UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIÓN
INFORME FINAL DEL PROYECTO N° ll1-A3-038
"ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS CELULARES PARA
LA REGENERACIÓN IN VITRO DEL AYOTE (Cucurbita moschata)"
Presentado por:
Registrado en B.O.
Marta Valdez Melara 2 8 FEB. 2008
Olé 0~Pilar Ramírez Fonseca Por:
Andrés Gatica Arias
Diciembre 2007
2
1. DATOS GENERALES DEL PROYECTO:
1.1 NÚMERO DEL PROYECTO: 111-A3-038
1.2 NOMBRE DEL PROYECTO: "Establecimiento de cultivos celulares para la regeneración in
vitro del ayote (Cucurbita moschata)".
1.3 UNIDAD RESPONSABLE: Escuela de Biología.
1.4 INVESTIGADORA PRINCIPAL: Dra. Marta F. Valdez Melara
Unidad Académica: Escuela de Biología
Tiempo de dedicación: 2 h semanales
1.5 OTROS INVESTIGADORES
Investigadora Asociada: Dra. Pilar Ramírez Fonseca
Unidad Académica: Escuela de Biología y CIBCM
Tiempo de dedicación: 5 h semanales
Investigador Asociado: M.Sc. Andrés Gatica Arias
Unidad Académica: Escuela de Biología
Tiempo de dedicación: 7 h semanales
1.6. VIGENCIA: del 01 Enero 2003 al 14 Diciembre 2007.
2. GRADO DE AVANCE DEL PROYECTO
2.1. OBJETIVO GENERAL
Desarrollar la metodología y los protocolos experimentales para la regeneración de plantas en
condiciones de cultivo in vitro, a partir de tejidos somáticos en varios genotipos de ayote
(Cucurbita moschata) de Costa Rica, para la aplicación ulterior de técnicas biotecnológicas de
mejoramiento genético.
3
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS (AÑOS 2003-2004):
• Desarrollar los procedimientos experimentales para la inducción de callos embriogénicos de
varias accesiones de ayote de Costa Rica.
• Desarrollar un sistema que permita la regeneración de plantas fértiles de ayote, a partir de
embriones somáticos.
• Evaluar la capacidad morfogénica de varios genotipos (accesiones) costarricenses de ayote,
en relación con su capacidad para la callogénesis y la regeneración de plantas.
2.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS (AÑOS 2005-2006):
• Confirmar el éxito de la metodología de embriogénesis somática y la capacidad de
regeneración de plantas en genotipos comerciales y del banco de germoplasma del CATIE.
• Evaluar las características agronómicas y la fertilidad de las plantas generadas por
embriogénesis somática, que fueron transferidas al campo, al alcanzar la madurez sexual.
• Desarrollar una metodología para la transformación genética de variedades de ayote,
utilizando genes marcadores como el gen bar y el gen reportero uidA (GUS) por medio del
método de bombardeo con micropartículas (biobalística).
2.4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS (AÑOS 2006-2007):
• Determinar las condiciones experimentales adecuadas para la transformación genética del
ayote, que permitan la transferencia ulterior de genes foráneos de interés agronómico a su
genoma, tales como genes de origen viral.
Realizar ensayos de expresión transitoria y estable de los genes reporteros y marcadores de
selección en las líneas de callos transformadas.
Comprobar la presencia del gen bar, el cual confiere resistencia al herbicida Basta TM,
utilizando técnicas moleculares.
Determinar la tolerancia natural de las plantas no transformadas a distintas concentraciones
(0,0.25,0.5, 1.0 Y 1.5 % v/v) del herbicida Basta TM.
Evaluar las características agronómicas y la fertilidad de las plantas transformadas con los
genes bar y uidA.
•
•
•
•
4
3. RESUMEN DE LOS AVANeES EN LOS LOGROS DE LOS OBJETIVOS Y LAS
ACTIVIDADES
3. Evaluar la capacidad
morfogénica de varios Evaluación de genotipos de
genotipos (accesiones) la zona de Guanacaste (de
costarricenses de ayote, en fincas privadas).
relación con su capacidad
para la callogénesis y la Evaluación de genotipos
regeneración de plantas. proveídos por el Centro
Agronómico Tropical de
Investigación y Enseñanza
(CATIE).
Objetivo
programado
1. Desarrollar los
procedimientos
experimentales para la
inducción de callos
embriogénicos de varias
accesiones de ayo te de
Costa Rica.
2. Desarrollar un sistema
que permita la
regeneración de plantas
fértiles de ayote a partir de
embriones somáticos.
Actividad( es)
asociada(s) al
objetivo
Obtención de plántulas
regeneradas a partir de los
callos obtenidos en la
primera etapa de la
investigación.
Traslado de las plantas
obtenidas a condiciones de
invernadero y campo para
evaluación agronómica.
Evaluación de genotipos
comerciales de ayote.
la
y
de
Duración
planteada
para la
actividad
Resultados
obtenidos
% avance
de las
actividades
100%
Enero 2003 a
junio 2004
Procedimiento
para la inducción
de callos
embriogénicos en
ayote.
Procedimiento
para
regeneración
aclimatación
vilroplantas.
100 %
Junio 2004 a
junio 2005.
Procedimiento
para la inducción
de callos
embriogénicos en
vanas accesiones
ayote.100%
Enero 2004 a
marzo 2006
5
4. Desarrollar una
metodología para la
transformación genética de
variedades de ayote,
utilizando genes
marcadores como el gen
bar y el gen reportero
GUS, por medio del
método de bombardeo con
micropartículas
(biobalística).
Determinar las condiciones
experimentales adecuadas
para la transformación
genética del ayote, que
permitan la transferencia
ulterior de genes foráneos
de interés agronómico a su
genoma, tales como genes
de origen viral.
Realizar ensayos de
expresión transitoria y
estable de los genes
reporteros y marcadores de
selección en las líneas de
callos transformadas.
Comprobar la presencia del
gen bar, el cual confiere
resistencia al herbicida
Basta TM, utilizando
técnicas moleculares.
100%
lOO %
100%
Procedimiento
para la
transformación
genética de callos
y segmentos de
cotiledón de ayote.Enero 200S a
diciembre
2007 Procedimiento
para la
identificación de
los genes bar y
uidA.
6
4. DESCRIPCIÓN DEL AVANCE DE LAS ACTIVIDADES.
Objetivo 1. Desarrollar los procedimientos experimentales para la inducción de callos
embrio¡:énicos de varias accesiones de ayote de Costa Rica. Se cumplió en un 100%.
Enero 2003 a diciembre 2003: Los resultados se presentaron en los informes anteriores.
El mejor medio de cultivo para la inducción de callos a partir de cotiledones de plantas
juveniles de ayote fue el MS suplementado con 0.5 mg/L de 2,4-D. El porcentaje de callogénesis
con este tratamiento fue de 83.5 % . Es decir de cada 100 exp1antes sembrados, 83.5 produjeron
callos. Consecuentemente, este medio ha sido escogido para la generación de callos que son
sometidos a los experimentos de regeneración de plantas.
Segunda etapa: enero - junio 2004: Los resultados se presentaron en los informes
anteriores. En esta etapa:
• Se confirmo el éxito de la metodología de cultivo in vitro y regeneración de plantas con la
evaluación de otros genotipos de ayote que fueron cultivados para el incremento de semilla.
• Se evaluó la capacidad morfogénica de varios genotipos con una nueva serie de tratamientos,
que incluyen el uso de la auxina de síntesis 2, 4, 5-T (ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético)
combinado con BAP. Se logró inducir algunos callos, pero sin capacidad morfogénica.
Resultados presentados en los informes anteriores.
• Se obtuvieron p1ántulas regeneradas a partir de los callos obtenidos en la primera etapa de
la investigación, que fueron evaluadas en condiciones de campo. Los resultados de esta
etapa se presentaron en el segundo informe.
Objetivo 2. Desarrollar un sistema que permita la re¡:eneración de plantas fértiles de ayote.
Se cumplió en un 100%.
Junio 2004 a junio 2005: Comprendió las siguientes actividades:
• Obtención de plántu1as regeneradas a partir de los callos obtenidos en la primera etapa de la
investigación.
• Traslado de las plantas obtenidas en la investigación a condiciones de invernadero y campo
para evaluación agronómica.
Las p1ántu1as regeneradas fueron sembradas en el campo, en una finca privada, en San Ramón,
crecieron en muy buenas condiciones. Todas fueron fértiles y produjeron frutos y semillas
viables.
Objetivo 3. Evaluar la capacidad morfogénica de varios genotipos de ayote. en relación con
su capacidad para la callogénesis y la regeneración de plantas. Se cumplió en un 100%.
Enero 2004 - Marzo 2006. Los resultados se presentaron en los informes anteriores. Esta
etapa comprendió las siguientes actividades:
• Evaluación de genotipos comerciales de ayote.
• Evaluación de genotipos de la zona de Guanacaste (de fincas privadas).
• Evaluación de genotipos proveídos por el Centro Agronómico Tropical de Investigación
y Enseñanza (CATIE).
De los 20 genotipos del CATIE examinados, 7 mostraron capacidad de regeneración de plantas
y 2 generaron brotes. Estos genotipos, fueron seleccionados por los expertos de CATIE, de
manera que fueran muy diferentes entre sí y representativos de la amplia variabilidad genética de
la especie, que incluye silvestres y cultivados. Nosotros no conocemos su verdadera identidad,
para efecto de tener una mayor objetividad y aleatoriedad en esta investigación.
De manera general, estos resultados confirman el éxito de la metodología de embriogénesis
somática, desarrollada en este proyecto de investigación, y la capacidad de regeneración de
plantas en genotipos comerciales y del banco de germoplasma del CATIE. Una investigación
ulterior de microscopía electrónica para confirmar y optimizar el proceso embriogénico de este
procedimiento experimental en esta especie, sería de sumo interés científico y aplicado para la
biotecnología del ayote.
Se puede entonces concluir que el procedimiento experimental adecuado para la regeneración
in vitro de plantas de ayote, válida para un gran número de genotipos, consiste en:
Inducción de callos embriogénicos a partir de cotiledones, en medio MS suplementado
con 0.5 mg/L de 2,4-D durante 16 semanas.
Los callos se transfieron luego a medio de maduración de embriones somáticos. Este
medio es un MS suplementado con 0.5 mg/L de AlA (ácido indolacético) y de 0.5 mg/L
de kinetina, durante 4 semanas o hasta que aparecen los puntos verdes.
Transferencia de los embriones somáticos maduros a medio de cultivo de regeneración,
que consiste en un MS al 50 %, sin reguladores de crecimiento. A las 4 semanas de
cultivo se observan las plántulas pequeñas, pero bien diferenciadas, que continuaron su
desarrollo hasta que alcanzaron un tamaño de unos 20 cm de altura.
