UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO CARACTERIZACIÓN DE LAS ESPECIES Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum Y R. syzygii EN LAS PRINCIPALES ZONAS PRODUCTORAS DE TOMATE (Solanum lycopersicum) EN COSTA RICA Y VERIFICACIÓN DE LA PATOGENICIDAD Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales con énfasis en Protección de Cultivos. ANNY CALDERÓN ABARCA Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica. 2025 ii DEDICATORIA A mi madre y a mi familia, por acompañarme en cada paso de este camino. iii AGRADECIMIENTO Al comité asesor, por su guía y acompañamiento durante el desarrollo de este trabajo. A los productores e ingenieros que me permitieron visitar y muestrear los cultivos de tomate. A CORBANA, por facilitar el acceso a controles positivos de ADN para la detección de Ralstonia spp. A los oficiales de seguridad, por su apoyo y buena disposición para facilitar mi ingreso a la Institución fuera del horario regular, lo cual fue fundamental para el desarrollo de mi investigación. A colegas, compañeros y todas las personas que, de una u otra forma, colaboraron para que este Trabajo Final de Graduación fuera posible. A mi familia, por su apoyo incondicional en todo momento. v ÍNDICE DE CONTENIDOS Dedicatoria .............................................................................................................................. ii Agradecimiento ............................................................................................................................. iii Índice de contenidos ...................................................................................................................... v Resumen ........................................................................................................................... viii Abstract ............................................................................................................................. ix Índice de cuadros ........................................................................................................................... x Índice de figuras ........................................................................................................................... xii Anexos .......................................................................................................................... xvii Lista de abreviaturas ................................................................................................................... xix Capítulo 1. Introducción general .................................................................................................... 1 Objetivos .............................................................................................................................. 4 Objetivo general ........................................................................................................ 4 Objetivos específicos ................................................................................................. 4 Marco teórico ....................................................................................................................... 5 Generalidades del cultivo .......................................................................................... 5 Generalidades de Ralstonia spp. ................................................................................ 5 Clasificación taxonómica de Ralstonia spp. a través del tiempo............................... 6 Biología de Ralstonia spp. ....................................................................................... 10 Manejo de Ralstonia spp. ........................................................................................ 11 Hospederos de Ralstonia spp................................................................................... 12 Pruebas diagnósticas para Ralstonia spp. ................................................................ 13 Capítulo II. Caracterización fenotípica de morfotipos Complejo de especies de Ralstonia solanacearum provenientes de zonas de producción de tomate en Costa Rica ........................... 18 Resumen ............................................................................................................................ 18 Palabras clave .................................................................................................................... 19 Abstract .............................................................................................................................. 19 vi Introducción ....................................................................................................................... 19 Materiales y métodos ......................................................................................................... 21 Colecta del material ................................................................................................. 21 Aislamiento de bacterias.......................................................................................... 23 Caracterización de los morfotipos ........................................................................... 23 Verificación de Ralstonia spp. en morfotipos Gram negativos ............................... 27 Análisis de datos ...................................................................................................... 27 Resultados .......................................................................................................................... 28 Discusión ........................................................................................................................... 41 Conclusiones ...................................................................................................................... 45 Agradecimientos ................................................................................................................ 46 Literatura citada ................................................................................................................. 46 Capítulo III. Identificación molecular de Ralstonia pseudosolanacearum, R. solanacearum, R. syzygii en cultivos de tomate en Costa Rica ................................................................................ 54 Resumen ............................................................................................................................ 54 Palabras clave .................................................................................................................... 54 Abstract .............................................................................................................................. 55 Introducción ....................................................................................................................... 55 Metodología ....................................................................................................................... 57 Colecta de material .................................................................................................. 57 Aislamiento bacteriano ............................................................................................ 59 Selección de morfotipos para análisis ..................................................................... 59 Identificación molecular por medio de PCR punto final ......................................... 60 Resultados .......................................................................................................................... 62 Discusión ........................................................................................................................... 71 Conclusiones ...................................................................................................................... 73 Agradecimientos ................................................................................................................ 74 Literatura citada ................................................................................................................. 74 vii Capítulo IV. Evaluar la patogenicidad de al menos una especie de RSSC, aislada de tomate .... 82 Resumen ............................................................................................................................ 82 Palabras clave .................................................................................................................... 83 Abstract .............................................................................................................................. 83 Introducción ....................................................................................................................... 84 Metodología ....................................................................................................................... 85 Ensayo 1 .................................................................................................................. 85 Ensayo 2 .................................................................................................................. 91 Resultados .......................................................................................................................... 96 Ensayo 1 .................................................................................................................. 96 Ensayo 2 ................................................................................................................ 106 Discusión ......................................................................................................................... 115 Conclusiones .................................................................................................................... 117 Agradecimientos .............................................................................................................. 117 Literatura citada ............................................................................................................... 118 Discusión general ....................................................................................................................... 123 Conclusiones generales .............................................................................................................. 125 Recomendaciones generales ...................................................................................................... 126 Literatura citada ......................................................................................................................... 127 Anexos .......................................................................................................................... 