Rev. Biol. Trop. 52 (3): 787-793, 2004 www.ucr.ac.cr www.ots.ac.cr www.ots.duke.edu Un método de transformación genética de maíz para conferirle resistencia ulterior a enfermedades virales Marta Valdez 1, Kenneth Madriz2,* & Pilar Ramírez1, 2 1 Escuela de Biología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica; mvaldez@biologia.ucr.ac.cr. 2 Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica, 2060 San José, Costa Rica. * Dirección actual: Biotécnica Análisis Moleculares S. A. Recibido 14-VII-2004. Corregido 02-IX-2004. Aceptado 02-IX-2004. Abstract: A method for genetic transformation of maize for resistance to viral diseases. A system for the genetic transformation of maize was developed for two Costa Rican varieties: CR-7 and Diamantes 8843, that can allow the subsequent transfer of viral-derived genes in order to confer resistance to the disease caused by maize rayado fino virus (MRFV). The method is based on particle bombardment of organogenic calli derived from shoot tips. On the other hand, the molecular construction pRFcp-bar, containing the coat protein gene of MRFV and the marker gene bar, was elaborated. For the visual selection of the transformed material was used also the plasmid pDM803 that contains the reporter gene uidA (GUS).The results indicate that devices evaluat- ed: the PIG (“ Particle Inflow Gun “) and the Bio-Rad ™ are both enough efficient to transfer foreign genes to the genome of the maize. Rev. Biol. Trop. 52(3): 787-793. Epub 2004 Dic 15. Key words: Zea mays, Biotechnology, Genetic Transformation, Biolistics, maize rayado fino virus (MRFV). Palabras clave: Zea mays, Biotecnología, Transformación Genética, Biobalística, virus del rayado fino del maíz (MRFV). El maíz es uno de los tres cereales de ma- 50% en el peso de las mazorcas en cultivares yor importancia en el mundo. Más de cuatro- criollos adaptados a las condiciones locales en cientos millones de personas en América Mesoamérica. Central, México, África y Asia dependen de Los nuevos cultivares e híbridos desarro- ese cultivo para su subsistencia. En países tro- llados por los fitomejoradores son, no obstan- picales su productividad es baja debido en gran te, muy susceptibles al MRFV, donde las parte a enfermedades virales (FAO y CIM- pérdidas pueden alcanzar el 100%. En varios MYT 1997). En América Latina hay muchos estadíos de la enfermedad, la planta entera se virus que atacan el cultivo, siendo uno de los marchita llegando hasta a morir (Gámez más importantes el virus del rayado fino del 1980). Es entonces, de fundamental importan- maíz (MRFV), descrito y caracterizado por cia el introducir resistencia no convencional al Gámez (1969, 1983). A nivel molecular, su ge- MRFV en los cultivares de maíz que se siem- noma fue clonado y secuenciado por Ham- bran en América Latina y en Costa Rica para mond y Ramírez (2001), quienes además aumentar su producción, y reducir la aplica- desarrollaron métodos moleculares para el ción de plaguicidas para el control del insecto diagnóstico de la enfermedad. Este virus es vector del virus. transmitido exclusivamente por el insecto cica- Las técnicas biotecnológicas modernas re- délido Dalbulus maidis (DeLong y Wocott fide presentan nuevas alternativas para el control Gámez 1973), y ocasiona pérdidas de 40 a de enfermedades virales. Algunas de esas 788 REVISTA DE BIOLOGÍA TROPICAL estrategias se basan en la expresión in planta, METODOLOGÍA de genes virales o de secuencias derivadas del patógeno, mediante técnicas de ingeniería ge- Se utilizó semillas de los genotipos costa- nética y de transformación genética (Madriz- rricenses CR-5, CR-7 y Diamantes 8843, que Ordeñana 1999). Esta forma de resistencia se fueron proveidas por la Oficina Nacional de conoce como: “resistencia derivada del pató- Semillas de Costa Rica. Los métodos de desin- geno” (Sanford y Johnston 1985). fección de explantes, y de inducción de callos La expresión de la proteína de cubierta vi- morfogénicos son similares a los descritos por ral en plantas transgénicas es una estrategia O’Connor-Sánchez et al. (2002). Para la rege- que ha sido muy utilizada para conferir