Las plantas se aclimataron progresivamente a condiciones de invernadero y se
transfirieron a macetas con suelo autoclavado, y luego a condiciones de campo para su
crecimiento y maduración sexual.
8
Objetivo 4. Desarrollar una metodología para la transformación genética de variedades de
ayote. utilizando genes marcadores como el gen bar y el gen reportero uidA. por medio del
método de bombardeo con micropartículas (biobalística). Se cumplió en un 100%.
Enero 2005 - Diciembre 2007: Comprendió las siguientes actividades:
• Determinar las condiciones experimentales adecuadas para la transformación genética del
ayote, que permitan la transferencia ulterior de genes foráneos de interés agronómico a su
genoma, tales como genes de origen viral.
• Realizar ensayos de expresión transitoria y estable de los genes reporteros y marcadores de
selección en las líneas de callos transformadas.
• Comprobar la presencia del gen bar, el cual confiere resistencia al herbicida Basta ™
utilizando técnicas moleculares.
Metodología
Para esta investigación se utilizó el método de bombardeo de micropartículas o biobalística,
mediante el uso del acelerador de partículas ("pistola de genes") de baja presión, conocida como
"Particle Inflow Gun" (PIG) y la pistola de genes PDS-l000 He de Bio-Rad.
Inducción de brotación y efecto del ultrasonido en cotiledones de C. moschata
Se siguió la metodología establecida por Anantha-krishnan el al. (2003) para cotiledones
de calabaza. Se colocaron las semillas de ayote de la variedad "Sello de Oro" a germinar en
placas Petri con medio de germinación (sales minerales MS reducidas a la mitad, vitaminas
del MS, 30 gl' de sacarosa, y 3 gl' de Gelrite) durante 9 días. Los explantes utilizados
fueron segmentos de cotiledones, de alrededor de un centímetro de longitud y con
aproximadamente 1 mm de hipocótilo. Se llevaron a cabo tres tratamientos:
1. US-BAP: Se extrajeron los cotiledones y se les trató con ultrasonido por dos
minutos en vial (25mmx80mm) con agua destilada estéril. Seguidamente se
colocaron 5 explantes en placas Petri con medio de inducción a organogénesis (sales
minerales MS reducidas a la mitad, vitaminas del MS, 30 gl-l de sacarosa, 3 gl' de
Gelrite y 1 rngl' de BAP).
2. BAP: Los explantes de cotiledón se colocaron directamente en el medio de
inducción a organogénesis.
3. Control: Los explantes de cotiledón se colocaron directamente en medio de
germinación.
Los brotes obtenidos en cada tratamiento se subcultivaron en frascos Gerber con medio de
elongación de brotes (sales minerales MS reducidas a la mitad, vitaminas del MS, 30 gl' de
sacarosa, 3 gl-l de Gelrite, 1 mgl' de AG3 y 0.1 mgl' de BAP).
9
Vector de transformación
Se utilizó el plásmido pDM803 y el plásmido pCAMBIA 1301-BAR. Ambos plásmidos
poseen el gen marcador bar y el gen reportero uidA (GUS). En el plásmido pDM803 el gen bar
esta bajo el control del promotor de la Ubiquitina 1 del maíz (Christensen et al. 1992) y de la
secuencia de terminación nos (Bevan et al. 1983). Por otro lado, en el plásmido pCAMBIA
1301-BAR, los genes bar y uidA están bajo el control del promotor constitutivo 35S del virus
del mosaico de la coliflor.
El gen bar codifica para la enzima fosfinotricina acetil-transferasa (PAT) (Thomson et al.
1987). El gen bar contrarresta el efecto inhibidor de la fosfinotricina (PPT) sobre la glutamina
sintetasa en las células vegetales, previniendo la acumulación de amoníaco y por ende la muerte
celular. Así, la expresión de ese gen foráneo, permite la selección las células vegetales en un
medio que contiene PPT (Spencer et al. 1990). Para efectos de selección visual del material
transformado se utilizará el gen reportero uidA (GUS) que codifica para la enzima B-
glucuronidasa (Jefferson et al. 1987). Esa enzima es una exohidrolasa que cataliza la hidrólisis
de una amplia variedad de B- glucurónidos. El gen uidA (GUS) es de gran utilidad para
estudios de expresión de los genes foráneos. Su expresión en los tejidos puede ser fácilmente
detectada mediante un ensayo histoquímico, en el cual se coloca una muestra de tejido en un
sustrato adecuado (solución reveladora X-gluc). La enzima degrada el sustrato y como
resultado se genera una coloración azul en los tejidos transformados que contienen el gen
(Gallagher 1992, Vasil y Thorpe 1994). Estos genes servirán para la identificación y selección
ulterior del material transgénico.
Preparación de microproyectiles
La preparación de las partículas de oro recubiertas con el ADN se realizó como lo describe
Valdez et al. (1998), con algunas modificaciones. Para ello, se mezclaron los componentes en el
siguiente orden: 50 "",Lde la solución de las partículas de oro (sonicadas previamente), 5 "",Lde
ADN, 50 "",Lde CaCl2 (2.5 M), Y 20 "",Lde espermidina (0.1 M). Luego la mezcla se sonicó
brevemente, se centrifugó a 10 000 rpm por 10 segundos, se eliminó el sobrenadante y el
precipitado ("pellet") se resuspendió en 250 "",Lde etanol al 100%. Después de otra breve
sonicación, se centrifugó por segunda ocasión, se procedió a eliminar el sobrenadante y a
resuspender el precipitado en 65 "",Lde etanol al 100%, seguido de una última sonicación.
Curva de calibración al PPT
Los cotiledones y callos embriogénicos se cultivaron en el medio MS de callogénesis (MS +
3% sacarosa +0.5 mgl' 2,4-D + 0.3% Gelrite, pH 5.6) complementado con distintas
concentraciones de PPT (O, 1, 2, 3, 4, Y 10 mgl'), Con el objetivo de determinar la tolerancia
natural del PPT en tejidos no transformados, se realizó una serie de experimentos control
(negativo) con las mismas concentraciones de PPT, empleadas en los experimentos con el
material bombardeado.
10
Preparación del material vegetal antes y después del bombardeo
El material vegetal (segmentos de cotiledón y callos embriogénicos) se cultivaron en el medio
osmótico (MS + 3% sacarosa + mannitol 0.4 M + 0.3% Gelrite, pH 5.6) 4 horas antes y 16 horas
después del bombardeo, esto con el objetivo de mejorar la eficiencia de regeneración de los
callos sometidos al bombardeo. Con el fin de determinar las mejores condiciones físicas para la
transformación, al utilizar la pistola PIG se evaluaron cuatro distancias desde el portador de los
microproyectiles hasta el tejido vegetal (9, 12, 15 Y 18 cm) y dos presiones del gas Helio (100 y
200 psi). Por otro lado, con la pistola de genes PDS-lOoo He se evaluaron dos distancias desde
el portador de los microproyectiles hasta el tejido vegetal (6 y 12 cm) y tres presiones del gas
Helio (1100, 1350 Y 1550 psi).
Después del bombardeo, el material vegetal se subcultivó en medio de callo génesis (MS + 3%
sacarosa +0.5 mgl' 2,4-D + 0.3% Gelrite, pH 5.6) sin agente selectivo durante un periodo de
una a dos semanas, con el fin de permitir la recuperación celular. Luego, el material vegetal
bombardeado se cultivó en el medio de selección (MS + 3% sacarosa +0.5 mgl' 2,4-D + 2 mgl'
PPT + 0.3% Gelrite, pH 5.6)
Luego de dos a tres meses de selección del material vegetal bombardeado, se ha evaluado la
eficiencia de los diversos tratamientos con PPT. De esta manera se trata de identificar las líneas
celulares resistentes (no necrosadas) y por ende, supuestamente transformadas.
Posteriormente, el material supuestamente resistente se colocó en medio de regeneración
suplementado con la concentración de PPT que resulte ser más eficiente durante la selección del
material vegetal transformado. Las plantas regeneradas supuestamente transformadas de manera
estable serán rociadas en los próximos meses con varias concentraciones (0.25, 0.5, 1.0 Y 1.5 %
(v/v) del herbicida Basta TM, para identificar las líneas resistentes. Con el objetivo de determinar
la tolerancia natural al Basta TM, de las plantas no transformadas se realizó una serie de
experimentos control (negativo).
Análisis de la expresión transitoria del gen GUS
Luego de 48 horas después del bombardeo se tomó una muestra de tejido y se colocó en
contacto con un sustrato que contiene la solución reveladora X-GLUC (5-bromo-4-cloro-3-
indoliyl-D-glucoronido). Las muestras se incubaron por varias horas a una temperatura de
37°C en la oscuridad. Si el gen se insertó en la célula, se sintetizará la enzima B-
glucuronidasa, que degradará al sustrato de revelación X-gluc en los productos ácido
glucorónico y CICR-indico. El CICR-indico es un precipitado azul insoluble, que produce una
coloración azulada en las regiones del tejido donde se expresa el gen uidA (GUS) y ésta se
observa en forma de puntos, conocidos como joci. El número de puntos azules se cuantificó
con ayuda de un estereoscopio. Cuando se visualiza una coloración azúl homogénea e intensa
en todo el tejido del material vegetal bombardeado, se puede considerar que se dio una
integración estable del gen GUS. Su expresión estable será examinada durante todo el proceso
de callogénesis y de regeneración del material aparentemente transformado.
11
Confirmación de la integración nuclear de los transgenes por PCR
Se seleccionó las plántulas de ayote que presenten reacciones GUS positivas y que resistan a
las aplicaciones del herbicida Basta ™ y se realizó una extracción genómica de ADN, utilizando
el protocolo descrito por Dellaporta (ver Anexo 1). Posteriormente, se comprobó la integración
del gen bar en el genoma del ayote mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando el iniciador para amplificar el gen bar 5'GTCTGCACCATGGTCAACC-3' y
5'GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC -3'.
Para 10 anterior, en un volumen de reacción de 50 ul, se añadió 1 ~l de ADN (50-100 ng/ ul),
1.5 ul dNTPs (lOmM), 5 ul de buffer de PCRIOX, 1.5 ul de cada uno de los iniciadores (lO
~M), 0.5 ~l Taq ADN polimerasa y 39 ~l de agua estéril ultrapura. Se utilizaron las siguientes
condiciones de amplificación en un termociclador PTC 100 (MJ Research, Inc.):
desnaturalización inicial de 4 minutos a 94° C, 30 ciclos de desnaturalización de l mino a 94° C,
hibridación de 30 segundos a 56° C, extensión de l minuto a 72° C y extensión final de 5
minutos a 72° C. Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1% en TBE IX.
