologías que no requieran la regeneración de gran cantidad plantas que luego Se han publicado numerosos trabajos relacionados con serán desechadas, evita, en gran medida, esta la identificación y caracterización de híbridos somáticos problemática (Hammatt et al., 1990). provenientes de fusiones intraespecíficas, interespecíficas e intergenéricas, particularmente en Selección manual las familias Solanaceae, Umbelliferae, Fabaceae, Poaceae, Rutaceae, Leguminoseae y Brassicaceae La selección manual (o micromanipulación) de los (Grosser y Gmitter, 1990; Wolters et al., 1994; Waara productos de fusión se utiliza cuando las dos y Glimelius, 1995; Guo et al., 2004); sin embargo, no poblaciones de protoplastos parentales pueden ser hay una revisión de literatura reciente específica sobre identificadas fácilmente. Esto facilita la selección Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 69 de los heterocariones y de los protoplastos fusionados. para epifluorescencia cuando se usan tintes Uno de los prerrequisitos para el aislamiento manual y fluorescentes (Patnaik et al., 1982). Dichos equipos posterior cultivo de únicamente los heterocariontes es tienen un alto costo y requieren del desarrollo de pericia la posibilidad de reconocerlos fácilmente y de para su utilización, por lo que la selección manual, en distinguirlos de los homocariontes (fusionantes entre muchos casos, depende de su disponibilidad y de la protoplastos del mismo donador) (Patnaik et al., habilidad del personal de laboratorio. Otro inconveniente 1982). Mendis et al. (1991) mencionan que el ejemplo que puede presentar esta metodología es que la típico de este procedimiento es la fusión entre intensidad de la fluorescencia de los compuestos puede protoplastos de mesófilo de hoja (de coloración verde variar entre células del mismo donador, lo cual puede por la presencia de clorofila) con protoplastos generar problemas durante la identificación de algunos obtenidos de suspensiones celulares cultivadas en heterocariontes (Ozias-Akins et al., 1986). oscuridad (incoloros, debido a la presencia de protoplastidios y leucoplastos). Citometría de flujo Cuando se fusionan protoplastos que tienen La citometría de flujo se basa en la medición de la características similares (fusión entre protoplastos de refracción de la luz al pasar por un fluido (Eeckhaut et mesófilo o entre protoplastos provenientes de al., 2005). Para ello, se utiliza el sistema de suspensiones celulares sin color, por ejemplo) resulta fluorescencia con el marcaje de ambas poblaciones de gran utilidad la tinción con fluorescencia (Patnaik et de protoplastos parentales, descrito antes. En un al., 1982). Para ello, los protoplastos de uno de los citómetro de flujo, las células resultantes de un parentales son marcados con fluorescencia verde experimento de fusión son transportadas en un flujo mediante diacetato de fluoresceína (1-20 mgl-1), y luego líquido entre una fuente de luz y un detector de se fusionan con los protoplastos del otro parental, el fluorescencia. La corriente de flujo es reducida y cual produce fluorescencia roja por autofluorescencia dispersada en gotas, permitiendo que una de la clorofila (Patnaik et al., 1982; Gilmour et al., 1987; computadora separe electrostáticamente las gotas Mendis et al., 1991; Navrátilová 2004), o bien mediante que contienen híbridos somáticos (Harkins y tratamiento con isotiocianato de rodamina, rodamina Galbraith, 1984). Este proceso es completamente 123 o escopoletina (10-20 mgl-1) (Barsby et al., 1984). automático y rápido, por lo que aproximadamente La fluorescencia presentada por los fusionantes puede 12 000 protoplastos pueden ser analizados y persistir en las células híbridas hasta 12 días, lo que separados por minuto (Blackhall et al., 1994). facilita la selección de las colonias de heterocariontes e híbridos somáticos en las primeras etapas de Ejemplos exitosos de selección con este método se desarrollo (Patnaik et al., 1982; Gilmour et al., 1989). han obtenido en la fusión de tomate con papa (Lindsay et al., 1995), trigo (Triticum aestivum) con maíz (Göntér Al estudiar la eficiencia del polietilenglicol (PEG) en la et al., 2002) y Hordeum vulgare con Datura inoxia fusión de protoplastos, Kao y colaboradores obtuvieron (Alexander et al., 1985). Esta técnica se recomienda fusionantes de cebada (Hordeum vulgare Lin) y soya cuando se logra aislar y fusionar concentraciones altas (Glycine max), así como de maíz (Zea mays) y soya. (superiores a los 5 x 107 protoplastos ml-1) de En ambos casos se logró la selección de los híbridos protoplastos parentales (Blackhall et al., 1994). somáticos mediante micromanipulación de los fusionantes entre células verdes de mesófilo y células Sin embargo, el equipo necesario es bastante costoso incoloras de suspensiones celulares (Kao y Michayluk, y tasas de fusión menores del 10% afectan 1974; Kao et al., 1974). Igualmente, la presencia de negativamente la efectividad de la técnica. Además, antocianinas en protoplastos de hipocótilos de las técnicas químicas de fusión provocan a veces la Corchorus olitorius (yute) fue utilizada para la selección formación de seudo-heterocariontes (protoplastos manual de fusionantes con protoplastos verdes de marcados con fluorescencia a los cuales de les adhirió cotiledones de Corchorus capsularis (Saha et al., 2001). en la plasmalema cloroplastos libres por la ruptura de otros protoplastos o protoplastos de ambos tipos Aunque la micromanipulación individual de los adheridos uno al otro sin fusionarse) los cuales pueden fusionantes consume mucho tiempo y es tediosa dar falsos positivos en el citómetro de flujo. En la (Blackhall et al., 1994; Navrátilová 2004), es el método electrofusión la cantidad de seudo-protoplastos es más directo para la selección de los productos de mínima, por lo cual la citometría de flujo es ampliamente fusión. Además, permite la extracción de híbridos aun recomendada (Hammatt