resis- neración de plantas los callos se cultivaron en tencia a enfermedades virales en muchos culti- frascos de vidrio Gerber con medio MS (Mu- vos vegetales de importancia agrícola (Beachy rashige y Skoog 1962), sin reguladores de cre- et al. 1990). Algunos han sido liberados para el cimiento, en un cuarto de crecimiento con un cultivo comercial. Estos incluyen tomates re- fotoperíodo de 12 h generado por lámparas sistentes al virus del mosaico de tomate fluorescentes blancas y rosadas para el creci- (ToMV) y al virus del mosaico del pepino miento de plantas (2000 lux). (CMV), pepino resistente a CMV, calabaza re- Por otro lado, se elaboró la construcción sistente a virus del mosaico amarillo del zuchi- molecular que denominamos pRFcp-bar. Para ni (ZYMV) y al virus del mosaico de la sandía ello se utilizó un fragmento de 580 pares de ba- (WMV2), etc. (Lomonossoff 1995). Kogel et ses del gen de la cubierta proteica viral del al. (1996), clonaron el gen de la proteína de cu- MRFV regulado por el promotor constitutivo bierta del MRFV (cpMRFV), clon que luego de la actina del arroz (McElroy et al. 1991) y fue utilizado en la elaboración de una cons- con la secuencia de terminación del gen que co- trucción molecular que pudiese ser expresada difica para la enzima ribulosa –1,5– difosfato en plantas transgénicas de maíz. O’Connor- carboxilasa oxigenasa (rubisco) (Gloria et al. Sánchez et al. (2002) desarrollaron un sistema 1984). Como gen marcador de selección, se in- muy eficiente de regeneración de plantas de ge- cluyó el gen bar que codifica para la enzima notipos tropicales de maíz, basado en la induc- fosfinotricina acetil-transferasa (PAT) (Thom- ción de callos organo-embriogénicos derivados son et al. 1987), regulado por el promotor de la de ápices, para ser utilizado en experimentos de Ubiquitina I del maíz (Christensen et al. 1992) transformación genética por medio de biobalís- y la secuencia de terminación nos proveniente tica. Es entonces de gran interés aplicar este de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al. método a los genotipos costarricenses de maíz, 1983). El gen bar contrarresta el efecto inhibi- para confererirles resistencia a enfermedades dor de la fosfinotricina (PPT) sobre la glutami- virales y otras plagas. na sintetasa en las células vegetales, El objetivo de la presente investigación previniendo la acumulación de amoníaco y por fue desarrollar una metodología para la trans- ende la muerte celular. Así, la expresión de ese formación genética de variedades costarricen- gen foráneo, permite la selección en un medio ses de maíz, utilizando genes marcadores que contiene PPT de las células vegetales, en como el gen bar y el gen reportero GUS, así relación con aquellas que no lo poseen (Spencer como el gen cpMRFV, por medio del método et al. 1990). La Figura 1 muestra la construc- de bombardeo con micropartículas (biobalísti- ción molecular final que fué utilizada para los ca) y de técnicas biotecnológicas de cultivo in experimentos de transformación genética del vitro, que permitan la transferencia ulterior del presente trabajo. El proceso de elaboración se gen cpMRFV a su genoma para poder conferir- describe en detalle en Madriz-Ordeñana (1999). le resistencia a la enfermedad ocasionada por Para efectos de selección visual del mate- el MRFV. rial transformado se utilizó el plásmido INTERNATIONAL JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY AND CONSERVATION 789 Fig. 1. Representación esquemática lineal de la construcción de ADN pRFcp-BAR. Fig. 1. Schematic linear representation of ADN’s construction for the transformation vector pRFcp-BAR. pDM803 que contiene el gen reportero uidA Para detectar el gen marcador bar se desa- (GUS) que codifica para la enzima ß-glucuro- rrolló un protocolo experimental de selección nidasa (Jefferson 1987), conjuntamente con el de los callos morfogénicos de nuestros genoti- pRFcp-bar. Al pDM803 se le eliminó el gen pos de maíz bombardeados con los dos acele- bar ya que se encuentra también en el pRFcp- radores de partículas. Este protocolo consistió bar (Madriz-Ordeñana 1999). Ese plásmido en la