UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 

SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO 

 

 

 

 

 

ANÁLISIS MOLECULAR Y CELULAR DE LA CAPACIDAD DE 

REGENERACIÓN DEL COMPLEJO DENTINO-PULPAR 

 

 

 

 

 

Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de 

Estudios de Posgrado en Doctorado en Ciencias para optar al grado y 

título de Doctorado Académico en Ciencias 

 

 

 

 

CRISTINA M. RETANA LOBO 

 

 

 

 

 

 

 

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 

 

2022



ii 

 

DEDICATORIA 

 

 

A mi familia.  

Siempre incondicional, siempre creyendo en mi e impulsándome a seguir.   

Cada uno llenándome… 

Mi mamá. Sensatez y bondad. 

Mi papá. Entrega absoluta y humildad. 

Tati. Compañía e inspiración.  

Artu. Valentía y alegría. 

Diana. Perseverancia y apoyo. 

 

 

 

 

 

 

 

 

Cada sueño por alcanzar además de su valor real, se queda en el alma por lo que implica 

llegar hasta él. Hoy puedo decir que el camino ha valido la pena por las personas con 

quienes se comparte. GRACIAS. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

iii 

 

AGRADECIMIENTOS 

 

A mi directora de tesis, la Dra. Jessie Reyes Carmona. Por acompañarme, guiarme y 

enseñarme durante la realización de este programa de doctorado. Por inspirarme desde 

siempre a ver más allá de la odontología clínica y por ser mi mentora en este mundo de 

la investigación. Mi agradecimiento más sincero por su apoyo y por aventurarse 

conmigo a investigar desde LICIFO para publicar al más alto nivel. 

 

Al Dr. Carlos Filloy Esna, decano de la Facultad de Odontología. Por brindarme su 

apoyo y motivación para realizar desde nuestra facultad esta investigación. Por la 

apertura y disposición para generar espacios en nuestra facultad, en los cuales se 

promueve la producción científica que además, es competitiva a nivel mundial. 

 

A mis asesores, Dra. Cecilia Díaz Oreiro y Dr. Fabián Murillo Gómez. Por su apoyo y 

disposición a colaborar en este proyecto de investigación.  

 

Al Dr. Mario Tanomaru Filio. Por su acompañamiento y valiosa colaboración en las 

publicaciones que, desde su experiencia como uno de los mas grandes investigadores en 

el área, enriqueció nuestro trabajo. 

 

A los diferentes investigadores de la Universidad de Costa Rica que me abrieron las 

puertas de sus laboratorios e hicieron accesibles sus equipos para realizar diferentes 

experimentos. En la Facultad de Microbiología, al Dr. Norman Rojas que, en los inicios 

de este proyecto, puso a disposición los laboratorios y recursos para trabajar. En el 

Instituto Clodomiro Picado, especialmente al Dr. José María Gutiérrez por su apoyo 

incondicional y motivación a nuestro equipo de trabajo, al Dr. Bruno Lomonte que, con 

paciencia y dedicación me enseñó diferentes técnicas, a la Dra. Alexandra Rucavado 

por su entrega y colaboración para aprender a desarrollar la técnica de zimografía. En 

el Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, a la MSc. Sandra Silva que 

amablemente siempre estuvo anuente a colaborar y me brindó un espacio para realizar 

parte de la extracción proteica. De estos grandes investigadores aprendí más allá de lo 



 

 

iv 

 

académico, que el conocimiento se comparte con humildad, que se avanza más y mejor 

cuando se hace en colaboración y que los espacios y oportunidades son para todos. 

Gracias. 

  

A la vicerrectoría de Investigación por el apoyo económico brindado. Por la asignación 

del Fondo de Apoyo a Proyectos de Tesis de Posgrado. 

 

A la Dra. Claudia Dávila Pérez, al Dr. Fernando Torres Méndez y a la Dra. Norma 

Verónica Zavala. Por el apoyo que siempre me han brindado, por abrirme las puertas de 

sus laboratorios en la UASLP y hacerme sentir como en casa.  

 

A todas las personas que, desde sus espacios, colaboraron conmigo en este proyecto. 

Hoy es posible culminar esta etapa académica gracias a los pequeños detalles que en 

sumatoria me ayudaron a llegar hasta aquí. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

v 

 

“Esta Tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en 

Doctorado en Ciencias de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para 

optar al grado y título de Doctorado Académico en Ciencias” 

 

 

 

____________________________________________ 

Dr. José María Gutiérrez Gutiérrez 

Representante de la Decana 

Sistema de Estudios de Posgrado 

 

 

 

 

____________________________________________ 

Dra. Jessie Reyes Carmona 

Directora de Tesis 

 

 

 

____________________________________________ 

Dra. Cecilia Díaz Oreiro 

Asesora 

 

 

 

____________________________________________ 

 Dr. Fabián Murillo Gómez  
Asesor 

 

 

 

____________________________________________ 

Dra. Cristina Barboza Solís 

Representante 

Programa de Posgrado en Doctorado en Ciencias 

 

 

 

 

____________________________________________ 

Cristina M. Retana Lobo 

Sustentante 

 



 

 

vi 

 

 

TABLA DE CONTENIDOS 

 

Portada          i 

Dedicatoria          ii 

Agradecimientos         iii 

Hoja de aprobación         v 

Tabla de contenidos         vi 

Resumen          viii 

Lista de figuras         ix  

Abreviaturas          x 

Referencias bibliográficas de las publicaciones     xi 

Licencia de publicación        xii 

I. Introducción         1 

 Endodoncia Regenerativa       2 

 Regeneración del tejido pulpar      3 

 Remineralización de la dentina      5 

 Composición de la matriz dentinaria      7 

 Materiales endodónticos bioactivos      8 

II. Hipótesis y objetivos        13 

III. Prólogo          14 

IV. Desarrollo de la investigación       15  

Capítulo 1          15 

1. Identificación de proteínas específicas en las diferentes  

etapas del desarrollo del órgano dental     15 

2. Publicaciones          18 

Capítulo 2          19 

1. Análisis de la dentina radicular remanente     19 

2. Publicaciones          22 

3. Resultados presentados en eventos científicos    22 

Capítulo 3          23 



 

 

vii 

 

1. Proceso de biomineralización de la dentina radicular   23 

2. Interacción de materiales endodónticos bioactivos con  

la dentina radicular        25 

3. Publicaciones         28 

4. Resultados presentados en eventos científicos    28 

V. Discusión general         29 

VI. Conclusión general        37 

VII. Bibliografía         38 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

viii 

 

 

RESUMEN 

Actualmente uno de los principales enfoques de las ciencias de la salud se orienta al 

desarrollo de estrategias y protocolos clínicos para la regeneración de tejidos. La 

emergente evidencia al respecto de las terapias basadas en principios biológicos, ha 

promovido la investigación traslacional en el campo de ciencias orales.  

Durante la regeneración del complejo dentino-pulpar, la interacción entre moléculas de 

señalización, biomateriales y el microambiente dirige el proceso de ingeniería de   tejidos. 

En esta investigación se busca elucidar si los componentes del sistema dentino-pulpar 

inducen la señalización para la regeneración de dentina mineralizada desde un enfoque 

acelular.  Así, el objetivo de este proyecto es evaluar la expresión proteica y la 

señalización molecular durante el proceso de regeneración del complejo dentino-pulpar.  

La estrategia metodológica dividida en tres etapas fue orientada a la comprensión de los 

procesos biológicos como puntos clave para su posterior aplicación clínica. En la primera 

etapa de la investigación, se identificaron proteínas específicas relacionadas con los 

procesos de diferenciación/proliferación, angiogénesis y neurogénesis, en relación con el 

proceso de formación del órgano dental. En la segunda etapa de este trabajo, se evaluó la 

presencia y localización de proteínas no colágenas y de proteasas en la dentina y posterior a 

diversos tratamientos endodónticos, con la finalidad de conocer el estado de la dentina en la 

cual se llevan a cabo los procesos regenerativos. Por último, en la tercera etapa se desarrolló 

y aplicó un modelo experimental de remineralización biomimética para entender la 

relación funcional entre proteínas no colágenas, biomineralización y  dentinogénesis. 

Además, se observó la interacción de materiales bioactivos de uso en endodoncia con la 

dentina radicular.  Para esto se utilizaron diversas técnicas como inmunohistoquímica, 

histología, determinación de pH, liberación de iones Ca, zimografía, MEB, EDAX, 

Raman, microdureza y resistencia adhesiva. 

 

 

 

 

 

 



 

 

ix 

 

 

LISTA DE FIGURAS 

 

 

 

Figura 1. Estadios de formación radicular Moorrees modificada   17 

Figura 2. Modelo experimental de mineralización biomimética   24 

Figura 3. Prueba de resistencia adhesiva      27 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

x 

 

 

 

ABREVIATURAS  

 

MEC    Matriz extracelular 

PNCs    Proteínas no colágenas 

DSPP    Sialofosfoproteina de la dentina 

DMP-1   Fosfoproteína ácida de matriz de dentina 1 

MMPs    Metaloproteinasas de matriz 

VEH    Vaina epitelial de Hertwig 

NaOCl    Hipoclorito de Sodio 

CHX    Clorhexidina 

EDTA    Ácido etilendiaminotetraacético 

MEB    Microscopia electrónica de barrido  

EDAX    Análisis de fluorescencia de rayos X por energía dispersiva  

PBS    Tampón fosfato salino/ Fluido tisular sintético 

MTA    Mineral trióxido agregado 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

xi 

 

 

 

Referencias bibliográficas de las publicaciones en las que se fundamenta el trabajo doctoral: 

• Retana-Lobo C, Guerreiro-Tanomaru JM, Tanomaru-Filho M, Mendes de Souza 

BD, Reyes-Carmona J. Sodium Hypochlorite and Chlorhexidine Downregulate MMP 

Expression on Radicular Dentin. Med Princ Pract. 2021;30(5):470-476. doi: 

10.1159/000517887. 

• Retana-Lobo C, Ramírez-Mora T, Murillo-Gómez F, Maria Guerreiro-Tanomaru J, 

Tanomaru-Filho M, Reyes-Carmona J. Final irrigation protocols affect radicular 

dentin DMP1-CT expression, microhardness, and biochemical composition. Clin 

Oral Investig. 2022. doi: 10.1007/s00784-022-04516-8.   

• Retana-Lobo C, Guerreiro-Tanomaru JM, Tanomaru-Filho M, Mendes de Souza 

BD, Reyes-Carmona J. Non-Collagenous Dentin Protein Binding Sites Control 

Mineral Formation during the Biomineralisation Process in Radicular Dentin. 

Materials (Basel). 2020 27;13(5):1053. doi: 10.3390/ma13051053.  