et al., 1990). cuando su porcentaje sea muy bajo, inclusive menor de 1% (Patnaik et al., 1982; Gilmour et al., 1989), lo Otro factor a considerar es el flujo de la solución, el que lo convierte en un método muy confiable (Mendis cual debe ser ajustado apropiadamente debido a que la et al., 1991). velocidad de paso puede afectar la eficiencia de la técnica para detectar fusionantes. Por lo general, flujos bajos (100- Para la correcta selección manual de los fusionantes 200 gotas por segundo) permiten una buena detección y se requiere de un microscopio óptico invertido con, al separación (Afonso et al., 1985; Hammatt et al., 1990). menos, un micromanipulador, así como de accesorios También, los cloroplastos pueden presentar niveles 70 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 mínimos de fluorescencia roja o verde (aún cuando bioquímicos con autotrofía o auxotrofía hormonal, estén teñidos con colorantes fluorescentes) lo que resistencia a antibióticos o a toxinas, o con la capacidad dificulta la selección automatizada utilizando el de metabolizar aminoácidos análogos (Power et al., citómetro de flujo en algunos eventos de fusión. 1976; Maliga et al., 1977; Glimelius et al., 1978; Menczel et al., 1978; Potrykus et al., 1984; Aziz et al., Complementación 1990; Mendis et al., 1991). En la figura 1 se presenta un esquema que ejemplifica el proceso de selección La complementación se basa en la incapacidad de los mediante complementación. protoplastos parentales (o donadores) de poder regenerar plantas completas bajo ciertas condiciones Polgar et al. (1999) lograron identificar fusionantes de de cultivo. No obstante, y por complementariedad, los Solanum tuberosum con Solanum brevidens mediante fusionantes adquieren la capacidad de sobrevivir en las la resistencia a Erwinia carotovora var. carotovora condiciones seleccionadas y regenerar plantas presente en los protoplastos de la primera especie y la (Cocking et al., 1977; Göntér et al., 2002). Durante la incapacidad de S. brevidens de desarrollar colonias preparación de los protoplastos se debe realizar una multicelulares en el medio de cultivo con extracto de la selección minuciosa de las características de bacteria. En fusionantes de Solanum bulbocastanum complementariedad a utilizar, algunas de las cuales con S. tuberosum, Helgeson et al. (1998) utilizaron la también pueden ser inducidas. Posterior a la fusión, y resistencia a Phytophthora infestans presente en S. si la complementación se da, el desarrollo de células bulbocastanum para la selección de híbridos híbridas da lugar al crecimiento de plantas. En algunos somáticos. La selección de híbridos somáticos casos, las especies parentales que, en teoría, no mediante sensibilidad de los padres a aminoácidos deberían crecer en las condiciones de cultivo análogos, como S(2-aminoetil)-L-cisteina (AEC) y DL- restrictivas, forman colonias celulares. Estas colonias, 5-metiltriptófano (5MT), fue informada por primera vez sin embargo, no llegan a regenerar plantas en las por White y Vasil (1979). Tabaeizadeh et al. (1986) condiciones restrictivas, por lo que se pueden utilizaron AEC en protoplastos de Pennisetum seleccionar fácilmente. Este método de selección americanum para la complementación con permite la detección de híbridos somáticos en estadios protoplastos de caña de azúcar (Saccharum spp. tempranos del desarrollo (Cocking et al., 1977). híbrido) inactivados mediante iodoacetato. También la resistencia al ácido acetidin-2-carboxílico, junto En los protocolos publicados se ha utilizado con tratamientos con acetato de yodo, han mostrado complementación de medios de cultivo (Power et al., ser útiles para la selección de híbridos somáticos 1976; Smith et al., 1976; Sakomoto y Taguchi 1991; de zanahoria (Daucus carota) mediante Göntér et al., 2002), así como el uso de mutantes complementación (Cella et al., 1983). S elecc ión de caracterís ticas d e co mpleme ntac ió n Especie A Especie B E specie C Inc ompa tib ilidad Inc ompatib ilidad Inc ompatib il idad A B inducida + Fusión de pro toplasto s + Co lonias de Colonias sin C olon ias s in microcallos crecimiento crec im iento C ult ivo e n co ndic ione s de incompat ibil idad H eteroca rionte Heteroca riont (A + B) e (B + C) C omplem entac ió n de Cal los s in p rotoplastos dona dores regeneració n R egenera ción de plantas híbridas Híbrido Híbrido S omá tico Somático (A + B) (B + C) Fuente: Modifica do de Cock ing et al. (1977) Figura 1. Proceso de selección de híbridos somáticos mediante complementación ( Crecimiento de colonias; Sin desarrollo; + Fusión). Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 71 La utilización de mutantes albinos también ha sido utilizadas para la caracterización de fusionantes, exitosa para la selección de fusionantes identificados debido a que en los productos de fusión simétrica y por su capacidad para producir clorofila en presencia complementaria deberían estar presentes las de luz (Cocking et al., 1977; Menczel et al., 1978; isoenzimas de ambos donantes, lo cual se puede Gilmour et al., 1989). El primer ejemplo de evidenciar en un gel de almidón o poliacrilamida si complementación mediante el uso de protoplastos tienen diferente movilidad electroforética (O´Conell y albinos fue informado por Giles (1972). El proceso Hanson, 1985). Las isoenzimas heterodiméricas se basa en la regeneración de híbridos somáticos tienden a ser más utilizadas en la caracterización de color verde a partir de donantes albinos y donantes de fusionantes debido a que pueden representar más (con clorofila) incapaces de desarrollarse en el medio de una región del genoma (Ozias-Akins et al., 1986). de cultivo usado (Mendis et al., 1991; Göntér et al., 2002). El análisis isoenzimático de shiquimato deshidrogenasas, isocitrato deshidrogenasas y Uno de los principales problemas para el uso de la fosfoglucomutasas permitió la identificación de complementación de protoplastos