147 viii RESUMEN La investigación se centró en la caracterización fenotípica y molecular de las especies del Complejo de Especies de Ralstonia spp., las cuales se asocian con el síntoma de la marchitez bacteriana en tomate, una enfermedad de importancia agrícola para el cultivo. Por lo cual es necesario identificar y comprender la diversidad y la patogenicidad de las especies para desarrollar estrategias efectivas de manejo de la enfermedad. Se realizó la colecta de 77 plantas sintomáticas por marchitez bacteriana en 25 puntos de muestreo distribuidos en 17 fincas, de las cuales se colectaron 33 plantas en la provincia de Alajuela, 22 en Cartago, ocho en Heredia y 10 en San José, además de otras cuatro de un área desconocida porque el productor no brindó los datos exactos de la ubicación. El tejido sintomático de cada planta se aisló en medio de cultivo de TZC (por sus siglas en inglés Triphenyl-Tetrazolium Chloride) (Kelman, 1954); donde se analizó el morfotipo en términos de morfología (pigmentación, forma y consistencia), así como la identidad molecular de los aislamientos para las especies del RSSC (Complejo de Especies de Ralstonia solanacearum) con base en los cebadores del gen 16S rADN (Seal et al., 1993) específicos para el género y los que amplifican la región ITS para la diferenciación de especies y filotipos (Prior & Fegan, 2005a), según ubicación de muestreo. Posteriormente, se realizó la prueba de patogenicidad con la especie R. pseudosolanacearum- filotipo I en híbridos de tomate con diferente nivel de resistencia reportada. Sólo 58 morfotipos fueron positivos para RSSC a partir de 91 morfotipos bacilos Gram negativos aislados, donde los morfotipos positivos para Ralstonia spp. tenían diversidad fenotípica. De acuerdo con lo reportado en la literatura para el medio TZC (Nurdika et al., 2022), 27.59% fueron caracterizados como virulentos con un color rojo o rosado y un borde amplio color blanco y consistencia fluida o mucoide, a diferencia de los morfotipos avirulentos (27.59%) que tienden a ser redondos, pequeños y completamente rojos. Con base en la identificación molecular se registró R. pseudosolanacearum- filotipo I en las cuatro provincias muestreadas, R. solanacearum- filotipo II en Alajuela, Cartago y Heredia, y un posible R. syzygii – filotipo IV en Heredia. Con base en las pruebas de patogenicidad se observó que híbridos de tomate con diferente nivel de resistencia pueden verse afectados por la marchitez bacteriana, aunque al no haber diferencias significativas, no se puede ser concluyente acerca del grado de afectación. Con lo cual se concluye que hay alta variabilidad fenotípica en la identificación de Ralstonia spp. a nivel de cultivo utilizando el medio TZC, diferente a lo que reporta la literatura. Se confirma la existencia de R. pseudosolanacearum- filotipo I y R. solanacearum- filotipo II en las zonas muestreadas. En cuanto a la presencia de R. syzygii– filotipo IV como posible nuevo hallazgo, el resultado debe ser confirmado por secuenciación del genoma bacteriano completo. En relación con las pruebas de inoculación, al no tener resultados concluyentes, es necesario que en un futuro se repliquen con aislamientos de bacterias frescas que no hayan perdido la virulencia. ix ABSTRACT This investigation focused on the phenotypic and molecular characterization of Ralstonia spp. species (a significant agricultural disease) associated with tomato bacterial wilt symptoms. It is essential to identify and understand the diversity and pathogenicity of these species to develop effective disease management strategies. A total of 77 symptomatic plants were collected from 25 sampling points distributed across 17 agricultural farms, collected 33 plants were in Alajuela, 22 in Cartago, eight in Heredia, and 10 in San José, as well as four unknown locations due to the producer's lack of precise location data. The symptomatic tissue from each plant was isolated on TZC medium (Triphenyl-Tetrazolium Chloride) (Kelman, 1954) and analyzed for morphotypes in terms of morphology (pigmentation, shape, and consistency). As well as the molecular identity of the species within the RSSC (Ralstonia solanacearum species complex). This was based on primers for the 16S rRNA gene (Seal et al., 1993) specific to the genus, and those that amplify the ITS region for species and phylotype differentiation (Prior & Fegan, 2005), sampling was conducted according to location. Subsequently, pathogenicity testing was performed using R. pseudosolanacearum- phylotype I on tomato hybrids with varying levels of reported resistance. The results showed that positive morphotypes for Ralstonia spp. exhibited phenotypic diversity, with only 58 morphotypes being positive for RSSC among 91 gram-negative bacilli. According to literature reports for the TZC medium (Nurdika et al., 2022), 27.59% were characterized as virulent with a red or pink color and a broad white border and fluid or mucoid consistency, in contrast to avirulent morphotypes (27.59%) that tend to be round, small, and completely red. Based on molecular identification, R. pseudosolanacearum- phylotype I was registered in all four provinces, R. solanacearum- phylotype II in Alajuela, Cartago, and Heredia, and a possible R. syzygii – phylotype IV in Heredia. The pathogenicity tests showed that tomato hybrids with different levels of resistance can be affected by bacterial wilt. However, no significant differences made it impossible to conclude the degree of impact. Therefore, it is concluded that there is high phenotypic variability in identifying Ralstonia spp. at the cultivation level in the TZC medium, differing from what is reported in the literature. The existence of R. pseudosolanacearum- phylotype I and R. solanacearum- phylotype II in the sampled areas. Regarding the presence of R. syzygii– phylotype IV as a possible new finding in Heredia; the result must be confirmed through whole bacterial genome sequencing. Additionally, for pathogenicity tests without conclusive results, it is required to replicate the study test by using fresh bacterial isolates that have not lost their virulence. ÍNDICE DE CUADROS Cuadro I. Oxidación de alcoholes y producción de ácido a partir de disacáridos según biovar. Fuente: Hayward (1964) y Huang et al. (2012) modificado. “+”: Positivo para la prueba, “-“: negativo para la prueba. .......................................................................................................... 8 Cuadro II. Características diferenciales de R. solanacearum (Smith 1896). Fuente: elaboración propia con base a Hassan et al., 2016; Yabuuchi et al. (2005) ................................. 14 Cuadro III. Identificación de los filotipos en los cuales se subdividía anteriormente las tres especies de Ralstonia spp., con un tamaño de secuencia de 666pb, al utilizar los cebadores M13rev-29 y M13uni-21. Fuente: (EPPO, 2021b) ...................................................................... 16 Cuadro IV. Cuadro descriptivo que agrupa las características fenotípicas evaluadas para los morfotipos de Ralstonia spp. Continúa… .................................................................................... 36 Cuadro IV. Cuadro descriptivo que agrupa las características fenotípicas evaluadas para los morfotipos de Ralstonia spp. ....................................................................................................... 37 Cuadro V. Síntesis de características fenotípicas evaluadas para los morfotipos de Ralstonia spp. Continúa… ........................................................................................................................... 67 Cuadro VI. Cantidad de plantas de cada híbrido muestreado, positivas para R. pseudosolanacearum- filotipo I (Rp- FI), R. solanacearum- filotipo II (Rs- FII) o R. syzygii- filotipo IV (Rs- FIV), según provincia. ........................................................................................ 70 Cuadro VII. Cuantificación y cálculos de suspensión de bacteria para inóculo. .................... 87 Cuadro VIII. Descripción de tratamientos utilizados en el ensayo 1. ...................................... 88 Cuadro IX. Valor de las interacciones de las variedades de tomate según el tratamiento. Fuente: González y Summers (1996) y López (2021), modificado. ............................................ 89 Cuadro X. Cuantificación y cálculos de suspensión de bacteria para inóculo. .................... 93 Cuadro XI. Descripción de tratamientos utilizados en el ensayo 2. ...................................... 94 Cuadro XII. Área bajo la curva de los síntomas evaluados en plantas de tomate, durante cuatro semanas de evaluación. .............................................................................................................. 102 Cuadro XIII. Detección de RSSC en las plantas, al término de cuatro semanas después de inoculación. Rp-FI: Ralstonia pseudosolanacearum- filotipo I, Rs-FII: Ralstonia solanacearum- filotipo II. .......................................................................................................................... 106 xi Cuadro XIV. Área bajo la curva de los síntomas evaluados en plantas de tomate, durante seis semanas de evaluación. .............................................................................................................. 110 Cuadro XV. Resumen de la detección de Ralstonia pseudosolanacearum-filotipo I, en las unidades experimentales de cada tratamiento. ........................................................................... 114 xii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Área sembrada (hectáreas) del cultivo de tomate en Costa Rica, según cantón. Punto en rojo es la Estación Experimental Agrícola Fabio Baudrit Moreno (EEAFBM). Fuente: (Instituto Nacional de Estadística y Censos, 2014). Realizado por Dr. Mauricio Serrano (2021). 1 Figura 2. Ejemplos de plantas muestreadas con síntomas de marchitez generalizada (encerradas con un óvalo rojo). A. Muestreo en Santa Cruz, Turrialba, Cartago, B. Muestreo en Santiago, Paraíso, Cartago, C. Muestreo en Barrantes, Flores, Heredia, D. Muestreo en San Isidro, Atenas, Alajuela. .......................................................................................................................... 22 Figura 3. Ilustración del proceso de preparación de las muestras para el aislamiento de bacterias. A. Ejemplificación del seccionamiento de la planta. B. Síntomas de coloración marrón a lo interno de la base del tallo. C. Representación de la preparación de muestras para la desinfección. D. Tejido de tomate en maceración, inmerso en solución salina. .......................... 25 Figura 4. Representación del proceso de aislamiento de microorganismos a partir de una única unidad de muestreo. A. Con base a una planta muestreada, B. se aisló de cada una de las partes sintomáticas de la planta y C. se obtuvo una placa de aislamiento por cada parte de la planta, donde se identificaron todos los morfotipos diferentes. D. Cada morfotipo se aisló, se caracterizó fenotípicamente y se identificó si era o no Ralstonia spp. a nivel molecular. ............................. 26 Figura 5. Resultado del conteo de morfotipos, de acuerdo con (B.) la evaluación de la forma de las bacterias y (C.) resultado de tinción Gram. ....................................................................... 29 Figura 6. Totalidad de morfotipos bacilos Gram negativos, aislados en medio de cultivo TZC, caracterizados según pigmentación, forma y consistencia. ................................................ 30 Figura 7. Morfotipos de coloración típica obtenidos en medio de cultivo TZC. A. Morfotipo rojo/rosado, de forma irregular y consistencia mucoide. B. Morfotipo rojo/rosado, borde blanco, de forma puntiforme (3mm de diámetro) y consistencia no mucoide. C. Morfotipo rojo, puntiforme (2.5 mm de diámetro), no mucoide. D. Morfotipo rojo, puntiforme (3.5mm de diámetro), no mucoide. ................................................................................................................ 30 Figura 8. Morfotipos obtenidos en medio de cultivo TZC, con pigmentación diferente a las tonalidades rojo/rosado con borde blanco y únicamente rojo. A. Morfotipo con tonalidad rosada (dimensiones de 4x3mm). B. Morfotipo con tonalidad blanca/crema (2 mm de diámetro). C. Morfotipo con tonalidad naranja (5mm de diámetro). D. Morfotipo de tonalidad mostaza (5mm de diámetro). ............................................................................................................................ 31 xiii Figura 9. Totalidad de morfotipos bacilos Gram negativo, aislados en medio de cultivo TZC, asociados a Ralstonia spp. caracterizados según pigmentación, forma y consistencia. ..... 32 Figura 10. Bacilos Gram negativos aislados en medio de cultivo TZC, positivos para Ralstonia spp. caracterizados según pigmentación, forma y consistencia, para las provincias de A. Alajuela y B. Cartago. .................................................................................................................. 38 Figura 11. Bacilos Gram negativos aislados en medio de cultivo TZC, positivos para Ralstonia spp. caracterizados según pigmentación, forma y consistencia, para las provincias de A. Heredia y B. San José. ................................................................................................................. 39 Figura 12. Bacilos Gram negativos aislados en medio de cultivo TZC, positivos para Ralstonia spp. caracterizados según pigmentación, forma y consistencia, para la ubicación desconocida. .... 