• Retana-Lobo C, Tanomaru-Filho M, Guerreiro-Tanomaru JM, Benavides-García M, 

Hernández-Meza E, Reyes-Carmona J. Push-Out Bond Strength, Characterization, 

and Ion Release of Premixed and Powder-Liquid Bioceramic Sealers with or without 

Gutta-Percha. Scanning. 2021 6;2021:6617930. doi: 10.1155/2021/6617930.  

Publicaciones adicionales: 

• Retana-Lobo C. (2017). Dental Pulp Regeneration: Insights from Biological 

Processes. Odovtos - International Journal of Dental Sciences, 20(1), 10-16. doi: 

http://dx.doi.org/10.15517/ijds.v0i0.31269 

• Retana-Lobo C. Reyes-Carmona J. Immunohistochemical characterization of stem 

cell, vascular, neural and differentiation markers within the apical papilla and dental 

pulp of human teeth at different stages of root development.  

Enviado a la revista Journal of Histotechnology, se recibieron observaciones de los revisores 

y la segunda versión fue sometida a revisión. 



 

 

 

 
 

 

 
 
 

Autorización para digitalización y comunicación pública de Trabajos Finales de Graduación del Sistema de 

Estudios de Posgrado en el Repositorio Institucional de la Universidad de Costa Rica. 

Yo, _______________________________________, con cédula de identidad _____________________, en mi 

condición de autor del TFG titulado ___________________________________________________ 

_____________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________ 

Autorizo a la Universidad de Costa Rica para digitalizar y hacer divulgación pública de forma gratuita de dicho TFG  

a través del Repositorio Institucional u otro medio electrónico, para ser puesto a disposición del público según lo que 

establezca el Sistema de Estudios de Posgrado.  SI           NO *     

*En caso de la negativa favor indicar el tiempo de restricción: ________________  año (s). 

Este Trabajo Final  de Graduación será publicado en formato PDF, o en el formato que en el momento se establezca, 

de tal forma que el acceso al mismo sea libre, con el fin de permitir la consulta e impresión, pero no su modificación. 

Manifiesto que mi Trabajo Final de Graduación fue debidamente subido al sistema digital Kerwá y su contenido 

corresponde al documento original que sirvió para la obtención de mi título, y que su información no infringe ni 

violenta ningún derecho a terceros. El TFG además cuenta con el visto bueno de mi Director (a) de Tesis o Tutor (a) 

y cumplió con lo establecido en la revisión del Formato por parte del Sistema de Estudios de Posgrado.  

FIRMA ESTUDIANTE 

Nota: El presente documento constituye una declaración jurada, cuyos alcances aseguran a la Universidad, que su contenido sea tomado como cierto. Su 

importancia radica en que permite abreviar procedimientos administrativos, y al mismo tiempo genera una responsabilidad legal para que quien declare 

contrario a la verdad de lo que manifiesta, puede como consecuencia, enfrentar un proceso penal por delito de perjurio, tipificado en el artículo 318 de nuestro 
Código Penal. Lo anterior implica que el estudiante se vea forzado a realizar su mayor esfuerzo para que no sólo incluya información veraz en la Licencia de 

Publicación, sino que también realice diligentemente la gestión de subir el documento correcto en la plataforma digital Kerwá.   

 

https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad
https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio


1 

 

I. INTRODUCCIÓN 

Antecedentes 

Uno de los principales enfoques de las ciencias de la salud en el siglo XXI ha sido el 

desarrollo de estrategias y protocolos clínicos dirigidos a la regeneración de tejidos (1), en 

consecuencia, aparece la medicina regenerativa, la cual plantea a través de diferentes terapias 

la posibilidad de remplazar o restaurar aquellos tejidos que se han perdido a causa de una 

enfermedad, trauma o enfermedades congénitas (2). La medicina regenerativa podría 

definirse como la combinación de células, ingeniería de materiales y los factores 

bioquímicos adecuados para reparar o reemplazar funciones biológicas en órganos y tejidos 

(3). De forma paralela, se basa en la ingeniería de tejidos como ciencia interdisciplinaria, 

aplica los principios biológicos para reparar o remplazar tejidos y órganos dañados por 

diversos factores (2,4).  

Actualmente, una importante área de la investigación en ciencias odontológicas, se enfoca 

en el desarrollo de nuevos protocolos que incorporen la ingeniería de tejidos para solventar 

las diferentes necesidades terapéuticas. Surge la posibilidad de resolver los diferentes 

problemas dentales a través de la regeneración o reemplazo de los tejidos orales que han sido 

afectados por trauma, desordenes hereditarios, enfermedades infecciosas y neoplásicas (3). 

De esta manera, el concepto tradicional restaurador ha ido cambiando de manera muy 

prometedora, hacia un abordaje orientado a alcanzar la regeneración/remineralización de 

tejidos dañados o perdidos en la cavidad oral (4–7).   

La caries dental constituye un problema de salud mundial, las investigaciones actuales 

muestran que alrededor de un 90% de los adultos han presentado caries en algún momento 

de sus vidas(8). Esta enfermedad multifactorial, resulta en la pérdida de las estructuras 

dentales (esmalte y dentina) conforme avanza la invasión bacteriana a través de las mismas. 

La lesión cariosa no tratada, progresa hasta alcanzar y dañar de manera irreversible el tejido 

pulpar ocasionando procesos de necrosis y periodontitis apical. Por lo tanto, la caries es la 



2 

 

razón más frecuente por la cual se debe realizar el tratamiento endodóntico. La consecuencia 

final de la enfermedad en casos muy avanzados es la pérdida de la pieza dental (8,9). 

El tratamiento endodóntico convencional o tratamiento de conductos radiculares, tiene como 

objetivo biológico la prevención y tratamiento de la periodontitis apical (10). La finalidad 

clínica de esta intervención es preservar las piezas dentales mediante la desinfección, 

conformación del sistema de conductos radiculares y la obturación de los mismos con un 

material biológicamente inerte (10). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos por preservar la 

mayor cantidad de estructura dental remanente, la evidencia científica ha demostrado que 

posterior al tratamiento la pieza dental se debilita, no recupera su función biológica y se 

vuelve más susceptible a la fractura, especialmente cuando se trata de piezas dentales con 

rizogénesis incompleta que han sufrido algún tipo de trauma o infección (11–13).   

Endodoncia regenerativa 

A partir de esta problemática, los principios de medicina regenerativa pueden ser aplicados 

en el campo de la endodoncia a través de la ingeniería de tejidos (3). De esta manera, surge 

la endodoncia regenerativa, que busca emplear procedimientos diseñados biológicamente 

para reestablecer las estructuras dentales perdidas tales como la dentina, la pulpa (7,11,14), 

mediante protocolos que promuevan la dentinogénesis, la remineralización y el 

mantenimiento/recuperación de la vitalidad del tejido pulpar (4,5).    

Los procedimientos regenerativos endodónticos tienen como objetivo la regeneración del 

complejo dentino-pulpar, regenerar dentina coronal dañada por caries y regenerar dentina 

radicular en procesos de reabsorción (3). El tratamiento regenerativo ideal, debe evitar o 

solventar la periodontitis apical y mantener o reestablecer la función biológica del tejido, de 

manera que la pieza dental se mantenga funcional a largo plazo (15). 

Es importante destacar que los procedimientos regenerativos implican la formación de 

tejidos que sean estructural y fisiológicamente similares a los tejidos naturales (16).  Por lo 

tanto, el entendimiento de su composición biológica y la interrelación altamente específica 



3 

 

que existe durante su formación y mantenimiento, son la base sobre la cual se orientan 

diversas líneas de investigación actual (17).  

Ante este panorama surge la necesidad de establecer un tratamiento que permita la 

regeneración del tejido pulpar vital e idealmente la formación de tejido mineralizado que 

provea de un selle adecuado. La combinación ideal de señales para formar todos los 

componentes celulares de una pulpa completamente funcional es aún desconocida (10,18). 

Por lo tanto, la ingeniería tisular aplicada en endodoncia se posiciona como una herramienta 

prometedora para alcanzar la regeneración en un futuro cercano. 

Regeneración del tejido pulpar 

Una gran parte de la investigación dentro de la ingeniería de tejidos en endodoncia, está 

orientada a la regeneración del tejido pulpar. Existen tres componentes claves aplicables 

para la regeneración pulpar: células indiferenciadas de origen dental, proteínas para la 

señalización molecular y andamios que soporten y provean de un espacio para la 

proliferación, diferenciación y desarrollo del tejido (14).  

Señalización molecular 

Desde las primeras etapas del desarrollo de las piezas dentales, los procesos fisiológicos de 

formación son dirigidos por múltiples interacciones dentro de los tejidos regulados por 

moléculas de señalización. Estas moléculas son proteínas que guían y estimulan la 

diferenciación celular, la síntesis y secreción de tejidos mineralizados (3,14). A través de la 

unión específica con receptores en la membrana celular, se da la inducción de una serie de 

procesos reguladores de las funciones vitales como la división y proliferación celular, 

señalización y síntesis de matriz (18). Estas proteínas son clasificadas de acuerdo a su 

función y pueden permanecer en los tejidos de manera inactiva, Tomson y cols. (19) 

demostraron que en la dentina se encuentran inmersos factores de crecimiento que se liberan 

cuando la dentina es solubilizada, y esta interacción puede regular procesos de reparación y 

regeneración. Por otra parte, Golberg y cols. (20) indican que algunas moléculas dentro de 

la matriz extracelular podrían actuar como agentes bioactivos en la ingeniería de tejidos o 



4 

 

en procesos de reparación pulpar. En la literatura está claro que las proteínas no colágenas 

(PNCs) presentes en la matriz extracelular tienen un papel esencial en los procesos de 

biomineralización, sin embargo, aún no se comprenden por completo los procesos de 

señalización requeridos para formar todos los componentes celulares de una pieza dental. 

Células indiferenciadas 

Las células indiferenciadas se definen como células que tienen la habilidad de dividirse 

continuamente y diferenciarse en otro tipo de células o tejidos especializados. Estas se 

clasifican en embrionales (totipotentes) y postnatales (multipotentes), estas últimas 

utilizadas como una fuente alternativa para aplicaciones clínicas ya que pueden ser 

encontradas en algunos tejidos a lo largo de la vida (3). 

En cavidad oral, las células madre o indiferenciadas se pueden encontrar en varios tejidos. 