para la selección híbridos somáticos en solanáceas (Iwamoto et al., de híbridos es la falta de mutantes que permita la 2007). En cítricos, la detección isoenzimática se ha selección (Patnaik et al., 1982). Además, la realizado mediante peroxidasas, fosfoglucomutasas aplicación de aminoácidos análogos en (Grosser et al., 1992a), fosfoglucosa isomerasas concentraciones relativamente altas puede ocasionar (Grosser et al., 1992b; Louzada et al., 1992) y problemas en la regeneración de los híbridos fosfoglucano deshidrogenasas (Tusa et al., 1992). somáticos, y reducir su desarrollo (Ozias-Akins et al., 1986). Li et al. (2004) lograron seleccionar híbridos somáticos de Triticum aestivum con Psathyrostachys Conteo de cromosomas juncea (Fisch.) Nevski mediante análisis isoenzimático de peroxidasas. Mientras que Gilmour El número de cromosomas de los híbridos somáticos et al. (1987) utilizaron la identificación isoenzimática simétricos debe ser el resultado de la suma del de esterasas y leucin-aminopeptidasas para la número cromosómico de los donadores (Kao, 1977; selección de células híbridas entre especies de Evans, 1983; Li et al., 2004). Sin embargo, como se Medicago. En híbridos somáticos de lotus (Lotus mencionó anteriormente, con frecuencia se forman corniculatus + L. tenuis), la caracterización híbridos asimétricos durante la división celular, ya isoenzimática se realizó mediante esterasas, que el genoma de alguno de los donantes puede ser peroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfatasas ácidas, eliminado parcial o totalmente (Smith et al., 1976; malato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas McGrath et al., 1996; Göntér et al., 2002; Li et al., y la actividad de leucin-aminopeptidasas (Aziz et al., 2004; Iwamoto et al., 2007). 1990). Híbridos somáticos obtenidos mediante fusión entre Para híbridos entre papa y tomate se evaluaron diez zanahoria y cebada fueron caracterizados mediante isoenzimas diferentes, de las cuales glucosa-fosfato conteo de cromosomas por Dudits et al. (1977). En isomerasas, fosfoglucomutasas y esterasas híbridos de arroz (Oryza sativa L.) con zanahoria, se mostraron polimorfismo en las bandas provenientes observó que gran parte del genoma de arroz fue de los parentales (Lindsay et al., 1995). Sin eliminado (Sala et al., 1985). Igualmente, híbridos embargo, en Pennisetum americanum + Panicum somáticos entre varias especies de Medicago maximun, solo las isoenzimas de alcohol presentaron conteos superiores a los de los deshidrogenasa, aminopeptidasa, shiquimato donadores; no obstante, ninguno de los casos mostró deshidrogenasa y fosfoglucano deshidrogenasa la sumatoria de los cromosomas de los parentales, permitieron la identificación de híbridos somáticos lo cual indica que ocurrió pérdida de algunos (Ozias-Akins et al., 1986). cromosomas (Mendis et al., 1991). Menczel et al. (1978) informaron que en Nicotiana Una desventaja del uso del conteo de cromosomas es knightiana + N. sylvestris, isoenzimas de esterasa que, con mucha frecuencia, se utilizan puntas de raíces y alcohol deshidrogenasa permitieron la en crecimiento activo para hacer las evaluaciones. Por caracterización de híbridos somáticos. Por su parte, ello, hay que esperar a que los regenerantes lleguen a para el híbrido obtenido entre caña de azúcar y esa etapa para realizar la selección, con la consiguiente Pennisetum americanum, la fosfoglucano pérdida en tiempo y de recursos invertidos en plantas deshidrogenasa presentó las bandas provenientes que luego deben ser desechadas. de ambos padres (Tabaeizadeh et al., 1986). También, fusionantes de Nicotiana tabacum + N. Isoenzimas glutinosa fueron identificados con isoenzimas de peroxidasa, leucin-aminopeptidasa, glutamato- La detección de híbridos somáticos por patrones de oxaloacetato transaminasa y ribulosa bifosfato isoenzimas ha sido, quizá, una de las pruebas más carboxilasa (Horn et al., 1983). 72 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 En yute (Corchorus capsularis + Corchorus olitorius), híbridos somáticos (Pehu et al., 1989, Fehér et al., el uso de peroxidasas facilitó la identificación de 1992, Williams et al., 1993). De igual manera, en fusionantes (Saha et al., 2001). Igualmente, híbridos fusionantes de Diospyros glandulosa con D. kaki, somáticos de Triticum aestivum con Agropyron Tamura et al. (1998) emplearon la enzima de elongatum presentaron bandas de esterasas y restricción StyI para la detección y caracterización peroxidasas provenientes de ambos parentales de híbridos somáticos. También en menta, se (Cheng et al., 2004). emplearon las enzimas ApaI y SteI para la detección de híbridos somáticos mediante RFLP (Krasnyanski Marcadores moleculares de ácido et al., 1998). desoxirribonucleico (ADN) Por su parte, AFLPs también han sido utilizados para A partir de inicios de la década de 1990, las técnicas la detección de híbridos somáticos en tomate moleculares basadas en ADN (tales como los (Thieme et al., 2008), Allium ampeloprasum con A. polimorfismos en la longitud de los fragmentos de cepa (Buiteveld et al., 1998), Cucumis melo con C. restricción o RFLP (Restriction Fragment Length anguria var. longipes (Dabauza et al., 1998), Oryza Polymorphism), los polimorfismos en la longitud de sativa con Daucus carota (Kisaka et al., 1994) y los fragmentos amplificados o AFLP (Amplified Daucus carota con Nicotiana tabacum (Kisaka y Fragment Length Polymorphism), la amplificación Kameya, 1994). aleatoria del ADN polimórfico o RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), las secuencias Los análisis mediante RAPDs han sido importantes repetitivas simples SSR (Simple Sequence Repeat) para la evaluación de fusionantes intra e or Microsatellite) o microsatélites y la hibridación interespecíficos en papa (Polgar et al., 1999). RAPDs genómica in situ o GISH (Genomic in situ también han permitido la identificación de híbridos Hybridization) se han convertido