UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 

SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO 

 

 

 

 

COMPARACIÓN DE PATRONES DE METILACIÓN EN SANGRE EN 

NONAGENARIOS CON Y SIN DEMENCIA DE ALZHEIMER EN UNA POBLACIÓN 

COSTARRICENSE 

 

 

 

 

 

 

Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en 

Biología para optar al grado y título de Maestría Académica en Biología con énfasis en 

Genética y Biología Molecular 

 

 

 

 

 

MARIA CAROLINA COTO VÍLCHEZ 

 

 

 

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 

 

2019 

 



	

II	
		

Agradecimientos 

 

Quiero agradecer en primer lugar a mis papás por todo el amor, comprensión y soporte que 

me han dado durante todo este proceso y durante toda mi formación. A mis hermanos por 

su compañía y apoyo siempre, gracias.  

 

Agradezco también a mi comité asesor. A Ph.D. Gabriela Chavarría Soley y a MSc. 

Henriette Raventós Vorst por toda la colaboración y el apoyo. Gracias por permitirme 

aprender tanto de ustedes durante este tiempo. A Ph.D. Alejandro Leal Esquivel, gracias 

por sus valiosos aportes para el desarrollo de esta investigación.  

 

A Lara Mora Villalobos, gracias por su colaboración y por tanto aprendizaje. A Daniela 

Ugalde Araya, gracias por su apoyo incondicional durante tantos años. Agradezco también 

al resto del grupo de investigación en Psiquiatría Genética del Centro de Investigación en 

Biología Celular y Molecular (CIBCM) gracias por sus aportes y apoyo durante la 

elaboración de este trabajo.  

 

A Ph.D. Humberto Nicolini Sánchez, Ph.D. Alma Genis Mendoza y MSc. Jaime Martínez 

Magaña del Instituto Nacional de Medicina Genómica de México (INMEGEN) muchas 

gracias recibirme en su grupo de investigación y por sus aportes en cuanto al diseño 

experimental, obtención y análisis de los datos. Al resto del personal del INMEGEN que 

fue parte de esta investigación y de mi estadía allá, muchas gracias.  

 

A todos quienes de una u otra forma han formado parte de mi formación académica, mi 

agradecimiento. 

 

A la Universidad de Costa Rica (UCR), el Sistema de Estudios en Posgrado, al CIBCM y al 

INMEGEN, gracias por hacer posible este trabajo.  

 

 

 



	

III	
	

“Esta tesis fue aceptada por Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Biología, 

como requisito parcial para optar por el grado de Maestría Académica en Biología con 

énfasis en Genética y Biología Molecular” 

 
 
 

Dr. Gustavo Gutiérrez Espeleta 
 Representante del Decano 

Sistema de Estudios de Posgrado 
 
 
 

Ph.D. Gabriela Chavarría Soley  
Directora de Tesis 

 
 
 
 

M.Sc. Henriette Raventós Vorst 
Lectora 

 
 
 
 

Ph.D. Alejandro Leal Esquivel 
Lector 

 
 
 
 

Dr. Jorge A. Lobo Segura 
Representante del Director del Programa de Posgrado en Biología 

 
 
 
 
 
 

         María Carolina Coto Vílchez 
 Postulante 



	

IV	
	

Tabla de contenidos 
 

Resumen ............................................................................................................................. v 

 

Lista de cuadros ................................................................................................................. vi 

 

Introducción ........................................................................................................................ 1 

 

Metodología ...................................................................................................................... 10 

 

Objetivo General: ............................................................................................................. 14 

 

Objetivos Específicos: ...................................................................................................... 14 

 

Artículo: Comparative whole genome DNA methylation profiling in Costa Rican 

nonagenarians with and without dementia: significant difference between chronological 

and epigenetic age and further evidence for a role of PM20D1 ....................................... 15 

 

Conclusiones .................................................................................................................... 34 

 

Referencias bibliográficas ................................................................................................ 35 

	

 
 
 



	

V	
		

Resumen 

 

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno complejo que resulta de una combinación de 

factores de riesgo genéticos y no genéticos. Existen variantes genéticas que pueden 

proteger contra el desarrollo de la demencia de Alzheimer en edades avanzadas. La mayoría 

de los estudios epigenéticos y no epigenéticos del envejecimiento cognitivo exitoso se han 

centrado en individuos con y sin demencia en el rango de edad 65-85, pero hay menos 

información sobre los marcadores epigenéticos del envejecimiento cognitivo normal. En 

este estudio, se comparan los perfiles de metilación del ADN de sangre total de los 

nonagenarios costarricenses, cognitivamente sanos y con demencia utilizando el Infinity 