Grontos y cols. (21) las obtuvieron del tejido pulpar en terceros molares (DPSCs, por sus 

siglas en inglés dental pulp stem cells). Miura y cols. (22) identificaron estas células en 

piezas deciduas exfoliadas (SHEDs, por sus siglas en inglés stem cells from human exfoliated 

deciduous teeth). Además, se han encontrado en la papila apical (SCAPs, por sus siglas en 

inglés stem cells from the apical papilla)(23) y en el ligamento periodontal (PDLSCs, por 

sus siglas en inglés periodontal ligament stem cells) (24). La presencia de estas células 

especialmente las DPSCs, se ha relacionado con procesos de reparación y sanado en el tejido 

pulpar debido a su capacidad de diferenciación en el linaje odontoblástico. Con base en esta 

premisa, la posibilidad de utilizar estas células en estrategias regenerativas es promisoria, ya 

sea través de su reclutamiento, implantación y diferenciación, de manera que el potencial 

inherente del tejido asociado con mecanismos de reparación sea aprovechado (18). 

Andamios 

Los componentes previamente descritos, se deben interrelacionar entre sí dentro de un 

microambiente óptimo, que permita la adhesión celular, la diferenciación y la proliferación 

guiada por las moléculas de señalización (25). 



5 

 

Este microambiente debe permitir la difusión de nutrientes y oxígeno de manera que se 

pueda desarrollar un tejido funcional que asemeje el tejido pulpar natural. Con esta finalidad 

se han diseñado diferentes tipos y modelos de andamios, por ejemplo, polímeros moldeados 

degradables y flexibles, polímeros rígidos, hidrogeles inyectables, etc., funcionalizados para 

mejorar las condiciones dentro del conducto radicular, espacio en el que se pretende 

regenerar el tejido pulpar (25).  

De esta manera, el andamiaje ideal debería llevar a la formación de un tejido conectivo en 

el espacio pulpar que permita el desarrollo de vasos sanguíneos y estructuras neuronales 

desde el foramen apical (14).  

Se desarrollan dos tipos de abordaje, el abordaje celular o basado en células que incluye la 

aplicación in vivo de células madre e inductores bioquímicos implantados en andamiajes 

diseñados para la proliferación tisular; y el abordaje libre de células que propone que las 

células madre y componentes necesarios están presentes en el hospedador y pueden ser 

aprovechados a través de quimiotaxis y procesos biológicos de inducción (14,26). 

La mayoría de las investigaciones se han centrado en el desarrollo de tejido pulpar a partir 

de la ingeniería de tejidos que incluya el uso de células indiferenciadas "adecuadas", 

descifrar la combinación de moléculas de señalización ideal y el apropiado diseño de 

andamiajes (7,11,14,27). No obstante, analizando los datos de la evidencia científica actual, 

la dentina como microambiente donde se realizan los procedimientos regenerativos tiene 

una función primordial y en muchas ocasiones no ha sido considerada de manera importante. 

Específicamente, la interacción molecular y fisicoquímica que se da con la matriz dentinaria 

es fundamental para lograr la regeneración de un tejido organizado y funcional (4,11).  

Remineralización de la dentina 

La remineralización del tejido dentinario es el objetivo de otra importante vertiente de la 

investigación en endodoncia regenerativa. Dentro del complejo dentino-pulpar, la 

regeneración del tejido mineralizado, por su naturaleza, plantea distintos desafíos en 

Cristina
Resaltado



6 

 

comparación con la regeneración del tejido blando, por lo tanto, los esfuerzos se dirigen 

hacia la remineralización del tejido mineral perdido. 

Los procesos de desmineralización y remineralización coexisten en la dentina a lo largo de 

la vida, sin embargo, en condiciones patológicas cuando la producción de ácidos por parte 

de las bacterias sobrepasa la deposición de minerales provenientes de la saliva y fluido oral, 

se genera la destrucción tisular (28,29). Conforme avanza la lesión cariosa dentro de la 

dentina, al perderse el componente mineral que actúa como protector de la matriz, se 

desencadena la degradación del componente colágeno afectando las propiedades mecánicas 

del tejido (29).  

Además de la caries, los protocolos que se emplean para lograr la adhesión de la resina a la 

dentina implican la desmineralización del tejido. Con el uso de ácidos o monómeros acídicos 

de resina provenientes de los materiales de autograbado, se busca la exposición de las fibras 

colágenas para alcanzar una retención micromecánica y lograr la mayor penetración de los 

materiales restauradores en la estructura dentinaria (29). Sin embargo, diferentes factores 

como la presencia de enzimas, la temperatura, el estrés funcional, posibles regiones con 

infiltración de resina incompleta en la capa híbrida, hacen que esta unión sea susceptible a 

la degradación comprometiendo la adhesión de la resina con la dentina. Por lo tanto, la 

remineralización de la dentina desmineralizada presenta importantes implicaciones en la 

estabilidad de la adhesión e incluso en el control de la caries (29). 

Actualmente, en la literatura se encuentran diversas estrategias para lograr la 

remineralización de la dentina coronal a través de diferentes mecanismos, por ejemplo, 

algunas se basan en la incorporación de compuestos bioactivos a las resinas y adhesivos 

(28), sin embargo, muchas de estas estrategias son desarrolladas en modelos in vitro e 

implican metodologías complicadas que distan mucho del escenario clínico al cual se 

necesitan aplicar (30,31). 

La dentina radicular por su parte, puede estar expuesta a diversos factores que causen 

desmineralización en su estructura como la exposición a caries, la erosión debido a diferentes 



7 

 

materiales o soluciones de uso endodóntico, necrosis pulpar y los productos que se generan 

de la infección del sistema de conductos radiculares e incluso condiciones patológicas 

periodontales. El uso de irrigantes comúnmente utilizados para el tratamiento de conductos 

radiculares, ha demostrado tener efectos colaterales en la composición e integridad de la 

matriz dentinaria (32–35). Además, es importante mencionar que la composición de la 

dentina coronal y la dentina radicular difiere en algunas características estructurales, en sus 

componentes e incluso el ambiente en el que están inmersas (36,37), por lo tanto, es posible 

que los avances en la investigación de la remineralización en dentina coronal no sean del 

todo extrapolables a la dentina radicular. Aunado a esto, actualmente no hay reportes 

publicados que analicen el proceso de remineralización en dentina radicular, lo cual deja un 

vacío importante en la literatura con información que podría ser determinante para los 

procesos regenerativos.   

Por otra parte, se ha observado que la remineralización no ocurre si no hay sitios específicos 

de nucleación que guíen la deposición de cristales y estimulen el proceso de mineralización. 

Estos sitios se han asociado con moléculas de señalización reguladoras de los procesos 

naturales de biomineralización, inmersas dentro de los componentes de la matriz dentinaria 

(29).  

Composición de la matriz dentinaria 

La dentina es un tejido mineralizado que está compuesto en un 70% por apatita carbonatada 

(componente inorgánico), 20% de matriz orgánica extracelular (MEC) y 10% de agua (38). 

Durante su formación, los odontoblastos sintetizan una matriz extracelular no-mineralizada 

compuesta por colágeno (principalmente colágeno tipo I) y proteínas no colágenas (PNCs) 

(39–41).  El colágeno se ensambla en fibrillas y estas forman un andamio que actúa como 

base para la deposición mineral durante el proceso de biomineralización (42–44). La 

formación de la fase mineral envuelve una serie de eventos de inducción y señalización 

que guían la deposición de cristales a lo largo de la matriz colágena. Se ha observado que 

las PNCs, por su composición acídica, inician y modulan la mineralización de las fibras 

colágenas a través de la atracción de los iones calcio (40,41,45,46). 



8 

 

Proteínas no colágenas (PNCs) 

La MEC es un reservorio de moléculas bioactivas secuestradas en la dentina durante la 

dentinogénesis (47,48). Estas moléculas pueden ser expuestas/liberadas en condiciones 

específicas por ejemplo en lesiones cariosas debido a los ácidos producidos por las bacterias 

o en tratamientos restaurativos debido al efecto de diferentes materiales dentales (33). De la 

misma manera, pueden exponerse mediante un proceso de desmineralización controlado que 

permite la generación de moléculas de señalización activas a partir de la escisión de proteínas 

estructurales inmersas en la matriz (19,49). 

Dentro de las principales PNCs se encuentran proteínas pertenecientes a la familia 

SIBLING (por sus siglas en inglés: small integrin‐binding ligand, N‐linked glycoprotein), 

que incluyen la sialofosfoproteina de la dentina (DSPP), fosfoproteína ácida de matriz de 

dentina 1 (DMP-1), sialoproteína ósea, osteopontina y la fosfoglicoproteína extracelular 

matricial. Estas proteínas actúan como promotores o inhibidores de la nucleación de 

cristales en el proceso de mineralización de dentina y hueso, ya que comparten una serie 

de características como la presencia de fosforilación, glicosilación y secuencias de unión 

(50–52). Además, dentro de las PNCs se encuentran diferentes proteasas como las 

metaloproteinasas de matriz (MMPs) que están envueltas en procesos de desarrollo 

fisiológico, remodelación tisular y procesos patológicos (53). Sin embargo, a pesar de que 

estas proteínas han sido estudiadas en diversas investigaciones, el papel que desempeñan 

durante el proceso de biomineralización y su potencial aprovechamiento en 

procedimientos clínicos que tengan como objetivo la regeneración del tejido, sigue siendo 

tema de estudio.  

Materiales endodónticos bioactivos 

La reciente introducción de materiales bioactivos ha representado una gran evolución en el 

desarrollo de la odontología regenerativa (54).  La bioactividad de un material está 

determinada por la habilidad de interaccionar con el tejido en el cual es colocado y permitir 



9 

 

su integración al desencadenar una serie de reacciones en la interface que resultan en la 

formación de una capa de apatita carbonatada (55).  

Los materiales endodónticos bioactivos surgen a partir del mineral trióxido agregado 

(MTA), el cual fue desarrollado en 1993 por Mahmoud Torabinejad en la Universidad de 

Loma Linda, California, como un material de obturación apical a base de cemento Portland 

con óxido de bismuto como radiopacificador (56). Las propiedades físicas y biológicas de 

este material han sido ampliamente estudiadas y muestran resultados favorables cuando se 

utiliza para sellar comunicaciones entre la cavidad pulpar y el periodonto (57,58). Por lo 

tanto, se han derivado diferentes formulaciones que incorporan las excelentes propiedades 

del mismo y buscan mejorar algunas de sus características iniciales (decoloración de la pieza, 

difícil manipulación, largo tiempo de fraguado) (57). 

