Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 www.mag.go.cr/rev agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr INOCULACIÓN AL SUELO CON Pseudomonas fluorescens, Azospirillum oryzae, Bacillus subtilis Y MICROORGANISMOS DE MONTAÑA (MM) Y SU EFECTO SOBRE UN SISTEMA DE ROTACIÓN SOYA-TOMATE BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO Leida Castro Barquero1/*, Mariana Murillo Roos*, Lidieth Uribe Lorío*, Rafael Mata Chinchilla* Palabras clave: Azospirillum oryzae; Pseudomonas fluorescens; Bacillus subtilis; microorganismos de montaña (MM); inoculación. Keywords: Azospirillum oryzae; Pseudomonas fluorescens; Bacillus subtilis; microorganismos de montaña (MM); inoculation. Recibido: 10/04/15 Aceptado: 01/06/15 RESUMEN ABSTRACT Se evaluó un sistema de rotación soya- Soil inoculation with Pseudomonas tomate, con incorporación de biomasa verde y fluorescens, Azospirillum oryzae, Bacillus aplicación de inóculos microbianos individuales subtilis and mountain microorganisms y en mezcla sobre el crecimiento de las plantas y (MM) and its effect on a soybean-tomato propiedades edáficas; para ello se evaluaron en crop rotation system under greenhouse invernadero por 24 meses los siguientes 9 trata- conditions. The effect, on growth of plants mientos: solo tomate (T); rotación tomate-soya and soil properties, of incorporating green (TS); rotación tomate-soya con inoculaciones biomass and applying individual and compound individuales de Azospirillum oryzae (A); de microbial inocula was evaluated in a soybean- Pseudomonas fluorescens (P); de Bacillus sub- tomato crop rotation system during 24 months in tilis (B); de microorganismos de montaña (MM); the greenhouse. Nine different conditions were y las inoculaciones en mezcla de B. subtilis y P. evaluated: tomato alone (T); tomato-soybean fluorescens (BP); de B. subtilis, P. fluorescens y rotation (TS); tomato-soybean rotation with A. oryzae (BPA); de B. subtilis, P. fluorescens, individual inoculations of Azospirillum oryzae Azospirillum sp. y MM (BPAMM). Se evalua- (A); of Pseudomonas fluorescens (P); of Bacillus ron las variables físicas: densidad aparente y subtilis (B); of mountain microorganisms (MM); de partículas; conductividad hidráulica; poros and tomato-soybean rotation with mixtures of B. totales; estabilidad de agregados; resistencia a subtilis and P. fluorescens (BP); of B. subtilis, P. la penetración (RP); las variables químicas: pH; fluorescens, and A. oryzae (BPA); of B. subtilis, conductividad eléctrica; contenido de N y C; P. fluorescens, Azospirillum sp., and mountain relación C/N; contenido de nutrientes en suelos microorganisms (BPAMM). The following y foliares; las variables biológicas: respiración physical and chemical soil indicators (variables) de suelos, unidades formadoras de colonias de were evaluated: apparent density; particle density; hongos, bacterias y actinomicetos y el peso fres- hydraulic conductivity; pore volume (porosity); co y seco foliar. Las variables físicas no fueron aggregate stability; penetration resistance (PR); 1 Autor para correspondencia. Correo electrónico: * Centro de Investigaciones Agronómicas, Universidad leida.castro@ucr.ac.cr de Costa Rica. 22 AGRONOMÍA COSTARRICENSE afectadas por los tratamientos, con excepción de pH; electrical conductivity (EC); carbon and RP, que fue mayor en el tratamiento T. Las varia- nitrogen content; C/N ratio; and soil and foliar bles biológicas y químicas fueron sensibles a los nutrient content. Biological indicators were also tratamientos, con valores significativamente más assessed: soil respiration; colony-forming units altos en presencia de MM. Destaca el incremento (CFU) of fungi, bacteria and actinomycetes; fresh del P en solución de suelo en tratamientos a los and dry foliar weight. The physical variables que se adicionó MM: pasó de 6 a 20 mg.l-1; esta were not affected by the treatments, except for condición se reflejó además en la cantidad de P PR, which was higher in treatment T. Chemical en el tejido foliar al final del ensayo. Se determi- and biological variables were sensitive to the nó que el pH, CE y la respiración del suelo fueron treatments, with significantly higher values in the afectados por la interacción entre los tratamientos presence of MM. The rise of P in soil solution in aplicados y el tiempo transcurrido; los mayores treatments with MM was of special importance: it valores se obtuvieron al final del ensayo y en los increased from 6 to 20 mg.l-1; this condition was tratamientos con MM. also reflected in the concentration of P in foliar tissue at the end of assay. It was determined that pH, EC and soil respiration were affected by the interaction among