MethylationEPIC BeadChip. Se calculó la edad epigenética de los participantes utilizando  

el reloj epigenético de Horvath. En promedio, la edad epigenética fue de 73 años en ambos 

grupos, lo que representa una diferencia de 23 años entre la edad epigenética y la edad 

cronológica en el caso de personas cognitivamente sanas y de 22 años en el caso de 

personas con demencia. Se identificaron las regiones diferencialmente metiladas entre 

ambos grupos. El análisis reveló 11 regiones diferencialmente metiladas entre grupos, que 

contienen cinco genes y dos pseudogenes. Estos genes están involucrados en la regulación 

del ciclo celular, la embriogénesis, la síntesis de ceramidas y la migración de interneuronas 

a la corteza cerebral. Uno de los cinco genes diferencialmente metilados es PM20D1, el 

cual ha sido encontrado asociado a AD en estudios anteriores, y es un QTL tanto para la 

expresión como para la metilación. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	

VI	
	

Lista de cuadros 

 
Cuadro 1. Principales genes que presentan un estado alterado de metilación en la demencia 
de Alzheimer………………………………………………………………………………...9 
 
 
Table 1. Differentially methylated genomic regions between non demented and 
demented…………………………………………………………………………………...33 
 
 
 
  



	

VII	
	

 



	

	

1	

Introducción 

La demencia de Alzheimer se reportó por primera vez por Alois Alzheimer en el 

año 1907, pero fue hasta 70 años después que se reconoció como la principal causa de 

demencia en edades avanzadas así como causa importante de muerte (Katzman, 2008). Se 

estima que en el mundo hay 26 millones de personas con la enfermedad (Brookmeyer et al., 

2007).  

Actualmente no se conoce cuantas personas tienen demencia de Alzheimer en Costa 

Rica. En el país, la Clínica de la Memoria del Hospital Nacional de Geriatría y 

Gerontología Raúl Blanco Cervantes es la encargada de atender a la población adulta 

mayor con enfermedades mentales desde febrero del 2007. Desde sus inicios hasta el 2014 

el 47.1% de la población atenida fue diagnosticada con demencia de Alzheimer (Miranda-

Valverde et al., 2014). Costa Rica es un país que se encuentra en un claro proceso de 

senescencia poblacional, donde aproximadamente un 10% de la población está compuesta 

por personas adultas mayores. En el país, la esperanza de vida al nacer es de 78 años, por lo 

que se ha ubicado como uno de los países con mayor longevidad en América, solo superado 

por Canadá (Rosero-Bixby & Dow, 2009). A una edad de 90 años, los nonagenarios del 

país tienen una esperanza de vida de 4.4 años lo cual es medio año más que en cualquier 

otro país del mundo (Rosero-Bixby, 2008). Es de destacar que Costa Rica cuenta con una 

de las regiones de mayor longevidad en todo el mundo en el cantón de Nicoya (Buettner, 

2012).  

 

Cuadro clínico y hallazgos anatomopatológicos 

Las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Alzheimer varían entre 

individuos. Sin embargo, la manifestación clínica inicial más común es una reducción 

gradual en la capacidad de recordar nueva información, que se asocia con una reducción en 

las neuronas en las regiones cerebrales involucradas en la formación de memoria reciente 

(Alzheimer's Association, 2016).  

Esta enfermedad se caracteriza por tres cambios anormales en el cerebro. El primero 

de ellos es que los giros o circunvoluciones cerebrales se estrechan, se da una ampliación 

de los surcos, se reduce el peso del cerebro y se da una dilatación de los ventrículos. La 



	

	

2	

segunda característica de la enfermedad es la producción, acumulación y oligomerización 

de proteína beta amiloide, formando placas amiloides extracelulares en el cerebro. Estos 

depósitos extracelulares se encuentran alrededor de axones y dendritas; estas últimas 

presentan engrosamientos en las neuronas de personas con la enfermedad. La tercera 

característica observada en pacientes con Alzheimer es la acumulación de ovillos 

neurofibrilares, los cuales son inclusiones filamentosas en los cuerpos celulares y dendritas 

de la proteína tau (Hudspeth et al., 2013).  