Asimismo, se incluyeron controles negativos (plantas de ayote no transformadas).
Análisis estadístico
Se utilizaró elementos de la estadística descriptiva: porcentajes, promedios, desviación
estándar, análisis de varianza, para evaluar la eficiencia de la transformación de los callos
embriogénicos (número de foci observados) y por evaluación visual durante la callogénesis, de
la resistencia del material vegetal al agente selectivo incorporado en el medio. De la misma
manera, se evaluó la eficiencia de regeneración del material transformado.
Resultados
Inducción de brotación y efecto del ultrasonido en cotiledones de C. moschata
Se observó la formación de brotes en los tratamientos evaluados a la primera semana de
cultivo (Figura 1). En la mayoría de los casos se observó la formación de brotes pequeños
sin que se pudiera distinguir el desarrollo de hojas (Figura lA). A partir de la segunda
semana de cultivo, se evidenció la aparición de hojas y la diferenciación de brotes múltiples
(Figura lA y B). Los explantes que poseían brotes con más de una hoja (Figura ID) se
transfirieron al medio de elongación.
Al cultivar los explantes de cotiledón directamente en un medio MS con 1 mgl' de BAP
se presentó la mayor producción de brotes por explante (Figura 2). Además, se obtuvo el
mayor porcentaje de explantes que reaccionaron produciendo brotes, en cualquiera de las
semanas después de iniciado el cultivo (Cuadro 1).
12
Figura 1. Formación de brotes en cotiledones de C. moschata. A y B. Inducción de brotes
en la primera semana en medio de organogénesis. C. Múltiples brotes de un solo explante.
D. Brote listo para subcultivar en medio de desarrollo.
La aplicación de dos minutos de ultrasonido antes de transferir los explantes a un
recipiente con medio de inducción de organogénesis, afectó considerablemente el número
de explantes que produjeron brotes y la utilización de este pretratamiento registró el
porcentaje de formación de brotes más bajo durante las primeras cuatro semanas de cultivo.
Independientemente del tratamiento empleado, el mayor porcentaje de explantes con brotes
se obtuvo entre la segunda y tercera semana de cultivo (Cuadro 1).
Cuadro 1. Efecto del tratamiento de ultrasonido en el porcentaje de explantes con brotes
durante las 5 semanas de cultivo.
Tratamiento Semanas después de iniciado el cultivo
1 2 3 4 5
US-BAP
BAP
Control
11,1 64,4 68,9 55,6 53,3
95,6 97,8 97,8 73,3 48,9
82,9 91,4 91,4 85,7 37,1
13
En el cuadro 2, se muestra la producción de hojas por brote durante cinco semanas de
cultivo. Los resultados muestran un efecto negativo de la aplicación de ultrasonido en el
número de hojas por brote, con un promedio máximo de 3.7 a las cinco semanas. Los
mayores valores se observaron en el control y el tratamiento 1 con una media de 5 y 6.8
hojas por brote. Los valores más altos para el número de hojas por brote se obtuvieron para
el tratamiento 2, con 16 y 17 hojas por brote en la cuarta y quinta semana de cultivo, por
otro lado, los valores más bajos se obtuvieron en los controles.
1,8
• Una semanaDos semanas
1,5 •Tres semanas• Cuatro semanaso
i5
Q)
Eo 1,3
"-O-
I.f)
Q)
+-'o
"-m
1,0
0,74-----
BAP BAP-US Control
Figura 2. Número promedio de brotes obtenidos a partir de los cotiledones de C. moschata
en medio de inducción a organogénesis durante la primeras cuatro semanas desde el inicio
del cultivo. Las barras de error corresponden al error estándar.
En conclusión, en el tratamiento 2 (sin aplicación de un pretratamiento con ultrasonido) se
obtuvieron los mejores resultados en la inducción de organogénesis (mayor frecuencia de
obtención de brotes múltiples, mayor porcentaje de explantes produciendo brotes y mayor
número de hojas por brote).
14
Cuadro 2. Promedio de hojas por brote a lo largo de cinco semanas en cada uno de los
tratamientos.
Promedio Desviación Mínimo de Máximo deTratamiento Variable n de hojas estándar hojas por hojas porpor brote brote brote
US-BAP Semana 1 5 1 0,71 O 2
US-BAP Semana 2 29 1,76 2,01 O 11
US-BAP Semana 3 31 2,16 2,47 O 13
US-BAP Semana 4 25 2,98 2,31 1 10
US-BAP Semana 5 24 3,67 3,35 O 14
BAP Semana 1 43 0,02 0,15 O 1
BAP Semana 2 44 2,06 1,42 O 6
BAP Semana 3 44 3,78 2,66 O 13
BAP Semana 4 33 4,98 3,35 O 16
BAP Semana 5 22 6,8 4,16 1 17
Control Semana 1 29 0,31 0,47 O 1
Control Semana 2 32 1,08 1,02 O 3
Control Semana 3 32 1,81 1,66 O 7
Control Semana 4 30 2,71 2,34 O 10
Control Semana 5 13 5,03 3,63 O 12
Efecto del herbicida Glufosinato de amomo (fosfinotricina- PPT) sobre explantes no
bombardeados
Se evaluó el efecto de la adición del PPT sobre el crecimiento e inducción de callo
embriogénico en cotiledones de ayote. Para ello se utilizaron cinco concentraciones de
PPT: O, 1, 2, 3, 4 10 mgl' en medio de cultivo para la inducción de callogénesis. Los
cotiledones fueron más sensibles a la presencia de PPT en el medio de selección. En este
caso, en los cotiledones se inhibió el desarrollo de callos en todos los tratamientos. Esto se
evidencia en el reducido o nulo crecimiento de tejidos en los bordes del explante y en un
aumento de la coloración café, indicadora de una necrosis en todo el fragmento del
cotiledón. Los controles por su parte, presentaron crecimiento en los bordes y mantuvieron
su coloración normal. Consecuentemente, se ha escogido la concentración de 2 mgl' de
PPT en el medio de selección, para los experimentos subsecuentes de transformación
genética del ayote (Figura 3 y 4).
A diferencia de los cotiledones, los callos embriogénicos control resultaron ser muy
resistentes al PPT con las concentraciones de PPT utilizadas (4, 6, 8 y 10 mgl'), No se
observaron diferencias evidentes entre los callos embriogénicos en las distintas
concentraciones y el control después de un mes de selección, ya que estos continuaron con
el crecimiento normal y mantuvieron su coloración crema claro, es decir, no fueron
afectados por el PPT.
15
D Necrosamiento
1.0
0.9
0.8
0.7
,...---- r--- r--- ,...---- r--- ,...----
f---
f---
f--- ~
f---
A , ,
.6 0.6
.~
o 0.5a.
~ 0.4
0.2
0.1
0.0
TO (Orng/l) T1 (1rng/L) T2 (2rrg'L) T3 (3mg/L) T4 (4rng/L) T5 (1Orng/L)
Trata m lento
1.0
0.9
0.8
0.7
r-- r- - D
,...---- -
f---
- f---
~
B
-6 0.6
.~
o 0.5a.
~ 0.4
0.2
0.1
0.0
TO (Orng/l) T1 (1mg/L) T2 (2rrg'L) T3 (3mg/L) T4 (4rng/L) T5 (10rng/L)
Trata m lento
Figura 3. Proporción de necrosamiento de los cotiledones de ayote después de 15 días (A) y
22 días (B) de cultivo en los tratamientos con PPT.
16
Ae
B
Figura 4. Efecto de las diferentes concentraciones de PPT en el crecimiento e inducción de
callos embriogénicos en cotiledones después de 15 días de cultivo en (A) Omgl' (B) 1mgl
1 (e) 2 mgl' (D) 3 mgl' (E) 4 mgl' (F) 10 rngl' PPT.
17
Selección de la altura y presión de bombardeo
Con la pistola de genes PIG, los resultados de la expresión transitoria del gen uidA
muestran que la altura de bombardeo tiene un mayor efecto que la presión de disparo sobre
la cantidad de puntos azules observados. Se determinó que la mejor altura de bombardeo se
encuentra entre los 12 y 15 cm independientemente de la presión suministrada (lOO, 150, o
200 PSI) (Figura 5). Cuando se aumenta la distancia entre los proyectiles de ADN y el
tejido blanco a 18 cm se observa una reducción importante, principalmente a presiones de
100 y 200 PSI. A menores distancias se da una pérdida de material debida a que los
explantes son expulsados fuera de la placa Petri en la que se encuentran, debido al excesivo
impacto de los microproyectiles y de la presión de gas Helio, y con esto se aumenta la
probabilidad de contaminación de los tejidos.
Además, se incrementó a 200 PSI la presión utilizada para los bombardeos con esta
pistola, con la cual se obtuvo un mayor número de puntos en los explantes con respecto a la
presión de 100 PSI. (Figura 6A y 6C).
Con la pistola PDS-1000/He ™ , se ensayaron tres presiones diferentes de bombardeo para
determinar la adecuada según el tejido blanco: 1100, 1350 Y 1550 psi. La presión de 1100
psi fue la mejor cuando se bombardeaban explantes de cotiledón con promedios de 83.3 y
62 puntos por fragmento en la prueba de revelación GUS (Figura 6B). Se utilizó solo 6 cm
de altura desde el tejido blanco hasta el cargador. En el caso de callos embriogénicos, la
mejor presión de bombardeo fue 1550 psi con la altura de 12 cm, pues se logró observar
expresión GUS en 3 de los 10 platos Petri con callos bombardeados (48, 33 Y 20 foci
respectivamente) (Figura 6D) (Cuadro 3). Por el contrario, al utilizar 1100 psi y 6 cm,
solamente se observó expresión transitoria del gen GUS en uno de los diez platos Petri con
callos embriogénicos bombardeados (Cuadro 3).
Expresión transitoria del gen GUS
Cuando se utilizó la pistola PDS-1000/He el 100% de los fragmentos empleados en la
prueba de revelación GUS dieron positivo. El máximo de puntos observados en una sola de
las muestras fue alrededor de 250 puntos azules y el valor mínimo fue de 2 puntos visibles
con el estereoscopio. Por otro lado, al utilizar la PIG como pistola de genes el porcentaje de
positivos estuvo entre 5 y 40% en los ensayos realizados, con un máximo de alrededor de
250 puntos observados y un mínimo de o. Asimismo, el mayor promedio de foci por
fragmento de cotiledón y callo embriogénico bombardeado se obtuvo al utilizar la pistola
PDS-1000/He (Cuadro 3).