the treatments applied and the time elapsed; the highest values were obtained at the end of the assay and in treatments with MM. INTRODUCCIÓN revolución verde, como el monocultivo, la labran- za intensiva y el uso de agroquímicos pueden El suelo es el ecosistema más diverso y afectar negativamente la calidad y productividad complejo del planeta y proporciona un amplio de los suelos, por lo que un mejor entendimiento rango de los recursos que las plantas necesitan de las relaciones que se dan en los agrosistemas, para crecer y enfrentar diversos retos bióticos y podría permitir el desarrollo de estrategias para abióticos. Debido a las relaciones existentes entre plantas, suelos, microorganismos y ambiente, la restaurar suelos agotados, que debido a la pérdida complejidad dinámica del suelo involucra fac- de sus propiedades holísticas y sistémicas han tores físicos, químicos y biológicos, en una red reducido su heterogeneidad y en consecuencia su de interacciones que facultan la transferencia de estabilidad ecológica (Capra 1998, Chaparro et ál. energía, los ciclos de materiales y nutrientes y la 2012, Kibblewhite et ál. 2015). transmisión de información. Todos estos factores Hoy en día el desarrollo de una agricultura interactúan a diferentes niveles de organización sostenible es vital no solo para hacer frente a la y siempre de manera compleja, debido a ello, las demanda de alimentos y fibras sino para mante- prácticas de manejo agrícola, las cuales distor- ner otros servicios ambientales necesarios para sionan el equilibrio natural de los ecosistemas, la vida (Godfray et ál. 2010, Kibblewhite et ál. afectan la estructura y función del suelo a corto, 2015). El uso de prácticas de conservación como mediano y largo plazo (Bautista et ál. 2008, la labranza mínima, la rotación de cultivos, la Young y Crawford 2004, Jones y Hinsinger 2008, incorporación de residuos y el uso de legumi- Mitter et ál. 2013). nosas, representan una oportunidad de capturar Las actividades antropogénicas de uso C y N atmosférico en el suelo, que permite su convencional, principalmente a partir de la conservación física y biológica (Balota et ál. Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 CASTRO et ál.: Inoculación al suelo con Pseudomonas, Azospirillum y Bacillus 23 2004, Govaerts et ál. 2007) mientras se mitiga Torsvik y Øvreås (2002) y Kibblewhite et el incremento en la concentración de CO2 en la ál. (2015) destacan que la diversidad microbiana atmósfera y los cambios negativos a escala global y los procesos en el suelo son llevados a cabo en los ciclos de nutrientes y agua (Ehrenfeld et por “consorcios microbianos” cuya característica ál. 2005). principal es la diversidad funcional más que la Las comunidades microbianas en los sue- de grupos taxonómicos, por lo que las funciones los se consideran vitales para asegurar la soste- individuales en estos consorcios quedan trasla- nibilidad de los ecosistemas (Young y Crawford padas, este hecho es de gran importancia para la 2004, Barrios 2007, Van der Heijden et ál. 2008, estabilidad y resiliencia del ecosistema suelo. Eisenhauer et ál. 2010, Mendes et ál. 2011, Cha- La elaboración de Microorganismos de parro et ál. 2012), donde son responsables de Montaña (MM) se fundamenta en la tecnología funciones tales como: las transformaciones de desarrollada en los años 80 por el japonés Dr. carbono, el ciclaje de nutrientes, el mantenimien- Teruo Higa, conocida como Microorganismos Efi- to de la estructura del suelo y la regulación de las cientes (EM) (Mayera et ál. 2010), Los MM se poblaciones biológicas (Castro et ál. 2009, Singh podrían catalogar como “consorcios microbianos” et ál. 2011, Kibblewhite et ál. 2015). En los agro- ya que su composición y las posibles relaciones sistemas estas funciones tienen una influencia que generan son múltiples, se indica que contienen permanente sobre la salud y la productividad de bacterias fotosintéticas, bacterias productoras de los cultivos. Se han encontrado como parte inte- ácido láctico, actinomicetes, hongos filamentosos y gral de la biota rizosférica de cultivos agrícolas levaduras. Los MM son un producto de fabricación un amplio rango de bacterias de vida libre, sim- artesanal de bajo costo, que no requiere medios de bióticas o en asociación de géneros tales como: crecimiento sofisticados para el escalamiento y que Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Azos- pretende aprovechar la diversidad microbiana tanto pirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, taxonómica como funcional, de las comunidades Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Proteus, de microorganismos nativos de zonas