La bioactividad es una propiedad deseable en diferentes materiales dentales, compuestos 

bioactivos han sido incorporados a cementos de uso en el tratamiento endodóntico con el 

fin de estimular la biomineralización, mejorar el selle marginal y aumentar la resistencia a 

la fractura del diente. Los componentes principales de estos materiales bioactivos son los 

silicatos de calcio por lo que también se conocen como cementos a base de silicatos de calcio, 

biocerámicos o cementos hidráulicos (57,59,60). Los cementos a base de silicato de calcio 

se definen como aquellos que están compuestos por di/tri/tetra-silicato de calcio 

principalmente, con un mecanismo básico de endurecimiento después de la hidratación que 

resultan en la formación de una fase mineralizada (61) 

Los materiales bioactivos se pueden dividir de acuerdo a su uso en dos grupos principales:  

Cementos reparadores: Se utilizan básicamente para sellar comunicaciones entre el 

periodonto y el sistema de conductos radiculares, por sus características permiten el selle 

adecuado de estos espacios sin verse afectados negativamente por la presencia de sangre o 

tejido tisular, además de la bioactividad que permite la deposición de tejido mineralizado en 

la interface generando una unión biológica entre el material y la dentina (57). Dentro de las 



10 

 

principales presentaciones comerciales se encuentran el MTA-Angelus, ProRoot MTA 

(Denstply) y el Biodentine de la casa comercial Septodont. 

Cementos selladores: Se han desarrollado diferentes cementos selladores a los cuales se les 

ha incorporado a su composición la fase cristalina más reactiva que es el silicato tricálcico, 

con la finalidad conferirle bioactividad a los cementos usados en el tratamiento de conductos 

radiculares, cuando se utiliza en unión con un material de núcleo como la gutapercha. La 

interacción micromecánica que es inducida por los cementos bioactivos mejora la adhesión 

entre los materiales y la dentina, mejorando también la calidad de la obturación (57,62). Estos 

materiales vienen en distintas presentaciones, por ejemplo, el BioRoot RCS (Septodont) y el 

ProRoot Endo Sealer (Densply) en presentación polvo líquido, Endosequence BC sealer 

(Brassler) premezclado, MTA Fillapex (Angelus) en presentación pasta-pasta, etc.  

Mecanismo de acción 

La bioactividad de estos materiales está relacionada con la habilidad que tienen de producir 

hidroxiapatita al entrar en contacto con el fluido tisular presente en los tejidos circundantes 

(58,63). El mecanismo por el cual se genera y se guía este proceso es ampliamente estudiado, 

tanto desde una perspectiva fisicoquímica como biológica en relación con el tejido. 

Reyes-Carmona y col. demostraron que la interacción de un material bioactivo con la 

dentina, en presencia de fluido tisular, desencadena una serie de reacciones 

fisicoquímicas las cuales a través de la liberación de iones calcio y su interacción con el 

fosfato del medio, se depositan en las fibras colágenas de la dentina y promueven la 

precipitación de apatita carbonatada (64). Esta apatita mediante su interacción con las 

proteínas de la dentina estimula la dentinogénesis en un ambiente ex vivo (58,59,64–68). Sin 

embargo, el mecanismo molecular subyacente a esta compleja interacción aún es 

desconocido. 

Conforme se da la deposición mineral en la estructura, se pueden observar precipitados con 

diferentes formas de acuerdo a su composición, inicialmente se da la formación de una fase 

de fosfato de calcio amorfo, que actúa como precursor de una fase secundaria en la cual se 



11 

 

forma apatita carbonatada. La apatita carbonatada es conocida como apatita biológica y se 

trata de la fase mineral del tejido duro (dentina, cemento, hueso) (45,58,69). 

La deposición continua de precipitados a lo largo del tiempo, permite la formación y 

mantenimiento de una capa que recubre la totalidad de la superficie en la interface dentina-

material, incluso se ha reportado la formación de estructuras que penetran en los túbulos 

dentinarios (58,60,65). 

Este proceso de biomineralización es esta relacionado directamente con las propiedades del 

sustrato. Por lo tanto, es de vital importancia la conservación de la matriz dentinaria cuando 

se intentan lograr procesos de biomineralización, con el fin de mantener esta relación 

funcional entre los componentes biológicos y los materiales a utilizar.  

Actualmente en la literatura, no hay un análisis de la composición proteica que permita 

conocer el estado del microambiente que resulta en el conducto radicular posterior a 

procesos infecciosos y al tratamiento que clínicamente se efectúa para lograr la desinfección 

del mismo. El efecto que tienen los tratamientos endodónticos convencionales muchas veces 

no es considerado en las investigaciones y es posible que la matriz dentinaria y sus moléculas 

de señalización se vean afectadas de forma colateral. Por lo tanto, se podría comprometer el 

éxito de los intentos terapéuticos de regeneración (50,67). 

A pesar de las diferentes presentaciones disponibles de los materiales bioactivos y la gran 

cantidad de información que se encuentra en la literatura científica, los mecanismos de 

acción, el adecuado uso y aplicación de estos materiales y sus propiedades fisicoquímicas 

siguen siendo blanco de numerosas investigaciones. Es imprescindible considerar el sustrato 

(dentina radicular) como parte activa de los protocolos regenerativos, la evaluación de las 

proteínas inmersas en la matriz dentinaria como moléculas de señalización, podría orientar 

los intentos terapéuticos hacia una perspectiva conservadora, concientizando sobre la riqueza 

de la matriz de dentina y su potencial aprovechamiento. 

Hasta el día de hoy, no se encuentran en la literatura investigaciones que analicen el proceso 

de regeneración/remineralización de la dentina radicular. La comprensión de la relación entre 



12 

 

el componente proteico de la dentina y el proceso de remineralización, complementaría de 

manera importante la información sobre el uso de materiales bioactivos y su mecanismo de 

acción, además brindaría bases biológicas para establecer un abordaje clínico basado en 

evidencia. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



13 

 

II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 

 

1. Hipótesis  

Los componentes del complejo dentino-pulpar inducen la señalización para la regeneración 

de dentina mineralizada desde un enfoque acelular. 

 

2. Objetivo general 

Evaluar la expresión proteica y la señalización molecular de la matriz dentinaria durante 

el proceso de regeneración del complejo dentino-pulpar. 

 

3. Objetivos específicos 

3.1 - Describir proteínas específicas relacionadas con procesos de formación de la pieza 

dental en diferentes etapas de desarrollo del órgano dental. 

3.2 - Identificar la presencia y localización de proteínas no colágenas (PNCs) y de proteasas 

posterior a diversos tratamientos de la dentina radicular. 

3.3 - Analizar, por medio de un modelo de mineralización biomimética libre de células, la 

relación funcional entre las PNCs y el proceso de biomineralización. 

3.4 - Evaluar la interacción de materiales bioactivos de uso en endodoncia, con la dentina 

radicular mediante la resistencia adhesiva. 

 

 



14 

 

III. PRÓLOGO 

La presente investigación está dividida en tres capítulos, de los cuales se generan las 

publicaciones relacionadas dentro del marco del programa de Doctorado en Ciencias. 

En el capítulo I, se desarrolla un análisis descriptivo de algunas proteínas específicas 

relacionadas con procesos de formación del órgano dental. De manera que establece un 

panorama general de la composición proteica durante el desarrollo de la pieza dental. 

El capítulo II, se enfoca el estado de la matriz dentinaria posterior al tratamiento 

endodóntico, de manera que permite observar el efecto que tienen los diferentes protocolos 

de irrigación utilizados para la desinfección del conducto radicular en el componente 

proteico de la dentina remanente. 

Por último, en el capítulo III se desarrolla un modelo experimental de mineralización 

biomimética, mediante el cual se analiza la relación funcional de las proteínas inmersas en 

la matriz dentinaria con el proceso de remineralización. Se establece un método de 

regeneración del tejido mineralizado potencialmente aplicable a la realidad clínica. Además, 

se realiza una evaluación de la interacción de algunos materiales bioactivos de uso en 

endodoncia con el tejido dentinario a través de la resistencia adhesiva. 

 

 

 

 

 

 

 



15 

 

IV. DESARROLLO DE LA INVESTIGACIÓN 

CAPITULO 1 

1. Identificación de proteínas específicas en las diferentes etapas del desarrollo del 

órgano dental 

La formación de las piezas dentales inicia con una serie de interacciones reciprocas epitelio-

mesenquimales. Diferentes estructuras interaccionan entre sí a través de complejos 

mecanismos de señalización y dan lugar a los tejidos dentales (10,70,71). La formación de 

la corona, por ejemplo, se da con la diferenciación del epitelio en ameloblastos que 

posteriormente depositan el esmalte y con la diferenciación del mesénquima en los 

odontoblastos encargados de secretar la matriz dentinaria, esta matriz posteriormente se 

mineraliza para formar la dentina que rodea la pulpa dental (10,70,71) 

El desarrollo radicular, por su parte, inicia cuando en la formación de la corona se da la 

elongación de la región apical del órgano del esmalte y da lugar a la vaina epitelial de 

Hertwig (VEH). La VEH guía el proceso de rizogénesis a través de una serie de eventos de 

inducción que estimulan la formación de la dentina radicular (72–74).  

La papila apical es la porción más apical del germen dentario, este tejido se ha descrito como 

una fuente importante de células indiferenciadas relacionadas con el proceso de formación 

de la pieza dental (75). Diferentes estudios han comprobado la presencia de células madre 

en los tejidos dentales, por ejemplo, en la pulpa de piezas permanentes, en dientes deciduos 

exfoliados, en la papila apical y ligamento periodontal (22,75,76). Las células 

indiferenciadas de la papila apical tienen la capacidad de diferenciarse en varios linajes 

celulares (odontogénico, osteogénico, neurogénico, etc.), por lo tanto, tienen un potencial 

terapéutico importante como fuente celular (75). 

El tejido pulpar formado está compuesto por sustancia fundamental, fibras colágenas y 

reticulares y es altamente vascularizado e inervado, además contiene fibroblastos y células 

madre que se relacionan con procesos de formación, reparación y regeneración (10,75). En 



16 

 

su periferia se encuentran los odontoblastos, células secretoras altamente especializadas que 

interactúan con los componentes de la matriz extracelular en complejas vías de señalización 

para formar la dentina (10). 

El desarrollo de estrategias para regeneración de tejidos debe estar basado en el estudio y 

comprensión de los principios biológicos mediante los cuales se desarrolla el tejido dental 

desde sus etapas iniciales. La estabilidad del tejido pulpar regenerado depende directamente 

de la formación de una red vascular apropiada que provea al tejido del oxígeno, nutrientes y 

flujo celular necesario (25). La formación del tejido mineralizado depende a su vez, de la 

disponibilidad de sustratos para la biomineralización que son llevados a través de los vasos 

sanguíneos (25,76).   De la misma manera, la inervación es esencial para regular la función 

de las células implicadas en la formación de tejido de novo, así como por el efecto protector 

que la transmisión de impulsos nerviosos le confiere a la pulpa, lo cual es indispensable en 

los procesos de inflamación y reparación del tejido (25,76).   