utilización del agente selectivo glufosina- fue cedido por los Laboratorios Carlsberg de to de amonio (fosfinotricina: PPT) en concen- Dinamarca. El método de preparación del traciones de 3, 4, 5 y 6 mgL-1 en el medio de ADN y de los microproyectiles de oro, es simi- cultivo para el mantenimiento de los callos lar al presentado por Valdez et al. (1998). control (no transformados), para determinar la La preparación de los explantes, así como susceptibilidad natural de este tipo de material las condiciones de mantenimiento de los callos al agente selectivo. De esa manera se determi- de maíz, antes y después de la transferencia de nó la concentración adecuada para discriminar genes, se realizó de acuerdo con los métodos los tejidos efectivamente transformados luego desarrollados por O’Connor-Sánchez et al. de los experimentos de biobalística. Los expe- (2002). Se realizaron experimentos de bombar- rimentos de cultivo in vitro y de bombardeo de deo de los genes transportados por los micro- micropartículas con el PIG, se llevaron a cabo proyectiles por medio de dos aceleradores de en el laboratorio de cultivo in vitro y de trans- partículas: el PIG (“Particle Inflow Gun”) formación genética de plantas, de la Escuela de (Finner et al. 1992) y el Bio-Rad™ “PDS- Biología de la Universidad de Costa Rica. Los 1000, Helium System” (Sanford et al. 1987). de transformación por medio del acelerador Este último aparato pertenece al Laboratorio Bio-Rad™ se realizaron en el laboratorio de de Biotecnología del Centro Agronómico Tro- Biotecnología del CATIE. El tiempo total de pical (CATIE) con sede en Turrialba, Costa Ri- ejecución de los experimentos fue de enero de ca. Con esos dos aparatos se compararon las 1999 a mayo de 2003. eficiencias de transformación genética, en rela- ción con la expresión transitoria del gen repor- tero GUS (Jefferson 1987) y con la resistencia RESULTADOS conferida a los tejidos vegetales por el gen marcador bar. La expresión en los tejidos del Los ápices de maíz cultivados en medio gen uidA (GUS) se detectó mediante un ensa- MS suplementado con 2 mgL-1 BAP (6- benzi- yo histoquímico, en el cual se colocó una laminopurina), 1 mgL-1 de 2,4-D (ácido 2,4-di- muestra de tejido en la solución reveladora X- clorofenoxiacético) y 40 mgL-1 de Adenina gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuróni- (Medio MPC), generaron estructuras organo- do). La enzima degrada el sustrato y como génicas que luego de ocho semanas generaron resultado se genera una coloración azul (foci) callos con capacidad para la regeneración de en los tejidos transformados que contienen el plantas (Fig. 2 A y B). El porcentaje de forma- gen (Gallagher 1992, Vasil y Thorpe 1994). ción de estructuras organogénicas fue de 32 a 790 REVISTA DE BIOLOGÍA TROPICAL Fig. 2. Organogénesis in vitro de maíz, y expresión de genes marcadores de transformación en los callos morfogénicos de maíz de la variedad “Diamantes 8843”. A- Callo organogénico en oscuridad; B- Callo en proceso de regeneración de plántulas; C- expresión de la ß-glucuronidasa en callos de maíz con ace- lerador PDS-1000/He ; D y E- expresión de la ß-glucuronidasa en callos de maíz con PIG; F- Plántula de maíz en condiciones de selección con PPT, luego de 1 mes de cultivo en medio de regeneración. Fig. 2. In vitro organogenesis of maize and expression of the marker genes of transformation in morpho- genic calluses of the variety “Diamantes 8843”. A - Organogenic callus in darkness; B – Organogenic ca- llus in process of plant regeneration; C - Expression of ß glucuronidase enzyme in calluses of maize by using the accelerator PDS 1000/He; D & E - Expression of ß glucuronidase enzyme in calluses of mai- ze by using the PIG; F - Plantlet of maize growing in conditions of selection with PPT, after four weeks of culture. 