El desarrollo de una clasificación para las enfermedades neuropsiquiátricas en 

categorías etiológicas precisas ha sido complejo, porque varias entidades comparten 

hallazgos clínicos y patológicos. Por ejemplo, teniendo en cuenta las características 

patológicas clásicas, se observa que las placas amiloides, que son una de las principales 

características de la enfermedad de Alzheimer, también son frecuentes en la demencia con 

cuerpos de Lewy y la aparición temprana del perfil neurodegenerativo similar a Alzheimer 

se ha observado también en el síndrome de Down (Arai, Lee, Hill, Greenberg & 

Trojanowski 1992).  

El diagnóstico definitivo de la demencia de Alzheimer se puede realizar solamente 

post mortem. Clínicamente, se puede hacer un diagnóstico probable, para lo cual se realiza 

un historial detallado del desarrollo de los síntomas para determinar si existe deterioro 

cognitivo del individuo y si se han afectado sus funciones sociales u ocupacionales. Esta 

información se toma del individuo afectado y de una persona cercana al mismo. Además se 

realizan pruebas cognitivas y exámenes físicos y neurológicos. Por otro lado, se realizan 

exámenes de sangre y de imágenes cerebrales para descartar otras causas de deterioro 

cognitivo como la presencia de un tumor o alguna deficiencia vitamínica (Hudspeth et al., 

2013; Ballard et al., 2011; Alzheimer’s Association 2016). 

 

Factores de riesgo 

El principal factor de riesgo asociado a la demencia de Alzheimer es la edad 

avanzada. Entre un 1% y 5% de los casos de Alzheimer se dan en personas con menos de 

65 años (Reitz, Brayne & Mayeux, 2011). Diversos estudios en diferentes poblaciones han 

encontrado que en edades entre 60 y 70 años, la enfermedad tiene una prevalencia de entre 



	

	

3	

1% y 3%, de entre 3% y 12% en personas entre 70 y 80 años y de entre 25% y 35% en 

personas con más de 85 años (Hudspeth et al., 2013, Mayeux & Stern, 2012).  

La enfermedad de Alzheimer se considera un trastorno complejo. Una enfermedad 

compleja se da por la combinación de muchos factores tanto ambientales como genéticos. 

En el caso de la genética, existen unos pocos genes cuyas variantes tienen un efecto mayor 

en la aparición de la enfermedad, pero en la gran mayoría de los casos las variantes 

genéticas que contribuyen al riesgo tienen un efecto menor. Se conocen tres genes cuyas 

variantes se caracterizan de efecto mayor: APP, PSEN1 y PSEN2. El gen APP codifica para 

la proteína precursora amiloidea (APP), la cual es una proteína de membrana que es cortada 

por secretasas para formar distintas proteínas, entre ellas, la beta amiloide (Goate et al., 

1991). PSEN1 y PSEN2 codifican para proteínas que son la subunidad catalítica de un tipo 

de secretasa que participa en el procesamiento de APP (Schellenberg et al., 1992; Levy-

Lahad et al., 1995). Por lo tanto, variantes en estos genes causan una acumulación de 

péptidos derivados de la proteína APP en el cerebro de las personas, lo que lleva al 

desarrollo de la demencia de Alzheimer (Shen & Kelleher, 2007). 

También se han descrito otros polimorfismos de efecto moderado o menor que 

resultan en alteraciones en la función génica y que pueden explicar algunos rasgos de las 

enfermedades relacionados con la edad (Kim, Kim & Issa, 2009). Por ejemplo, en la 

enfermedad de Alzheimer el factor de riesgo genético más prevalente es la presencia del 

alelo ApoE4 del gen de ApoE; las personas con el alelo ApoE4 tienen mayor riesgo de 

tener la enfermedad de Alzheimer. Diversos estudios han descrito la frecuencia de este 

alelo en distintas poblaciones, con valores de 6-15% en personas no afectadas por demencia 

y de 30-50% en personas con Alzheimer (Corder et al., 1993; Singh, Singh & Mastana 

2006; Bang et al., 2003; Hudspeth et al., 2013). Sin embargo, se ha visto en algunas 

poblaciones que esta asociación disminuye gradualmente con la edad. Se ha planteado la 

hipótesis de que esto se puede deber a que a pesar de que el alelo es un factor de riesgo 

tanto para mortalidad como para demencia, existe un grupo que tiene protección contra 

esta. A edades avanzadas, aumenta la proporción de supervivientes protegidos entre los que 

permanecen libres de demencia (Valerio et al., 2014; Miech et al., 2002; Farrer et al., 

1997).  