Los mecanismos de señalización celular durante el desarrollo de las piezas dentales han sido 

ampliamente estudiados, sin embargo, el comportamiento de los diferentes componentes del 

tejido pulpar, como la presencia de células madre, odontoblastos, componentes vasculares y 

neurales a lo largo de las diferentes etapas de formación en la pulpa y la papila dental no ha 

sido analizado.  

Por lo tanto, en esta etapa de la investigación, a través de técnicas de inmunohistoquímica, 

se identificaron proteínas específicas de procesos de diferenciación/proliferación celular 

(STRO-1), angiogénesis (VEGF-R2) y neurogénesis (Nestin y Neurofilamento polipéptido 

pesado (NFH) por sus siglas en ingles), en piezas con formación radicular incompleta. Para 

la identificación de estas proteínas se seleccionaron piezas dentales extraídas por razones 

ajenas a esta investigación, de la clínica de Exodoncia y Cirugía y donadas por el Banco de 

piezas dentales de la Facultad de Odontología de la Universidad de Costa Rica, y se 

clasificaron de acuerdo a las diferentes etapas de formación radicular (Ri, R1/2 y RC) según 

la clasificación de Moorrees (77). 



17 

 

 

Figura 1. Etapas de formación radicular Moorrees. Etapas seleccionadas marcadas en recuadros. 

Ri: formación radicular inicial, R1/2: longitud de la raíz formada a la mitad de su desarrollo y Rc: 

longitud de la raíz formada por completo. Figura tomada de Moorrees y cols. 1963 (52). 

Estas muestras fueron procesadas mediante técnicas de histología e inmunohistoquímica, 

posteriormente, se tomaron imágenes para ser analizadas con la finalidad de evaluar la 

presencia y localización de estos marcadores en el tejido pulpar y en la papila apical a lo 

largo de las diferentes etapas del desarrollo.  

Los datos obtenidos permitieron obtener un panorama general del desarrollo de la pieza 

dental desde una perspectiva histológica tomando en cuenta tanto el tejido pulpar como la 

papila apical. Hasta la fecha, no se encuentra en la literatura un mapeo de la 

inmunolocalización de estas proteínas que se relacionan con estructuras y células 

funcionales. Por lo que este trabajo representa un primer intento para comprender la 

composición biológica de los tejidos dentales. Además, de manera descriptiva se observaron 

patrones de expresión de los diferentes anticuerpos estudiados, tanto en el tejido pulpar como 

en la papila en las etapas del proceso de odontogénesis. 

 

 

 



18 

 

2. Publicaciones  

• Retana-Lobo C. (2017). Dental Pulp Regeneration: Insights from Biological 

Processes. Odovtos - International Journal of Dental Sciences, 20(1), 10-16. doi: 

http://dx.doi.org/10.15517/ijds.v0i0.31269 

• Retana-Lobo C. Reyes-Carmona J. Immunohistochemical characterization of stem 

cell, vascular, neural and differentiation markers within the apical papilla and dental 

pulp of human teeth at different stages of root development.  

Enviado a la revista Journal of Histotechnology, se recibieron observaciones de los 

revisores y la segunda versión fue sometida a revisión.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

http://dx.doi.org/10.15517/ijds.v0i0.31269


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Dental Pulp Regeneration: Insights from Biological Processes

Regeneración pulpar: Perspectivas desde los procesos biológicos

RETANA C., 2018: Dental Pulp Regeneration: Insights from Biological Processes.-ODOVTOS-Int. J. Dental Sc., 20-1 (January-April):       .

           Received: 1-VIII-2017                       Accepted: 7-XI-2017 Published Online First: 13-XI-2017

DOI:  https://doi.org/10.15517/ijds.v0i0.31269

ABSTRACT 

One of the major approaches on dentistry research in this century is the development of 
biological strategies (tissue engineering) to regenerate/ biomineralize lost dental tissues. During 
dentin-pulp regeneration, the interaction between stem cells, signaling molecules, biomaterials and 
the microenvironment in the periapical area drives the process for dental pulp tissue engineering.  
Understanding the signaling mechanisms and interactions involved with the biological process for the 
formation of a new tissue, is essential. The knowledge of the micro-environment is the key for the 
application of tissue engineering.  The present article is a short review of the current state of this topic, 
with the purpose of showing insights of pulp regeneration.

KEYWORDS

Pulp regeneration; Molecular signals; Scaffolds; Stem cells.

RESUMEN

Actualmente la investigación en odontología se orienta al desarrollo de estrategias basadas 
en principios biológicos (ingeniería de tejidos) para la regeneración/biomineralización de estructuras 
dentales perdidas. El proceso de regeneración del complejo dentino-pulpar está guiado por la compleja 
interacción entre las células indiferenciadas de origen dental (DTSC), moléculas de señalización y 
biomateriales con el microambiente donde se va a restablecer. Es esencial comprender detalladamente, 
los mecanismos de señalización e interacciones involucradas en los procesos biológicos para la formación 
de un nuevo tejido, además de la identificación de los componentes presentes en los tejidos dentales 
implicados en este proceso (características del microambiente), ya que representan la base sobre la 
cual se debe emplear la ingeniería de tejidos. El presente articulo es una breve revisión del estado actual 
del tema, con el fin de entender el proceso de regeneración pulpar, basado en la comprensión de los 
fundamentos biológicos.

PALABRAS CLAVE

Regeneración pulpar;  Señalización molecular; Andamios; Células madre.



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The recovery of a lost, damaged organ or 
tissue is one of the most frequent, devastating 
and costly issues in human health care (1). Tissue 
engineering is an emerging interdisciplinary science 
that applies the principles of biology and engineering 
in regenerative medicine to improve or replace the 
biological function of cells, tissues and organs 
damaged by intrinsic or extrinsic factors (1-5).

These procedures are based on the interactions 
of these essential components: stem cells, 
morphogens and scaffolds. Two primary approaches 
have been developed: 1) cell-based approaches, 
which involve the seeding of undifferentiated cells 
and suitable biochemical inductors in designed 
scaffolds to be implanted in vivo; and 2) cell-
free approaches, which propose that stem cell 
populations that are already present on the host 
can be recruited into a bioactive scaffold by 
chemotaxis and growth factors to induce cell 
migration, proliferation and differentiation (3,4,6).

Currently, dental research applies tissue 
engineering protocols and explores the potential 
of cell-based products as alternative therapies to 
replace tissues such as pulp, dentin and bone (7-9). 
Regenerative endodontic procedures attempt to 
apply biologic procedures to substitute the lost/
damaged dentin-pulp complex tissue to restore 
biological function (10). 

The biologic rationale for endodontic 
treatment is the prevention or treatment of apical 
periodontitis through the disinfection of the root 
canal space, the conformation of the canal and the 
filling with an inert material (10,11). However, in 
spite of efforts to preserve as much dental structure 
as possible, evidence suggests that endodontic 
treatment causes loss of a significant amount 
of dentin, resulting in a non-vital and weakened 
tooth, especially when clinicians are dealing with 
dental trauma on an open apex tooth (4). In a 
retrospective study, Caplan et al. (12) found that 
the removal of pulp in a compromised tooth may 

lead to tooth loss in comparison with teeth with 
normal developed tissues (12). The ideal treatment 
to solve this problem would involve maintaining the 
vital pulp to allow complete development and to 
prevent apical periodontitis through regenerative 
procedures (13). 

Under these criteria, Dr. Jacques Nör (9) 
stated that when there is a need to endodontically 
treat a tooth with incomplete root development, the 
principles of regenerative medicine may be applied. 
The key elements for dental pulp engineering are 
a) molecular signals that induce the differentiation 
of cells that constitute dental pulp, b) cells that 
will respond to these signals and c) scaffolds that 
will either carry or attract these cells and will 
provide an environment to proliferate, differentiate 
and develop a tissue with the characteristics and 
functions of normal pulp (4,5,9). However, it is 
necessary to study and understand the principles 
of tooth development and the various pathways 
involved in cell differentiation to produce a 
functional replacement tooth or any other organ 
using tissue engineering technologies (5,14). 

MOLECULAR SIGNALS

The process of tooth formation implies 
different and multiple interactions between the 
developmental tissues mediated by regulatory 
signals (15). These signals are required to stimulate 
the differentiation of dental pulp stem cells and 
are necessary for the synthesis and secretion of 
mineralized matrix in hard tissues (4,5,9). 

Morphogens are proteins that bind to specific 
cell membrane receptors and induce a cascade of 
processes that coordinate all cellular functions, 
influencing vital processes such as cell division, cell 
signaling, matrix synthesis and proliferation (9,16). 
Though they are quite versatile, these proteins 
are classified according to their activity(4). For 
example, cytokines are related with immune and 
inflammatory reactions and growth factor functions 

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as stimulators or inhibitors of growth by controlling 
the rates of cell proliferation, differentiation and 
stem cell activity (4,5).

Grontos et al.  (17) suggested that biochemical 
pathways are involved in the differentiation of 
dental pulp stem cells (DPSCs) into functional 
odontoblasts. Indeed, several regulators of bone 
formation (e.g., bone morphogenetic proteins - 
BMPs) are related to odontoblast development. It is 
well known that fibroblast growth factor, epidermal 
growth factor and tumor necrosis factor-α, among 
others, regulate the proliferation and differentiation 
of odontoblast precursors. Proteins such as dentin 
matrix protein 1 (DMP-1), fibronectin, collagen type 
1, alkaline phosphatase, osteonectin, osteopontin, 
bone sialoprotein, osteocalcin, dentin sialoprotein 
(DSP) and dentin phosphoprotein (DPP) are involved 
in the formation of the mineralized matrix of either 
bone or dentin (17). However, it is still necessary 
to identify a more global morphogenetic signaling 
pathway and their functions and sequences to 
propose a signaling strategy. 

Collagen fibers and non-collagenous proteins 
(NCPs) constitute the organic dentin matrix. 
The NCPs of dentin play an important role in the 
biomineralization of the extracellular matrix, mainly 
DMP1, DPP and DSP, which function as regulatory 
factors (15). Goldberg et al. found that, in dental 
therapy, some molecules within the extracellular 
matrix may have the potential as bioactive agents 
for pulp repair or tissue engineering (18). In 
accordance, Tomson et al. (19) demonstrated 
that after complete root development, dentin 
retains “fossilized” growth factors that can be 
released when the dentin is solubilized. These 
dentin matrix components potentially influence 
cellular events for dentine repair and regeneration 
(4,19). Nevertheless, Nör suggests that the ideal 
combination of signals required to engineer all of 
the cellular components of a fully functional dental 
pulp is still unclear (9). 