40% para la variedad Diamantes 8843, de 73 a El número de plántulas regeneradas por gramo 84% para CR-5 y de 55 a 100% para CR-7. To- de peso fresco de callo varió según el genoti- dos los callos generados fueron capaces de re- po: 5 para CR-5, 9 para CR-7 y 39 para Dia- generar plantas al ser transferidos a medio de mantes 8843. La capacidad para la inducción regeneración luego de seis semanas de cultivo. de callos entonces, no parece estar relacionada INTERNATIONAL JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY AND CONSERVATION 791 con la capacidad para la regeneración de esas sobre la expresión transitoria del gen GUS, a estructuras globulares. En consecuencia, los las 48 horas después del bombardeo. La expre- experimentos de transformación genética se sión de este gen siempre fue mayor con el tra- realizaron sólo en los genotipos Diamantes tamiento osmótico, en ambos aceleradores. 8843 y CR-7. El porcentaje de callos supervivientes lue- La expresión transitoria de la ß-glucuroni- go de 4 meses de selección con 6 mgL-1 de dasa en los callos de maíz bombardeados con PPT varió entre 56% para el tratamiento osmó- los aceleradores PDS-1000/He y PIG se mues- tico en la Bio-Rad ™ y 57% en la PIG. Luego tra en la figura 2 (C, D y E). En relación con la de cinco meses de selección con PPT, se obtu- tolerancia natural de ambos genotipos al agen- vieron 14 clonas resistentes del genotipo Dia- te de selección PPT, los resultados indican que mantes 8843 cuando se utilizó el aparato PIG y la concentración adecuada de ese agente es de solo 3 con el Bio-Rad ™, no obstante los me- 6 mgL-1, ya que alrededor del 73 al 75% de los jores resultados en expresión transitoria del callos control de ambos genotipos se necrosa- gen GUS, obtenidos con este dispositivo en las ron. El número de foci azúles, generados por la semanas siguientes al bombardeo (Cuadro 1). actividad de la enzima ß-glucuronidasa (gen Este último resultado se debió probablemente GUS) fue mayor, con un promedio de 41 por al largo traslado del material vegetal, para rea- muestra, cuando el bombardeo se realizó con lizar los experimentos de bombardeo en el la- el acelerador Bio-Rad ™, que cuando se utili- boratorio del CATIE en Turrialba. zó la PIG (Cuadro 1). El uso de un tratamiento El Cuadro 1 presenta las condiciones más osmótico (medio MPC suplementado con 12% adecuadas con los dos dispositivos de acelera- de sacarosa) por 24 horas antes y después del ción de micropartículas cubiertas de ADN eva- bombardeo, también mostró un efecto positivo luados, para la transformación genética de los CUADRO 1 Comparación de resultados de expresión transitoria del gen Gus en experimentos de transformación genética de maíz (Zea mays L.), variedad “Diamantes 8843”, con dos aceleradores de particulas: Bio-Rad ™ (PDS-1000/He) y “Particle Inflow Gun” (PIG), con y sin tratamiento osmótico (12% sacarosa) TABLE 1 Comparison of results of transitory expression of the gene Gus in experiments of genetic transformation of maize (Zea mays L.), variety “Diamantes 8843”, with two gene guns: Bio-Rad™ (PDS-1000/He) and “Particle Inflow Gun” (PIG), with and without osmotic treatment (12% saccharose) Tipo de acelerador: PDS-1000/He PIG Tratamiento Control Tratamiento Control osmótico osmótico (n=80) (n=43) (n=92) (n=50) No. foci de actividad de la enzima ß-glucuronidasa (gen GUS): promedio por muestra * 41 31 22 7 desviación estándar 16 25 16 7 Porcentaje de callos supervivientes luego de 4 meses de selección con PPT (6 mgL-1) 56 62 57 22 * (10 mg PF de callo) Condiciones de transformación: Presión de gas Helio: 1 350 PSI en PDS-1000/He 100 PSI en PIG Altura de la muestra: 9 cm en PDS-1000/He; 15 cm en PIG Plásmidos: co-transformación: pRFcp-bar: (MRFVcp + Bar) + pDM803 - Bar: (GUS) 792 REVISTA DE BIOLOGÍA TROPICAL genotipos costarricenses de maíz examinados. por su asistencia en el trabajo experimental, a Con esas condiciones se recuperaron 11 even- Oscar Rocha por la revisión del manuscrito. Se tos adicionales de transformación del genotipo agradece la colaboración de María Elena Agui- CR-7, con el acelerador PIG luego de 5 meses lar y de Nelly Vázquez del Departamento de de selección. Esos callos desafortunadamente, Biotecnología del Centro Agronómico Tropical en su mayoría, perdieron su capacidad de rege- de Investigación y Enseñanza (CATIE), por fa- neración, debido posiblemente al largo período cilitar sus instalaciones y equipo. Este trabajo de