	

	

4	

Estudios de asociación de todo el genoma (GWAS, por sus siglas en inglés) han 

encontrado regiones que se asocian a la demencia del Alzheimer, en distintas poblaciones 

pero principalmente en población caucásica. Dentro de estas regiones, se han identificado 

genes cuyos productos participan en procesos que pueden estar relacionados con la 

patología de la enfermedad como por ejemplo: respuesta inmune (CD33, ABCA7, CD2AP, 

HLA-DRB5/DRB1, INPP5D, MEF2C), procesamiento de la proteína APP (SORL1, 

CASS4), procesamiento de la proteína tau (CASS4, FERMT2), función sináptica (MEF2C) 

migración celular (PTK2B) y transporte de lípidos y endocitosis (SORL1) (Hollingworth et 

al., 2011; Nai et al., 2011; Lambert et al., 2013; Akhtar et al., 2012; Reitz & Mayeux 2014). 

Por otro lado, la asociación con los genes CELF1, NME8 y CASS4 sugiere que los procesos 

relacionados con el citoesqueleto y transporte axonal podrían ser relevantes en la patología 

del Alzheimer (Lambert et al., 2013). 

Existen enfermedades que representan un factor de riesgo para la demencia de 

Alzheimer. Una de ellas es la enfermedad cerebrovascular que trae como consecuencia 

infartos isquémicos, infartos hemorrágicos, vasculopatías y cambios en la materia blanca 

cerebral que causan lesiones en regiones cerebrales que son importantes en los procesos de 

memoria. Además, estos infartos favorecen la acumulación de proteína beta amiloide lo que 

causa un declive cognitivo (Esiri et al., 1999; Lee et al., 2014). Existe evidencia que la 

hipertensión arterial puede aumentar el riesgo de desarrollar Alzheimer ya que afecta la 

integridad de la barrera hematoencefálica. Esto puede resultar en la extravasación de 

proteínas al tejido cerebral, lo cual puede causar daño celular, reducción en la eficacia de la 

transmisión sináptica, apoptosis y al igual que la enfermedad cerebrovascular, acumulación 

de proteína beta amiloide (Kalaria 1992; Farrall & Wardlaw, 2009; Blennow et al., 1990).  

Por otro lado, existen otros factores de riesgo para la demencia de Alzheimer que 

son modificables al variar los hábitos de vida, es decir, son relevantes en el contexto de la 

prevención. Se ha encontrado evidencia que sugiere que factores como el fumado, el nivel 

educativo y la dieta juegan un rol en la enfermedad (Norton et al., 2014). Diversos estudios 

han encontrado que la actividad física está asociada con una reducción en el riesgo de 

desarrollar la enfermedad de Alzheimer (Scarmeas et al., 2009). Se ha encontrado que el 

ejercicio promueve el aprendizaje en animales jóvenes y de edades avanzadas por medio de 

la activación de mecanismos de plasticidad cerebral y de circuitos neuronales, además, 



	

	

5	

aumenta la sobrevivencia neuronal y estimula la neurogénesis (van Praag et al., 1999; 

Cotman & Berchtold, 2002).  

La evidencia indica que personas jóvenes y de edades avanzadas que realizan 

actividad de estimulación cognitiva como estudiar, leer y jugar son menos propensas a 

desarrollar demencia que quienes no (Fratiglioni, Paillard-Borg & Winblad, 2004). 

También existe evidencia sobre el rol que tiene el nivel de escolaridad de una persona en el 

declive cognitivo relacionado con la edad; se ha encontrado un menor declive en personas 

con un alto nivel educativo (Chodosh et al., 2002).  

Algunos estudios han determinado que la depresión puede ser un factor de riesgo 

para la demencia de Alzheimer, sin embargo, aún no existe claridad al respecto. Green y 

colaboradores (2003) realizaron un estudio para elucidar la asociación entre la depresión y 

la demencia,  y concluyeron que, si el Alzheimer aparece aproximadamente en el mismo 

año que inició la depresión, es un síntoma de la demencia. Si la depresión se da años antes, 

sí se considera un factor de riesgo para el Alzheimer. Sin embargo, esta información es 

difícil de interpretar.  