boscosas, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, y Xantho- para luego incorporarlos en las unidades de pro- monas entre otras (Bhattacharyya y Jha 2012). ducción agrícola. Entre los usuarios de este tipo de En los últimos años se ha destacado el tecnología se acepta que la mejor fuente de inoculo éxito de la inoculación con microorganismos son los bosques cercanos a los sitios de producción para la promoción del crecimiento vegetal y el agrícola, ya que presentan microorganismos adap- control biológico de patógenos (Vessey 2003). tados a las condiciones de la zona. Existe poca lite- Los géneros bacterianos Azospirillum, Bacillus ratura que respalde las respuestas positivas del uso y Pseudomonas han sido ampliamente utilizados de este tipo de inoculo en la producción, se destaca con estos objetivos (Bhattacharyya y Jha 2012). el aporte de Restrepo y Hensel 2007. Debido a la gran variedad de funciones La presente investigación tuvo como obje- realizadas por microorganismos diferentes, las tivo evaluar en un sistema de rotación tomate- inoculaciones múltiples pueden ser más efectivas soya con incorporación de biomasa verde, la que las inoculaciones individuales. Con la adi- aplicación de inóculos individuales y en mezcla ción de inoculaciones combinadas de bacterias de Azospirillum, Pseudomonas, Bacillus y bioles promotoras de crecimiento se ha logrado aumen- de Microorganismos de Montaña, sobre el creci- tar la absorción de nutrientes y el crecimiento miento de las plantas y variables edáficas. de las plantas, además de conferir resistencia a estrés abiótico y suprimir enfermedades y pla- MATERIALES Y MÉTODOS gas (Kirankumar et ál. 2008, Cummings 2009, Guiñazú et ál. 2009, Dimkpa et ál. 2009, De El experimento se realizó en el inverna- Vleesschauwer y Höfte 2009). dero y Laboratorio de Microbiología Agrícola Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 24 AGRONOMÍA COSTARRICENSE del Centro de Investigaciones Agronómicas de la se muestran en el Cuadro 1. El suelo se transpor- Universidad de Costa Rica entre julio del 2011 tó al invernadero del Centro de Investigaciones y octubre del 2013. Se evaluaron los siguientes Agronómicas donde se procedió a cribar con un 9 tratamientos, a partir de 4 repeticiones: 1-Solo sarán grueso para eliminar rocas u otros objetos, tomate (T); 2-Rotación tomate-soya (TS); 3-TS posteriormente se llenaron todos los recipientes con inoculación de Azospirillum oryzae (A); 4-TS pertenecientes al ensayo con 8 kg de suelo (cada con inoculación de Pseudomonas fluorescens (P); recipiente correspondió a una unidad experi- 5-TS con inoculación de Bacillus subtilis (B); 6-TS mental) y se cultivaron con soya (var. CIGRAS con inoculación de Microorganismos de Montaña 06), excepto el tratamiento de solo tomate, cuyos (MM); 7-TS con inoculación de B. subtilis y P. recipientes se dejaron sin cultivar. En el siguiente fluorescens (BP); 8- TS con inoculación de B. sub- ciclo de cultivo (o rotación) se sembró tomate (var. tilis, P. fluorescens y A. oryzae (BPA); 9-TS con Hayslip) en todos los tratamientos, en el tercer y inoculación de B. subtilis, P. fluorescens, A. oryzae cuarto ciclo de cultivo se sembró soya (excepto en y MM (BPAMM). Las cepas microbianas utiliza- el tratamiento de solo tomate), finalmente en el das pertenecen a la colección del Laboratorio de quinto ciclo se plantó tomate en todos los trata- Microbiología Agrícola del Centro de Investigacio- mientos. Posterior a la siembra del primer ciclo, el nes Agronómicas de la Universidad de Costa Rica. suelo no fue disturbado, excepto para la toma de Se utilizó suelo proveniente de Liberia muestras, las arvenses que crecieron espontánea- Guanacaste clasificado como Lithic Ustorthents mente se cortaron con tijera y se dejaron sobre la (Entisol pedregoso de régimen ústico, derivado superficie de los recipientes (Figura 1). El suelo de ignimbritas ácidas) con las características que en las macetas se mantuvo siempre húmedo y se Cuadro 1. Análisis químico del suelo utilizado en el experimento. Análisis pH Cmol(+).l-1 % mg.l-1 % H2O acidez Ca Mg K CICE SA P Zn Cu Fe Mn C N C/N 5,5 0,14 7,22 1,38 0,51 9,25 2,0 6,0 8,0 3,0 275 115 1,83 0,17 10,8 A B C Fig.1. Rotación soya-tomate y manejo de arvenses. A-Tomate, B- soya, C-Manejo de arvenses. Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 CASTRO et ál.: Inoculación al suelo con Pseudomonas, Azospirillum y Bacillus 25 observó un crecimiento adecuado de las plantas tapa de rosca, 8 litros de agua de manantial, 300 durante todas las rotaciones realizadas. No se ml de melaza y 400 g de MM sólido, se mezcló y hicieron aplicaciones de ningún tipo de fertiliza- se dejo en reposo para su posterior aplicación. Las ción química. aplicaciones de MM líquido se realizaron 12 y 26 En los tratamientos con soya, se cosechó el días después de la preparación. Se aplicaron 250 material foliar a los 3 meses después de la siem- ml de MM líquido por maceta, diluido al 50% con bra, las muestras de cada tratamiento se pesaron agua de riego, para un volumen final de 500 ml. individualmente, se mezclaron y se aplicaron Se determinó la densidad aparente de par- como abono verde, a partir de la distribución del tículas, la conductividad hidráulica, la porosidad material verde por partes iguales en cada una de total y la resistencia a la penetración, mediante las repeticiones de cada tratamiento, este mate- las metodologías propuestas por Forsythe (1975) rial se dejó sobre la superficie de las macetas y y Henríquez y Cabalceta (2012) y la estabilidad aproximadamente 2 meses después se trasplanta- de los agregados a partir del método descrito por ron plántulas de tomate de 30 días de edad. Dos Kemper (1965). Estas determinaciones se realiza- meses después las plantas se cosecharon y se les ron en el Laboratorio de Recursos Naturales del determinó el peso fresco y seco foliar, el material Centro de Investigaciones Agronómicas (CIA). seco fue incorporado a las macetas de la misma La biomasa microbiana se evaluó mediante la forma que la soya, con la humedad adecuada metodología de extracción-fumigación de Vance para su descomposición por aproximadamente 2 et ál. (1987), para la determinación de la respira- meses (Figura 1). Se realizaron en cada ciclo de ción de suelo se utilizó la técnica de Jenkinson cultivo, 2 aplicaciones de los inóculos microbia- y Powlson (1976), las unidades formadoras de nos según correspondiese; para ello se colocaron en cada unidad experimental a nivel de suelo y colonias (UFC) de hongos, bacterias y actino- alrededor del tallo, 10 ml de una suspensión en micetes se determinaron mediante la técnica de agua estéril de cada una de las bacterias, culti- recuentos de microorganismos viables en placas vadas por 48 horas en agar nutritivo. Se utilizó petri, el peso fresco y seco foliar y peso fresco una concentración bacteriana de 5*108 UFC.ml-1 radical se realizaron en el Laboratorio de Micro- para A. oryzae, 1,2 *109 UFC.ml-1 para P. fluores- biología Agrícola del CIA. La determinación de cens y 2*107 UFC.ml-1 para B. subtillis. N y C del suelo y la relación C/N se llevó a cabo A la siembra se inocularon las semillas por el método de Bremner y Tabatabai (1971), el de soya con 2 ml de una suspensión en agua contenido foliar de nutrientes por los métodos estéril de una mezcla de 3 cepas de Bradyrhi- descritos por Díaz y Hunter 1978 y Henríquez y zobium japonicum (CR-506, CR-508 CR-514), Cabalceta (2012), pH y conductividad eléctrica pertenecientes a la colección del Laboratorio de con un potenciómetro-conductímetro portátil, Microbiología Agrícola, la concentración de las Metter Toledo, Seven go duo en el Laboratorio de bacterias inoculadas fue de 8 x 108 UFC.ml-1. Suelos y Foliares del CIA. Los MM sólidos para la preparación de los Los tratamientos evaluados se arreglaron bioles se elaboraron de la siguiente manera: En un en un diseño irrestricto al azar. Los datos se trata- estañón con tapa hermética, válvula de salida de ron por medio de análisis de varianza y se utilizó gases y con capacidad de 200 litros, se colocó la como separador de medias la prueba de LSD mezcla de 2 sacos de mantillo de bosque con un Fisher al 5%. Las variables que presentaron inte- saco de semolina de arroz y 2 litros de melaza, el racción del tiempo con los tratamientos, se ana- material se comprimió en el recipiente y se tapó lizaron por medio de un diseño factorial con los por un mes. Posteriormente esta mezcla sólida se factores tratamientos y tiempo (T1: evaluación al utilizó para preparar un biol líquido, para ello se final del primer ciclo de soya; T2: evaluación al colocaron en un recipiente de plástico oscuro y final del último ciclo de soya). Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 26 AGRONOMÍA COSTARRICENSE RESULTADOS Y DISCUSIÓN el tratamiento T en T2 que es la evaluación al final del último ciclo de soya, obtuvo un Evaluación del sistema de rotación soya- valor estadísticamente mayor (p=0,0031) lo tomate que indica que la incorporación de la biomasa de la soya afectó en todos los casos, el valor En cuanto a las características físicas de esta variable, aspecto que coincide con lo del suelo, la resistencia a la penetración (RP) indicado por Martínez (2008) que suelos con fue la única variable afectada por los trata- mayor contenido de materia orgánica tienen a mientos (Cuadro 2); en este caso, solamente presentar una menor RP. Cuadro 