Independientemente de la pistola de genes utilizada, las mejores visualizaciones (número
de foci azules) se obtuvieron con los fragmentos de cotiledones. Sin embargo, su expresión
no ha sido semejante en todos los ensayos realizados. El conteo de los foci, da un rango que
varía éntre O y más de 250 puntos por muestra, con un promedio que va desde 6.3 a 83.3
puntos por muestra (Cuadro 3). Cuando se utilizaron callos embriogénicos, hubo muy poca
expresión GUS. En un experimento se observaron sólo 20 foci y en los otros experimentos,
se observo 200 puntos azules por muestra. En la figura 7, se muestran secciones de los
cotiledones de ayote que evidencian el rango de puntos azules (foci) observados después de
la prueba de revelación GUS.
18
Cuadro 3 Resumen e los últimos e ro bombardeos
C6digo del Pistola de Al ra Presión Ti o de Número de Promedio Máximo Mínimo Selección
bombardeo genes u ilizada (pSI) Exolante E lantes e~ e~ defW
(em) bomb ardeados
6 1350 Callo 5 O . -
xvm PDS-1000 6 1100 Callo 5 40? 200 O6 1350 Conledén 40 322 72 2
6 1100 Cotiledón 40 833 250 2
En15 200 Callo 10 3.3 '. 33 OXIX PIG 15 200 Cenledón 80 381 250 O
ev lu cién
XX PIG 15 200 COhledón 80 6.3 24 O
XXI PDS-l000 12 1550 Callo 10
10.1 n 48 20
6 1100 Cotiledón 80 62 250 6
Solo un callo dio positivo en la rueb de GUS
Tres callos ieron osi ivo a la rueba de GUSO
19
11
::.' ::::::: ...O +----L~..:..L..~o o"f'-oO.:.:J°oL..L~....L.....J.:...o..'T--'-L..L'4......L~~L-J.-"-'-r'..:....L...Lc...;;':"':'L....1-'--;-.......L--,
90
79
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.......
0.::.-::0
::.',:.
Figura 5. Efecto de la distancia entre el cargador y el tejido blanco, en el número de puntos
azules observado en cotiledones bombardeados con la PIG. Las barras corresponden al
error estándar de la media.
35
V> 29
ID
"S
::ti 23
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e5. 18
ID
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e 12
ID
E
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V> 6
ID
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Nro 5
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~ 2
E
.:;)z .
18100 15100 12100 18150 18200 15200 12150 12200 15150
Altura de bombardeo(cmtPresión de bombardeo(PSI)
100PSI 200 PSI
Presión dedisparo en la PIG
1100PSI 1350PSI
Presión de disparo en la PDS-1OOO/He
85
r 1 0+-_..L-,---.l_---r_~L...-...,.--l- _ _,
1100PSI 1350PSI 1550PSI
Presión de disparo en PSWD-1000/He
Figura 6. Efecto de la presión de disparo en el número de puntos azules observado en
cotiledones (A-B) y en callos embriogénicos (C-D). Las barras de error corresponden al
error estándar.
A B
V>
~ 64
Nro
V>oe5. 43
ID
"O
e
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O+-__ -L---,-_L---1_.,...... ....L __ .....,
7 17
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ID
"O
e
ID
E.::;¡ 4Z
e
100PSI 200 PSI
Presión de disparo en PIG
20
Figura 7. Fragmentos de cotiledones bombardeados después de la prueba de expresión transitoria del gen
uidA. A-e Variación en la expresión transitoria del gen gus. D. Control no bombardeado.
Formación de brotes en explantes bombardeados
En la figura 8, se presenta el número promedio de brotes por cotiledón bombardeado en
cada una de las combinaciones de altura y presión a las cuatro semanas después del
bombardeo. Se puede notar una disminución significativa del número de brotes producidos,
al utilizar como parámetros una altura de bombardeo de 12 cm en combinación con 100,
150 Y200 PSI. Al utilizar 12 cm se logró obtener un promedio de alrededor de 0.5 brotes
por explante. Esto se puede deber al daño mecánico producido por el oro recubierto con el
plásmido, en la región proximal del cotiledón donde se forman los brotes, ya que a menor
distancia hay mayor violencia en el impacto. Por su parte, al usar una altura de 15 cm o
superior el daño se puede reducir y tener un efecto menos adverso en el desarrollo de
brotes. En la figura 8, se observa que a alturas de 15 y 18 cm, el promedio de brotes por
explante es mayor que al emplear 12 cm. Cuando se utilizó una altura de 15 cm, el
promedio de brotes por explante se acercó a 1, pero aún es inferior a los resultados
mostrados en la figura 1, en donde se alcanzó un promedio de 1.5 brotes por explante. Un
factor que puede estar involucrado en esta disminución es la etapa en la cual los cotiledones
se mantuvieron en un medio de cultivo osmótico o bien el daño mecánico ocasionado por
los rnicroproyectiles. Mediante un análisis de varianza (Cuadro 4) se determinó que existen
diferencias entre las diferentes condiciones de bombardeo (gl=8, F=7.81, p < 0.0001).
21
Cuadro 4. Resultados del análisis de varianza para el número de
brotes según las condiciones de bombardeo.
Variable N R2 R2Aj CV
Número de brotes 657 0,09 0,08 87,86
F.V. SC gl CM F p-valor
Modelo 22,52 8 2,82 7,81 <0,0001
Condic. de bombardeo 22,52 8 2,82 7,81 <0,0001
Error 233,63 648 0,36
Total 256.15 656
1,05 d
2e-a 0,84
x
Q)•..
oo..
~ 0,63
Q)
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VI
Q) 0,42e.o
Q)
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o•..E 0,21
'::Jz
cdb
abb
a be
cdb
abcd abe
bcd
a
15:150 18:150 12:150 18:100 15:100 12:100 18:200 15:200 12:200
Altura de bombardeo (cm) *Presión de bombardeo (PSI)
Figura 8. Número de brotes promedio por explante observado en las diferentes alturas y
presión de disparo empleadas. Los datos se tomaron a las cuatro semanas de cultivo. Las
barras de error corresponden al error estándar. Letras distintas indican diferencias
significativas (p<= 0,05).
El número de hojas por brote a las cuatro semanas de cultivo se presenta en la figura 9 y
se tomó como una estimación del grado de desarrollo de los brotes. Hay una disminución
significativa bajo las siguientes condiciones 12cm : 100 PSI, 12cm : 200 PSI, 18cm : 100
PSI y 18 cm : 200 PSI, en las cuales se registran valores inferiores a una hoja por brote. Sin
embargo, en las combinaciones restantes se observan datos muy similares entre sí, y estos
rondan entre 2 y 4 hojas por brote, cercana a los valores mostrados en el cuadro 2. Al
realizar un análisis de varianza se observaron diferencias significativas entre el número
promedio de hojas y la condición de bombardeo utilizada (g1=8, F=7.81, P < 0.0001).
22
4,60 e
2e
~ 3,45
oa.
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abed
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abb
15:150 18:150 12:150 18:100 15:100 12:100 18:200 15:200 12:200
Altura de bombardeo (cm) ·Presión de bombardeo (PSI)
Figura 9. Número de hojas promedio por brotes en las diferentes condiciones de bombardeo
empleadas (altura y presión de disparo) a las cuatro semanas de cultivo. Las barras de error
corresponden al error estándar. Letras distintas indican diferencias significativas (p<=
0,05).
En el Cuadro 5, se muestra la respuesta de los explantes para la inducción de brotes a los
15, 30 Y 45 días después del bombardeo bajo las diferentes condiciones de bombardeo.
Durante ese periodo, los valores más altos se concentran en las combinaciones de altura 15
cm. y las tres presiones utilizadas. Bajo las condiciones de altura 18 cm. y presión 100 y
200 PSI se presentó la respuesta más baja en los explantes durante la primera semana. La
disminución en los porcentajes de respuesta conforme avanza el tiempo se puede deber a la
pérdida de explantes por contaminación y por necrosis, este último debido a la selección
con PPr.
Cuadro 5. Efecto de las condiciones de bombardeo en el porcentaje de explantes
produciendo brotes.
Altura (cm)
J'!!'"'o.III!'~",!"!!!!~__ ••••D,¡¡¡ía_S~d!!,,eíiiis_d_e,.¡¡e_l••b_om~b~a_rd_eíiiio_OíiiiYo_~~
Presión (PSI; 15 30 45
12
12
12
15
15
15
18
18
18
100 72 66 34
150 62 48 34
200 72 66 30
100 64 59 55
150 74 71 56
200 71 66 55
100 32 27 18
150 58 68 56
200 46 48 20
23
Expresión estable
A los brotes que han sobrevivido por más de 45 días se les realizó la prueba de expresión
del gen reportero uidA, para determinar si las células han incorporado dicho gen dentro su
genoma. Para ello, se tomó una muestra de hoja de cada brote y se colocó en un eppendorf
con solución de revelación GUS y se dejó por toda la noche a 37°C.
Todas las muestras analizadas han dado negativo en la prueba (Figura 10), por lo que se ha
procedido a aumentar la concentración de PPT en los medios de cultivo de estos brotes, con
el fin de excluir a aquellos brotes no transformantes.
Figura 10. Muestras de hojas después de la prueba de expresión del gen uidA, provenientes
de brotes que han sobrevivido por más de 45 días en medio de selección con PPT.
Sobrevivencia de los brotes bajo selección con PPT
En las figura 11 y 12 se muestra la sobrevivencia de los brotes después de dos meses en
medio de selección con 4 rngl' de PPT. En general las plantas son de tamaño pequeño, con
pocas hojas y de coloración amarillo-verdoso, mientras los controles presentan un mayor
tamaño y número de hojas verdes. En la mayoría de los experimentos con diferentes
condiciones de transformación, la sobre vivencia de los brotes bajo selección con PPT se
mantuvo cercana al 2.5%. El mayor registro de sobrevivencia se obtuvo para las
condiciones de altura de bombardeo de 12 cm. y una presión de 150 PSI, pero son plantas
que se mantienen con un tamaño inferior a 1 cm. de altura.
24
100
• 15 días
• 30 días
o .45 díase 75
Q)
E
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(J)
o
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Q)
e 50
Q)
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Q)
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e
Q)
uo 25o.
0+---
15:200 15:150 15100 18:150 12:150 12:100 12:200
Altura de bombardeo (cm)"Presión de bombardeo(PSI)
Figura 11. Efecto del PPT en el necrosamiento de los explantes bombardeados con diferentes alturas y
presiones de Helio. Los datos se tomaron a los 15,30 Y45 días.
..-.
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Q) 2,5~oo,
10,0
12:100 12:150 12:200 15:100 15:150 15:200 18:100 18:150 18:200
Altura (cm)*Presión (PSI)
Figura 12. Porcentaje de sobrevivencia de brotes obtenidos después de los bombardeos bajo
diferentes condiciones de presión de Helio y altura y bajo selección en medio MS
adicionado con 4 mgl'.