en métodos rápidos somáticos en trigo + maíz (Göntér et al., 2002). Esta para la detección de híbridos somáticos (Baird et técnica ha sido utilizada, adicionalmente, para la al., 1992; Xu et al., 1993; Li et al., 2004). evaluación de fusionantes entre Solanum tuberosum y S. brevidens (Baird et al., 1992; Xu et al., 1993; Los AFLPs han sido utilizados con resultados Rokka et al., 1994), así como sus progenies satisfactorios en varias especies. Por ejemplo, los obtenidas de retrocrusas (McGrath et al., 1994, RFLPs, obtenidos mediante las enzimas de 1996). RAPDs y RFLPs (con las enzimas de restricción XbaI y EcoRI, confirmaron la presencia restricción HindIII y BamHI) permitieron la selección de secuencias homólogas provenientes de los dos de híbridos somáticos en productos de fusión de trigo parentales (Pennisetum americanum y Panicum con Agropyron elongatum (Cheng et al., 2004). maximum) en el ADN del híbrido somático (Ozias- Akins et al., 1986). De igual manera, RFLPs, Por otro lado, los SSR han sido utilizados para la utilizando las enzimas de restricción BamHI, DraI, detección de híbridos somáticos de Triticum aestivum EcoRI, EcoRV, HindIII y XbaI, fueron utilizados para + Psathyrostachys juncea (Fisch.) Nevski (Li et al., la selección de fusionantes de Solanum acaule + 2004). Los microsatélites son de tipo codominante Solanum tuberosum (Yamada et al., 1998). lo que, a diferencia de los RAPDs y los RFLPs, permite la identificación simultánea de ambos alelos En Nicotiana glauca + N. langsdorfii, se utilizaron de los donadores en el híbrido somático (Johnson, las enzimas de restricción AccI, AvaI, BamHI, EcoRI, 1998). HindIII, HpaII, KpnI, SalI, SmaI, de caña de azúcar + Pennisetum americanum Sau961, XbaI y XhoI para Las técnicas moleculares anteriores no permiten la la detección de híbridos somáticos (Uchimiya et al., identificación de cromosomas completos, por lo que 1983) y la enzima de restricción XbaI mostró ser GISH, una técnica muy utilizada para este fin, puede una herramienta importante en la selección, mediante proporcionar información valiosa a este nivel (Dong RFLPs, de híbridos con ADN ribosomal (Tabaeizadeh et al., 1999; Iwamoto et al., 2007). Pruebas mediante et al., 1986). Otros autores, como Saul y Potrykus RAPDs y GISH permitieron la detección de híbridos (1984) han realizado análisis mediante RFLPs con somáticos entre Solanum integrifolium y S. la enzima de restricción HindIII que permitieron la sanitwongsei (Iwamoto et al., 2007) y entre Triticum detección de híbridos somáticos entre Hyoscyamus aestivum y Psathyrostachys juncea (Li et al., 2004). muticus y Nicotiana tabacum. Igualmente, en Por su parte, Dong et al. (1999) demostraron que la Brassica juncea y Moricandia arvensis (Kirti et al., combinación de análisis de RFLPs y GISH facilita la 1992a) y Trachystoma ballii con Brassica juncea (Kirti detección y caracterización de los cromosomas et al., 1992b). contenidos en el genoma de híbridos somáticos de papa en relación con los genomas parentales. En híbridos de Solanum tuberosum + S. brevidens, análisis mediante RFLPs (con las enzimas de La tabla 1 muestra una lista de híbridos somáticos, restricción EcoRI, EcoRV, BamHI, DraI y HindIII) de siméticos y asimétricos, identificados mediante la progenie obtenida permitieron la detección de diferentes métodos de selección. Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 73 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Híbrido somático Método de selección Referencia Cariotipo Agropyron elongatum + Triticum Molecular (GISH, AFLP y SSR de cloroplastos) Cui et al. (2009) aestivum Análisis de glutenina Morfo logía (crecimiento, tipo y color de hoja) Complementación (normal + iodoacetamida) Citometría de flujo Allium ampeloprasum + Allium cepa Conteo de cro mosomas (32 + 16) Buiteveld et al. (1998) Isoenzimas (glutamato oxaloacetato transaminasas, shiquimato deshidrogenasas) Molecular (GISH, AFLP) Arabidopsis thaliana + Brassica Manual (c lorofila + incoloro) Hoffmann y Adachi campestris Conteo de cro mosomas (20 + 36) (1981) Morfo logía (tipo de hoja, ta llo) Arabidopsis thaliana + Brassica Complementación (luz UV o rayos X + iodo Yamagishi et al. (2002) napus acetato) Molecular (RFLP) Conteo de cro mosomas Arabidopsis thaliana + Bupleurum Isoenzimas (esterasas) Wang et al. (2008) scorzonerifolium Molecular (RAPD y SSR) Morfo logía de hoja y flor Arabidopsis thaliana + Raphanus Yamagishi y G limelius Conteo de cro mosomas sativus (2003) Molecular (RAPD) Armoracia rusticana + Brassica Manual (c lorofila + incoloro) Navrátilová et al. (1997) oleracea var. botrytis Beta vulgaris + Beta vulgaris Complementación (luz UV + rayos γ) Hall et al. (1992) Morfo logía (crecimiento, tipo de hoja, flor) Brassica juncea + Morican dia Conteo de cro mosomas (36 + 28) Kirti et al. (1992a) arvensis Molecular (RAPD, RFLP) Morfo logía (crecimiento, tipo de f lor) Manual (carboxifluoresceína + c lorofi la) Isoenzimas (leucin-aminopeptidasas, fosfoglucosa Brassica napus + Eruca sativa Fahleson et al. (1988a) isomerasas, 6-fosfogluconato deshidrogenasas) Citometría de flujo Molecular (RFLP) Conteo de cro mosomas Brassica napus + Isatis indigotica Du et al. (2009) Molecular (AFLP, GISH) Brassica napus + Orychophragmus Morfo logía de hoja Zhao et a l. (2008) violaceus Molecular (GISH) 74 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Morfología de hoja y f lor Brassica napus + Raphanus sativus Wang et al. (2006) Molecular (SSR, GISH) Morfología de hojas y flores Brassica napus + Sinapis arvensis Citometría de f lujo Hu et al. (2002) Molecular (RAPD) Morfología (tipo y color de hoja) Brassica oleracea var. capitata + Conteo de cromosomas (18 + 32) Navrátinová et al. (1997) Armoracia rusticana Molecular (GISH) Morfología Citometría de f lujo Brassica oleracea var. capitata + Molecular (ceb adores que detecten secuencia Sigareva y Ear le (1997) Brassica oleracea var. italica mitocondrial