2. Resistencia a la penetración del suelo mostrada al final del primer ciclo de soya (T1) y al final del último ciclo de soya (T2). Resistencia a la Tratamientos penetración (kg cm2) T TS B P A MM BP BPA BPAMM T1 0,80 a 0,38 a 0,43 a 0,45 a 0,59 a 0,46 a 0,45 a 0,31 a 0,43 a T2 1,01 b 0,39 a 0,46 a 0,44 a 0,49 a 0,45 a 0,48 a 0,50 a 0,46 a Diferentes letras implican diferencias significativas entre los tratamientos. (p=0,0031). Los contenidos de C y N en el suelo Montagnini et ál. 1993, Wood and Lawrence (Figuras 2 y 3) aumentaron con el paso del tiem- 2008), sin embargo Hartemink (2003) considera po en todos los tratamientos (p=<0,0001). El que los mismos deben mantenerse al menos por mayor incremento comparado al contenido inicial 10 años para ser considerados como estables. (1,83% para C y 0,17% para N) se presentó en el Marín (2015) encontró que suelos sometidos a tratamiento de mayor complejidad microbiana un manejo orgánico por 15 años presentaron un (BPAMM), y fue de alrededor del 100% para contenido de 6,24% de C y 0,59% de N, mientras ambos elementos. Cambios en los contenidos que suelos aledaños utilizados en agricultura de C y N a corto plazo han sido observados por convencional presentaron valores de 4,05% de C diferentes autores (Sauerbeck y González 1977, y 0,41% de N. Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 CASTRO et ál.: Inoculación al suelo con Pseudomonas, Azospirillum y Bacillus 27 Barras del mismo color con diferentes letras implican diferencias significativas entre los tratamientos. Fig. 2. Porcentaje de C del suelo al final del primer ciclo de soya (T1) (p=0,0287) y al final del último ciclo de soya (T2) (p=0,019). Barras del mismo color con diferentes letras implican diferencias significativas entre los tratamientos. Fig. 3. Porcentaje de N del suelo al final del primer ciclo de soya (T1) (p=0,0089) y al final del último ciclo de soya (T2) (p=0,005). Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 28 AGRONOMÍA COSTARRICENSE El aumento en el contenido de C y N que recuperar el carbono orgánico de un suelo observado en este experimento, se debió a la puede llevar entre 20-50 años según la textura, la conversión en biomasa vegetal en el caso del estructura, la temperatura, el sistema del cultivo C y fijación biológica en el caso del N, princi- y el manejo del suelo, mientras que Hungria et ál. palmente a través de la incorporación en todos (2009) determinó en Brasil que con la adopción los tratamientos de la biomasa producida en de cero labranza se incrementó entre un 25% y un la unidad experimental. Si se asume que este 30% el total de C del suelo a los 7 años y luego de proceso de captura de C y N ocurre en los pri- 21 años los incrementos alcanzaron un 45%. Por meros 5 centímetros del suelo (donde se realizó su parte Ncube et ál. (2011) reporta que aplicacio- el muestreo) y se extrapola a una hectárea con nes combinadas de microorganismos eficientes una densidad aparente de valor uno, la captura (ME) en el cultivo del tomate, incrementaron el de C en el tratamiento BPAMM correspondería contenido de N en la planta y los contenidos de a 4200 kg.ha-1 más de C (15 401 kg CO2 captu- N en el suelo. rado) y 640 kg.ha-1 de N que en el tratamiento Las variables pH, conductividad eléctrica testigo. En este sentido Lal (2004) indica que el y respiración de suelos presentaron interacción límite crítico de carbono orgánico del suelo para entre los tratamientos y tiempo trascurrido. la mayoría de los suelos del trópico es de 1,1% y El valor del pH en el suelo original fue que hasta los pequeños incrementos se convier- de 5,5 (Cuadro 1), al realizar la evaluación en ten en un gran desafío en los suelos tropicales, T1 (Figura 4) se observó una tendencia al incre- aunque Alvarado (2006) demuestra como este mento del pH, excepto en los tratamientos a los valor varía en Costa Rica por zona de vida (entre que se aplicó MM, donde el pH fue significati- 1,1-19,8) y orden de suelo (entre 3,5-10,9). vamente menor, debido posiblemente a la acidez Sandoval (2014) encontró que en fincas del producto el cual presenta al ser aplicado un de café con sombra evaluadas por 28 años en pH alrededor de los 4,0. En la evaluación T2, Costa Rica, el incremento en el CO del suelo fue el pH aumentó significativamente en todos los de 0,76% bajo un manejo orgánico y de 0,60% tratamientos respecto a la evaluación inicial para el sistema convencional. Lal (2004) indica (Figura 4), los tratamientos a los que se aplicó Diferentes letras implican diferencias significativas. Fig. 4. Valores de pH al final del primer ciclo de soya (T1) y al final del último ciclo de soya (T2). (Interacción Tratamientos- Tiempo p=0,05). Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 CASTRO et ál.: Inoculación al suelo con Pseudomonas, Azospirillum y Bacillus 29 MM muestran un pH muy similar a los otros de MM el cual presentó al ser aplicado una CE tratamientos aunque menores al tratamiento T. de 7,0 dS.m-1 (Cuadro 3) debido a los aportes de El incremento del pH a lo largo del ensayo se iones del material orgánico (Bautista et ál. 2000), debe posiblemente a la acumulación de elementos así como de elementos como Ca y K aplicados solubles, en este caso bases en el sistema cerrado en la melaza (Fajardo y Sarmiento 2007). En que representa cada unidad experimental. Debido este sentido Bautista et ál. (2000) reportaron al aumento en las bases, la conductividad eléctri- conductividades eléctricas de hasta 19 dS.m-1 en ca fue mayor en la mayoría de los tratamientos material orgánico líquido tipo vinazas, las mis- en T2 (Figura 5), sin que el valor represente un mas se aplicaron al suelo donde no ocasionaron problema para el desarrollo de las plantas, des- problemas de salinidad. Los autores indican que taca la mayor CE de los tratamientos con adición al interactuar con el suelo se neutralizaron los de MM, posiblemente esto se deba a una mayor iones H+ y OH- que junto con K, Ca, Mg, otros solubilización de bases, las cuales se han acumu- iones y materia orgánica disuelta contribuyen en lado en la solución del suelo o al aporte del biol los valores de la CE. Diferentes letras implican diferencias significativas. Fig. 5. Valores conductividad eléctrica al final del primer ciclo de soya (T1) y al final del último ciclo de soya (T2). (Interacción Tratamientos-Tiempo p=0,0005). Cuadro 3. Análisis químico de los bioles de MM listos para la aplicación. CE % mg.kg-1 g.ml-1 Origen pH dS.m-1 N P Ca Mg K S Fe Cu Zn Mn B Dens Río Frío 3,5 7,2 0,05 0,01 0,03 0,01 0,14 0,02 39 ND ND ND ND 1,01 Coronado 3,7 7,1 ND 0,01 0,06 0,02 0,17 0,03 28 1 2 4 ND 1,01 Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 30 AGRONOMÍA COSTARRICENSE Se observó también un ligero aumento de los tratamientos con presencia de MM en T1, la CE de los tratamientos con aplicación de P. mientras que para la evaluación en T2 todos los fluorescens que se puede atribuir a la liberación tratamientos provocaron aumentos en esta varia- de nutrientes asociadas a las inoculaciones con ble, al parecer al menos el hecho de mantener el bacterias promotoras del crecimiento (Bhatta- suelo sin disturbar (comparado con el tratamiento charyya y Jha 2012). T) es suficiente para promover una respuesta, La actividad microbiana (Figura 6) medi- en este caso positiva. Destaca el hecho que los da como respiración de suelo fue mayor en tratamientos con mayor complejidad en orden Diferentes letras implican diferencias significativas. Fig. 6. Respiración de suelo al final del primer ciclo de soya (T1) y al final del último ciclo de soya (T2) (Interacción Tratamientos-Tiempo p=<0,0001). ascendente BP, BPA, MM, BPAMM lograron los población de microorganismos al comparar el valores mayores de respiración de suelos en T2. tratamiento T con los tratamientos TS (presencia Esto probablemente se deba a que a mayor diver- de Bradyrhizobium) y A (presencia de Bradyrhi- sidad microbiana, mayor probabilidad de explotar zobium y Azospirillum), en este sentido Bashan diferentes fuentes de carbono. y de-Bashan (2010) indican que géneros como Al evaluar el efecto de los tratamientos Azospirillum pueden presentar actividad anta- sobre las poblaciones de hongos, bacterias y gónica debido a la producción de sideróforos, actinomicetes (Cuadro 4) se observó una menor HCN, bacteriocinas y ácido fenilacético. Las Cuadro 4. Logaritmo del número de UFC/g de hongos, bacterias y actinomicetes evaluados al final del último ciclo de soya (p=<0,0001 para las 3 variables). Tratamientos Logaritmo del número T TS B P A MM BP BPA BPAMM Hongos 5,60 c 5,18 ab 5,44bc 5,56 c 5,13 a 5,95 d 5,43bc 5,63 c 5,39 d Bacterias 6,65 bc 6,35 a 6,68 bcd 6,87 cd 6,33 a 6,91 d 6,61 b 6,76 bcd 7,44 e Actinos 6,23 b 5,95 a 6,45 bc 6,67 d 5,84 a 6,74 de 6,59 cd 6,70 cde 6,95 e Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 CASTRO et ál.: Inoculación al suelo con Pseudomonas, Azospirillum y Bacillus 31 inoculaciones con Bacillus y Pseudomonas no y 23% respectivamente y en referencia al trata- provocaron efectos significativos en las pobla- miento TS, sin embargo, en concordancia con las ciones de hongos, bacterias y actinomicetes, otras variables evaluadas, fueron los tratamientos mientras que las inoculaciones mixtas de estos con MM los que causaron una mayor producción microorganismos lograron aumentar la población de biomasa en los 3 ciclos de soya (64%). de actinomicetes; para