25
Pruebas moleculares
Para aquellos brotes que han sobrevivido en el medio de selección con 4 mgl' se están
realizando pruebas moleculares basadas en la técnica de PCR, con el fin de determinar la
presencia del gen de resistencia bar y para el gen reportero uidA. En la figura l3A se
muestra el ADN extraído de las supuestas plantas transgénicas de ayate y las plantas
controles (no bombardeadas) con el protocolo descrito por Dellaporta. Por otra parte, en la
figura 13B, se muestra la amplificación del gen bar en los controles positivos (plásmido
pCAMBIA BOl-BAR) pero no así en las tres muestras de ADN extraído de hojas de brotes
de ayate bombardeados que han sobrevivido a la selección con PIT. En el mes de
diciembre del 2007, se llevará a cabo un nuevo PCR con muestras de ADN de hojas de
brotes de ayate bombardeados con el plásmido pCAMBIA BOl-BAR y ADN extraído de
plantas de arroz modificado genéticamente con el gen bar.
Figura 13. Amplificación de los genes marcadores. A. ADN extraído de las brotes control y
bombardeados con el plásmido pCAMBIA 130l-BAR. B. Amplificación del gen marcador
bar. P: Plásmido pCAMBIA BOl-BAR. B: Pozos cargados con ADN de brotes
bombardeados. C: control negativo. M: Marcador molecular de 100 pb.
Para cumplir con el objetivo 4 en un 100 % aún falta por determinar la tolerancia natural
de las plantas no transformadas a distintas concentraciones (O, 0.25, 0.5, 1.0 Y 1.5 % v/v)
del herbicida Basta TM. Esta actividad se llevará a cabo en el mes de diciembre como parte
de la tesis de Licenciatura en Biología con énfasis en Genética y Biotecnología del
estudiante Alexander García.
Por otra parte, no ha sido posible evaluar las características agronómicas y la fertilidad de
las plantas transformadas con los genes bar y uidA, por cuanto, las vitroplantas que
permanecen en el medio de selección con PIT no han alcanzado la altura adecuada que les
permita ser transplantadas al invernadero. En estas condiciones, las plantas transferidas y
aclimatadas a las condiciones del invernadero probablemente moriran. Asimismo, al no
haberse comprobado aún la presencia de los genes bar y uidA podría ser que estas
vitroplantas correspondan a falsos positivos.
26
5. PRESUPUESTO
Recursos solicitados a la Vicerrectoría de Investi2ación
Año 2004 (julio a diciembre):
2103 Reactivos y útiles de laboratorio <t 90.000.00
4207 Horas asistente (20 Hrs. semanales x 6 meses) <t 421 560.00
Año 2005 (ya solicitado en formulario OAF" zorrita"):
2103 Reactivos y útiles de laboratorio <t 190.000.00
4207 Horas asistente (20 Hrs. semanales x 10 meses) <t 702600.00
Año 2006:
2103 Reactivos y útiles de laboratorio <t 190.000.00
4207 Horas asistente (20 Hrs. semanales x 10 meses) <t 702600.00
TOTAL SOLICITADO 2004-2007 (/:. 2 296 760
6. PROPUESTAS RESULTANTES DEL PROYECTO
El 13 de mayo de 2003, el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MICIT), a través de la
Comisión Nacional de Incentivos, aprobó un presupuesto de <t 1 870 000, para el desarrollo de
este proyecto, con una vigencia del 30 de mayo 2003 al 30 de noviembre de 2004.
Dentro del marco de este proyecto se están realizando dos tesis de Licenciatura en Biología,
con énfasis en Genética y Biotecnología:
• Estudiante Marlon Delgado Castro, intitulada: "Desarrollo de una metodología para la
regeneración de plantas de ayote Cucurbita moschata (Duch. ex Lam.) Duch. ex Poir.
(Cucurbitaceae) a partir de tejidos somáticos en varios genotipos de interés comercial en Costa
Rica"
• Estudiante Alexander García Valverde, intitulada: "Establecimiento de una metodología
para la transformación genética de ayote Cucurbita moschata (Duchesne ex. Lam.) Duchesne
ex Poir (Cucurbitaceae), mediante el método de biobalística". Aceptación anteproyecto julio
2006-fecha finalización esperada: Diciembre 2007.
Los resultados de esta investigación se presentaron en el mes de octubre, en forma de resumen
y afiche explicativo, cuya copia se adjunta a este informe (ver Anexo 2). También, se preparó el
manuscrito para su publicación en el Suplemento Especial del 50 Aniversario de la Escuela
Biología de la Revista Biología Tropical (ver Anexo 3).
27
7. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En la primera etapa del proyecto se desarrolló la metodología para la embriogénesis somática
y la regeneración de plantas en cultivos celulares de ayote. En la segunda etapa se validó la
tecnología y se demostró su aplicación a otros genotipos de la especie, de interés agronómico y
comercial.
Se alcanzaron los objetivos propuestos originalmente, es decir la obtención de embriones
somáticos a partir de callos indiferenciados y la subsiguiente regeneración de plantas. Una
investigación ulterior de microscopía electrónica para confirmar y optimizar el proceso
embriogénico de este procedimiento experimental en esta especie, sería de sumo interés
científico y aplicado para la biotecnología del ayote. Al respecto, la estudiante Jenny Muñoz
Valverde como parte del Programa de Posgrado en Ciencia Agrícolas y Recursos Naturales con
énfasis en Biotecnología está realizando una investigación por tutoría la cual tiene por objetivo
analizar morfológicamente el proceso de embriogénesis somática a través del tiempo a partir de
tejidos de cotiledón y el proceso de regeneración con la utilización de la microscopía electrónica
de barrido y el estereoscopio de luz.
El presente proyecto de investigación logró desarrollar la metodología y los protocolos que
permiten la regeneración de plantas de ayote en condiciones de cultivo in vitro, via
embriogénesis somática. Ello permitirá establecer una metodología de punta, que permita la
producción sincronizada y a gran escala de los embriones somáticos de ayote en Recipientes de
Inmersión Temporal Automáticos (RITA®). De esta manera, en un futuro cercano, será posible
el cultivo de dichos embriones somáticos, a escala pre-industrial en biorreactores, para la
producción de semillas artificiales de ayote. La aplicación de técnicas como el cultivo in vitro
para la producción a gran escala de semilla vegetativa, representa una poderosa herramienta
para obtener un producto biotecnológico con características agronómicas deseadas que permita
mejorar la producción y la competitividad de los productores de ayote.
El desarrollo e implementación de técnicas de esta naturaleza, para la producción de semilla
vegetativa en ayote, será un aporte sumamente valioso para la ciencia y la tecnología de Costa
Rica y de otras regiones del mundo, ya que aún no se ha desarrollado en ningún otro país. De
manera general, el desarrollo de esta metodología permitirá muchas aplicaciones futuras, de tipo
básico y aplicado, con miras al desarrollo del país en ese campo, tales como: i) fijación de
características agronómicas de las variedades de ayote; ii) micropropagación de variedades de
ayote con características deseadas y iii) desarrollo futuro de técnicas no convencionales de
mejoramiento genético para resistencia a enfermedades y plagas en esta especie.
El principal interés de este proyecto fue iniciar una estrategia para la aplicación de la
biotecnología al mejoramiento genético del cultivo del ayote en Costa Rica. Es por ello que en
la tercera etapa se desarrolló la metodología de transformación genética para el ayote
(Cucurbita moschata) que permita la transferencia ulterior de genes de interés agronómico, tales
como los que confieren resistencia a enfermedades virales. Efectivamente, las cucurbitáceas son
altamente susceptibles a más de 30 enfermedades virales, que, en muchos casos, pueden infectar
simultáneamente una misma planta. De hecho, las pérdidas debidas a las infecciones virales son,
con gran frecuencia, el mayor limitante de su producción.
Así, se contribuirá con el desarrollo de una agricultura sostenible en este cultivo emergente, de
gran importancia para el país, y podrán sentarse las bases de un futuro plan de manejo
integrado, que sea coherente con las políticas de conservación del ambiente y de la
biodiversidad de Costa Rica.
28
8. REFERENCIAS
Bevan MW., R. B. Flavell. & M. D. Chilton. 1983. Structure and transcription of the nopaline
synthase gene region of the T-DNA. Nucleic Acids Research 11: 369-385.
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thennal perturbation of expression, transcript splicing, and promoter activity following
transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology 18: 675-689.
Gallagher S. 1992. GUS protocols: Using the GUS gene as a reporter of gene expression.
Academic Press, Inc. USA. 219 p.
Jefferson R. A., Kavanagh T. A., & Bevan M. W. 1987. GUS fusions B-glucuronidasa as a
sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6:3901-3907
Madriz-Ordeñana, K. 1999. Molecular studies of the defence responses of maize (Zea mays L.)
in interaction with Maize Rayado Fino Maravirus (MRFV). Thesis of PhD, The Royal
Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Denmark.
Murashige T. & Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Planto 15: 473-497.
Thomson Cl., Nova NR., Tizzard R., Crameri R., Davis JE., Lauwerys M. & Bottennan J. 1987.
Characterization of the herbicide resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus.
EMBO Joumal, 6: 2519-2523.
Ribas A.F., Kobayashi A.K., Pereira L.F.P., Vieira L.G.E. 2005. Genetic transfonnation of
Coffea canephora by particle bombardment. Biologia Plantarum. 49: 493-497.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (ed) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold
Spring Harbour Laboratory Press, New York.
Spencer T.M., Gordon-Kamm W.J., Daines R.J., & Lemaux P.G. 1990. Bialaphos selection of
stable transfonnants from maize cell culture. Theor. Appl. Genet. 79:625-631
Valdez, M., J. L. Cabrera-Ponce, D. Sudhakar, L. Herrera-Estrella & P. Christou. 1998.
Transgenic Central American, West African and Asian elite rice varieties resulting from
particle bombardment of foreign DNA into mature seed-derived explants utilizing three
different bombardment devices. Annals of Botany 82: 795-801.
Vasil l., y Thorpe T. 1994. Plant ceIl and tissue culture. KIuwer Academics Publishers.
Netherlands. 593 p.
29
Anexo 1
Extracción de ADN por el método de Dellaporta
1. Tome 3 círculos del material vegetal (que se obtuvo de la hoja por medio de un
sacabocados ).
2. Coloque los tres CÍrculos en un tubo eppendorff de 1,5 ml que contenga 5OO}tl de
Buffer Dellaporta. Macere bien con un pistilo.
3. Agregue 33 ~l de SDS al 20% (lOg/50ml de agua) e invierta el tubo. Incube a 65 "C
por 10 minutos.