específica) Complementación (resistencia a frío) Brassica oleracea var. italica + Manual (incoloros + clorofi la) Kao et al. (1992) Brassica napus Conteo de cromosomas (18 + 38) Morfología Brassica oleracea var. italica + Citometría de f lujo Ren et al. (200 0) Brassica rapa ssp. pekinensis Molecular (RAPD) Liu et al. (2007) Complementación (normal + resistencia a Erwinia) Morfología (crecimiento, tipo y color de hoja) Complementación (normal + iodo acetato) Citometría de f lujo Brassica oleracea + Camelina sativa Hansen (1998) Isoenzimas (isocitra to d eshidrogenasas, aminotransferasas) Molecular (RAPD) Morfología (hoja, flor) Brassica rapa + Isatis indigotica Conteo de cromosomas Tu et al. (2008) Molecular (AFLP y GISH) Morfología (tipo y color de hoja) Complementación (resistencia a frío + iodoacetato) Isoenzimas (fosfoglucosa isomerasas, malato Capsella bursa-pastoris + Brassica deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas, Sigareva y Ear le (1999) oleracea aspartato amino transferasas, isocitrato deshidrogenasas) Molecular (RAPD) Cichorium intybus + Cichorium Conteo de cromosomas Cappelle et al. (2007) endivia Molecular (SSR) Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 75 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus aurantium + Citrus ja mbhiri Louzada et al. (1992) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Citrus aurantium + Citrus Conteo de cromosomas (36 + 36) Louzada et al. (1992) volkameriana Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus jambhiri + Citrus limon Tusa et al. (1992) Isoenzimas (fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas, fosfogluconato deshidrogenasas) Isoenzimas (fosfoglucomutasas, fosfoglucosa Citrus microcarpa + Citrus aurantiu m isomerasas, isoc itrato deshidrogenasas) Grosser et al. (1996) Molecular (RFLP) Morfología (tipo de hoja) Citrus paradis i + (Citrus reticulata x Conteo de cromosomas (36 + 36) Grosser et al. (1992b) Citrus sinens is) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfogluco isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, Louzada et al. (1992) Citrus reticulata + Citrus aurantium fosfoglucosa isomerasas, isocitrato Grosser et al. (1996) deshidrogenasas) Molecular (RFLP) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus reticulata + Citrus ja mbhiri Louzada et al. (1992) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus reticulata + Citrus limonia Louzada et al. (1992) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Citrus reticulata + (Citrus paradisi x Conteo de cromosomas (36 + 36) Grosser et al. (1992b) Poncirus trifoliata) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfogluco isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus reticulata + Citrus Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, Louzada et al. (1992) volkameriana fosfoglucosa isomerasas) 76 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus reticulata + Poncirus trifoliata Grosser et al. (1992b) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfogluco isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Citrus reticulata x (Citr us reticulata x Conteo de cromosomas (36 + 36) Grosser et al. (1992a) C. paradisi) + C. s inesis Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas) Morfología (tipo de hoja) Citrus sinensis + (Citrus paradisi x Conteo de cromosomas (36 + 36) Louzada et al. (1992) Poncirus trifoliata) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Isoenzimas (fosfoglucomutasas, fosfoglucosa Tusa et al. (1992) Citrus sinensis + Citrus limon isomerasas, fosfogluconato deshidrogenasas, Grosser et al. (1996) isocitrato deshidrogenasas) Molecular (RFLP) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus sinensis + Citrus limonia Louzada et al. (1992) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Citrus sinensis + Citrus ret iculata Conteo de cromosomas (36 + 36) Grosser et al. (1992a) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus sinensis + Severinia buxifolia Grosser et al. (1992b) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Morfología (tipo de hoja) Conteo de cromosomas (36 + 36) Citrus sinensis + Citrus jambhiri Grosser et al. (1992b) Isoenzimas (p eroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfoglucosa isomerasas) Manual (c lorofi la + antocianinas) Corchorus capsularis + Corchorus Isoenzimas (p eroxidasas) Saha et al. (2001) olitorius Molecular (RFLP) Manual (albino + c lorofi la) Cucumis melo + Cucumis anguria Dabauza et al. (1998) Molecular (AFLP) Complementación (albino + rayos X) Datura innoxia + Datura discolor Schieder (1978) Conteo de cromosomas (24 + 24) Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 77 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Datura innoxia + Datura innoxia Complementación (albino + rayos X) Schieder (1977) Complementación (albino + rayos X) Datura innoxia + Datura stramonium Schieder (1978) Conteo de cromosomas (24 + 24) Complementación (albino + medio d e cultivo) Morfología (tipo de hoja) Daucus carota + Daucus capillif olius Dudits et al. (1977) Conteo de cromosomas (36 + 36) Isoenzimas (peroxidasas) Daucus carota + Daucus carota Complementación (iodoacetato + A2CA) Cella et al. (1983) Complementación (rayos X + resistencia a kanamicina-estrep tomicina) Conteo de cromosomas (24 + 32) Daucus carota + Nicotiana tab acum Kisaka y Kameya (1994) Presencia del gen que codifica para la neomicina fosfotransferasa Molecular (AFLP) Daucus carota + Panax Isoenzimas (peroxidasas) Han et al. (2009) quinquefolius Molecular (RAPD, GISH) Conteo de cromosomas Dendranthema x grandiflorum + Hibridación Sourthern Furuta et al. (2004) Artemisia sieversiana Morfología (h ojas y flores) Citometría de flujo Diospyros glandulosa + Diospyros Conteo de cromosomas (30 + 90) Tamura et al. (1998) kaki Moleculares (RFLP, RAPD) Citometría de flujo Eruca sativa + Brassica napus Fahleson et al. (19 88b) Conteo de cromosomas Conteo de