STEM CELLS

Stem cells are the second key element for 
dental pulp engineering. These nonspecialized cells 
have the capacity for self-renewal and continuously 
divide and differentiate into specialized cells. 
Embryonic stem cells found in early stages of 
development are capable of unrestrictedly forming 
new tissues and organs (totipotent). Nevertheless, 
due to ethical and legal concerns, their use is 
controversial. Postnatal stem cells also share 
some characteristics with embryonic stem cells, 
the main difference being their limited capacity for 
specializing into diverse cells types (multipotent). 
As an advantage, they can be found in some 
tissues at any stage of life; therefore, their use is 
more accessible (20).

Subpopulations of postnatal stem cells have 
been found in adult tissues, such as bone marrow, 
adipose tissue, brain, skin, muscle and dental 
tissues(16). In 2000, Grontos et al (17) discovered 
stem cells obtained from the pulp of third molars 
(DPSCs). Songtao Shi et al. (21) identified other 
types of human dental pulp stem cells obtained 
from exfoliated deciduous teeth (SHEDs) and stem 
cells from the apical papilla (SCAPs)(22) and 
periodontal ligament (PDLSCs)(16,23).

The discovery of DPSCs evokes an important 
and accessible source of undifferentiated cells, 
with the potential for use by either seeding or 
recruitment in many potential therapies. DPSCs are 
highly proliferative and can specialize themselves 
into a number of cell types, such as odontoblasts, 
neural progenitors, osteoblasts, chondrocytes and 
adipocytes (3,16). In this scenario, the possibility to 
develop strategies for dental tissue engineering could 
begin successfully with endodontic regeneration. 

Furthermore, dental pulp tissue has an 
inherent potential associated with the healing 
process. As a defense response, odontoblasts can 

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be replaced via the migration and differentiation of 
resident DPSCs. These cells produce a collagenous 
matrix and then mineralize to maintain the balance 
and vitality of the dental pulp. Understanding the 
intrinsic mechanisms associated with the protective 
capacity of the dental pulp is the fundamental 
basis for applying similar approaches to induce 
pulp regeneration therapeutically (6,10,24). 

Isolated DPSCs may differentiate into 
odontoblast-like cells in vitro, positive to mineralizing 
factors and, therefore, suitable for novo dental-pulp 
complex formation (17, 25-27). The research group 
led by Nör showed that SHEDs and DPSCs are 
capable of regenerating well-vascularized tissue 
with morphological and functional characteristics 
that closely resemble those of human dental pulp 
(3,28,29). Among these studies, Cordeiro et al. 
reported the engineering of dental pulp tissue 
using a biodegradable scaffold with SHEDs. The 
engineered tissue exhibited a similar architecture 
and histologic structure when compared to human 
dental pulp (3) and demonstrated the feasibility of 
engineering a well-vascularized dental tissue.

SCAFFOLDS

The association of previously described 
key elements must develop into a helpful 
microenvironment, called bioactive scaffolds. These 
microenvironments should provide a framework 
for stem cell attachment, differentiation and 
proliferation guided by morphogenic molecules. 
In addition, these scaffolds should be suitable for 
nutrient and oxygen diffusion to develop a fully 
functional tissue as naturally as possible (9,24). 

Scaffolds can be molded (rigid and made 
for specific purposes) or injectable (delivered gels 
adaptable to the site for tissue regeneration). Both 
can be functionalized by enhancing the conditions 
for cell attachment and improved with morphogenic 
signals that supplement the host conditions and 
guide stem cells differentiation (4,24).

However, based on the finding that dentin-
derived proteins are capable of inducing the full 
differentiation of DPSCs into odontoblasts, it has 
been suggested that the necessary morphogenic 
signals are already present in the root canal. 
As Piva et al. suggested, it is critical to protect 
dentin-derived factors from degradation and to 
enhance their accessibility and mobilization by 
treating the dentin surface. Taking advantage of 
these “well-prepared” host molecules, is essential 
to provide an adequate attachment for the stem 
cells to provide efficient vascularization for oxygen 
and nutrient perfusion and the chemotaxis of 
circulating progenitor cells by the application of 
functionalized scaffolds (24,29,30).

The accomplishment of an ideal scaffold to 
regenerate dental pulp tissue is a critical procedure. 
The translation of laboratory findings into clinical use 
represents a significant challenge. The approach 
should allow the formation of connective tissue 
within the confines of the dental root and must 
simultaneously be suitable for the recruitment or 
formation of blood vessels and neuronal structures 
through the apical foramen (4).

Several materials and models have been 
developed, e.g., polymers with suitable flexibility 
and degradability, synthetic polymers (poly-L-
lactic acid) as a model for mechanic studies, co-
polymers (poly-lactic-co-glycolic acid), gelatin and 
others. However, it has been demonstrated that 
hard polymer scaffolds are not practical for clinical 
applications. Therefore, injectable scaffolds seem 
to be the best option (4,24,28).

Injectable hydrogels penetrate throughout 
the root canal system and are conducive to stem 
cell survival and proliferation. Available options 
such as alginate hydrogels or self-assembling 
peptide hydrogels have been used. For example, 
Puramatrix® is a commercially available peptide 
matrix that instantly polymerizes, forming a 
biodegradable scaffold. Cavalcanti et al. showed that 

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these scaffolds allowed odontoblastic differentiation 
of dental pulp stem cells in vitro, demonstrating 
that this protocol was a promising alternative 
for dental pulp tissue engineering (4,24,28,31). 
The goal for future studies must be focused on 
achieving an optimum scaffold that resembles 
the microenvironment observed during tooth 
development.

VASCULAR AND NEURAL SUPPLY

To develop a novel strategy for dental pulp 
engineering, studies cannot focus merely on DPSC 
differentiation into odontoblasts. Indeed, to maintain 
and preserve the tissue, their specialization into 
supporting cells or the chemotaxis of vascular 
endothelial and neural cells is required. Vascular and 
neural supplies represent challenges, as they must 
be maintained and supplied through the foramen. 
Some strategies have been proposed to address 
this problem, such as embedding angiogenic 
and neurogenic factors into the scaffolds, the 
application of a prevascularized matrix, utilization 
of polymers containing vessel-like networks, and, 
more recently, taking advantage of the inherent 
vasculogenic potential of endothelial cells (9,24).

Successful tissue regeneration depends 
directly on the formation of an effective vascular 
network to provide oxygen, nutrients, immune cells 
and the recruitment of circulating cells. Moreover, 
substrates required for mineralization, such 
as calcium or phosphate, become available for 
odontoblasts through the blood vessels. It might be 
necessary to provide (or attract) endothelial cells 
to enhance the process of tissue vascularization 
to sustain viability and tissue vitality over time. 
Furthermore, innervation is essential for the 

regulation of the cells involved in the regeneration 
process, providing a protective effect with essential 
roles in inflammation and tissue repair (9,16,24). 

The comprehension of strategies to improve 
these processes becomes one of the most critical 
challenges to dental pulp engineering. Despite all of 
the progress in the field, several processes remain 
unclear in pursuing the formation of a functional 
vascular network and efficient innervation for the 
clinical engineering of dental tissue.

Regenerated dental pulp must be both 
structurally and functionally as similar as possible 
to the natural tissue (32). The complexity of this 
tissue still challenges clinicians and investigators. 
Remarkable progress has been achieved over a 
short amount of time. Evidence suggests that the 
engineering of new dental pulp may be feasible. 
However, attaining full comprehension of the 
biological events underlying pulp-dentin complex 
formation is essential to regenerate this tissue 
and is key to achieving its application from the 
clinical perspective. 

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Attribution (BY-NC) - (BY) You must give appropriate credit, provide a link to the license, and 
indicate if changes were made. You may do so in any reasonable manner, but not in any way 
that suggest the licensor endorses you or your use.  (NC) You may not use the material for 
commercial purposes.

Cristina Retana-Lobo DDS, MSD¹,²

1.  Departamento de Ciencias Restaurativas, Facultad de Odontología, 
Universidad de Costa Rica, Costa Rica. 

2.  LICIFO, Facultad de Odontología, Universidad de Costa Rica, Costa  Rica.
Email:  cristina.retana@ucr.ac.cr 

ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.. ISSN:1659-1046.16



The Journal of Histotechnology
 

Immunohistochemical characterization of stem cell, vascular, neural, and differentiation
markers in the apical papilla and dental pulp of human teeth at various stages of root

development
--Manuscript Draft--

 
Manuscript Number: HIS550R2

Full Title: Immunohistochemical characterization of stem cell, vascular, neural, and differentiation
markers in the apical papilla and dental pulp of human teeth at various stages of root
development

Article Type: Research Paper

Keywords: Apical papilla;  Dental pulp;  Nestin;  Neurofilament heavy;  STRO-1;  VEGFR-2;  Root
development;  Odontoblast

Corresponding Author: Jessie Reyes-Carmona, PhD
Costa Rica University: Universidad de Costa Rica
Montes de Oca, San José COSTA RICA

Corresponding Author Secondary
Information:

Corresponding Author's Institution: Costa Rica University: Universidad de Costa Rica

Corresponding Author's Secondary
Institution:

First Author: Cristina Retana-Lobo

First Author Secondary Information:

Order of Authors: Cristina Retana-Lobo

Jessie Reyes-Carmona, PhD

Order of Authors Secondary Information:

Abstract: This study aimed to evaluate the expression of several differentiation markers in the
apical papilla (AP) and dental pulp (DP) of human permanent teeth. Twenty human
permanent teeth were extracted and classified according to the three Moorrees
formation stages: initial root formation (Ri), root length ½ (R1/2), and root length
complete (Rc).
Immunohistochemical analyses were performed using anti-STRO-1, Anti-VEGF
Receptor-2, Anti- Neurofilament heavy  (NFH), and Anti-Nestin antibodies. Stained
tissue sections were analyzed under light microscopy. Hematoxylin and eosin-stained
sections showed an apical cell-rich zone between the DP and AP. The AP revealed
fewer vascular and cellular components than the DP. STRO-1 was detected on
vascular and neuronal elements beneath the odontoblast (OB) and in the sub-
odontoblastic (SOB) zone, and VEGFR-2-positive cells were observed in the
endothelium, arterioles, and blood vessels. Neuroepithelial stem cell protein (Nestin)
was highly expressed in differentiated odontoblasts in the OB and OB cell processes in
the predentin. NFH was observed in mature axons throughout the DP. STRO-1 and
VEGFR-2 microvascular immunoexpression was higher at Ri and R1/2. The STRO-1
and NFH markers showed intense spatial distribution of neuronal elements at Rc.
Differentiated OBs and SOB cells showed Nestin expression, indicating a reservoir of
newly differentiated OB-like cells.