4. Agregue 160 ~l de Acetato de Potasio 5M (245g KoAc/ 500rnl de agua), agite con
vortex y centrifugue por 10 minutos a 12000 rpm. Luego Transfiera el sobrenadante
a un tubo eppendorff de 1,5 ml limpio.
5. Agregue 500 ul de PCI, mezcle y centrifugue por 8 minutos a 12000 rpm. Tome la
fase acuosa y transfiérala a un tubo eppendorf de 1,5 rnllimpio.
6. Agregue un volúmen de isopropanol, Mezcle bien volteando el tubo y centrifugue
por 10 minutos a 12000 rpm.
7. Aspire el sobrenadante y añada 500 ul de Etanol al 70%. Deje reposar por dos
minutos. Luego centrifugue, aspire el sobrenadante con la pipeta, vuelva a
centrifugar, vuelva a aspirar el sobrenadante con la pipeta y deje secar el botón al
aire por 10 minutos.
8. Resuspenda el botón en 10 }tI de agua bidestilada estéril, transfiera 5 }tI a un tubo
eppendorff limpio de 0,5 ml. A los 5 }tI restantes agrégueles 20 }tI de agua y
almacene ambos tubos a -20 oc.
Preparación del Buffer Dellaporta: 100 mM TrisHCl pH 8.0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl y
10 mM Mercaptoetanol
TrisHCI 1M pH 8.0: Tome 121,1 g de Tris Base y disuelva en 800 rnl de Agua destilada.
Agregue HCl conc hasta llegar a pH 8.0. Luego afore a 1 L.
EDTA 0,5 M pH 8.0: Tome 181,1 g de EDTA y añada 800 ml de agua destilada. Luego
añada NaOH a 1M hasta llegar a pH 8.0. (El EDTA se disolverá cuando el pH esté cerca de
8; una vez disuelto se puede autoclavar).
NaCl 0,5 M: Tome 29,22 g de NaCl y disuelva en 1 L de agua destilada.
Preparación 50 mi de Buffer Dellaporta
En una botella color ámbar agregue 5 ml de solución Tris-HCl 1M pH 8.0,5 ml de EDTA
0,5 M pH 8.0, 5 ml NaCl 0,5 M Y 34,5 }tI de f3-Mercaptoetanol. Luego añada agua
bidestilada hasta 50 ml. El buffer se almacena a 4° en una Botella Ámbar.
30
Anexo 2
Resumen presentado a
VI Encuentro Latinoamericano y del Caribe de Biotecnología Agropecuaria (REDBIO
2007) organizado por REDBIOIF AO, 22 al 26 de octubre del 2007, Viña del Mar y
Valparaíso, Chile.
Plant regeneration by somatic embryogenesis and development of a system for genetic
transformation in tropical butternut squash (Cucurbita moschata)
Valdez Marta 1, García Alexander 1, Delgado Marlon 1, Gatica Andrés 1, Ramírez Pilar 1,2
1 Laboratorio de Biotecnología y Transformación Genética de Plantas, Escuela de Biología,
Universidad de Costa Rica, 2060 San José, Costa Rica.
2 Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa
Rica, 2060 San José, Costa Rica.
Palabras clave: Cucurbita moschata, squash, cucurbits, somatic embryogenesis, genetic
transformation.
Squash is an economically important crop for countries of tropical and temperate zones.
In 2006, Costa Rica exported 8,348 Kg of squash with a total value of US$ 2,509,472.
Despite its importance, this crop is susceptible to different diseases and pests, such as those
caused by virus, fungi and bacteria. Techniques such as plant tissue culture and genetic
plant transformation can contribute to squash improvement and accelerate the release of
varieties with novel traits.
The aim of this study was to establish a protocol for regeneration of commercial and pure
lines of buttemut squash plants via somatic embryogenesis by studying the influence of
genotype, explant source, N6-benzylaminopurine (BAP), 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D)
acid and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5- T) concentration. For genetic
transformation, cotyledons of C. moschata cv. Sello de Oro were bombarded with
pCAMBIA BOl-BAR (uidA and the bar gene) using Helium pressure of 1100, 1300 or
1550 psi from a target distance of 6 or 12 cm with a PDS 1000/ He Biolistic Particle
Delivery System (Bio-Rad). Also, cotyledons were bombarded with a Particle Inflow Gun
(PIG) using Helium pressure of 100 and 200 psi from a target distance of 9, 12, 15 or 18
cm.
Regarding the influence of BAP and 2,4-D on somatic embryogenesis induction, the best
results were obtained when cotyledons and zygotic embryos were cultured on Murashige
and Skoog medium (MS) with 0.5 and 3.5 mgl' 2,4-D. No embryogenic calli were
observed in leaf segments of C. moschata cv. Sello de Oro cultured on MS with different
concentrations of BAP and 2,4-D and cotyledons of C. moschata cv. PVG 04 cultured on
MS with different BAP and 2,4,5- T concentrations. Successful acclimatization of in vitro
plants was achieved. Regenerated plants appeared morphologically normal.
In relation to the establishment of biolistic parameters, the higher number of blue spots
per explant was obtained with 1100 psi and 6 cm of target distance using the PDS 1000/ He
device. On the other hand, using the PIG, the higher number of blue spots in squash
cotyledons was obtained with 200 psi and 15 cm of target distance.
31
•Establecimiento de cultivos celulares para la regeneración de plantas in vitroy para la transformación genética del ayote (Cucurbita moschata)ValdezMarta ',Garda Alexander', Delgado Marlon ',GaticaAndrés ',Rarnírez Pilar ',1
, Laboratorio de Biotecnología y Transformación Genética de Plantas. Escuela de Biología. Universidad de Costa Rica. San Pedro de Montes de Oca. San José, Costa Rica.
1Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular. Universidad de Costa Rica. Ciudad de la Investigación. San Pedro de Montes de Oca. San José, Costa Rica.
Introducción
El ayote (Cucurbita moschata) es uno de los cultivos de mayor importancia en los trópicos. En Costa Rica presenta una creciente importancia económica y social. Sin embargo, La
producción se ve afectada por el ataque de plagas y enfermedades, en especial las ocasionadas por virus. Las técnicas biotecnológicas como el cultivo de tejidos y la transformación
genética pueden contribuir a la reducción de ese problema.
Objectivo general
Desarrollar los protocolos experimentales para la regeneración de plantas en condiciones de cultivo in vitro y para la transformación genética del ayote (c. moschata) con genes marcadores.
Metodología
Figura 2. Microscopía electrónica de barrido del proceso de embriogénesis
somática en C. moschala cv. Sello de Oro. (a) Embrión somático en estado
globular. (b) Embrión somático en estado torpedo.
Figura 3. Análisis histoquímico de la expresión transitoria del gen uidA. (A)
Cotiledones no bombardeados (control) (B) Cotiledones bombardeados con
pCAMBIA \301-BAR.
VicerrectORa de Investigaci6n, Universidad de Costa Rica
Ministerio de Ciencia y Tecnologra (MICIl)
L.. C:::on=se~l<!l':':..:Nac=~iona=~1=/!ll~s~tlgaclones Cientrficas y Técnol6gicas (CONICIl)
Cotiledones, segmentos de hoja, embriones
zigóticos de C. moschata cv. Sello de Oro y
20 accesiones del Centro Agronómico
Tropical de Investigación y Enseñanza (CATlE) .
.1
T
Cotiledones de C. moschata cv. SeUo de OroSelección del medio de
inducción de callo
embriogénico.
I
Desarrollo y maduración de
embriones somáticos. PDS 10001
Particle
System(Bi
Regeneración de plantas a
partir de embriones
L_SO_m_áti_·co_S_. .J I 1100,1356,9y lOOy 200 psi9, 12, 15 or 18 cm.
Resultados
Los mejores explantes para la inducci6n de callos embriogénicos en C.moschata cv. Sello de Oro
fueron los cotiledones (70%) y embriones zig6ticos (53-56%), Con respecto al medio de cultivo,
el mejor medio consisti6 de las sales minerales Murasnige y 5koog (MS)con 05 ó 35 mgl-' 2,4-0,
Al transferir los callos embriogénicos al medio de regeneraci6n se obtuvieron brotes luego de
dos semanas de cultivo. Los brotes se transfirieron a un medio MSpara el desarrollo de plántulas,
las cuales se llevaron a condiciones de invernadero y campo (Figura 1), De las 20 accesiones del
CATIEexaminadas, 10 han generado brotes y plántulas. El análisis histoléqicc demuestra la
regeneración de plantas in vitre vio embriogénesis somática (Figura 2),
En cuanto al establecimiento de parámetros de bombardeo, el mayor número de puntos azules
por explante se obtuvo con 1100 psi Y6 cm de distancia al utilizar la pistola PDS 10001 He. Por
otro lado, con la pistola P1G,el mayor número de puntos azules por cotiledón se obtuvo con una
presión de Helio de 200 psi Yuna distancia de 15 cm (Figura 3),
Figura 1. Proceso de embriogénesis somática en
C. moschata ev. Sello de Oro. (A) Callo emhriogénioo
obtenido después de 16 semanas en medio de
callogénesis. (B) Brotes regenerados a partir de
embriones somáticos. (C) PIMduIasde ayate en medio
de re~ón. (D) Plantas aclimatadas en el campo
con flores normales. (E) Frutos de ayote.
Agradecimientos
Anexo 3
Manuscrito sometido a consideración para el Suplemento Especial del 50 Aniversario
de la Escuela Biología de la Revista Biología Tropical
In vitro plant regeneration system for different tropical butternut squash genotypes
(Cucurbita moschata)
Marta Valdez-Melara 1, Alexander García1, Marlon Delgado 1, Andrés M. Gatica-Arias 1,
Pilar Ramírez- Fonseca2
1 Escuela de Biología, Universidad de Costa Rica, P.O. Box 2060, San Pedro, Costa
Rica.
Escuela de Biología y Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular
(CIBCM), Universidad de Costa Rica, P.O. Box 2060, San Pedro, Costa Rica.
Abstract. An efficient and reproducible method for regeneration of cornmercial and pure
lines of tropical buttemut squash (Cucurbita moschata) plants via somatic
embryogenesis was developed. The influence of genotype, explant source, N'-
benzylaminopurine (BAP), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-
trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) concentration on somatic embryogenesis
induetion was investigated. Friable embryogenie ealli was produeed from zigotie
embryos (53-56%) and eotyledons (70%) of C. moschata ev. Sello de Oro eultured on
eallus induetion medium (CIM) supplemented with 0.5 mgl" or 3.5 mgl" 2,4-D. No
embryogenie ealli was obtained from leaf segments of C. moschata ev. Sello de Oro
cultured on CIM supplemented with different coneentrations of BAP and 2,4-D and
eotyledons of C. moschata ev. PVG 04 cultured on CIM with BAP and 2,4,5-T.