40 Figura 13. Sintomatología de marchitez generalizada (encerradas con un óvalo rojo) en cultivos de tomate. A. Plantas en Santa Cruz, Turrialba, Cartago, B. Plantas en Santiago, Paraíso, Cartago, C. Plantas en Barrantes, Flores, Heredia, D. Plantas en San Isidro, Atenas, Alajuela. . 58 Figura 14. Ejemplo del proceso para la obtención de morfotipos para la identificación de Ralstonia spp., donde cada planta muestreada (A) se seccionó en diferentes partes (B) y se aisló a partir de las partes de planta sintomáticas (C), de los cuales se obtuvo “n” cantidad de diferentes morfotipos por aislamiento (D). ................................................................................................... 60 Figura 15. Resultados de productos de PCR para morfotipos bacilos Gram negativos. Pocillo E: Gene Ruler 100pb Plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM). A. Cepas representantes de Ralstonia spp. con los cebadores Oli1/Y2. B. Cepas representantes de R. pseudosolanacearum- filotipo I. C. Cepas representantes de R. solanacearum- filotipo II. D. Cepas con banda de tamaño correspondiente a R. syzygii- filotipo IV. E. Cepas con de resultados atípicos con R. pseudosolanacearum- filotipo I y R. solanacearum- filotipo II. ................................................. 63 Figura 16. Cuantificación de plantas según la identificación de especies de Ralstonia spp. R. pseudosolanacearum- Filotipo I (Rp- FI), R. solanacearum- Filotipo II (Rs-FII) y R. syzygii- Filotipo IV (Rs- FIV). .................................................................................................................. 64 Figura 17. Cantidad de plantas positivas para Ralstonia spp. R. pseudosolanacearum- Filotipo I (Rp- FI), R. solanacearum- Filotipo II (Rs-FII) y R. syzygii- Filotipo IV (Rs- FIV), según provincia de muestreo. ................................................................................................................. 65 xiv Figura 18. Mapeo de la presencia de los diferentes filotipos de Ralstonia spp. en Costa Rica, según los cantones muestreados. A. Ralstonia pseudosolanacearum-Filotipo I, B. Ralstonia solanacearum-Filotipo II, C. Ralstonia syzygii-Filotipo IV. ....................................................... 69 Figura 19. Crecimiento de las bacterias 66.1.4 (A), 72.2.1 (B) y 75.1.1 (C) en medio de cultivo TZC al término de cuatro, dos y cuatro días, respectivamente. ....................................... 86 Figura 20. Distribución de tratamientos en el invernadero 5 del CIPROC. ........................ 90 Figura 21. Crecimiento de las bacterias 68.1.1 (A) y 72.2.1 (B) en medio de cultivo TZC al término de dos días. ..................................................................................................................... 92 Figura 23. Incidencia de síntomas asociados a Ralstonia spp., según tratamiento e híbrido de tomate. A. Armada. B. Milán. T1: inoculó con la cepa 72.2.1, T2: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 72, T3: fue el inóculo bacteriano 75.1.1, T4: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 75, T5: el inóculo 66.1.4, T6: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 66, T7: suelo autoclavado que se utilizó para inocular, T8: el suelo sin autoclavar. . 100 Figura 24. Evolución del síntoma de la marchitez para cada híbrido según el tratamiento, en el ensayo 1. T1: inoculó con la cepa 72.2.1, T2: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 72, T3: fue el inóculo bacteriano 75.1.1, T4: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 75, T5: el inóculo 66.1.4, T6: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 66, T7: suelo autoclavado que se utilizó para inocular, T8: el suelo sin autoclavar. .......................... 101 Figura 25. Plantas representativas de la severidad en cada tratamiento para el híbrido Armada, al término de cuatro semanas después de inoculación. A: T1- inoculó con la cepa 72.2.1, B: T2- suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 72, C: T3- fue el inóculo bacteriano 75.1.1, D: T4- suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 75, E: T5- el inóculo 66.1.4, F: T6- suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 66, G: T7- suelo autoclavado que se utilizó para inocular, H: T8- el suelo sin autoclavar. ................................................................... 103 Figura 26. Plantas representativas de la severidad en cada tratamiento para el híbrido Milán, al término de cuatro semanas después de inoculación. A: T1- inoculó con la cepa 72.2.1, B: T2- suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 72, C: T3- fue el inóculo bacteriano 75.1.1, D: T4- suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 75, E: T5- el inóculo 66.1.4, F: T6- suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 66, G: T7- suelo autoclavado que se utilizó para inocular, H: T8- el suelo sin autoclavar. .............................................................................. 104 Figura 27. Plantas representativas de la severidad en cada tratamiento para los híbridos Milán (A) y Armada (B), al término de cuatro semanas después de inoculación. E: marcador molecular, xv T1: inoculó con la cepa 72.2.1, T2: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 72, T3: fue el inóculo bacteriano 75.1.1, T4: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 75, T5: el inóculo 66.1.4, T6: suelo donde estaban las raíces de la planta sintomática 66, T7: suelo autoclavado que se utilizó para inocular, T8: el suelo sin autoclavar, “Positivo”: control positivo R. pseudosolanacearum- filotipo I, “Negativo”: control negativo. .................................................. 105 Figura 28. Porcentaje de incidencia (A) y área bajo la curva (B) de los síntomas evaluados en las plantas de tomate, durante seis semanas luego de inoculación. T0: testigo sin inocular, T1: inoculación con 68.1.1, T2: inoculación con 72.2.1, V1: Milán, V2: Amada, V3: Shin Cheon 108 Figura 29. Plantas representativas de la severidad en cada tratamiento al término de seis semanas después de inoculación. A: V1T0- Milán en suelo sin inocular, B: V1T1- Milán inoculado con 68.1.1, C: V1T2- Milán inoculado con 72.2.1, D: V2T0- Armada en suelo sin inocular, E: V2T1- Armada inoculado con 68.1.1, F: V2T2- Armada inoculado con 72.2.1, G: V3T0- Shin Cheong Gang en suelo sin inocular, H: V3T1- Shin Cheong Gang inoculado con 68.1.1, I: V3T2- Shin Cheong Gang inoculado con 72.2.1. .................................................................................. 109 Figura 30. Análisis de la presencia de RSSC en plantas para cada tratamiento para los híbridos Milán (V1), Armada (V2) y Shin Cheong Gang (V3), al término de seis semanas después de inoculación. MM: marcador molecular, T0: suelo autoclavado que se utilizó para inocular, T1: inoculó con la cepa 68.1.1, T2: fue el inóculo bacteriano 72.2.1, “+”: control positivo de R. pseudosolanacearum- filotipo I, “-”: control negativo. Continúa. ................................................ 111 Figura 30. Análisis de la presencia de RSSC en plantas para cada tratamiento para los híbridos Milán (V1), Armada (V2) y Shin Cheong Gang (V3), al término de seis semanas después de inoculación. MM: marcador molecular, T0: suelo autoclavado que se utilizó para inocular, T1: inoculó con la cepa 68.1.1, T2: fue el inóculo bacteriano 72.2.1, “+”: control positivo de R. pseudosolanacearum- filotipo I, “-”: control negativo. Continúa. ................................................ 112 Figura 30. Análisis de la presencia de RSSC en plantas para cada tratamiento para los híbridos Milán (V1), Armada (V2) y Shin Cheong Gang (V3), al término de seis semanas después de inoculación. MM: marcador molecular, T0: suelo autoclavado que se utilizó para inocular, T1: inoculó con la cepa 68.1.1, T2: fue el inóculo bacteriano 72.2.1, “+”: control positivo de R. pseudosolanacearum- filotipo I, “-”: control negativo, N/A: no hay muestra. ............................. 113 Figura 31. Análisis de la presencia de RSSC en los suelos de cada tratamiento para los híbridos Milán (V1), Armada (V2) y Shin Cheong Gang (V3), al término de seis semanas después de inoculación. E: marcador molecular, T0: suelo autoclavado que se utilizó para inocular, T1: xvi inoculó con la cepa 68.1.1, T3: fue el inóculo bacteriano 72.2.1, “+”: control positivo de R. pseudosolanacearum- filotipo I, “-”: control negativo, N/A: no hay muestra. ............................. 114 xvii ANEXOS Anexo 1. Origen geográfico y familias de hospederos asociados, según biovar. Fuente: Hayward (1964), Cook y Sequeira (1994), Pussier et al. (1999), modificados. ........................ 147 Anexo 2. Detalle de la reclasificación del Complejo de Especies de Ralstonia solanacearum. Fuente: Prior & Fegan (2005), Prior et al. (2016), Safni et al. (2014). ............. 148 Anexo 3. Lista de cebadores para amplificar y secuenciar cepas del Complejo de Especies de Ralstonia spp. Fuente: Wicker et al. (2012). Continúa… ..................................................... 149 Anexo 3. Lista de cebadores para amplificar y secuenciar cepas del Complejo de Especies de Ralstonia spp. Fuente: Wicker et al. (2012). ......................................................................... 150 Anexo 4. Detalle de muestreo plantas y obtención de muestras para aislamientos, según los lotes y fincas muestreadas de acuerdo con el distrito, cantón y provincia. ................................ 151 Anexo 5. Resumen de los resultados de los aislamientos, según los lotes y fincas muestreadas de acuerdo con el distrito, cantón y provincia. Continúa… .................................. 152 Anexo 5. Resumen de los resultados de los aislamientos, según los lotes y fincas muestreadas de acuerdo con el distrito, cantón y provincia. Continúa… .................................. 153 Anexo 5. Resumen de los resultados de los aislamientos, según los lotes y fincas muestreadas de acuerdo con el distrito, cantón y provincia. ...................................................... 154 Anexo 6. Receta del medio de cultivo TZC (Triphenyl-tetrazolium chloride) (Kelman, 1954; Ray et al., 2021). .............................................................................................................. 155 Anexo 7. Metodología de la tinción de Gram (Kumar et al., 2017). ............................... 156 Anexo 8. Extracción de ADN según Trout et al. (1997), modificado por Mónica Blanco (2009). .......................................................................................................................... 157 Anexo 9. Datos de incidencia de los diferentes filotipos de Ralstonia spp. en tomate cultivado en Costa Rica, según los cantones y distritos muestreados. ....................................... 158 Anexo 10. Detección de Ralstonia spp. mediante imagen de electroforesis de la amplificación por PCR de la región intergénica parcial del 16S ARNr, a partir de productos de PCR para morfotipos bacilos Gram negativos. Pocillo E: Gene Ruler 100pb Plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM), pocillos 1-16, 19-34, 37-52, 55-70, 73-88, 91-106: ADN de aislamientos xviii bacterianos, pocillos 17, 35, 53, 71, 89, 107: control positivo R. pseudosolanacearum- filotipo I, pocillos 18, 36, 54, 72, 90, 108: control negativo. Continúa… ................................................. 159 Anexo 10. Detección de Ralstonia spp. mediante imagen de electroforesis de la amplificación por PCR de la región intergénica parcial del 16S ARNr, a partir de productos de PCR para morfotipos bacilos Gram negativos. Pocillo E: Gene Ruler 100pb Plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM), pocillos 109-124, 127-142, 145-160, 163-178, 181-194, 199-208: ADN de aislamientos bacterianos, pocillos 125, 143, 161, 179, 195, 197, 207: control positivo R. pseudosolanacearum- filotipo I, pocillos 126, 144, 162, 180, 196, 210: control negativo, pocillos 209-216: sin reacción de PCR. ................................................................................................... 