Funding Information:

Powered by Editorial Manager® and ProduXion Manager® from Aries Systems Corporation



1 

 

 

Immunohistochemical characterization of stem cell, vascular, neural, and differentiation 

markers in the apical papilla and dental pulp of human teeth at various stages of root 

development 

 

Authors 

Cristina Retana-Lobo a  

e-mail: cristina.retana@ucr.ac.cr; ORCID: 0000-0001-9754-5047 

Jessie Reyes-Carmona a* 

e-mail: jessreyesc@hotmail.com; jessie.reyes@ucr.ac.cr, ORCID: 0000-0003-2872-6623.  

 

Affiliations  

a Department of Endodontics, University of Costa Rica, Montes de Oca, (San José,) Costa Rica 

 

Short Title: Immunohistochemical analyses of young teeth 

 

*Corresponding Author: 

Jessie Reyes-Carmona 

Department of Endodontics  

Universidad de Costa Rica  

Montes de Oca, San José, 11502, Costa Rica  

Tel: +506 8729 0359 

E-mail: jessreyesc@hotmail.com; jessie.reyes@ucr.ac.cr 

 

. 

Manuscript - with author details

mailto:jessie.reyes@ucr.ac.cr


2 

 

 

Abstract 

This study aimed to evaluate the expression of several differentiation markers in the apical 

papilla (AP) and dental pulp (DP) of human permanent teeth. Twenty young human teeth were 

extracted and classified according to three Moorrees tooth development stages:   initial root 

formation (Ri), root length ½ (R1/2), and root length complete (Rc). Immunohistochemical 

assays were performed using STRO-1, VEGF Receptor-2, Neurofilament heavy (NFH), and 

Nestin antibodies and analyzed under light microscopy. Decalcified, formalin fixed paraffin 

embedded tooth sections stained with hematoxylin and eosin showed an apical cell rich zone 

between the DP and AP.  The AP revealed fewer vascular and cellular components than the DP. 

STRO-1 was expressed on vascular and neuronal elements beneath the odontoblast (OB) and 

in the sub-odontoblastic (SOB) zone, and VEGFR-2 positive cells were observed in the 

endothelium, arterioles, and blood vessels. Neuroepithelial stem cell protein (Nestin) was 

highly expressed in differentiated odontoblasts in the predentin OB and OB cell processes.  

NFH was expressed in mature axons throughout the DP. STRO-1 and VEGFR-2 microvascular 

expression was higher at the Ri and R1/2 while STRO-1 and NFH showed strong spatial 

distribution of Rc neuronal elements rather than the of Ri and R1/2.  Differentiated OB and 

SOB cells showed Nestin expression, indicating a reservoir of newly differentiated OB-like 

cells. 

Keywords 

 

Apical papilla, Dental pulp, Nestin, Neurofilament heavy, STRO-1, VEGFR-2, Root development 

Odontoblast 

 

 



3 

 

 

Introduction 

 

The dental pulp (DP) is a specialized connective tissue containing cells, ground substance, 

collagen, reticular fibers, blood vessels, and nerves. This pulp is enclosed within the dentin walls 

and can form mineralized tissue [1,2]. Peripheral pulp cells or odontoblasts (OB) are highly 

specialized secretory cells that continuously interact with the components of the extracellular 

matrix in a complex network of signaling mechanisms, eliciting the physiological properties of 

the tissue [2–4]. 

During dentinogenesis, the process of dentin formation by differentiated OB in the dental pulp 

pheriphery, interactions in the epithelial-mesenchymal structures guide the cell differentiation 

[5]. After completion of crown development, root formation is initiated in a process controlled 

by signaling molecules. Thus, in the apical region of the enamel organ, an ectodermal ingrowth 

from the dental lamina that encloses the interior part of the dental papilla, and elongation occurs 

and produces the Hertwig’s epithelial root sheath (HERS), a bilayer epithelial structure that 

proliferates apically and guides the root formation process, known as rhizogenesis [5,6]. The 

mesenchyme condenses around and interacts with the HERS. Subsequently, the apical papilla 

(AP) mesenchyme comes into contact with the inner HERS layer, and through a series of 

induction events, stimulates odontoblast (OB) differentiation to form radicular dentin and 

cementoblasts via epithelial-mesenchymal transition [5,7]. 

The AP is the most apical portion of the tooth germ that contributes to tooth formation and is 

eventually converted into pulp tissue. This tissue is loosely attached to the apical part of the apex 

and has been reported as an important source of cell populations involved in the tooth 

development processes [3,6,8]. Sonoyama et al. designated the AP as histologically distinct from 



4 

 

 

the pulp, furthermore, described the tissue between the pulp and the AP as an “apical cell-rich 

zone” that contains more blood vessels and cellular components than the AP [8]. 

Several studies have reported the isolation and characterization of mesenchymal stem cell 

(MSC) populations from dental tissue [3,6,8]. Stem cells from the AP (SCAP) are found in 

teeth with incomplete root development [3,6,8]. These cells exhibit a high proliferative 

potential, self-renewal ability, low immunogenicity and can differentiate into various cell 

lineages, including osteogenic, odontogenic, neurogenic, and adipogenic.  As reported by 

Kang et al, SCAP represent     promising therapeutic potential because they are an alternative 

cell source [  3]. The molecular and cellular mechanisms of tooth development and crown 

morphogenesis have been extensively studied [5].  However, little is known about the 

signaling expression of stem cells, OB, vascular, or neuronal components of the AP and DP 

during root development. 

Molecular biological studies that evaluated the expression of different markers in dental tissue 

have elucidated the presence and spatial distribution of specific tissue components. Although 

STRO-1 is a stromal cell surface marker in bone marrow cells, it has also been found in human 

dental tissue, specifically in DP, blood vessels, and perineural sheath regions [1,8]. Vascular 

endothelial growth factor receptor 2 (VEGF-R2) is related to angiogenesis and has been 

associated with vascular endothelial and human DP cells adjacent to the subodontoblast (SOB) 

layer [2,9]. Neuroepithelial stem cell protein (Nestin) and neurofilament heavy chain protein 

(NFH) are neural signaling expression markers. Neurofilaments are major structural components 

of neurons, found in the cytoplasm of axons and dendrites [10].   Specifically  NFH expression 

was observed in most human DP unmyelinated nerve fibers originated from myelinated fibers, 

specific for  pulpal afferents by Henry et al. [11]. 



5 

 

 

 

Based on the complexity of the DP composition, the understanding on anatomical features during 

dental development could provide essential information that can be applied in tissue 

bioengineering and regenerative strategies. Therefore, this study aimed to evaluate the expression 

of STRO-1, vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), NFH, and Nestin 

antibodies in the AP and DP of human young permanent teeth at various stages of root 

development. 

 

Materials and Methods 

 

Ethical statement 

The research protocol was approved by the Ethics Committee of Universidad de Costa Rica, San 

José, San Pedro, Costa Rica (VR-467-2018).  All experiments were followed in accordance with 

the principles of the Helsinki Declaration of 1975. 

 

Sample selection 

Twenty healthy, young human permanent teeth (6-15 years) were extracted for reasons unrelated 

to this investigation. Samples were classified according to the three Moorrees formation stages 

[12] as follows:  initial root formation (Ri), root length ½ (R1/2) and root length complete (Rc). 

The criteria for inclusion were sound teeth with incomplete root development. The  exclusion 

criteria were teeth with complete root formation, dental caries, resorptive defects, complex 

anatomy, and previous endodontic treatment. 

Specimen preparation 



6 

 

 

Teeth selected were placed in 10% neutral buffered formalin (05310, Laboratorios Químicos 

ARVI S.A, Costa Rica) in a 25:1 ratio for 48 h fixation.  Specimens were immersed in the rapid 

hydrochloric acid Shandon TBD-1 Decalcifier (6764001, Thermo Scientific, USA) in a 20:1 ratio 

until complete decalcification (72-96 hours). Optimum decalcification was determined by 

physical test by inserting a needle through the sample, and washed in running water before 

processing. Specimens were sliced longitudinally to expose the pulp tissue. Following this step, 

teeth were dehydrated manually with ethanol at room temperature (RT) as follows: 70% (24 

hours), 80% (1 hour), 95% (3 changes every 2 hours) and 100% (overnight and 2 changes every 

1 our) (Laboratorios Químicos ARVI S.A, Costa Rica). Cleared in 3 changes of xylene every 1 

hour (X0056 Diapath, Italy) before being embedded in paraffin (Diawax, Diapath, Italy) at 56-

58°C (2 changes every 2 hours). Paraffin blocks were sectioned at 3-µm thickness (5 

sections/block), mounted on Silane-Prep slides (S4651-72EA, Sigma-Aldrich, USA), and 

deparaffinized in xylene, rehydrated through descending ethanol series and washed in distilled 

water (DIH2O). 

 

Histology and Immunohistochemistry analysis 

Five sections were obtained from each stage sample (Ri, R1/2 and Rc) with one section stained 

with hematoxylin and eosin (H&E) (ab245880, Abcam, UK). After deparaffinization sections 

were completely cover with Hematoxylin Mayer´s and incubated for 5 mins, rinsed in 2 changes 

of DIH2O, then completely cover with the bluing reagent and incubated for 10-15 secs. 

Subsequently slides were dipped in absolute ethanol and completely cover with eosin solution 

for 2-3 mins, after specimens were dehydrated in three changes of absolute ethanol. The other 

four sections were used for  immunohistochemical (IHC) analysis, and were subdivided for the 



7 

 

 

following primary antibodies: (1) mouse monoclonal anti-STRO-1 IgM (NBP1-48356, Novus 

Biologicals, USA), 1.0 mg/ml, used at 1:200 dilution, against stromal cell surface marker (lot#E-

1, RRID:AB_11020813), (2) rabbit polyclonal anti-VEGF Receptor-2 IgG (ab2349, Abcam, 

UK), 65 µg/ml, used at 1:100 dilution, against synthetic peptide corresponding to Mouse VEGF 

Receptor 2 (C terminal) (lot#GR3200281-6, RRID:AB_302998). (3) rabbit polyclonal anti-

Neurofilament heavy polypeptide antibody IgG (ab8135, Abcam), Whole antiserum, used at 

1:5000 dilution, against full length native protein (purified) corresponding to Cow Neurofilament 

heavy polypeptide (lot#GR3183142-7, RRID:AB_306298), and (4) mouse monoclonal anti-

Nestin antibody IgG1 (ab18102, Abcam), 1 mg/ml,  used at 1:100 dilution, against a 150 amino 

acid fragment from the cloned human Nestin (lot #GR147064-44 RRID:AB_444246). Negative 

controls were performed in parallel by incubating sections with phosphate-buffered saline (PBS), 

pH 7.4, (ab286856, Abcam) instead of primary antibody.  