Embryogenic calli induction was achieved in 75 % C. moschata pure lines evaluated
and calli percentage frequency range from 5% to 34%. Suecessful acclimatization of
squash in vitro plants was achieved in the greenhouse and in the field. Regenerated
plants appeared morphologically normal and set flowers and fruits with seeds that could
germinate normally.
Keywords: Cucurbits . auxins . cytokinin· explant source . genotype
The Cucurbitaceae is a large family that inc1udes a number of valuable edible crop
species. Collectively world production of cucurbits in 2004 reached 19.7 million metric
tones (FAOSTAT 2005). Squash (Cucurbita moschata) is an economic important crop
for countries of tropical and temperate zones (Chee 1991). In Costa Rica, squash is a
crop of increasing economic and social importance. In 2006, Costa Rica exported 8.348
Kg ofsquash with a total value ofUS$ 2.509.472 (BCCR 2006).
Despite its importance, this species has not been subject of sufficient genetic or
biotechnological investigations. Improvement of this crop to resist virus es, insects,
weeds and to improve its growth and vigor would be of considerable cornmercial value.
Plant biotechnology techniques could help overcoming these problems, but their use
requires a reliable and efficient in vitro culture system (Debeaujon and Branchard
1993).
Plant regeneration from in vitro cultured cells can be accomplished thought somatic
embryogenesis or organogenesis. In the first case, somatic embryogenesis is the
developmental process by which bipolar structures that resemble zygotic embryos are
developed from haploid or diploid somatic cell through an orderly embryological stage
without gametes fusiono This process can be achieved via direct somatic embryogenesis
(DSE) or indirect somatic embryogenesis (ISE). DSE is characterized by the induction
of somatic embryos directIy from pro-embryogenic cells of the leaf, stem, microspores
or protoplasts in the absence of conspicuous embryogenic calli proliferation, whereas in
ISE somatic embryos are developed from friable embryogenic calli (Jimenez 2005).
On the other hand, organogenesis is the developmental pathway by which shoots and
roots are formed in response to culture (concentration and type of plant growth
regulators) and environmental (light intensity, temperature and photoperiod) conditions.
Contrasting to somatic embryogenesis pathway, organogenesis is characterized by the
presence of vascular connections between mother tissue and the regenerating sections
(Jimenez 2001, 2005).
In the Cucurbitaceae family, in vitro plant regeneration has been reported by
organogenesis in squash (Cucurbita pepo L.) (Abrie and Staden 2001, Ananthakrishnan
et al. 2003, Kathiravan et al. 2006, Selvaraj et al. 2006, Ananthakrishnan et al. 2007),
pumpkin (Cucurbita maxima L.), melon (Cucumis melo L.) and cucumber (Cucumis
sativus L.) (Abrie and Staden 2001) or somatic embryogenesis in pumpkin (Cucurbita
pepo L.) (Chee 1991, Gonsalves et al. 1995, Kintzios et al. 2002, Leljak-Levanié et al.
2004) and melon (Abrie and Staden 2001, Kintzios et al. 2002). Several protocols have
been described in the literature for plant regeneration of squash via ISE (Debeaujon and
Branchard 1993); nevertheless, specific conditions and protocols developed for a
particular genotype are not necessarily reproducible for others.
The influence of BAP, 2,4-D and 2,4,5- T concentration, explant source and genotype
on ISE induction of Cucurbita moschata has not been reported. The aim of this work
was to set up a protocol for the callus induction and plant regeneration thought ISE, as
well as for the acclimatization oftropical buttemut squash (Cucurbita moschata) plants.
MATERIALS AND METHODS
Plant material and explant preparation: Mature seeds of commercial buttemut
squash (Cucurbita moschata) cultivars Sello de Oro, Birris, PVG 01 and PVG 04 were
used as source ofexplants. AIso, seeds of C moschata pure lines 7036,18933, 15049A,
5896, 5998, 14895, 12130, 5978, 18938, 7211, 11048, 11442, 9284A, 9206, 9212,
11316, 5996, 9316A, 6368 and 11428, provided by the Centro Agronómico de
Investigación y Enseñanza (CATIE, Turrialba, Costa Rica) were used. After removal of
the seed coat, the de-coated seeds were washed in 70% (v/v) ethanol for 10 min,
disinfected in 4.5% (v/v) sodium hypochlorite (NaOCI) supplemented with 8 drops of
Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO, USA) for 20 min followed by an immersion in the
fungicide Benomyl (piscis, Costa Rica) at a concentration of 100 mg rl for 5 mino
Finally, the seeds were washed three times with sterile distilled water.
The disinfected seeds were cultured in 125 mI flasks, closed with polyethylene food
wrap (Glad, Costa Rica), containing 20 ml ofhalf strength Murashige and Skoog (1962)
medium (MS) with 30 gl" sucrose and 3 gl' Gelrite. The pH was adjusted to 5.6 with
NaOH before autoclaving for 21 min at 121°C and 1.05 kg cm". Explants were
cultured with 16 h light photoperiod (30 umol m-2 S-I) at 26±2°C.
Induction of somatic embryogenic and plant regeneration: Cotyledons (1 cm") and
leaf segments (1 crrr) of e. moschata cv. Sello de Oro were excised from in vitro grown
seedlings 7 days after germination. Moreover, the zygotic embryos excised from
disinfected seeds were used as explant. In a first experiment, these explants were
cultured on Petri dishes (100 mm x 20 mm) containing 20 mI ofCIM composed ofMS
mineral salts and vitamins, BAP (O, 0.4,0.8 and 1.6 mgl") and 2,4-D (0.5, 1.0,2.5 and
3.5 mgl") (Table 1), 30 grl sucrose and 3 grl Gelrite. The pH was adjusted to 5.6 with
NaOH before autoclaving for 21 min at 121 "C and 1.05 kg cm". Cultures were
maintained in the dark at 26±2 "C. Embryogenic calli were transferred to fresh medium
every four weeks during 16 weeks.
Once the best explant source and culture media composition was determined, in a
second experiment, cotyledons from C. moschata cv. Birris, PVG 01 and PVG 04 were
cultured on CIM supplemented with 0.5 mgl" 2,4-D. To evaluate the influence of2,4,5-
T on embryogenic calli induction, in a third experiment, cotyledons from C. moschata
cv. PVG 04 were cultured on MS basal medium supplemented with BAP (O, 0.4, 0.8
and 1.6 mgl") and 2, 4, 5-T (0.5, 1.0, 2.5 and 3.5 mgl") (Table 2). Moreover, the
cotyledons from 20 pure lines of C. moschata provided by CATIE were cultured on MS
basal medium supplemented with 0.5 mgl" 2,4-D. Callus formation frequency
[(explants with embryogenic callus/total of explants)*100] was evaluated after 16
weeks of culture.
After 16 weeks of culture on CIM, embryogenic calli were transferred to regeneration
medium (RM) composed of MS mineral salts supplemented with 0.05 rngl"
napthaleneacetic acid (NAA) and 0.05 mgl" kinetin (Chee, 1991). After 6 weeks of
culture RM, the regenerated plantlets were transferred to half strength MS medium. The
explants were cultured under 16 h light photoperiod (30 umol m-2 S-I) at 26±2°C. The
regeneration percentage [(number of plants regenerated from shoots/total of
embryogenic calli)*100] was recorded after five weeks of culture on RM.
Scanning electro n microscopy (SEM): Embryogenic callus pieces were fixed in
2.5% glutaraldehyde and 2.5% paraformaldehyde in 0.1 M sodium phosphate buffer
with pH 7.4 for 24 h at 4 "C. The samples were washed twice in the same buffer and
were postfixed in 2% osmium tetroxide solution for 2 h. Fixed tissues were dehydrated
in a graded ethanol solutions for 15 min each. After that, the dehydrated specimens
were critical point dried and then dried specimens were mounted on aluminium blocks.
Finally, the mounted specimens were coated with a very thin layer of gold-palladium
and subsequently the coated specimens were examined in a scanning electron
microscope (S-570, Hitachi, Japan) at an accelerating voltage of 15 KV.
Acclimatization and field transfer: Regenerated shoots (approximately 3 cm long)
with well developed leaves and roots were transferred to pots containing soil, covered
with plastic bags and maintained in the greenhouse under 12 h light photoperiod at
26±2°C. The plantlets were watered twice a week with distilled water. Then, after two
week, the plantlets were transferred in soil under field conditions. The plant
regeneration percentage [(number of plants successful acc1imated/total number of
acc1imated plants)*100] was determined. Moreover, a phenotypic analysis was
conducted using flowers, fruits and seeds production.
Statistical analysis: The statistical analysis was performed using one-way ANOV A
and the significance of differences among treatment means were contrasted with
Tukey's Honestly Significant Difference Test (HSD) at P< 0.05. The program
STATISTICA (StatSoft, Tulsa, OK, USA) version 6.0 was used.
RESULTS
ISE began with the development of a translucid primary callus on the cut edges of
explants after two weeks of culture on CIM. Subsequently, yellow friable embryogenic
callus formed on the edges of primary callus after 16 weeks of culture on CIM (Fig.
lA). Scanning electron micrographs showed formation of globular (Fig. 2A) and
torpedo shape somatic embryos on the embryogenic calli surface (Fig. 2B). Shoots
developed after five weeks of culture on RM (Fig. lB).
Cucurbita moschata cv. Sello de Oro was used in initial experiments. Regardless of
the concentration of BAP and 2,4-D on the CIM, the calli formation frequency differed
significantly among the three types of explants evaluated. The higher percentage of
callus formation was obtained using zigotic embryos (21%), coty ledons (10%) and leaf
segments (0%) (P<0.05) (Fig. 3).
Culture of C. moschata cv. Sello de Oro cotyledons on CIM supplemented with a
range concentration of BAP and 2,4-D resulted in a differential response. The best
results were obtained when cotyledons were cultured on CIM with 0.5 rngl" 2,4-D
(Table 1). Embryogenic calli were obtained from C. moschata cv. Sello de Oro zygotic
embryos cultured on CIM supplemented with all the concentrations of BAP and 2,4-D
evaluated, except with 1.6 mgl' BAP and 2.5 mgl" 2,4-D. The best results were
obtained when zygotic embryos were cultured on CIM with 0.5 or 3.5 mgl' 2,4-D
(Table 1).
Independently ofthe 2,4-D concentration on the CIM, it was observed that as the BAP
concentration on the CIM increase, the callus formation frequency decreased (Table 1).
Among the of commercial squash cultivars Birris, PVG 01 and PVG 04, the higher
embryogenic calli frequency (29%) was obtained when PVG 04 cotyledons were
cultured on CIM supplemented with 0.5 mgl" 2,4-D. No embryogenic calli was
obtained from Birris and PVG 01 cotyledons after 16 weeks of culture on the same
callus induction medium.