160 Anexo 11. Detección de especies de RSSC mediante imagen de electroforesis de la amplificación por PCR de la región intergénica 16-23S ARNr, a partir de productos de PCR para morfotipos bacilos Gram negativos. Pocillo E: Gene Ruler 100pb Plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM), pocillos 1-16, 19-34, 37-52, 55-70, 73-88, 91-106: ADN de aislamientos bacterianos, pocillos 17, 35, 53, 71, 89, 107: controles positivos R. pseudosolanacearum- filotipo I y R. solanacearum- filotipo II, pocillos 18, 36, 54, 72, 90, 108: control negativo. Continúa…161 Anexo 11. Detección de especies de RSSC mediante imagen de electroforesis de la amplificación por PCR de la región intergénica 16-23S ARNr, a partir de productos de PCR para morfotipos bacilos Gram negativos. Pocillo E: Gene Ruler 100pb Plus DNA Ladder (Thermo ScientificTM), pocillos 109-124, 127-142, 145-160, 163-178, 181-194, 199-208: ADN de aislamientos bacterianos, pocillos 125, 143, 161, 179, 195, 197, 207: controles positivos R. psedosolanacearum- filotipo I y R. solanacearum- filotipo II, pocillos 126, 144, 162, 180, 196, 210: control negativo, pocillos 209-216: sin reacción de PCR. ................................................. 162 Anexo 12. Datos de incidencia de los diferentes filotipos de Ralstonia spp. en tomate cultivado en Costa Rica, según las variedades de tomate muestreadas. .................................... 163 xix LISTA DE ABREVIATURAS ANI: Average Nucleotide Identity, en español se puede traducir como Identidad Promedio de Nucleótidos. CBTBIF: Canasta Básica Tributaria por el Bienestar Integral de las Familias. GGDC: Genome-to-Genome Distance Calculator, en español se puede traducir como Calculadora de Distancia Genoma a Genoma. ha: hectárea. ITS region: Internal Transcribed Spacer region, en español se puede traducir como Región Espaciadora Transcrita Interna. kg: kilogramo. MUMi: Maximum Unique Matches index, en español se puede traducir como el Índice Máximo de Coincidencias Únicas. pb: par de bases. PCR: Polymerase Chain Reaction, en español se puede traducir como Reacción en Cadena de la Polimerasa. qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction, en español se puede traducir como Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa o por tiempo real. RSSC: Ralstonia solanacearum Species Complex, en español se puede traducir como Complejo de Especies de Ralstonia solanacearum. TZC o TCC: Triphenyl-Tetrazolium Chloride, en español se puede traducir como Cloruro de Trifenil Tetrazolio. 1 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN GENERAL El tomate se encuentra dentro de los cultivos hortícolas anuales de mayor producción y consumo en Costa Rica. Es un cultivo con una alta producción a nivel hortícola, asociado con 1001 hectáreas (ha) sembradas en el año 2019, según el Instituto Nacional de Estadística y Censos [INEC] (2020) y 888 ha en el año 2021 según Consejo Nacional de Producción [CNP] (2022). Las provincias de Alajuela, Cartago y Heredia son las provincias con una mayor área sembrada; dentro de las cuales se halló la mayor concentración de producción en los cantones de Alajuela, Cartago y Santo Domingo, con 99.4, 90.5 y 82.0 ha (figura 1), respectivamente (INEC, 2015a, 2015b, 2015c). La producción ha sido primordialmente para satisfacer la demanda nacional y en muy poca cuantía para exportación hacia el Caribe, Guatemala y Panamá (Ministerio de Comercio Exterior [COMEX], 2020; Secretaría Ejecutiva de Planificación Sectorial Agropecuaria [SEPSA], 2018). Además, como se mencionó anteriormente, el tomate se encuentra entre las hortalizas de mayor preferencia, con un consumo per cápita de 18.78kg/año (Programa Integral de Mercadeo Agropecuario, 2016). Figura 1. Área sembrada (hectáreas) del cultivo de tomate en Costa Rica, según cantón. Punto en rojo es la Estación Experimental Agrícola Fabio Baudrit Moreno (EEAFBM). Fuente: (Instituto Nacional de Estadística y Censos, 2014). Realizado por Dr. Mauricio Serrano (2021). 2 La producción de este cultivo puede ser afectado negativamente por diversos problemas fitosanitarios tanto abióticos como bióticos. Dentro de los problemas abióticos que generan estrés a las plantas de tomate se enlistan desbalances nutricionales, manejo deficiente del riego o condiciones extremas de temperatura. Respecto al estrés biótico se considera a los insectos, los ácaros y las enfermedades fúngicas, virales y bacterianas (Mekonnen et al., 2022; Shi et al., 2023). Algunos patógenos bacterianos como las especies patógenas de Ralstonia spp. son causantes de un declive importante en la producción de tomate (Hamilton et al., 2023). El Complejo de Especies de Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearum Species Complex [RSSC]) puede causar alta severidad de marchitez bacteriana o inclusive puede ocasionar la muerte del cultivo, debido a la agresividad de la bacteria, facilidad de dispersión mediante el agua, el suelo y manejo del cultivo, la capacidad de sobrevivencia en el suelo en condiciones aeróbicas, así como las limitantes en el control de la enfermedad por medio de agroquímicos; lo que se deriva en pérdidas económicas considerables (Balamurugan et al., 2020; Cho et al., 2011; Espinoza-Pizarro, 2006; López-Marín et al., 2019; Mekonnen et al., 2022; Naranjo-Feliciano y Martínez-Zubiaur, 2013; Sato et al., 2012; Wang et al., 2019). Sumado a ello, la problemática aumenta con la siembra intensiva del cultivo, donde la utilización de cultivares susceptibles propicia la infección y dispersión del patógeno, favorecido por las lesiones a nivel de raíz, sumado a que el inóculo se mantiene por largos periodos en los suelos de las fincas (López-Marín et al., 2018; Rivard et al., 2012). La marchitez bacteriana puede considerarse un problema severo, principalmente en cantones como Santa Ana, Alajuela y Cartago, donde se ha incrementado la aplicación de agroquímicos para tratar de controlar esta enfermedad y otras enfermedades bacterianas. (Blanco- Meneses et al., 2023; López-Marín et al., 2018; Oficialización y declaratoria de interés público y nacional del “Plan de acción nacional de lucha contra la resistencia a los antimicrobianos. Costa Rica 2018-2025”, 2018). Algunos de los ingredientes activos más aplicados para el control de enfermedades bacterianas son gentamicina, oxitetraciclina y tetraciclina, así como sulfato de cobre y CobrethaneTM (Blanco-Meneses et al., 2023). La aplicación inapropiada o desmedida de los antibióticos induce a que los microorganismos se enfrenten a una alta presión de selección y se induzca al desarrollo de resistencia a los diferentes ingredientes activos, en periodos muy cortos, debido a la fácil capacidad de mutación de estos. Se menciona que los antibióticos que se aplican en la producción agrícola costarricense pueden estar causando impactos importantes en la salud humana, en el área 3 agropecuaria y en el ambiente (Oficialización y declaratoria de interés público y nacional del “Plan de acción nacional de lucha contra la resistencia a los antimicrobianos. Costa Rica 2018-2025”, 2018). El Gobierno de Costa Rica del periodo 2018-2022 creó el Plan antes mencionado, en el marco de la declaratoria de emergencia por la resistencia a los agentes antimicrobianos como consecuencia del uso u abuso de los antibióticos, pronunciado por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) (por mencionar algunos) (Oficialización y declaratoria de interés público y nacional del “Plan de acción nacional de lucha contra la resistencia a los antimicrobianos. Costa Rica 2018-2025”, 2018; Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura [FAO], 2017). Además del “Plan de acción nacional de lucha contra la resistencia a los antimicrobianos”, en Costa Rica se ha realizado investigaciones para evaluar opciones de manejo de la enfermedad, materiales de tomate tolerantes o resistentes, e incluso la evaluación y uso de porta-injertos resistentes, en vista de que las opciones de combate son escasas y en algunas ocasiones no efectivas (Brenes-Peralta et al., 2017; O´Neal, 2016). Es imperante ofrecer soluciones de manejo y conocer la identificación de las bacterias de acuerdo con la nueva clasificación taxonómica según especies, que están involucradas con la marchitez en el cultivo de tomate (Paudel et al., 2022). Hasta el momento, la identificación y la mayor cantidad de análisis genéticos para RSSC se basa en la clasificación taxonómica de las especies y los filotipos (López-Marín et al., 2018), por lo que parte de la importancia de esta investigación estuvo en identificar fenotípica y molecularmente cada morfotipo de Ralstonia spp. aislado en las principales zonas de producción de tomate del país, para hacer un mapeo con base en la presencia de especies del patógeno en las zonas muestreadas. La descripción de las especies de Ralstonia spp. es un resultado que permite posteriormente hacer análisis de severidad y pruebas de eficacia de los productos utilizados comúnmente en el mercado. Una clasificación más exhaustiva del patógeno permitirá dilucidar la variabilidad genética y patogénica en el país. Sumado a ello, pero no menos importante, permitirá concluir si es posible dar soluciones de manejo del cultivo y del uso de antibióticos, de acuerdo con los diferentes morfotipos diferenciados molecularmente, en mira a una producción de alimentos más inocua y segura para la población. 4 OBJETIVOS Objetivo general Caracterizar las especies Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum y R. syzygii en tomate de diferentes zonas de Costa Rica y verificar la patogenicidad de las especies aisladas. Objetivos específicos 1. Caracterizar a nivel fenotípico la población de aislamientos bacterianos asociados a las especies Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum y R. syzygii, aisladas de plantas de tomate sintomáticas, proveniente de las provincias Alajuela, Cartago, Heredia y San José, Costa Rica. 2. Identificar a nivel molecular los aislamientos positivos para las especies de Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum y R. syzygii, obtenidos de plantas de tomate provenientes de las provincias Alajuela, Cartago, Heredia y San José, Costa Rica. 3. Evaluar la patogenicidad de al menos una especie diferenciada molecularmente, aislada de tomate. 4. Elaborar un mapa de distribución geográfica de las especies aisladas e identificadas. 5 MARCO TEÓRICO Generalidades del cultivo El tomate (Solanum lycopersicum) es una planta de origen andino (Rodríguez et al., 2001), que pertenece a la familia Solanaceae; la cual cuenta con alrededor de 91 géneros y 2500 especies (Cappers & Bekker, 2021), donde el género Solanum es reconocido por su diversidad en cuanto a ciclo vital (anuales y perennes) así como por su distribución geográfica (Sato et al., 2012). A nivel comercial y de consumo, el tomate es uno de los alimentos que se produce en casi todos los países del mundo (Kaur & Kapoor, 2019). En Costa Rica, se producen 28 variedades y 30 híbridos, que divergen en características de fruto, adaptabilidad al medio ambiente en el que se cultiva y en su resistencia a enfermedades. En términos generales, muchas de estas variedades o híbridos presentan resistencia a nematodos o agentes fitopatógenos como virus, hongos y bacterias (Agrios, 2004; Arauz, F, 2011; Starr & Taggart, 2007; Vidaver & Lambrecht, 2004). Dentro de estos últimos, los patógenos procariontes son más severos porque tienen una alta tasa de reproducción y evolucionan más rápido que los eucariotas (Madigan et al., 2015c). Generalidades de Ralstonia spp. Como se mencionó anteriormente, la incidencia de un patógeno procarionte podría ser muy alta para un cultivo, y la producción de tomate no es la excepción, ya que puede ser afectada por varias enfermedades causadas por agentes bacterianos fitopatógenos como el cáncer bacteriano (Clavibacter michiganensis subspp. michiganensis), podredumbre blanda bacteriana (Pectobacterium carotovorum), mancha bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria), peca bacteriana (Pseudomonas syringae pv. tomato), médula negra (Pseudomonas corrugata), necrosis de la médula del tomate (Pseudomonas mediterranea) y marchitez bacteriana o maya (Complejo de Especies de R. solanacearum) (Rodríguez et al., 2001). Las especies R. solanacearum, R. pseudosolanacearum y R. syzygii ssp. indonesiensis se encuentran entre las más importantes y destructivas a nivel fitopatológico en el cultivo de tomate, ya que estas especies generan un gran impacto productivo y económico en zonas de clima templado y tropical (Kado, 2010; Perea-Soto et al., 2011). 