las 3 variables mencio- En el caso de tomate (Figura 8) los trata- nadas el tratamiento con mayor complejidad (BPAMM) mostró los recuentos más altos. mientos con adición de MM obtuvieron la mayor Respecto a la producción de biomasa para producción de biomasa (alrededor de 179%) res- soya (Figura 7), la inoculación con A, BP y BPA pecto al tratamiento T. Las inoculaciones con P, logró aumentar la biomasa evaluada como peso BP y BPA también lograron aumentar la produc- fresco foliar acumulado (suma de la biomasa de ción de biomasa evaluada como PFF acumulado todos los ciclos de cultivo) (PFF), en 18%, 22% en 43%, 43% y 39% respectivamente. Fig. 7. Peso fresco foliar acumulado obtenido en los 3 ciclos de soya. (p=<0,0001). Fig. 8. Peso fresco foliar acumulado obtenido en los 2 ciclos de tomate. (p=<0,0001). Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 32 AGRONOMÍA COSTARRICENSE Se observó respuesta en el crecimiento (2015) indica que al determinar los contenidos de de ambos cultivos a las inoculaciones tanto de N en tejidos foliares de forestales, aquellos que microorganismos como de bioles de MM, sin pertenecen a las leguminosas presentan mayores embargo la respuesta en porcentajes fue mayor en concentraciones. el caso del tomate; este comportamiento puede En cuanto a la cantidad de elementos deberse a que la soya presenta una relación sim- y microelementos extraídos por las plantas de biótica que le permite acceder al nitrógeno atmos- tomate en el último ciclo, los datos se muestran férico, elemento considerado como el nutriente en el Cuadro 5. Para la mayoría de los nutrientes más limitante para el crecimiento de las plantas la inoculación con cualquiera de los microorga- (Franche et ál. 2009), en este sentido Alvarado nismos utilizados logró incrementar el contenido Cuadro 5. Nutrimentos extraídos por planta en los diferentes tratamientos en el segundo ciclo de tomate (Solanum lycopersicum). Tratamientos g.planta-1 TA TS B P A MM BP BPA BPAMM P 0,01 a 0,01 a 0,02 a 0,02 a 0,02 a 0,13 b 0,02 a 0,03 a 0,13 b N 0,11 a 0,16 ab 0,23 bc 0,28 c 0,23 bc 0,53 d 0,26 c 0,28 c 0,51 d Ca 0,12 a 0,15 ab 0,23 bc 0,26 cd 0,24 cd 0,64 e 0,30 cd 0,31 d 0,65 e Mg 0,03 a 0,06 b 0,06 b 0,07 b 0,06 b 0,17 c 0,08 b 0,07 b 0,17 c K 0,22 a 0,34 b 0,33 ab 0,43 b 0,35 b 0,97 c 0,45 b 0,44 b 0,97 c S 0,06 a 0,08 a 0,14 b 0,15 b 0,14 b 0,37 c 0,17 b 0,17 b 0,36 c Fe 0,98 a 1,12 a 2,87 abc 2,60 abc 2,26 ab 7,55 d 3,29 bc 4,39 c 7,06 d Cu (mg) 0,13 a 0,21 ab 0,29 bc 0,35 cd 0,30 bc 0,45 de 0,35 cd 0,37 cde 0,47 e B (mg) 0,26 a 0,41 a 0,77 b 0,84 bc 0,72 b 1,06 c 0,76 b 0,85 bc 1,07 c p=<0,0001. foliar del elemento, sin embargo fueron los trata- de P encontrados en este producto (3,3*109 UFC. mientos inoculados con MM los que presentaron ml-1), a la presencia de ácidos orgánicos en el biol las respuestas más significativas. Respecto al que pueden solubilizar el P presente (Richardson contenido de P los únicos tratamientos que no et ál. 2009), o a un efecto combinado de ambos presentaron síntomas visibles de deficiencia de factores. Cuando se comparó el contenido de P en P (reconocidos como tonalidades púrpuras por el haz y el envés de las hojas bajeras) fueron aque- el suelo original, con el contenido de P en el trata- llos a los cuales se les aplicó MM, lo que coincide miento con MM al final del ensayo (Cuadro 6), se con los mayores contenidos de P foliar, posible- encontró que a pesar de los ciclos de cultivo, este mente este hecho está relacionado con las altas elemento pasó de 6 a 20 mg.l-1 mientras que en el poblaciones de microorganismos solubilizadores tratamiento T al final del ensayo fue de 3 mg.l-1. Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 CASTRO et ál.: Inoculación al suelo con Pseudomonas, Azospirillum y Bacillus 33 Cuadro 6. Análisis químico del suelo original, de los tratamientos BPAMM y T, al final del ensayo. pH cmol(+).l-1 % mg.l-1 H2O ACIDEZ Ca Mg K CICE SA P Zn Cu Fe Mn Suelo original 5,5 0,1 7,2 1,4 0,5 9,3 2,0 6,0 8,0 3,0 275 115 BPAMM * 6,2 0,2 6,1 2,0 1,2 9,4 1,8 19,8 4,8 3,3 189 18 T* 5,9 0,2 5,5 1,4 0,3 7,4 2,3 3,3 4,2 2,0 171 34 *Promedio de 4 repeticiones. En el caso del N la inoculación con B, BP respecto a T y a TS; para el caso del B la inocu- y BPA (comparado con TS) causó un aumento lación con al menos un microorganismo aumentó del contenido foliar de este elemento, pero fue la absorción del nutriente. la aplicación de MM el tratamiento que permi- Richardson et ál. (2009) indica que la ino- tió obtener los mayores contenidos de N en la culación con rizobacterias aumenta la absorción planta (Cuadro 5). de nutrientes como Ca, K, Fe, Cu, Mn y Zn y Los tratamientos a los que se aplicó MM que