On the other hand, no embryogenic calli were observed in cotyledons of C. moschata
cv. PVG 04 after 16 weeks of culture on the CIM supplemented with different BAP and
2,4,5- T concentrations (data not show).
Embryogenic calli induction was achieved in 75 % (15 of the 20) C. moschata pure
lines evaluated. No embryogenic calli were obtained in 11048, 11442, 9284A, 9206 and
9212 pure lines after 16 weeks ofculture on CIM supplemented with 0.5 mgl" 2,4-D. In
the reactive C. moschata pure lines, callus formation frequency range from 5% to 34%
and it was lower than the frequency obtained using C. moschata cv. Sello de Oro (Table
2).
In relation to the regeneration of shoots from embryogenic calli and their conversion
into plants, only C. moschata cv. Sello de Oro and the pure lines 6368, 11428, 7036,
18933, 15049A, 5896 and 5998 developed plants from shoots. In the C. moschata pure
lines 5996, 9316A and 11316, the shoots regenerated from embryogenic calli did not
develop into plants (Table 3). The higher regeneration percentage and number of plants
developed from shoots was obtained with C. moschata cv. Sello de Oro (Table 3).
Squash somatic embryos developed into plants with two to four pairs of leaves (Fig.1 C)
and 100% of the regenerated plants were succesful acclimated and developed into adult
plants with normal flowers and fruits (Fig. ID and lE). Moreover, the number of seeds
per fruit, the number of fruits per plant and the weight of the fruits were very similar
among plants regenerated in vitro from embryogenic calli and plants regenerated ex
vitro from sexual seed (Table 4).
DISCUSSION
A protocol for the induction of C. moschata embryogenic callus and for the formation
of somatic embryos was established in the present study. Germination and development
of buttemut squash somatic embryos into plants was also successfully obtained.
Moreover, the results obtained in this work corroborated the influence of the genotype,
the source of explant and the type and concentration of plant growth regulator on ISE
induction using commercial and pure lines of C. moschata.
The influence ofthe genotype was observed since the higher calli formation frequency
was obtained with Sello de Oro cultivar than with Birris, PVG 01, PVG 04 and the C.
moschata pure lines (Table 1 and 2). In this sense, it has been reported that the
embryogenic capacity is genetically determined in cucumber (Nadolska-Orczyk and
Malepsky 1989 reviewed by Debeaujon and Branchard 1993) melon (Oridate et al.
1992 reviewed by Debeaujon and Branchard 1993), black peper (Piper nigrum L.)
(Ramakrishnan et al. 2005) rice (Oryza sativa L.) (Hoque and Mansfield 2004), cotton
(Gossypium hirsutum L.) (Wu et al. 2004) and coffee (Coffea sp.) (Bieysse et al. 1993,
Molina et al. 2002, Santana et al. 2004).
In addition, our results corroborated that the explant source influenced ISE since
higher calli formation frquency was obtained using zigotic embryos and cotyledons.
Success in regeneration thought somatic embryogenesis depends on the origin,
physiological state and age of the explant. Generally, immature organs and meristematic
tissues, which contain undifferentiated cells, are more suitable for plant morphogenesis
(Hoque and Mansfield 2004). In cucurbits, diverse types of explants have been used to
induce somatic embryogenesis, nevertheless, cotyledons and hypocotyls tissue are
especially successful (Debeaujon and Branchard 1993). In C. moschata cv. Seoul
Dabagi and PM 143, somatic embryos and plants have been obtained by DSE from
nucellar cells from unfertilized ovules cultured on half strengthMS (Kwack and Fujieda
1998 reviewed by Debeaujon and Branchard 1993). To our knowledge, this is the first
report of somatic embryogenesis induction in C. moschata using zigotic embryos and
cotyledons as explants. However, due to the lower availability of zigotic embryos, this
tissue was considered less appropiate for ISE induction and plant regeneration in C.
moschata.
Regarding the influence of plant growth regulators (pGR), the best results were
obtained using 0.5 and 3.5 mgl" 2,4-D (Table 1). On squash somatic embryogenesis
induction, investigations have been focused on the type, concentration and time of
application ofPGR. The process of somatic embryogenesis in the Cucurbitaceae family
requires an induction culture medium followed by a maturation medium. Generally, the
former medium is supplemented with an auxin, such as 2,4-D, NAA, IBA (indole-3-
butyric acid) and 2,4,5-T (Debeaujon and Branchard 1993).
On the other hand, no embryogenic calli were obtained from C. moschata PVG 04
cotyledons using different BAP and 2,4,5-T concentrations. In contrast, Chee (1991,
1992) obtained embryogenic calli from shoot tips and cotyledons of C. pepo L. cv.
YC60 cultured on MS supplemented with 1.2 mgl" 2,4,5- T, 0.8 mgl' BAP and 0.1 mgl
I kinetin. Because cotyledons of C. moschata cv. PVG 04 were the only source of
explants evaluated, further studies are required to determine the influence of BAP and
2,4,5- T on somatic embryogenesis induction from different C. moschata genotypes and
explants.
The PGR used at the induction phase can play an important role on somatic
embryogenesis process. Somatic embryogenesis is generally promoted by auxins, either
alone or in combination with cytokinins (Pacheco et al. 2007). Althought, BAP is the
most frequently used cytokinin for somatic embryogenesis induction in cucumber and
me Ion (Debeaujon and Branchard 1993), in C. pepo L. BAP reduced embryogenesis
efficiency (Noel et al. 1992 reviewed by Debeaujon and Branchard 1993). A similar
result was observed in the present study when C. moschata Cv. Sello de Oro cotyledons
were cultured with different BAP concentrations (Table 1).
Based on the protocol developed in this study, C. moschata in vitro plants could be
obtained in 20 weeks after culture initiation. Moreover, the in vitro protocols reported in
this work could be used for mass production of somatic embryos in bioreactor for use in
artificial seeds and to obtain competent target tissue (embryogenic calli and plants) for
genetic modification thought biolistic, Agrobacterium or mutagenesis.
ACKNOWLEDGEMENTS
Financial support was provided by Consejo Nacional para Investigaciones Científicas y
Tecnológicas (CONICIT, Costa Rica) and the Vicerrectoria de Investigación of the
University of Costa Rica (UCR).
REFERENCES
Abrie, A.L. & J. Van. Staden. 2001. Development of regeneration protocols for selected
cucurbit cultivars. Plant Growth Regul. 35: 263-267.
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TABLE 1
The effect of BAP and 2,4-D concentration on embryogenic callus formation from
cotyledons, leaf and zygotic embryos of Cucurbita moschata cv. Sello de Oro afier 16
weeks of culture on C1M supplemented with different growth regulators concentrations.
Growth regulator Callus formation frequency (%t
BAP (mgrl) 2,4-D (mgrl) Cotyledons Leaf segments Zygotic embryos
O 0.5 70 a O 56 a
0.4 0.5 O e O 7 d
0.8 0.5 O e O 22 a bcd e
1.6 0.5 O e O 11 de
O 1.0 37 b O 33 a bcd e
0.4 1.0 O e O 16cde
0.8 1.0 O e O 18 e de
1.6 1.0 O e O 2 e
O 2.5 O e O 14 e d e
0.4 2.5 O e O 8 de
0.8 2.5 O e O 6 e
1.6 2.5 O e O O e
O 3.5 40 b O 53 a b
0.4 3.5 O e O 40 a bcd
0.8 3.5 O e O 47 a be
1.6 3.5 O e O 20 bcd e
Values followed by the same letter are not significantly different with the Tukey HSD
test at P< 0.05.
a Callus formation frequency were ca1culated using this formula [(explants with
embryogenic callus/total of explants)* 100].
TABLE2
Higb frequency somatic embryogenesis response from cotyledons o/ 20 Cucurbita
moschata pure 1ines after 16 weeks o/ culture on C/M supplemented w ith 0.5 mgl ' 2,4-
D.
Pure line Callus formation frequency (%t
7036 22
18933 11
15049A 18
5896 23
5998 8
14895 19
12130 18
5978 5
18938 22
7211 13
11048 O
11442 O
9284A O
9206 O
9212 O
11316 18
5996 11
9316A 17
6368 20
11428 34
a Callus formation frequency were calculated using this formula [(explants with
embryogenic callus/total of explants)* 100].
TABLE 3
Regeneration of somatic embryos into plants 01 Cucurbita moschata after six weeks 01
culture on RM.
Number of shoots Number of plants
Cultivars Regeneration (%t formed from developed from
embryogenic calli shoots
Sello de Oro 38 8 8
11428 13 14 4
7036 8 2 1
18933 25 4 3
15049A 14 3 2
5896 10 1 1
5998 4 4 1
6368 17 4 1
5996 O 4 O
9316A O 2 O
11316 O 1 O
Birris O O O
PVG 01 O O O
PVG04 O O O
a Regeneration was ca1culatedusing this formula [(number of plants regenerated from
shoots/total of embryogenic calli)*100].
TABLE4
Morphological characteristics of Cucurbita moschata cv. Sello de Oro plants
regenerated in vitro and ex vitro.
Variety Origin Number of Germination" Number ofseeds (%) fruits
Weight of
the fruit (kg)
Sello de In vitro
Oro regeneration
Sello de Sexual
Oro regeneration
568 97 5 7.2
436 4 6.9
a The germination percentage [(number of germinated seeds/ the total number of
seeds)* 100)].
FIGURES LEGENDS
Fig. 1. High frequeney somatie embryogenesis from Cucurbita moschata ev. Sello de
Oro. (A) Embryogenie eallus formed after 16 weeks of culture on basal MS medium
supplemented with 0.5 mgl" 2,4-D. (B) Regenerated squash plantlets from somatie
embryos eultured on regeneration medium. (C) Squash plants eultured on basal MS
medium. (D) Plant aec1imated in the field with flowers. (E) Squash fruits with normal
seeds.
Fig. 2. Seanning eleetron mierographs of Cucurbita moschata ev. Sello de Oro. (A)
Globular somatie embryos. (B) Torpedo somatie embryos.
Fig. 3. Effeet ofthe explant souree on high frequeney somatie embryogenesis induetion
from from Cucurbita moschata ev. Sello de Oro regardless ofthe eoneentration ofBAP
and 2,4-D on the CIM. The eallus formation pereentage was evaluated 16 weeks after
the initiation of the experiments. Values within eolumns followed by the same letter are
not signifieantly different with the Tukey HSD test (P< 0.05).
Figura 1
Figura 2
Figura 3
~ 75..........
~ue
Q)
:::Jo-
&
e 50
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E1.....E
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:::J
8 25
100
a
e
Zigotic embryos Leaf segmentsCotyledons
Explant source