Antigen retrieval was Proteinase K Ready to Use (S302030-2, Dako, USA) according to product 

instructions for use (3-6 mins at RT) and endogenous peroxidase was inactivated in 3% hydrogen 

peroxide (216763, Sigma-Aldrich) diluted in DIH2O, for 10 min. Nonspecific binding was 

blocked with 5% normal goat serum (ab7481, Abcam, UK) diluted in PBS. The blocking solution 

was removed and the sections were incubated overnight at 4 °C with primary antibodies. The 

sections were washed with TBS-T wash buffer (20x TBS-T with Tween 20, ab64204, Abcam) 

and incubated with the appropriate corresponding conjugated secondary antibody SignalStain 

Boost detection reagent (HRP, Rabbit) RTU (#8114, Cell Signaling, USA) and SignalStain Boost 

Detection Reagent (HRP, Mouse) RTU (#8125, Cell Signaling) in a humidified chamber for 30 

min at RT. The sections were washed with TBS-T, and chromogen visualized using the 

SignalStain DAB Substrate kit (#8059, Cell Signaling) according to kit instructions, washed and 



8 

 

 

lightly counterstained with Mayer’s hematoxylin (Ready to use aqueous solution, S330930-2 

Agilent Dako, USA).  Tissue sections of H&E and IHC were dehydrated in three changes of 

absolute ethanol, cleared in xylene and mounted in SignalStain Mounting medium (#14177, Cell 

Signaling, USA).      

Images of H&E and for each antibody immunoexpression in tissue sections from each stage were 

acquired using a light microscope (Nikon, Eclipse Ti-5, Japan) fitted with Infinity 3-6UR camera 

(Lumenera, Canada) at 10, 20, 40, and 100x magnifications. The stained tissue sections were 

qualitatively analyzed to evaluate the spatial distribution (strong, moderate and weak) for each 

antibody at three stages of root development (R1, R1/2 and Rc). 

 

Results 

Hematoxylin- and eosin-stained sections, showed: 

Ri: the DP showed the subodontoblastic (SOB) zone and the odontoblastic (OB) layer at the DP 

periphery. It was possible to observe the predentin secreted by the OB and the mineralized dentin 

in the outer surface (Fig 1 a,b). In the AP images, it was possible to observe some blood vessels. 

(Fig 1 c,d) 

R1/2: the DP showed the histological SOB and OB layer at the DP periphery, predentin and dentin 

tissues in development. It was possible to observe a globular pattern of mineralization. (Fig 2 a,b) 

In the AP, it was possible to observe an apical cell-rich zone between the pulp and the AP, besides 

fewer blood vessels in the AP than in the apical cell-rich zone or DP. (Fig 2 c,d) 

 Rc: the DP blood vesels through the tissue, the SOB zone, OB layer, predentin and mineralized 

dentin. (Fig 3 a,b). In the AP, it was possible to observe the apical cell-rich zone between the pulp 



9 

 

 

and the AP. Typically, there were fewer blood vessels, arterioles, and cellular components in the 

AP than the apical cell-rich zone or DP. (Fig 3 c, d)  

Immunohistochemistry assay:  

STRO-1:  Expression of STRO-1 was detected on arterioles, the perineurium surrounding nerve 

bundles. Beneath the OB layer and in the SOB zone was noted on capillary endothelial cells, and 

surrounding blood vessels (Fig 4 g-l, Fig 8 a-c). Moreover, STRO-1-positive cells were found 

in the perivascular and perineural areas, suggesting that they are early markers of stem cell 

populations, such as SCAP and postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs). (Fig 4 a-f) 

STRO-1 showed strong immunostaining in the early stages of root development. (Fig. 4) 

VEGFR-2: Immunohistochemical qualitative analysis showed VEGFR-2-positive cells at the 

endothelium, in arterioles, and blood vessels in the DP at all stages of root development. (Fig 5 

g-l, Fig 8 d-f) However, Rc exhibited a more uniform spatial distribution of VEFGR-2-positive 

cells than the other stages. (Fig. 5) 

Nestin: Immunohistochemical analysis revealed that Nestin was highly expressed in 

differentiated OBs in the OB layer. Additionally, under magnification, Nestin immunoreactivity 

was observed in the SOB layer and was uniformly stronger in OB cell processes in the predentin 

at all stages of root development. (Fig. 6 g-l, Fig 8 j-l) 

NFH: Neurofilament heavy chain was observed in mature axons, mainly in the center of the DP 

and near arteries and capillaries. (Fig 7 g-l, Fig 8 g-i) The Rc sections showed stronger 

immunolabeled positive cells in the perineurium with spatial distribution throughout the dental 

pulp. (Fig 7 i, l) Neurofilament-heavy-positive cells were observed in a few arterioles and venules 

at the AP. (Fig. 7 a-f) 



10 

 

 

The control sections did not show any specific immunoreactivity.  

Areas of high expression for STRO-1, VEGFR-2, and Nestin were observed in the AP appearing 

as similar to a “cotton speck- like” structures. This appearance was consistent for all antibodies 

except NFH, which is exclusively expressed in mature axons. The “cotton speck-like” structure 

does not seem like an artifact of immunohistochemistry but an immunoreactive pattern in the 

apical zone, and found restricted to the AP.  This immunoreactive patters was seen in areas 

surrounding venules and arterioles at higher magnifications (Fig 9 a-c).  

Discussion 

Little was available in the literature on the apical papilla (AP) and its differentiation from the 

dental pulp (DP) which has been considered the source of OB during tooth development. As the 

primary mature odontoblasts form radicular dentin, the DP is encapsulated and evolves into pulp 

tissue [8]. Thus, understanding the signaling mechanisms during tooth formation is very 

important to clarify possible pathways for dental tissue regeneration. This study highlights some 

in situ histologic and immunohistological features in the pulp and AP during different stages of 

rhizogenesis. 

STRO-1 immunoreactivity was present in both tissues but in a different distribution. STRO-1 

was observed on arterioles and the perineurium through the pulp tissue and beneath the OB layer 

on the endothelial cells of vascular structures and nerve fibers. The results obtained in this study 

were consistent with Yoshiba et al. [1] which reported STRO-1 expression in the endothelium, 

pericytes, and perineurium. Pericytes developed from tissue-derived stem cells or peripheral 

blood pluripotent stem cells, and are putative MSC progenitors that help maintain tissue 

homeostasis [13,14].  

STRO-1-positive adult human DPSC exhibit neuronal differentiation potential and were 



11 

 

 

investigated as a source of cells for neuronal regeneration and dental pulp healing [1]. In this 

study, it is important to note that STRO-1 expression was stronger in the perivascular and 

perineural regions at the initial stages of root formation. The immunoreactivity pattern observed 

for STRO-1 corroborated this protein as an early marker of mesenchymal stem cells [15]. 

IHC results showed positive Nestin expression mainly in the OB layer, in differentiated OB and 

in the SOB layer, demonstrating the presence of a reservoir of newly differentiated OB-like cells. 

Several studies considered Nestin as a marker for differentiated OB [16-18].  It has been 

demonstrated that progenitor cells in the SOB layer initially migrate and differentiate into new 

OB-like cells to compensate for the loss in the OB layer, and subsequently, the reorganization of 

the dental pulp is completed by the active proliferation of mesenchymal cells in a wide range of 

pulp tissue [17,19]. In this study, the Nestin pattern demonstrated synchronized expression in 

OB-lineage cells. 

On the other hand, angiogenesis is an essential part of natural tissue development; VEGF is an 

angiogenic inducer considered a master regulatory molecule for the process [9]. VEGF receptors 

are expressed on the vascular endothelial cell surface; based on Mattuella et al., VEGFR-2 was 

used because of its relevance to vascular homeostasis and microvessel density regulation [2]. 

An important VEGFR-2 expression was observed in the AP, distributed throughout the tissue 

and notably around blood vessels. Immunostaining was located along the blood vessels and 

close to the SOB layer of the pulp. As reported in previous studies, uniform VEGFR-2 

immunostaining patterns could indicate physiological pulpal angiogenesis throughout the root 

development process [2,20,21].  

Dental pulp innervation is a key component of the process; in addition to its sensory function, it 

is essential for pulp homeostasis, vascular and immunologic modulation, repair, and 



12 

 

 

regeneration [22]. NFH is a commonly expressed protein in sensory neurons that produces 

myelinated afferents [11]. The results obtained showed positive NFH immunostaining that 

increased with the root development stage and was positively correlated with pulp tissue 

maturation and root formation. Studies have shown widely expressed NFH in pulpal afferents 

and unmyelinated fibers originating from axons myelinated at proximal locations [11].  

Therefore, the positive immunoreaction observed for NFH could provide information on nerve 

distribution in the pulp tissue, which increased with the stage of root development. 

The apical papilla has been suggested as a source of undifferentiated cells that are a replacement 

for the pulpal population [3,7,8,23]. As the root develops, the location of the papilla becomes 

apical to the pulp tissue and remains as a different structure; histologically, their vascular 

density and cell compositions are notably distinct [8]. MSCs are located in the apical cell-rich 

zone and the apical papilla harbors an important SCAP population that is the source of 

odontoblast replacement and has been reported positive to immunostaining for neurovascular 

markers [7,8,17]. Therefore, is possible to suggest that the “cotton-specks-like” 

immunoreactivity patterns in the perivascular areas are the immunoexpression of proteins that 

accumulate in the SCAP cytoplasm based on the progress of cell differentiation because it was 

stronger at the Rc stage. The literature presents several case reports of continued root 

development after conservative treatment of immature permanent teeth with pulp necrosis and 

periapical lesions [24,25], suggesting that SCAPs harbored in the apical papilla may survive 

the infection process and differentiate into OBs [3] because of their proximity to the periapical 

tissues, as reported by Sonoyama et al. [8]. Accordingly, the pattern of spots observed in the 

Rc samples at the periapical tissue could be related to the maintenance and the physiological 

supply of neurovascular and cell requirements. 



13 

 

 

Conclusion 

 

STRO-1, VEGFR-2, NFH, and Nestin immunostaining provided major information regarding the 

localization and distribution within the pulp and apical papilla tissues of human young permanent 

teeth at various stages of root development. In the initial stages, the presence of mesenchymal stem 

cells related to cell differentiation processes is predominant. Simultaneously, the angiogenesis and 

neurogenesis processes evolve with the root development, highlighting the presence of a reservoir 

of newly differentiated OB-like cells for pulp repair and regeneration. Further studies are required 

to quantitatively evaluate the expression of the various markers to clarify tissue variation 

throughout the root developmental process. 

 

 

Declaration of interest statement 

The authors report there are no competing interests to declare. 

 

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