cromosomas Festuca arundinacea + Triticum Isoenzimas (peroxidasas) Cai et al. (2007) aestivum Molecular (RAPD, RFLP, GISH) Manual (c lorofila + incoloros) Glycine max + Hordeum vulgare Kao y Michayluk (1974) Morfología (crecimiento, tipo de hoja) Gossypium hirsutum + Gossypium Conteo de cromosomas Sun et al. (2006) davidsonii Molecular (RAPD y SSR) Isoenzimas (malato deshidrogenasas, fosfatasas ácidas, fosfohexosa isomerasas, 6-fosfogluconato Helianthus annu us + Helianthus Taski-Ajdukovic et al. deshidrogenasas, fosfoglucomutasas y maximiliano (2006) aconitasas) Molecular (RAPD) Citometría de flujo (normal + diacetato de Hordeum vulgare + Datura inoxia Alexander et al. (1985) fluoresceína) 78 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Manual (incoloros + clorofi la) Morfología (crecimiento, tipo y color de hoja, f lor) Hordeum vulgare + Daucus carota Kisaka et al. (1997) Conteo de cromosomas (18 + 14) Molecular (RFLP) Manual (clorofi la + incoloros) Hordeum vulgare + Glycine max Kao et al. (1974) Morfología (crecimiento, tipo de hoja) Hyoscyamus muticus + Nicotiana Molecular (RFLP) Saul y Potrykus (1984) tabacum Conteo de cromosomas Ipomoea cairica + Ipomoea batatas Isoenzimas (peroxidasa) Guo et al. (2006) Molecular (RAPD) Complementación (albino + iodoacetato) Iris ensata + Iris germanica Shimizu et al. (1999) Molecular (RAPD) Lotus corniculatus + Lolium perenne Molecular (amplificación con hebra desplazada) Raikar et al. (2007) Morfología (tipo de inflorescencia, color de flor) Lotus corniculatus + Lotus Complementación (iodoacetato + normal) Wright et al. (1987) conimbricensis Isoenzimas (esterasas, fosfoglucomu tasas) Conteo de cromosomas (24 + 12) Morfología (crecimiento, tipo de hoja, color de f lor) Complementación (iodoacetato + resistencia a kanamicina) Isoenzimas (esterasas, peroxidasas, Lotus corniculatus + Lotus tenuis Aziz et al. (1990) fosfoglucomutasas, fosfatasas ácidas, malato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas, leucin- aminopeptidasas) Conteo de cromosomas (24 + 12) Lupinus angustifolius + Lupinus Molecular (secuencias específicas para Lupinus) Sonntag et al. (2009) subcarnosus Morfología (tipo de hoja, flor) Lycopersicon esculentum + Complementación (rayos γ + normal) O´Connell y Hanson Lycopersicon pennellii Isoenzimas (fosfoglucosa isomerasas) (1985) Molecular (RFLP) Morfología (tipo de hoja, flor) Complementación (normal + rayos γ) Conteo de cromosomas (24 + 24) Lycopersicon esculentum + Isoenzimas (fosfatasas ácidas, glutamato Wijbrandi et al. (1990ab) Lycopersicon peruvianum oxaloacetato tr ansaminasas) Resistencia a kanamicina Análisis Sourthern beot Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 79 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Morfología Lycopersicon esculentum + S olanum Conteo de cromosomas Melchers et al. (19 92) acaule Complementación (iodo acetamida + rayos X γ) Conteo de cromosomas Lycopersicon esculentum + S olanum Morfología de hoja y flor Handley et al. (1986) lycopers icoides Isoenzimas (c inco) Morfología (crec imiento, tipo de hoja , flor, fruto) Lycopersicon esculentum + S olanum Complementación (incompatibilidad con el medio + Sakomoto y Taguchi muricatum normal) (1991) Conteo de cromosomas (24 + 24) Morfología Lycopersicon esculentum + S olanum Conteo de cromosomas Melchers et al. (19 92) tuberosum Anális is de ADN mitocondrial Morfología (tipo de hoja, color y forma de la flor) Lycopersicon esculentum + Conteo de cromosomas (24 + 96) (Solanum tuberosum x Solanum Citometria de flujo (ioduro de propidium + nor mal) Lindsay et al. (1995) nigrum) Isoenzimas (g lucosa-fosfato isomerasas, fosfoglucomutasas, esterasas) Resistencia a kanamicina (Lycopers icon esculentum x Isoenzimas (fosfoglucosa isomerasas y Lycopersicon pennellii) + Solanum perox idasas) Liu et al. (1995) melo ngena Conteo de cromosomas Hibridización Southern beot Complementación (albino + albino) Medicago sativa + Medicago borialis Isoenzimas (leucin-aminopeptidasas) Gilmour et al. (198 9) Conteo de cromosomas (32 + 16) Morfología (crec imiento, color de flor) Manu al (diacetato de f luoresceína + clorofila) Gilmour et al. (198 7) Medicago sativa + Medicago falcata Isoenzimas (esterasas y leucin-amin ope ptidasas) Mendis et al. (1991) Conteo de cromosomas Manu al (diacetato de f luoresceína + clorofila) Medicago sativa + Medicago Isoenzimas (esterasas y leucin-amin ope ptidasas) Gilmour et al. (198 7) quasifalcata Conteo de cromosomas (32 + 31) Complementación (resis tencia a fosfinotric ina + Medicago sativa + Medicago varia Deak et a l. (1 988) glutamin-sintetasa) Medicago truncatula + Med icago Conteo de cromosomas Tian y Rose (1999) scutellata Molecular (AFLP) Morfología (tipo y color de hojas) Mentha piperita + Mentha spicata Conteo de cromosomas (48 + 36) Krasnyanski et al. (1998) Moleculares (RAPD, RFLP) 80 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Moricandia nitens + Brassica oleracea var. capitata Morfología (tipo de hoja, color de hoja y flor) Moricandia nitens + Brassica Manual (c lorofi la + incoloro) Yan et al. (1999) oleracea var. gongylodes Conteo de cromosomas Moricandia nitens + Brassica Molecular (RAPD) oleracea var. it alica Musa sp. cv. Gros Michel Morfología de hoja Assani et al. (2005) (AAA) + Musa sp. cv. SF265 (AA) Citometría de flujo Musa sp. cv. Maçã (AAB) + Musa sp. Citometría de flujo Matsumoto et al. (2002) cv. Lidi (AA) Molecular (RAPD) Complementación (iodoacetamida + luz Musa Silo (AAB) + Musa acuminata ultravioleta) Xiao et a l. (2009) (AA) Molecular (RAPD, ISSR) Complementación (medio de cultivo) Nicotiana glauca + Nicotiana Smith et al. (1976) Conteo de cromosomas(24 + 18) langsdorffi i Uchimiya et al. (1983) Molecular (RFLP) Conteo de cromosomas Nicotiana glauca + Nicotiana Morfología de hoja y flor Evans et al. (1980) tabacum Isoenzimas (aspartato aminotransferasas y alanil aminopeptidasas) Complementación (albino + resistencia