cultivo en medio de selección, por lo que no fue financiado por la Universidad de Costa Ri- fue posible regenerar las plántulas. Sólo una ca (Proyecto No 111-96-222), por el Ministerio logró sobrevivir dos meses en medio de rege- de Ciencia y Tecnología a través del Fondo de neración (Fig. 2F). Incentivos, y por el Centro Internacional de In- geniería Genética y Biotecnología (ICGEB). DISCUSIÓN RESUMEN Los métodos de transformación genética del maíz, utilizados de manera comercial, re- Se desarrolló un sistema de transformación genética quieren del cultivo de embriones inmaduros para dos variedades costarricenses de maíz: CR-7 y Dia- mantes 8843, que permita la transferencia ulterior de ge- que producen el tipo de callo “Hi-II”, de muy nes de origen viral a su genoma, y conferirles resistencia a alta capacidad embriogénica. Desafortunada- la enfermedad ocasionada por el virus del rayado fino del mente, sólo unos pocos genotipos, como el A- maíz (MRFV). El método se basa en el bombardeo de mi- 188, sin interés comercial, producen este tipo croproyectiles en callos organogénicos derivados de ápi- de callos morfogénicos (Rhodes et al. 1988, ces de jóvenes vitrogerminaciones. Por otro lado, se elaboró la construcción molecular pRFcp-bar que contie- Fromm et al. 1990, Gordon-Kamm et al. 1990). ne el gen de la cubierta proteica del MRFV y el gen mar- Los transgenes de interés agronómico, integra- cador bar. Para la selección visual del material dos de esta manera al genoma del maíz, son transformado, se utilizo también el plásmido pDM803 que luego transferidos por mejoramiento conven- contiene el gen reportero uidA (GUS). Los resultados indi- cional, a las líneas de maíz de valor comercial, can que los dos aceleradores de partículas evaluados: el PIG (“Particle Inflow Gun”) y el Bio-Rad™ son igual- lo que toma varios ciclos reproductivos a fín de mente eficientes para transferir genes foráneos al genoma eliminar los caracteres genéticos no deseados. del maíz. Este es además, un proceso de alto costo debi- do a las complejas manipulaciones para aislar embriones inmaduros en cada generación REFERENCIAS (O’Connor-Sánchez et al. 2002). Por esta razón, y con la finalidad de pro- Beachy, R.N., S. Loesch-Fries & N.E. Tumer. 1990. Coat ducir plantas transgénicas de maíz, de interés protein-mediated resistance against virus infection. agronómico, resistentes al virus del rayado fi- Annu. Rev. Phytopathol. 28: 451-474. no del maíz (MRFV) en el futuro, esta investi- Bevan, MW., R.B. Flavell. & M.D. Chilton. 1983. Struc- gación desarrolló un método alternativo para la ture and transcription of the nopaline synthase gene regeneración y transformación genética de region of the T-DNA. Nucl. Ac. Res. 11: 369-385. plantas de maíz de genotipos costarricenses. Christensen, A.H., R.A. Sharrock & P.H. Quail. 1992. Maize polyubiquitin genes: Structure, thermal per- turbation of expression, transcript splicing, and pro- AGRADECIMIENTOS moter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18: 675-689. Los autores agradecen a Rosemarie Ham- Finner, J., P. Vain, M.W. Jones & M.D. McMullen. 1992. mond por el asesoramiento en las técnicas mo- Development of the Particle Inflow Gun for ADN leculares, a Narcy Villalobos y Marlon Delgado delivery to plant cells. Plant Cell Rep. 11: 323-328. INTERNATIONAL JOURNAL OF TROPICAL BIOLOGY AND CONSERVATION 793 FAO & CIMMYT (Food and Agriculture Organization of Madriz-Ordeñana, K. 1999. Molecular studies of the de- the United Nations) and (International Maize and fence responses of maize (Zea mys L.) in interaction Wheat Improvement Center). 1997. White maize: a with Maize Rayado Fino Marafivirus (MRFV). Tesis traditional food grain in developing countries. 22 p. PhD. The Royal Veterinary & Agricultural Univer- sity, Copenhagen, Denmark. Fromm, M.E., F. Morrish, C. Armstrong, R. Williams, J. Thomas & T.M. Klein. 1990. Inheritance and expres- McElroy, D., A.D. Blowers, B. Jenes & R. Wu. 1991. sion of chimeric genes in the progeny of transgenic Construction of expression vectors based on the rice maize plants. 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