6 Clasificación taxonómica de Ralstonia spp. a través del tiempo La marchitez bacteriana se ha registrado desde el siglo XIX y ha sido sometida a varias reclasificaciones taxonómicas del agente causal, hasta llegar a lo que hoy conocemos como Complejo de Especies de R. solanacearum. Fue a finales del siglo XIX cuando Burrill registró la enfermedad de la marchitez con base a su investigación del aislamiento y reinoculación del microorganismo (Burrill, 1890, 1891, como se citó en Paudel et al., 2020). Smith describió la bacteria por primera vez como Bacillus solanacearum y en la misma época se registró en Asia, Estados Unidos y Suramérica la presencia del patógeno en la papa, el tomate, el tabaco y el maní como hospederos (Kelman, 1953; Smith, 1895, como se citó en Paudel et al., 2020). En 1898 la bacteria fue reclasificada en Bacterium solanacearum por un flagelo polar en el bacilo (Chester, 1898; Smith, 1909, como se citó en Paudel et al., 2020). A principios del siglo XX, la enfermedad fue propuesta a ser reclasificada entre Bacterium solanacearum o Pseudomonas solanacearum (Smith, 1905, como se citó en Paudel et al., 2020) y se reportó las enfermedades el marchitamiento Granville en tabaco según Smith (Smith, 1909, como se citó en Paudel et al., 2020) y el Moko en banano y plátano (Rorer, 1911, como se citó en Paudel et al., 2020). Las últimas reclasificaciones únicamente a nivel microscópico por medio de la caracterización de los flagelos fueron Phytomonas solanacearum (Bergey, 1923, como se citó en Paudel et al., 2020) y Xanthomonas solanacearum (Dowson, 1943, como se citó en Paudel et al., 2020). Además de la descripción microscópica, se sumaron las técnicas bioquímicas; con las cuales se retornó a la clasificación de P. solanacearum (Bergey, 1923; Breed, 1948, Dowson, 1949; Kelman, 1953; Savulescu, 1948, como se citó en Paudel et al., 2020). Se describió el patógeno como Pseudomonas solanacearum E.F. Smith; el cual se registró como el agente que producía la marchitez bacteriana en un amplio registro de especies de plantas (Kelman, 1954). A su vez, el agente causal se describió con más detalle a través de la clasificación subespecífica de acuerdo con el hospedero, el origen geográfico, la patogenicidad, los aspectos fisiológicos (los biovares clasificaban de acuerdo con las propiedades bioquímicas de las bacterias) y la epidemiología (anexo 1). Buddenhagen (1986) y Buddenhagen et al. (1962) realizaron la descripción de las razas (denominación según el hospedero), una de las divisiones más grandes de P. solanacearum; aunque también se consideró que el término más atinado era patovar, ya que se basaba en el patotipo de cada cepa con respecto al hospedero asociado. La raza 1 fue conocida como la raza del tomate (S. lycopersicum) o el tabaco (Nicotiana tabacum) que a su vez incluía hospederos silvestres de Solanaceae y Compositae en diferentes zonas a nivel 7 mundial, así como el ataque a ciertas especies de Musa. La raza 2 se encontró en banano Musa spp. diploide, pero en un área geográfica específica de América y la enfermedad ha sido conocida como Moko. La raza 3 estuvo asociada a la papa principalmente en especies como Solanum tuberosum y S. andina. La raza 4 fue una cepa variante de la raza 1, la cual se encontró en jengibre (Zingiber officinale) de Filipinas. La raza 5 la propusieron como específica para la mora (Morus spp.) según fue identificada en China (Buddenhagen, 1986; Hayward, 1964), luego Cook y Sequeira (1994) registraron la reclasificación a raza 1, biovar 5. Posteriormente, Hayward (1964) propuso otra subdivisión de P. solanacearum según la habilidad de la cepa para oxidar fuentes de carbono como los alcoholes de hexosa (manitol, sorbitol y dulcitol) y la capacidad de producción de ácido a partir de tres disacáridos (celobiosa, maltosa y lactosa); esta clasificación se denominó biovar, biotipos, biovariedades o tipos bioquímicos. No obstante, Persley et al., (1986) aclararon que el término correcto era biovar en lugar de biotipo, según el Código Internacional de Nomenclatura de Bacterias (International Code of Nomenclature in Bacteria [ICNB]). A partir de esa definición, se describieron cuatro biovares de la siguiente manera (ver cuadro I); el biovar 1 no oxida ningún tipo de carbohidrato. El biovar 2 se encontró sólo en papa y tomate, con la capacidad de oxidar los disacáridos, no así los alcoholes de hexosa. Este se caracteriza por la subdivisión en biovar 2 tropical (2T o 2N) que se ubicó en zonas tropicales de baja altitud y el Amazonas, que es su centro de origen, mientras que el biovar 2 andino se identifica como 2A (de Morais et al., 2015). El biovar 3 se detectó en múltiples hospederos con la capacidad de oxidar tanto los carbohidratos como los alcoholes de hexosa. El biovar 4 sólo fue capaz de oxidar los alcoholes de hexosa, y se asoció a plantas de tomate y jengibre. Como se mencionó en el párrafo anterior, se realizó posteriormente en la década 1980 una reclasificación de raza 5 a biovar 5 dentro de la raza 1 (Cook y Sequeira, 1994; Huang et al., 2012). 8 Cuadro I. Oxidación de alcoholes y producción de ácido a partir de disacáridos según biovar. Fuente: Hayward (1964) y Huang et al. (2012) modificado. “+”: Positivo para la prueba, “-“: negativo para la prueba. Compuestos Biovar 1 2 3 4 Oxidación de alcoholes hexosa: Dulcitol - - + + Manitol - - + + Sorbitol - - + + Producción de ácido a partir de los disacáridos: Celobiosa - + + - Maltosa - + + - Lactosa - + + - * No se cuenta con datos del biovar 5. En la década de 1990, cepas de P. solanacearum se reclasificaron a Burkholderia solanacearum, por medio del análisis de secuencias del gen 16S rADN y caracterización de los ácidos grasos celulares (Yabuuchi et al., 1992). En 1995, se reclasificaron las especies Burkholderia pickettii, Burkholderia solanacearum y Alcaligenes eutrophus al género Ralstonia spp. debido a similitudes en características fenotípicas, lípidos celulares, ácidos grasos y análisis filogenéticos (Yabuuchi et al., 1995). En estos años, los análisis moleculares como el análisis de secuencias por medio del gen 16S rDNA, los genes de la poligalacturonasa y endoglucanasa ayudaron a reconocer tres diferentes grupos en lo que hasta ese momento se denominó “complejo de especies” (Poussier et al., 1999, Fegan et al., 1998; como se citó en Poussier et al., 2000; Poussier et al., 2000; Taghavi et al., 1996). En los años 2000 fue propuesta la diferenciación de cuatro filotipos, que fueron definidos como grupos monofilogenéticos, con base en el análisis secuencias del gen parcial de mutS (Prior & Fegan, 2005a); con el cual se confirmó divisiones previamente registradas con el estudio de las secuencias en la región ITS 16S-23S, el gen 16S rRNA, el gen hrpB, el gen de la endoglucanasa. (Cook & Sequeira, 1994; Fegan et al., 1998, como se citó en Prior & Fegan, 2005; Fegan & Prior, 2005; Poussier et al., 2000; Prior & Fegan, 2005; Taghavi et al., 1996). Las cepas que analizaron y se agruparon dentro de un mismo grupo monofilético, coincidieron mayoritariamente con el mismo origen geográfico (Prior & Fegan, 2005a). El filotipo I asociado a las cepas originarias de Asia (agrupó cepas de los biovares 3, 4 y 5) (Cook & Sequeira, 1994; Prior & Fegan, 2005a). El 9 filotipo II se asoció a las cepas de los biovares 1, 2 y 2T principalmente aisladas en América (Cook et al., 1989, como se citó en Fegan & Prior, 2005; Prior & Fegan, 2005); Prior & Fegan (2005) reconocieron dos grupos, uno con pocos hospederos que incluía el biovar 1 en Musa spp. (el cual fue conocido previamente como raza 2) y cepas en papa (anteriormente conocido como raza 3), así como un segundo grupo de un amplio número de hospederos que se asoció a cepas del biovar 1 en Solanaceae. El filotipo III correspondía a las cepas de los biovares 1 y 2T originarias de África, Madagascar e Islas Reunión (Fegan & Prior, 2005; Prior & Fegan, 2005a). El filotipo IV fue asociado a las cepas que pertenecían a los biovares 1, 2 y 2T originarias de Indonesia (Fegan & Prior, 2005; Prior & Fegan, 2005a). Asociado a los filotipos fueron definidos 23 secuevares, los cuales se describieron como grupos intrasubespecíficos de cepas dentro de cada filotipo, debido a una secuencia parcial muy conservada dentro la secuencia del gen de la endoglucanasa (Fegan & Prior, 2005; Prior & Fegan, 2005a). En el 2012, se describió una subdivisión de los filotipos denominada clados; de acuerdo a los diferentes patrones evolutivos de las cepas analizadas (Wicker et al., 2012). Se utilizó el MLSA (Multilocus Sequence Analysis, en español se puede traducir como Análisis de Secuencia Multilocus) con los genes de mantenimiento cromosómico gdhA, mutS, ppsA, adk, leuS, rplB, gyrB y los genes egl y fliC asociados a la virulencia en el megaplásmido (Wicker et al., 2012). El filotipo I contiene el clado 1 (biovares 1, 3, 4, 5), el filotipo II incluye los clados 2, 3, 4 y 5 (se encuentran dos subdivisiones, el filotipo IIA compuesto por los clados 2 y 3 (biovares 1, 2 y 2N) y el filotipo IIB compuesto por los clados 4 y 5 (biovar 1). El filotipo III correspondía al clado 6 y el filotipo IV contenía a los clados 7-8 (Cook & Sequeira, 1991, 1994; Poussier et al., 2000; Shutt et al., 2018; Wicker et al., 2012). Al año 2014, se confirmó las cuatro agrupaciones de los filotipos por medio de los análisis de secuencias la región ITS 16S-23S rARN y análisis adicionales con secuencias del gen parcial del egl (Safni et al., 2014). En esta investigación se observó la relación cercana de los filotipos I y III, con base en las secuencias de la región 16S-23S rRNA ITS, lo cual reafirma los hallazgos de Remenant et al. (2010) y Wicker et al. (2012) (Safni et al., 2014). Fueron Safni et al. (2014) quienes realizaron la primera propuesta de las tres especies del RSSC considerando análisis fenotípicos y genotípicos que incluían resultados propios y previos entre los que se incluyeron secuencias de genoma, matrices comparativas de hibridación del genoma y MLSA, dando como resultado una primera especie denominada R. pseudosolanacearum sp. nov. que agrupó los filotipos I y III de lo que hasta ese momento se conoció como R. solanacearum, la segunda especie fue R. solanacearum 10 conservando sólo cepas asociadas al filotipo II, y la tercera especie propuesta fue R. syzygii (antes conocido como el filotipo IV de R. solanacearum) con sus subespecies R. syzygii subsp. celebesensis subsp. nov., R. syzygii subsp. indonesiensis subsp. nov. y R. syzygii subsp. syzygii subsp. nov. Con base en los avances de la tecnología y la investigación, la propuesta de las tres especies para el RSSC de Safni et al., (2014) fue confirmada por medio de la comparación genoma a genoma por medio de la Identidad Promedio de Nucleótidos (Average Nucleotide Identity [ANI]), luego los resultados con ANI se compararon con el índice Máximo de Coincidencias Únicas (Maximum Unique Matches index [MUMi]) y la Calculadora de Distancia Genoma a Genoma (Genome-to-Genome Distance Calculator [GGDC]) (Prior et al., 2016). Además, fue respaldado por los análisis proteómicos utilizando la Espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry [MALDI-TOF MS]) y análisis previos de hibridación ADN-ADN (DNA-DNA Hibridation [DDH]) (Prior et al., 2016; Vaneechoutte et al., 2004). Actualmente, la enfermedad denominada marchitez bacteriana se encuentra clasificada dentro del filo Pseudomonadota (sinónimo homotípico de Proteobacteria), clase Betaproteobacteria, orden Burkholderiales, familia Burkholderiaceae y el género Ralstonia (Garrity et al., 2005; Oren & Garrity, 2021). Se cuenta con tres especies; las cuales