a Nicotiana knightiana + Nicotiana kanamicina) Menczel et al. (19 78) sylvestris Manual (albino + c lorofi la) Isoenzimas (ester asas y alcohol deshidrogenasas) Morfología (crecimiento, tipo y color de hoja, flor) Complementación (normal + resistencia a Nicotiana plumbaginifolia + kanamicina, luz UV) Vlahova et al. (1997) Lycopersicon esculentum Conteo de cromosomas (20 + 24) Isoenzimas (n eomicin-fosfato tr ansferasas) Molecular (RFLP) Nicotiana plumbaginifolia + Nicotiana Conteo de cromosomas plumbaginifolia (mutantes Negrutiu et al. (1986) Complementación (nitrato y aminoácidos) auxotróf icos) Morfología (hojas y flores) Nicotiana rustica + Nicotiana Isoenzimas (6-fosfoglucona to deshidrogenasas) Gleddie et al. (1983) sylvestris Patrón de enzima RUBISCO Morfología (hoja, flor) Nicotiana rustica + Nicotiana Douglas et al. (1981) Isoenzimas (ester asas) tabacum Pental et al. (1984) Patrón de enzima RUBISCO Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 81 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Complementación (resis tencia a kanamicina + Nicotiana sy lvestris + Nicotiana normal) Maliga et al. (1977) knightiana Isoenzimas (ester asas, alcohol deshidrogenasas y 6 fosfatoglucosa deshidrogenasas) Nicotiana sy lvestris + Nicotiana Complementación (AEC + 5MT) White y Vasil (1979) sylvestris Conteo de cromosomas (48 + 96) Nicotiana tabacum + Nicot iana alata Manual (diacetato de f luoresceína + clorofila) Patnaik et al. (1982) Morfología (tipo de hoja, flor) Complementación (5MT + normal) Nicotiana tabacum + Nicot iana Conteo de cromosomas (24 + 24) Horn et al. (1983) glutinosa Isoenzimas (p eroxidasas, leuc in-aminopept idasas, glutamato-oxaloacetato transaminasas y ribu losa bifos fato carbox ilasas) Conteo de cromosomas Nicotiana tabacum + Nicot iana Isoenzimas (ester asas y peroxidasas) Sun et al. (2005) remanda Molecular (RAPD) Morfología (tipo de hoja, flor) Nicotiana tabacum + Nicot iana Molecular (RFLP) Belliard et al. (1978) tabacum Complementación (defic ienc ia de nitrato reductasa Glimelius et al. (1978) + normal) Complementación (nitrato reductasa deficiente– estreptomic ina resis tente + normal) Patnaik et al. (1982) Nicotiana tabacum + P etunia hybrida Isoenzimas (p eroxidasas, leuc in-aminopept idasas) Pental et al. (1986) Manual (diacetato de f luoresceína + clorofila) Molecular (RFLP) Isoenzimas (p eroxidasas) Nicotiana tabacum (mutantes) + Res istencia a antibióticos (estreptomicina y Toki et al. (1990) Solanum melongena kanamic ina) Manual (isotiocianato de fluoresceína + isotiocianato de rodamina B) Complementación (resis tencia a hidroxiprolina + Onobrychis v iciaefol ia + Medicago normal) sativa Xu y Jia (1997) Conteo de cromosomas (28 + 32) Isoenzimas (n opa linsintetasas, peroxidasas, esterasas) Complementación (rayos X + iodoacetamina) Conteo de cromosomas (24 + 24) Oryza sativa + Daucus carota Isoenzimas (p eroxidasas) Kisaka et al. (1994) Molecular (AFLP) Isoenzimas (ester asas, perox idasas) Oryza sativa + Glycine max Niizeki et al. (1985) Selección manual (pigmentos y consistencia) 82 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Manual (incoloros + clorofi la) Morfología (crecimiento, tipo y color de hoja) Oryza sativa + Hordeum vulgare Conteo de cromosomas (24 + 14) Kisaka et al. (1998) Molecular (RFLP) Morfología (crecimiento, tipo y color de hoja) Complementación (iodoacetamina + rayos γ) Oryza sativa + Zizania latif olia Conteo de cromosomas (24 + 24) Liu et al. (1999) Molecular (RFLP) Passiflora edulis f. flavicarpa + Conteo de cromosomas Barbosa et al. (2007) Passiflora cincinnata Molecular (RFLP) Complementación (AEC + iodoacetato) Isoenzimas (a lcohol deshidrogenasas, Pennisetum americanum + Panicum aminopeptidasas, shiquimato deshidrog enasas y 6- maximum Ozias-Akins et al. (1986) fosfogluconato deshidrogenasas) Molecular (RFLP) Complementación (albino + medio de cult ivo) Power et al. (1976) Petunia hybrida + Petunia parodii Complementación (resistencia a D-actinomicina) Cocking et al. (1977) Complementación (albino + normal) Power et al. (1979) Morfología (tipo de hoja, tamaño y color de la flor) Petunia parodii + Petunia inflata Complementación (albino + medio de cult ivo) Power et al. (1979) Conteo de cromosomas (14 +14) Manual (c lorofi la + incoloros) Pisum sativum + Glycine max Kao et al. (1974) Morfología (crecimiento, tipo de hoja) Manual (c lorofi la + incoloros) Pisum sativum + Vic ia hajastana Kao et al. (1974) Morfología (crecimiento, tipo de hoja) Manual (c lorofi la + incoloros) Morfología (tipo y color de hoja) Poncirus trifoliata + Fortunella hindsii Miranda et al. (1997) Citometría de flujo Molecular (RFLP) Morfología (tamaño y color de la f lor) Raphanus sativus + Brassica Manual (c lorofi la + incoloro) Kameya et al. (1989) oleracea var. capitata Complementación (incompatibil idad con el medio + iodoacetato) Morfología (hoja, flor) Raphanus sativus + Isatis indigotica Conteo de cromosomas Tu et al. (2008) Molecular (AFLP y GISH) Complementación (iodoacetato + Aet-Cys) Saccharum offic inarum + Pennisetum Taba eizadeh et al. Isoenzimas (fosfogluconato deshidrogenasas) americanum (1986) Molecular (RFLP) Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 83 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Solanum acaule + Solanum Conteo de cromosomas (48 + 48) Yamada et al. (1998) tuberosum Molecular (RFLP) Morfología (crecimiento, tipo y color de hoja) Complementación (normal + resistencia a Solanum bulbocastanum + Solanum Phytophthora infestans) Helgeson et al. (1998) tuberosum Conteo de cromosomas (24 + 48) Greplová et al. (2008) Molecular (RFLP, RAPD) Citometría de flujo Solanum chacoense + Solanum Citometría de flujo Johnson (1998) phureja Molecular (SSR) Morfología (altura, diámetro del tallo, tipo de hoja, color de la flor, inf lorescencia) Complementación (luz UV + iodoacetamida) Solanum integrifolium + Solanum Isoenzimas (shiquimato deshidrogenasas, Iwamoto