este incremento podría ser explicado por la presentaron los mayores valores de Mg, K, Ca y producción de ácidos orgánicos por las plantas S (Cuadro 5), mientras que la rotación con soya y/o las bacterias que disminuye el pH de la rizós- logró aumentar la cantidad de Mg y K absor- fera y hacen solubles formas no disponibles de bida por la planta, no así las inoculaciones con nutrimentos adyacentes a la raíz. En el caso del microorganismos solos o en mezcla. Para el Ca la P pueden alterar la solubilidad de compuestos inoculación con P, A, BP y BPA aumentó el nivel inorgánicos o afectar la cinética de las reacciones de este elemento en la planta; en el caso del S la de adsorción-desorción de ortofosfatos en el suelo inoculación con al menos un microorganismo con la subsecuente disponibilidad de fosfatos. aumentó la absorción del nutriente. En el Cuadro 6 se observa el aumento en los contenidos de Mg Otros factores a considerar son el potencial de y K en la solución del suelo en el tratamiento oxidación/reducción y el pH del suelo. BPAMM al final del ensayo, mientras que el Zn, Hay que destacar que la aplicación de MM Fe y el Mn generalmente relacionados con condi- afectó una cantidad importante de las variables ciones reducidas y ácidas en el suelo, disminuye- evaluadas, las cuales convergen en una mayor ron tanto en el tratamiento BPAMM como en el producción de biomasa de soya y tomate. Este tratamiento T. tratamiento modificó las propiedades biológicas Para los microelementos Fe, Cu, B los tra- del suelo según quedó evidenciado al evaluar la tamientos con aplicación de MM fueron también respiración y las poblaciones microbianas, este los que permitieron un mayor contenido del ele- efecto puede deberse al aporte nutricional del mento en la planta (Cuadro 5). En el caso de las MM a la flora microbiana del suelo consistente inoculaciones con los microorganismos, para el en nutrientes (Cuadro 6), azúcares, vitaminas, Fe solamente los tratamientos BP y BPA aumen- ácidos orgánicos, y a la adición de un inóculo taron los valores de este elemento con respecto al microbiano rico en levaduras (1*108 UFC.ml-1) tratamiento T, mientras que las inoculaciones con y lactobacilos (1,5*108 UFC.ml-1), microorganis- un solo microorganismo no presentaron respues- mos que producen ácidos orgánicos, antibióticos ta; para el Cu los tratamientos P, A, BP y BPA y sustancias promotoras de crecimiento. El aporte lograron incrementar la absorción del elemento nutricional directo a la planta es poco probable Agronomía Costarricense 39(3): 21-36. ISSN:0377-9424 / 2015 34 AGRONOMÍA COSTARRICENSE ya que el producto al ser aplicado presenta muy LITERATURA CITADA bajos contenidos de nutrimentos (Cuadro 3). Por otro lado, la aplicación de MM favo- ALVARADO A. 2006. Potential of soil carbon sequestration in Costa Rica. Chapter 8, pp. 147-165. In: R. La.l, reció una mayor absorción de nutrientes por las C.C. Cerri, M. Bernoux, J. Etchevers and C.E. plantas y/o una mayor disponibilidad de P, Mg Cerri (eds.). Carbon sequestration in soils of Latin y K en la solución del suelo (Cuadro 6). Estos America. The Haworth Press Inc. USA. efectos pueden deberse a la liberación de ácidos ALVARADO A., CAMACHO M., FERNÁNDEZ J., orgánicos durante la descomposición de residuos, MEZGER G., MATA R., BERTSCH F., ARAYA M., AVELLÁN M., MURILLO R., RAMÍREZ al mayor aporte de biomasa en este tratamiento, D., PORTUGUEZ E., FALLAS J., ÁVILA C., a cambios en el pH del suelo y a cambios en la MONTERO M., RAIGOSA J., RÍOS V., VAIDES flora microbiana que incidieran en la promoción E. 2015. Interpretación del análisis foliar de de crecimiento. Según Nakkeeran (2005), la apli- varias especies forestales latifoliadas del trópico americano. 61 p. 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How Según los resultados de este estudio la uti- the plant growth-promoting bacteria Azospirillum promotes plant growth-A critical assessment. lización de bioles de MM afectó las propiedades Advances in Agronomy 108:77-136. químicas y biológicas de las unidades experi- BASHAN Y., HOLGUIN G., DE-BASHAN L. 2004. mentales y este efecto promovió el crecimiento Azospirillum-plant relationships: physiological, de las plantas de soya y tomate. Por su origen molecular, agricultural, and environmental advances (1997–2003). Can. J. Microbiol. 50:521–577. (poblaciones nativas de bosques naturales) y BAUTISTA F., DURÁN C., LOZANO R. 2000. Cambios preparación, los bioles de MM tienen potencial químicos en el suelo por aplicación de materia para ser utilizados como insumo en la produc- orgánica soluble tipo vinazas. Rev. Int. Contam. ción agrícola sostenible. 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