se agruparon como R. pseudosolanacearum anteriormente conocido como filotipos I y III, R. solanacearum equivalente al filotipo II, y R. syzygii se asoció al filotipo IV (Prior et al., 2016; Safni et al., 2014) (Anexo 2). Biología de Ralstonia spp. Se describe como un bacilo Gram negativo (1.5-2.0 µm de longitud, 0.5-0.7 µm de ancho), motil por dos flagelos en un extremo polar, que no tiene capacidad de formar esporas (Balamurugan et al., 2020). Este patógeno que causa la enfermedad de marchitez bacteriana es característico por ser específico del suelo y que sobrevive en condiciones aeróbicas (Balamurugan et al., 2020; Wang et al., 2019). La bacteria sobrevive en el suelo de forma saprofítica de 1-4 años, aunque no haya hospederos susceptibles. Cuando una planta hospedera inicia la liberación de señales de quimiotaxis y Ralstonia spp. está presente en el suelo, las células bacterianas se movilizan hacia la planta por medio de la motilidad que le brindan los flagelos (Balamurugan et al., 2020), y cuenta con polisacáridos, proteínas y pilus que le permite la adhesión a los tejidos de la planta. Luego, la bacteria puede ingresar a través de los tejidos, por grietas o heridas radiculares. Después de colonizar el 11 córtex, invade el xilema e incluso puede llegar a transportarse hasta la parte aérea por vía vascular y desencadena la marchitez de la planta por la obstrucción del transporte del agua. Los síntomas iniciales característicos son una leve marchitez asociada a las horas de mayor temperatura durante el día, la severidad avanza de acuerdo con las condiciones favorables para el patógeno, mostrando una merma en el crecimiento de la planta y la producción de raíces adventicias (Wang et al. 2019). Con una sola planta infectada en el campo, se puede diseminar el patógeno por medio del suelo, el agua, herramientas de trabajo, maquinaria y labores culturales del cultivo. La infección se ve favorecida con temperaturas ambientales entre 30-35°C, especialmente las cepas que fueron catalogadas en su momento como biovar 3 y 4, mientras que el biovar 2 puede presentar una alta severidad a temperaturas más bajas (16-24°C). Sin olvidar que existe la interacción planta, patógeno, el ambiente tiene un papel predominante en la capacidad de desarrollo de la enfermedad; lo cual se ejemplifica con que la bacteria tiene buena capacidad para sobrevivir en suelos húmedos y declinación de crecimiento en suelos más secos. También, se ha registrado que la bacteria puede crecer considerablemente en suelos arcillosos, en comparación con suelos arenosos (Hayward, 1991). Manejo de Ralstonia spp. Debido a las diferentes estrategias de Ralstonia spp. para la supervivencia, los factores de virulencia, la fácil diseminación y la adaptación al medio ambiente (Álvarez et al., 2008; De Pedro-Jové et al., 2021; Geng et al., 2022), actualmente la alternativa más viable y recomendada para el manejo de la bacteria en el campo es la utilización de híbridos y variedades de tomate con alta tolerancia a Ralstonia spp., ya que el manejo cultural y químico no representa un control efectivo para reducir las pérdidas en producción, según Hamilton et al., (2023). No obstante, otros autores como Prasetyawati et al., (2023) menciona que algunos aislamientos de Bacillus spp. pueden inhibir el crecimiento de Ralstonia spp. debido al efecto surfactante y ruptura de la tensión superficial. También, se ha evaluado el uso de vermicompost a base de neem (Azadirachta indica A. Juss) y resultó con alta efectividad al ser aplicado a las semillas y al suelo en el momento de trasplante de tomate, inhibiendo la incidencia de la enfermedad (Reddy et al., 2012). Incluso el uso de enmiendas fermentadas como el compost tipo bokashi ha mostrado la reducción de la población bacteriana de Ralstonia sp. justificado por el enriquecimiento mineral y biológico en la rizosfera de las plantas (Hernández-Garboza & Bustamante-Rojas, 2001). Cepas de rizobacterias han sido capaces de disminuir la incidencia y severidad de la enfermedad, en el último caso se ha registrado disminución de aproximadamente un 60% del área bajo la curva del progreso de la 12 enfermedad (Lemessa & Zeller, 2007). Se han evaluado alternativas como la aplicación de calor y la luz UV para el control de los cultivos, la única opción efectiva en material vegetal ha sido la incineración de los cultivos (Hayes et al., 2022). Se ha estudiado la reducción de la viabilidad in vitro de Ralstonia spp., ya que se puede erradicar la bacteria con exposición a desinfectantes como el peróxido de hidrógeno, Huwa-SanTM (peróxido de hidrógeno y plata) y cloro (Hayes et al., 2022). Otros investigadores verificaron la efectividad de productos y determinaron que el hidróxido de cobre podrían evitar por completo el desarrollo de la bacteria, Bacillus subtillis la inhibió en más el 90% y extracto de toronja sólo permitió la reducción de la población bacteriana en un tercio con respecto a la población testigo (Torres-González et al., 2014). En evaluaciones de exposiciones a temperaturas mayores a 50°C, se ha observado la erradicación de la bacteria, contrario a lo que se ha experimentado in vivo, según Hayes et al. (2022). Hospederos de Ralstonia spp. Con base en la historia y la evolución de la clasificación taxonómica de los agentes causales asociados a la enfermedad de la marchitez bacteriana, se describieron hospederos desde el concepto de biovares Se identificó una amplia variedad de familias taxonómicas de hospederos descritas desde hace más de 60 años (anexo 1) por Cook & Sequeira (1991); Hayward (1964); Poussier et al. (1999), tales como Asteraceae, Boraginaceae, Commelinaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Heliconaceae, Musaceae, Solanaceae, asociados al biovar 1. La familia Solanaceae estaba asociada al biovar 2. El biovar 3 fue el que se vinculó a con mayor cantidad de familias asociadas, dentro de las que se encuentran Asteraceae, Brassicaceae, Casuarinaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Musaceae, Oleraceae, Solanaceae, Strelitzaceae, Verbenaceae y Zingiberaceae. El biovar 4 está asociado con las familias Fabaceae, Moraceae, Olearaceae, Solanaceae y Zingiberaceae. También se ha registrado la familia Moraceae para el biovar 5. Con el avance de la investigación y las técnicas de identificación aplicadas a Ralstonia spp. hasta llegar a lo que hoy se conoce como las especies del RSSC descritas por Prior et al., (2016) y Safni et al. (2014), se reagruparon y vincularon los hospederos de acuerdo a las tres especies de Ralstonia spp. Asociados a la especie R. pseudosolanacearum- filotipo I se encuentran los hospederos de las cepas de los biovares 3, 4 y 5. R. solanacearum- filotipo II agrupó los hospederos de los biovares 1, 2 y 2T, más la raza 3 que afecta a papa y la raza 2 que afecta el banano. R. pseudosolanaceraum- filotipo III agrupó los hospederos asociados a los biovares 1 y 13 2T. Finalmente, en R. syzygii- filotipo IV se asoció a los hospederos de los biovares 1, 2 y 2T (Prior & Fegan, 2005a; Safni et al., 2014). Pruebas diagnósticas para Ralstonia spp. Para analizar las bacterias de las diferentes especies se pueden aplicar pruebas preliminares que son técnicas rápidas de la taxonomía clásica que facilitan la clasificación bacteriana. Para una identificación más precisa se debe realizar una cantidad de pruebas morfológicas, metabólicas o bioquímicas establecidas para cada especie bacteriana. También existe la posibilidad de la identificación de las especies mediante la identificación del microorganismo a través de las técnicas moleculares que serán abordadas posteriormente (Chaudhry & Rashid, 2011a; Kado, 2010; Madigan et al., 2015c). Mediante las pruebas bioquímicas se definen perfiles de crecimiento o metabolismo de las bacterias que se pueden observar a través de medios de cultivo diferencial (Madigan et al., 2015d). Uno de los métodos comunes para la caracterización de Ralstonia spp. es el aislamiento en medio de cultivo diferencial, que permite el crecimiento de esta bacteria con características específicas, por ejemplo el TZC, donde las especies virulentas del Complejo crecen como colonias de color blanco-crema perlado, planas, de borde irregular y de apariencia fluida, cuyas células al microscopio deben verse como células Gram negativas (Chaudhry & Rashid, 2011b). Sin embargo, es importante acotar que se debe tener cuidado con los subcultivos de la bacteria en medios con tetrazolio, porque la bacteria puede perder su patogenicidad (Vivas et al., 2009). Dentro de la clasificación antes mencionada, las pruebas son dependientes del cultivo de la bacteria, ya que se requiere del cultivo y la observación al microscopio permite analizar morfológicamente la estructura de las células bacterianas. Este es el caso de la técnica de tinción Gram (Madigan et al., 2015b). Para la identificación del género Ralstonia existe características particulares por medio de las cuales se deriva una serie de pruebas bioquímicas ques se han determinado, por ejemplo, la prueba de oxidasa, la reacción de la arginina dehidrolasa, la oxidación de la glucosa, la fluorescencia de los medios de cultivo, la producción de gas a partir de nitrato, la producción de levan a partir de sacarosa, la actividad de la lipasa en agar Tween 80 (Chaudhry & Rashid, 2011a; Cores & Scarella, 2016; Obrador, 2016; Perea-Soto et al., 2011). Según el Manual Bergey de Bacteriología Sistemática (Yabuuchi et al., 2005) y Hassan et al. (2016) se describió Ralstonia 14 solanacearum sin motilidad, positiva para las pruebas de hidróxido de potasio, oxidasa, catalasa y Tween 80, y resultado negativo para arginina dehidrolasa, oxidación de la glucosa, fluorescencia en medio de cultivo, producción de gas a partir de nitrato y producción de Levan a partir de sacarosa (cuadro II). Cuadro II. Características diferenciales de R. solanacearum (Smith 1896). Fuente: elaboración propia con base a Hassan et al., 2016; Yabuuchi et al. (2005) Sustrato o prueba Ralstonia spp. Motilidad - Hidróxido de potasio + Oxidasa + Catalasa + Arginina dehidrolasa - Oxidación de la glucosa - Fluorescencia en medio de cultivo - Producción de gas a partir de nitrato - Producción de Levan a partir de sacarosa - Tween 80 + Otra alternativa para la detección de la bacteria es a través de métodos serológicos, donde por medio de los antígenos asociados a las especies de Ralstonia spp. se podría realizar una detección rápida del patógeno (Krieg, 2005). La prueba de inmunoensayo enzimático (enzyme immunoassay [EIA]) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]), son técnicas de serología donde se observa la reacción anticuerpo- antígeno (Madigan et al., 2015d). ELISA ha sido útil para aquellas bacterias que no crecen en medios de cultivo, no obstante, se considera que está siendo desplazada por técnicas de detección de biología molecular por ser técnicas más sensibles y directas, que permiten una interpretación fácilmente (García-Coca et al., 2019). Se puede analizar la bacteria con técnicas moleculares, lo cual permite identificar la bacteria por especificidad, observando la variabilidad que hay dentro de las agrupaciones de especies bacterianas. Para determinar con certeza esta identificación, es necesario utilizar herramientas comunes como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction [PCR]) de punto final o tiempo real mediante la utilización de una serie de pares de cebadores, que permiten diferenciar hasta el nivel de 15 secuevar a través de la secuenciación (García et al., 2019a). En primera instancia se puede utilizar el PCR punto final para amplificar y secuenciar la región 16S del ADN ribosomal, con un producto de PCR esperado de 1400-1500 pares de bases (anexo 3) (Weisburg et al., 1991), por medio de cebadores como el F27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) y el R1492 (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT- 3′). Además, existen una serie de cebadores específicos para detectar RSSC (anexo 3), como lo son 759F (5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′) y 760R (5′-GTCGC CGTCAGCAATGCGGAATCG-3′) de la región Gen IpxC (Opina et al., 1997), Rsol_fliC_for (5′-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3′) y Rsol_fliC_rev (5′-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3′) de la región Gen fliC (Schönfeld et al., 2003). La detección de cada una de las especies del Complejo se realiza por medio de PCR multiplex basado en la región 16S-23S rRNA ITS, utilizando los cebadores Nmult21:1F (5′- CGTTGATGAGGCGCGCAATTT-3′) y Nmult22:RR (5′- TCGCTTGACCCTATAACGAGTA-3′) para el filotipo I- R. pseudosolanacearum, Nmult21:2F (5′-AAGTTATGGACGGTGGAAGTC-3′) y Nmult22:RR para el filotipo II- R. solanacearum, Nmult23:AF (5′- ATTACGAGAGCAATCGAAAGATT-3′) y Nmult22:RR para el filotipo III- R. pseudosolanacearum, Nmult22:Inf (5′-ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA-3′) y Nmult22:RR para el filotipo IV- R. syzygii (anexo 3) (Fegan y Prior 2005). Otra posibilidad para analizar las tres especies es con la técnica de ADN barcoding. Se realiza un PCR amplificando el gen de endoglucanasa (egl), el cual está ubicado en un megaplásmido (Fegan & Prior, 2005; Prior & Fegan, 2005a). Los pares de cebadores para el PCR punto final son EndoF (incluido el M13 con letras en minúscula) (5′- caggaaacagctatgaccATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3′) y el EndoR (incluido el M13 con letras en minúscula) (5′- tgtaaaacgacggccagtGCGTTGCCCGGCACGAACACC-3′) (European and Mediterranean Plant Protection Organization [EPPO], 2021b; Wicker et al., 2007). Seguidamente, la secuenciación se realiza por medio de los pares de cebadores M13rev-29 (5′- CAGGAAACAGCTATGACC-3′) y M13uni-21 (5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′), los filotipos se diferencian por las bases ubicadas al principio y final de la hebra, así como el codón y su posición en la secuencia cortada con el cebador EPPO, 2021b) (cuadro III). Además del gen egl, comúnmente se utiliza también las regiones ITS 16S-23S ARNr y genes como hrpB, mutS (Prior & Fegan, 2005a; Wicker et al., 2012). 16 Cuadro III. Identificación de los filotipos en los cuales se subdividía anteriormente las tres especies de Ralstonia spp., con un tamaño de secuencia de 666pb, al utilizar los cebadores M13rev-29 y M13uni-21. Fuente: (EPPO, 2021b) Filotipo Características de identificación Hebra positiva para el filotipo Codón Inicio Final Bases Posición I ACCGACACC CAGTGG ACC 74 IIA ACCGACACC CAGTGG ACC 80 IIB ACGGACACC CAGTGG ACG 83 III GCCGACACC, ACCGACACC CAGTGG GCC, ACC 80 IV ACCGACACC CAGTGG, CAATGG ACC 80 Para un análisis más específico de la subdivisión de los filotipos por sus características filogenéticas, se utilizan las técnicas de Análisis de Secuencia Multilocus (MLSA, según sus siglas en inglés) y la Tipificación de Secuencias Multilocus (MLST, según sus siglas en inglés), en ambos utilizando siete genes constitutivos (“housekeeping”) gdhA, MutS, ppsA, adk, leuS, rplB y gyrB, y además dos genes egl y fliC asociados a la virulencia en el megaplásmido. Esto permite valorar la evolución y la diversidad de la bacteria, que en parte se debe a la recombinación y origen de las cepas (Wicker et al. 2012). Se considera la opción de secuenciación de genoma completo de las bacterias, no sólo para construir los árboles filogenómicos sino también para conocer acerca de los genes que posee cada cepa bacteriana, así como analizar la función de estos (Lowe-Power et al., 2018). Esta última es una técnica que es más factible en términos económicos y a su vez brinda mucha más información, en comparación con un MLSA de tres o más genes constitutivos, ya que el genoma permite una organización taxonómica más precisa que ha permitido la reclasificación de filotipos a especies del RSSC, también se puede conocer la línea evolutiva del microorganismo, así como se pueden estudiar los diferentes genes y su función (Lowe-Power et al., 2018; Paudel et al., 2022; Remenant et al., 2010; Shutt et al., 2018). Luego de la identificación del microorganismo, para verificar y demostrar si este es el agente causal de la patología que se observa en el cultivo, se realizan los postulados de Koch (Volcy, 2008). Los postulados se basan en el principio de identificación de la problemática biótica presente en el cultivo, el aislamiento y purificación del microorganismo que se presume que está asociado al síntoma y la inoculación del microorganismo en un hospedero sano y susceptible. Si el microorganismo es el agente causal debería reproducir los síntomas observados previamente y, por último, se debería recuperar e 17 identificar el mismo microorganismo que se utilizó para inocular y que infectó al hospedero; de esta manera se puede aseverar la causalidad del microorganismo (GN, 2004; Volcy, 2008). En síntesis, con base en la información recabada de la importancia de la marchitez bacteriana en tomate, se propuso la caracterización e identificación de Ralstonia spp. asociado a los síntomas de marchitez bacteriana en tomate en las principales zonas productoras de tomate en el país, y la evaluación de patogenicidad, como una investigación previa y necesaria para desarrollar futuras propuestas de manejo del cultivo de acuerdo con las especies de Ralstonia spp. patogénicas identificadas y caracterizadas. 18 CAPÍTULO II CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE MORFOTIPOS COMPLEJO DE ESPECIES DE Ralstonia solanacearum PROVENIENTES DE ZONAS DE PRODUCCIÓN DE TOMATE EN COSTA RICA RESUMEN Introducción. La caracterización fenotípica ha cumplido un papel fundamental en la taxonomía de las bacterias y complementa la identificación genética, reforzando la descripción y conocimiento de las cepas bacterianas. Objetivo. Caracterizar a nivel fenotípico la población de morfotipos bacterianos asociados a las especies Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum y R. syzygii, aisladas de plantas de tomate sintomáticas, provenientes de las provincias Alajuela, Cartago, Heredia y San José, Costa Rica. Metodología. Se muestreó 77 plantas de tomate con los síntomas característicos de la marchitez bacteriana, 42.86% en Alajuela, 28.57% en Cartago, 10.39% en Heredia, 12.99% en San José y 5.19% en una ubicación no precisada. Se utilizó el cultivo diferencial TZC (Cloruro de trifeniltetrazolio) de (Kelman, 1954) y los morfotipos fueron descritos según la pigmentación, forma y mucosidad, así como por la respuesta a la prueba oxidasa. Los morfotipos seleccionados por estas pruebas con características compatibles con Ralstonia spp. fueron identificadas por medio de PCR punto final con marcadores específicos. Los morfotipos que resultaron positivos para Ralstonia spp. se describieron en un cuadro para comparar las características dentro de cada agrupación. Resultados. Se obtuvo 301 morfotipos diferentes de los cuales 91 resultaron bacilos Gram negativos, y de estos últimos sólo 58 correspondieron a alguna especie de RSSC. Se obtuvo una alta variabilidad en la caracterización fenotípica de los morfotipos identificados como Ralstonia spp. Las colonias con características descritas como virulentas (27.59%) y avirulentas (27.59%) en el medio utilizado, se observó coloraciones atípicas en un 18.97% no reportadas antes en la literatura, y el restante 25.85% tuvo otras características diferentes a lo antes descrito. La mayoría de los aislamientos resultaron positivos (67.24%) para la prueba de oxidasa. Conclusiones. Se observó alta variabilidad fenotípica de los morfotipos de Ralstonia spp. en el medio de cultivo TZC, y por lo que se debería realizar análisis genéticos más detallados que permitan dilucidar las razones de esa diversidad de morfotipos. 19 PALABRAS CLAVE Bacteria, aislamiento, morfología, virulencia, fitopatología. ABSTRACT Introduction. Phenotypic characterization, such as morphology and biochemistry, has played a fundamental role in the taxonomy of bacteria and complements genetic identification, reinforcing the description and understanding of bacterial strains. Objective. Phenotypic characterization of the population of morphotypes associated with the species Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum, and R. syzygii, recovered from symptomatic tomato plants, from the provinces of Alajuela, Cartago, Heredia, and San José, Costa Rica. Methodology. A total of 77 tomato plants exhibiting characteristic symptoms of bacterial wilt were sampled, 42.86% in Alajuela, 28.57% in Cartago, 10.39% in Heredia, 12.99% in San José and 5.19% in an unspecified location. Differential medium TZC (2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride) (Kelman, A, 1954) was used, and the morphotypes of Ralstonia spp. were described according to pigmentation, shape and mucosity, as well as the oxidase test response. The Ralstonia spp. morphotypes were molecularly identified using endpoint PCR with specific markers. The morphotypes that tested positive for Ralstonia spp. were described in a table to analyze the common characteristics within each group. Results. A total of 301 different morphotypes were obtained, of which 91 were gram-negative bacilli, of the latter, only 58 corresponded to some species of RSSC. A high variability was obtained in the phenotypic characterization of the morphotypes identified as Ralstonia spp. The colonies described as virulent (27.59%) and avirulent (27.59%) with the culture medium used, atypical colorations (18.97%) not previously reported in the literature, and the remaining 25.85% had different characteristics from those previously described. The isolates tested positive (67.24%) for the oxidase test. Conclusions. A high phenotypic variability of Ralstonia spp. morphotypes were obtained and observed from the cultivation of the bacteria on TZC culture medium, which should be complemented with more detailed genetic analyses to elucidate the reasons for this diversity of morphotypes. INTRODUCCIÓN El cultivo de tomate es un cultivo de importancia en Costa Rica, donde al año 2022 se estimaron 88 ha sembradas, una producción de 45 500 ton y un rendimiento promedio aproximado 20 de 51.2 ton/ha (Consejo Nacional de Producción [CNP], 2022), y forma parte de la Canasta Básica Tributaria por el Bienestar Integral de las Familias (CBTBIF) con un consumo estimado de 18.78 kg/per capita anual en el año 2015 (Campos-Quirós, 2022; Reglamentación de lista de bienes que conforman la Canasta Básica Tributaria por el Bienestar Integral de las Familias (CBTBIF), 2022). Es un cultivo que resulta afectado negativamente por la incidencia de plagas y enfermedades, como el Complejo de Especies de Ralstonia solanacearum (por sus siglas en inglés RSSC), que está conformado por tres diferentes especies de Ralstonia spp., clasificadas de acuerdo con su región de origen, R. pseudosolanacearum originaria de Asia y África, R. solanacearum proveniente de América y R. syzygii nativa de Indonesia (Paudel et al., 2022), y las tres tienen la capacidad de infectar tomate (Prior & Fegan, 2005a). Ralstonia spp. se identifica como el agente causal de la marchitez bacteriana en las plantas de tomate, porque invade el xilema vía sistémica y presenta síntomas de marchitez que podrían desencadenar la muerte de la planta, causando pérdidas de hasta el 70% producción y por ende mermas significativas a nivel económico (López- Marín et al., 2018; Lowe-Power et al., 2018; Mekonnen et al., 2022; Sato et al., 2012). Existen diferentes alternativas para la caracterización e identificación de las bacterias, dentro de las que se encuentran las pruebas morfológicas y las pruebas bioquímicas, que permiten realizar pruebas preliminares para definir la taxonomía clásica bacteriana, como se ha realizado con Ralstonia spp., y complementan la identificación que se realiza por medio de biología molecular (Gobernado & López-Hontangas, 2003). Una de las pruebas iniciales más comunes es con la tinción Gram, la cual permite diferenciar la composición de las paredes bacterianas, y define si una bacteria es Gram positiva por su color morado por la fijación del cristal violeta debido a una gruesa capa de peptidoglicano o Gram negativa por la coloración fucsia por la safranina debido que la delgada pared de peptidoglicano no retiene el cristal violeta; lo que permite