et al. (2007) sanitwon gsei isocitrato deshidrogenasas, fosfoglucomutasas) Conteo de cromosomas (24 + 24) Molecular (RAPD, GISH) Solanum integrifolium + Solanum Conteo de cromosomas Tamura et al. (2002) violaceum Molecular (RAPD y RFLP) Solanum melongena + Solanum Conteo de cromosomas Borgato et al. (2007) marginatum Molecular (ISSR) Citometría de flujo Morfología (tamaño, forma y color de hojas, forma de flores y frutos) Solanum melongena + Solanum Conteo de cromosomas Collonnier et al. (2003) sisymbrifolium Isoenzimas (malato deshidroge nasas e isocitrato deshidrogenasas) Molecular (RAPD, GISH) Morfología de hoja y flor Solanum nigrum + S olanum Szczerbakowa et al. Citometría de flujo tuberosum (2003) Molecular (RAPD) Solanum pinnatisectum + Solanum Citometría de flujo Greplová et al. (2008) tuberosum Molecular (RAPD) Morfología (tipo y densidad de tricomas) Solanum tub erosum + Solanum Citometría de flujo Horsman et al. (1997) americanum Conteo de cromosomas (48 + 72) Isoenzimas (6-fosfogluconato d eshidrogenasas) 84 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Fish et al. (1987) Pehu et al. (1989) Morfo logía (crecimiento, tipo de hoja) Fehér et al. (1992) Complementación (resistencia a Erwinia + normal); Solanum tuberosum + Solanum Williams et al. (1993) (rayos X + resistencia a kanamicina) brevidens Rokka et al. ( 1994) Conteo de cro mosomas (48 + 24) McGrath et al. (1994, Molecular (RAPD, RFLP) 1996) Polgar et al. (1999) Morfo logía (tipo y densidad de tricomas) Solanum tuberosum + Solanum Citometría de flujo Horsman et al. (1997) chenopodioides Conteo de cro mosomas (48 + 24) Isoenzimas (6-fosfogluconato deshidrogenasas) Morfo logía (crecimiento, tipo y color de hoja) Solanum tuberosum + Solanum Citometría de flujo Cardi et al. (1993) commersonii Conteo de cro mosomas Bastia et al. (2000) Molecular (RAPD) Solanum tuberosum + Solanum Conteo de cro mosomas (48 + 48) Dong et al. (1999) etuberosum Moleculares (RFLP, GISH) Morfo logía (crecimiento, tipo y color de hoja) Citometría de flujo Solanum tuberosum + Solanum tarnii Thie me et al. (2008) Conteo de cro mosomas (48 + 24) Molecular (AFLP, SSR) Morfo logía (tipo y densidad de tricomas) Solanum tuberosum + Solanum Citometría de flujo Horsman et al. (1997) nigrum Conteo de cro mosomas (48 + 72) Isoenzimas (6-fosfogluconato deshidrogenasas) Solanum tuberosum + Solanum Molecular (RAPD) Takemori et al. (1994) tuberosum Morfo logía (tipo y densidad de tricomas) Solanum tuberosum + Solanum Citometría de flujo Horsman et al. (1997) villosum Conteo de cro mosomas (48 + 48) Isoenzimas (6-fosfogluconato deshidrogenasas) Tanacetum vulgare + Tanacetum Citometría de flujo Keskitalo et al. (1999) cinerariifolium Moleculares (RAPD) Thlaspi caerulescens + Brassica Complementación (tolerancia a zinc + normal) Brewer et al. (1999) napus Molecular (AFLP) Morfo logía (tipo de hoja y flor) Trachystoma balli i + Brassica juncea Conteo de cro mosomas (16 + 36) Kirti et al. (1992b) Molecular (RFLP) Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 85 Tabla 1. Híbridos somáticos simétricos o asimétricos identificados mediante diferentes métodos de selección. Continuación... Híbrido somático Método de selección Referencia Morfología (tipo de hoja, ta llo e inflorescencia) Complementación (normal + UV) Triticum aestivum + Agropyron Conteo de cromosomas (21-29 + 58-64) Cheng et al. (2004) elongatum Isoenzimas (esterasas, peroxidasas) Molecular (RAPD, RFLP) Conteo de cromosomas Triticum aestivum + Haynaldia villosa Isoenzimas (esterasas, shikimato deshidrogenasas) Zhou y Xia (2005) Molecular (GISH, RFLP) Conteo de cromosomas Triticum aestivum + Lolium Isoenzimas (esterasas y peroxidasas) Ge et al. (2006) mult iflorum Molecular (RFLP y AFLP) Conteo de cromosomas (27 + 27) Triticum aestivum + Psathyrostachys Isoenzimas (peroxidasas) Li et al. (2004) juncea Molecular (RAPD, GISH, SSR) Citología Isoenzimas (esterasas, peroxidasas y malato Triticum aestivum + Setaria italica deshidrogenadas) Xiang et al. (2004) Molecular (RAPD, secuencia de l espaciador del ADNr 5S, GISH) Complementación (incomp atibilidad con el medio + albino) Triticum aestivum + Zea mays Göntér et al. (2002) Citometría de flujo (bromur o de etidio + normal) Molecular (RAPD, GISH) Manual (c lorofila + incoloros) Vicia hajastana + Glycine max Kao y Michayluk (1974) Morfología (crecimiento, tipo de hoja) Manual (c lorofila + incoloros) Vicia hajastana + Pisum sativum Kao y Michayluk (1974) Morfología (crecimiento, tipo de hoja) Manual (c lorofila + incoloros) Zea mays + Glycine max Kao et al. (1974) Morfología (crecimiento, tipo de hoja) CONSIDERACIONES FINALES hibridación somática, además de aumentar la eficiencia de fusión, es disponer de métodos de Los programas de mejoramiento genético detección que permitan una selección y convencionales se limitan al intercambio genético caracterización rápida y eficiente de los híbridos entre especies sexualmente compatibles. Mediante somáticos simétricos o asimétricos (Cocking, 1979). la fusión de protoplastos, la información genética Mediante mejoras en los procesos de identificación puede intercambiarse sobrepasando las barreras de será posible incrementar la frecuencia de éxito. incompatibilidad naturales. Diferentes trabajos han demostrado que los porcentajes de formación y REFERENCIAS regeneración de híbridos somáticos son bajos (Cocking 1979; Blackhall et al., 1994; Lindsay et al., Afonso, CL, Harkins KR, Thomas-Compton MA, Krejci AE, 1995). El principal reto para mejorar las técnicas de Galbraith DW (1985) Selection of somatic hybrid plants in 86 Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2, 2009 Nicotiana through fluorescence-activated sorting of Cai, Y, Xiang F, Zhi D, Liu H, Xia G (2007) Genotyping of somatic protoplasts. Bio/Technology 3: 811-816 hybrids between Festuca arundinacea Schreb. and Triticum aestivum L. 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