definir con más claridad la forma de la célula por medio de la tinción (Chaudhry & Rashid, 2011; Madigan et al., 2015b). Otra forma de diagnóstico preliminar de bacterias es en medios de cultivo que permiten la descripción de las colonias por forma, color, bordes y tamaño (Vargas-Flores & Kuno-Vargas, 2014). En el caso de Ralstonia spp. se ha utilizado comúnmente el medio de cultivo con cloruro de tetrazolio (TZC) desarrollado por (Kelman, 1954) y se han realizado algunas descripciones morfológicas para diferenciar fenotípicamente las colonias entre virulentas y avirulentas, las primeras definidas como colonias rojas con bordes crema de forma irregular y textura fluida y las segundas de color rojo con forma circular (Nurdika et al., 2022; Saquicela Cruz et al., 2023). Estas características se han observado en condiciones de cultivo de 25-32°C según Bhanwar (2022) y García et al., (2019). Este último autor ha reportado la temperatura de incubación de 25-27°C por 21 48 horas, aunque otros autores han reportado 28°C por 48 h (Bittner et al., 2016), e incluso 30°C por 72 horas (Galiano-Murillo et al., 2024). También es posible caracterizar el metabolismo mediante diversas pruebas basadas en reacciones enzimáticas, como la prueba de oxidasa, que identifica el complejo enzimático citocromo c oxidasa y que resulta positiva en el caso de Ralstonia spp. (Colburn-Clifford & Allen, 2010). La ventaja que tienen las pruebas fenológicas sobre las moleculares es que favorecen la selección de bacterias objetivo por medio de la caracterización dentro de grupos de bacterias, además que a nivel de costo económico suelen ser más accesibles. Con base a lo anterior, se propuso caracterizar una colección de bacterias aisladas de plantas de tomate sintomáticas provenientes de las provincias Alajuela, Cartago, Heredia y San José, Costa Rica e identificadas como Ralstonia spp. mediante métodos moleculares, para comprobar la diferenciación a nivel morfológico de dichos aislamientos. MATERIALES Y MÉTODOS Colecta del material Se recolectó 77 muestras de plantas de tomate con síntomas de marchitez bacteriana (figura 2), de 25 lotes distribuidos en 17 fincas, con historial de problemas por aparente Ralstonia spp. Se colectó 33 muestras en Alajuela, 22 muestras en Cartago, 8 muestras en Heredia, 10 muestra en San José y 4 muestras de las cuales se desconoce la provincia de proveniencia (anexo 4). Las fechas de los muestreos fueron del 08 de octubre del 2021 al 15 marzo del 2023. El muestreo se realizó con base en la sintomatología característica para la enfermedad de la marchitez bacteriana en tomate, diferenciada por los síntomas de marchitez en las hojas más jóvenes avanzando hacia la marchitez de toda la planta y la formación de raíces adventicias. Se colectó manualmente las plantas completas y se almacenaron en bolsas plásticas, en refrigeración a 4°C hasta su procesamiento, procurando que no transcurrieran más de tres días de almacenamiento en frío. Las plantas fueron analizadas en las instalaciones del Laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigación en Protección de Cultivos (CIPROC), Universidad de Costa Rica. 22 Figura 2. Ejemplos de plantas muestreadas con síntomas de marchitez generalizada (encerradas con un óvalo rojo). A. Muestreo en Santa Cruz, Turrialba, Cartago, B. Muestreo en Santiago, Paraíso, Cartago, C. Muestreo en Barrantes, Flores, Heredia, D. Muestreo en San Isidro, Atenas, Alajuela. A. B. C. D. 23 Aislamiento de bacterias Las plantas (figura 4.A) se seccionaron en raíz, base de tallo, partes intermedias y tercio superior de la planta (figura 3.A), y se realizó el aislamiento de cada una de las partes que mostraron lesiones marrones o necrosis a lo interno del tejido (figura 3.B. y figura 4.B.). Cada muestra se desinfectó con etanol al 70%, durante 30 segundos, seguido de tres lavados con agua destilada estéril (figura 3.C) (Chaudhry & Rashid, 2011). El tejido vegetal desinfectado, se colocó en 3 mL de solución salina y se incubó por 10-15 minutos (figura 3.D) (Kumar et al., 2017). Posteriormente, se maceró el tejido, se tomó una suspensión con el asa (aproximadamente 10 μL) y se rayó en un plato de Petri con medio de cultivo TZC (figura 4.C.) (Kelman, 1954) modificado por Ray et al. (2021) (anexo 6). Se incubó por 48-72 horas a 27 ±1 °C. En síntesis, se obtuvo un aislamiento para cada parte sintomática de cada una de las plantas muestreadas. Caracterización de los morfotipos Luego del periodo de incubación, se describió todos aquellos morfotipos que se diferenciaron en forma y color dentro de cada plato de cultivo (figura 4.D.), según Vargas-Flores y Kuno-Vargas (2014). Primero se realizó la prueba de Gram (anexo 7), donde se seleccionó los morfotipos de bacilos Gram negativos, que se observaron aparentemente puros en la revisión microscópica y que a su vez podían ser potenciales especies del RSSC (Agrios, 2004; Kado, 2010; Madigan et al., 2015c; Seal et al., 1993; Starr & Taggart, 2007). Cada morfotipo se describió según la pigmentación, la forma y la consistencia. Para las dos categorías de pigmentación se tomó en cuenta el pigmento rojo o rosado con borde blanco y el de color rojo, cualquier otro color o patrón de coloración se consideró como atípico. Los morfotipos se describieron según su forma como “circular” cuando eran redondos y con diámetro igual o mayor a 4mm, “puntiformes” eran también redondos, pero con diámetro menor a 4mm e “irregulares” a las que no tenían forma definida, según Vargas-Flores & Kuno-Vargas (2014). Con base en lo anterior y según lo descrito por (Nurdika et al., 2022), los morfotipos de se han descrito como “virulentos” y “avirulentos”. Los morfotipos virulentos en TZC tienen consistencia fluida o mucoide, con un color rojo o rosado y un borde amplio color blanco, a diferencia de los morfotipos avirulentos que no tienen consistencia mucoide, son redondos, pequeños y completamente rojos. Para este análisis se determinó una tercera categoría nominada como “atípica”, para aquellas colonias que tenían una coloración disímil a lo mencionado anteriormente. Por último, se realizó 24 la prueba de oxidasa (cintas de detección Microbact™) siguiendo las instrucciones de la casa matriz Sigma Aldrich, sin el uso de controles positivos o negativos. Dentro de la agrupación y caracterización de las colonias se consideró la ubicación geográfica en las cuatro provincias Alajuela, Cartago, Heredia y San José, hubo una variable más que fue la ubicación desconocida para las muestras que fueron aportadas como incógnitas. Asociado a los puntos de muestreo se detalló cuáles fueron los híbridos de tomate a partir de los que se aislaron morfotipos de Ralstonia spp., entre estos Dioniso, DWR 7810, FDR 8565, Green Rise, JR Special, TD1, Toretto y Vulcano, y algunas muestras que se identifican como desconocidas ya que fueron una incógnita al no conocerse con exactitud el híbrido o variedad de tomate muestreado, porque el productor tenía una mezcla de diferentes materiales. 25 Figura 3. Ilustración del proceso de preparación de las muestras para el aislamiento de bacterias. A. Ejemplificación del seccionamiento de la planta. B. Síntomas de coloración marrón a lo interno de la base del tallo. C. Representación de la preparación de muestras para la desinfección. D. Tejido de tomate en maceración, inmerso en solución salina. A. B. C. D. T ercio Pa rte B ase de R 26 Figura 4. Representación del proceso de aislamiento de microorganismos a partir de una única unidad de muestreo. A. Con base a una planta muestreada, B. se aisló de cada una de las partes sintomáticas de la planta y C. se obtuvo una placa de aislamiento por cada parte de la planta, donde se identificaron todos los morfotipos diferentes. D. Cada morfotipo se aisló, se caracterizó fenotípicamente y se identificó si era o no Ralstonia spp. a nivel molecular. D. Aislamientos de morfotipos descritos fenotíficamente C. Aislamiento inicial con "n" morfotipos B. Partes de planta analizadas A. Muestreo de la planta Planta Raíz Aislamiento con 2 morfotipos Morfotipo 1, de raíz Morfotipo 2, de raíz Base de tallo Aislamiento con 3 morfotipos Morfotipo 1, de base de tallo Morfotipo 2, de base de tallo Morfotipo 3 de base de tallo Tallo Aislamiento con 3 morfotipos Morfotipo 1, de tallo Morfotipo 2, de tallo Morfotipo 3, de tallo Tercio superior Aislamiento con 2 morfotipos Morfotipo 1, de tercio superior Morfotipo 2, de tercio superior 27 Verificación de Ralstonia spp. en morfotipos Gram negativos Para confirmar la identidad de las colonias de bacilos Gram negativos, con apariencia pura al microscopio, se procedió a realizar el PCR de identificación de las especies de RSSC. Primero, se realizó la extracción de ADN genómico a través del método de (Trout et al., 1997 modificado), (anexo 8). Segundo, se realizó el PCR con dos pares de cebadores específicos para Ralstonia spp. Un par de cebadores del gen 16S rARN diseñados en su momento para detectar Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. pickettii y Blood disease, OLI1 (5'-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3') y Y2 (5'- CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'), utilizados en este ensayo como un control externo (Seal et al., 1993; Young et al., 1991). El producto de la amplificación de la reacción de PCR fue de 287-288 pb. Cada reacción de PCR contenía 12.5 µL de DreamTaq PCR Master Mix (2X), 1 µL de 10 µmol/L de cada oligo, 1.25 µL de DMSO, 5.25µL de agua y 1µL de ADN. El perfil de PCR fue 95°C por 2 min para la desnaturalización inicial, 30 ciclos de desnaturalización a 95°C por 1 min; anillamiento a 59°C por 1 min y extensión a 72°C por 1 min, y por último una extensión final de 72°C por 10 min. El otro grupo de cebadores utilizados fueron de la región ITS del 16S-23S rARN para los filotipos de RSSC, Nmult21:1F (5'CGTTGATGAGGCGCGCAATTT3'), Nmult21:2F (5'AAGTTATGGACGGTGGAAGTC3'), Nmult23:AF (5'ATTACSAGAGCAATCGAAAGATT3'), Nmult22:InF (5'ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA3') y Nmult21:RR (5'TCGCTTGACCCTATAACGAGTA3') (Prior & Fegan, 2005). El producto de la reacción de PCR fue de 144, 372, 91 y 213 pb, para los filotipos I, II, III, IV, respectivamente. Cada reacción de PCR contenía 12.5 µL de DreamTaq PCR Master Mix (2X), 1 µL de 10 µmol/L de cada cebador, 1.25 µL de DMSO, 5.25µL de agua y 1µL de ADN. El programa de PCR fue 95°C por 2 min para la desnaturalización inicial, 30 ciclos de desnaturalización a 95°C por 1 min; anillamiento a 59°C por 1 min y extensión a 72°C por 1 min, y por último una extensión final de 72°C por 10 min. El producto de PCR se visualizó por medio de un gel de electroforesis, a 95V por 45 min en un gel de agarosa al 2%, bajo luz ultravioleta (UV). Por lo tanto, se realizó una caracterización morfológica sólo para las muestras cuyo ADN resultó positivo para ambos análisis de PCR. Análisis de datos Para describir los aislamientos positivos para Ralstonia spp. se creó un cuadro descriptivo que permitió caracterizar agrupaciones de morfotipos bacterianos según pigmentación, forma y consistencia. Adicionalmente, se incluyó la información de la ubicación de los muestreos, los híbridos de tomate de los cuales se aisló los morfotipos y el resultado de la prueba oxidasa. 28 RESULTADOS Con base en el muestreo de 77 plantas, se obtuvo 182 aislamientos iniciales, de los cuales se diferenció 301 morfotipos. De esos 301 morfotipos, sólo 91 resultaron bacilos Gram negativos, aparentemente puros a nivel microscópico; a partir de los cuales se realizó la descripción fenotípica (figura 5). A partir de la caracterización morfológica (figura 6) de los 91 (100%) bacilos Gram negativos, se verificó que 39 (42.86%) morfotipos tenían pigmentación rojo/rosado con borde blanco (figura 7.A y B), 27 (29.67%) de color rojo (figura 7.C y D) y 25 (27.47%) de coloración diferente a las antes indicadas (figura 8). Dentro de los morfotipos rojo/rosado con borde blanco, 23 (25.27%) mostraron consistencia mucoide (figura 7.A) y las restantes 16 (17.58%) no tuvieron consistencia mucoide (figura 7.B); en el primero de los casos de acuerdo con su forma se clasificaron e