 

Epigenética y Alzheimer 

La epigenética se refiere a cambios en la expresión de genes que son estables entre 

divisiones celulares, pero que no involucran cambios en la secuencia de ADN (Allis et al., 

2006). Estas alteraciones pueden darse por la exposición ambiental a factores nutricionales, 

químicos y físicos los cuales pueden alterar el fenotipo (Kovalchuk, 2008). Mediante estos 

mecanismos epigenéticos, es posible modular procesos como unión de factores de 

transcripción, expresión génica y procesos de editaje; además, es posible regular la 

expresión específica de tejido (Mazzio & Soliman, 2012). Existen diversas modificaciones 

epigenéticas como la metilación del ADN, las modificaciones post traduccionales de las 

proteínas histonas, la remodelación de la cromatina por medio de complejos proteicos y la 

modulación por medio de ARN no codificantes (Jaenisch & Bird 2003; Kouzarides 2007; 

Mercer & Mattick 2013).  

La modificación epigenética más estudiada es la metilación del ADN, en el cual se 

adiciona un grupo metilo en el carbono 5 de una molécula de un residuo de citosina en el 



	

	

6	

ADN,  resultando una 5-metlcitosina (m5C) (Bird, 1985). En las células se dan dos 

procesos de metilación diferentes: de novo, que establece estados de metilación nuevos, y la 

de mantenimiento, que copia los patrones de metilación en células hijas luego de la 

replicación del ADN (Bestor, 2000).  

En general, la metilación del ADN en las regiones de promotores se asocia 

principalmente al silenciamiento de genes (Nakao, 2001). En el genoma de los seres 

humanos existen regiones donde la frecuencia de CG es muy abundante,  conocidas como 

islas CpG (Chatterjee & Vinson, 2012). Las islas CpG se encuentran comúnmente 

asociadas a genes, principalmente en los promotores y en los primeros exones; sin 

embargo, también se encuentran en regiones hacia el extremo 3’ (Larsen et al., 1992). 

Usualmente, tanto el promotor del gen como el sitio del inicio de la transcripción están 

incluidos dentro de la isla CpG y la expresión de ese gen está reprimida cuando esa región 

se encuentra hipermetilada, de aquí el efecto de silenciamiento que produce esta marca 

epigenética (Nakao, 2001).  

 La metilación de ADN en promotores y el silenciamiento de genes asociado, es el 

cambio epigenético que más se ha estudiado en las enfermedades asociadas a la edad (Kim 

et al., 2009). En general, se ha observado una disminución en la metilación del ADN a 

nivel de todo el genoma, aunque acompañada de una hipermetilación localizada en algunos 

promotores específicos a edades avanzadas (Marques et al., 2011). En cuanto a los procesos 

cerebrales, las alteraciones epigenéticas parecen tener un rol clave en un amplio ámbito de 

funciones como los mecanismos de aprendizaje y memoria, adicción a drogas, 

neurodegeneración y ciclos circadianos. Además, se han encontrado alteraciones 

epigenéticas en enfermedades como Síndrome del X frágil, Síndrome de Rett, enfermedad 

de Huntington, esquizofrenia y trastorno bipolar, enfermedad de Alzheimer, entre muchas 

otras (Jiang et al., 2008).  

Las modificaciones epigenéticas podrían participar en la etiología de los trastornos 

multifactoriales como la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson. En estas enfermedades 

se ha encontrado discordancia entre gemelos idénticos tanto para el diagnóstico de la 

enfermedad como para la edad de inicio, por lo que se ha sugerido que la metilación 



	

	

7	

diferencial podría estar asociada a los fenotipos discordantes entre ellos (Fraga et al., 2005; 

Gatz et al., 2006; Nee & Lippa, 1999).  

Como se mencionó anteriormente, se han realizado estudios en los cuales se 

evidencia que la aparición de la demencia de Alzheimer está asociada a factores 

ambientales como la dieta y el estilo de vida, entre otros, donde la epigenética podría ser el 

mediador entre el componente ambiental y el genético (Chouliaras et al., 2010).  

Con respeto a factores ambientales, se ha sugerido en estudios en animales que el 

ejercicio promueve la neurogénesis y la plasticidad sináptica. Se ha determinado que en 

animales la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) aumenta con el 

ejercicio y que esto podría estar involucrado en los efectos protectores de la actividad física 

en patologías como el Alzheimer, probablemente mediante mecanismos epigenéticos 

(Scarmeas et al., 2009; Dao et al., 2015).  

A nivel general, un estudio encontró que en neuronas del tejido cortical postmortem 

de pacientes con Alzheimer, la inmunoreactividad de 5-metilcitosina (5mC) es mucho 

menor que en controles de una edad similar. Además, el nivel de 5mC se relaciona de 

forma inversamente proporcional con marcadores de ovillos neurofibrilares en las mismas 

neuronas, lo cual en conjunto implica que en el cerebro de personas con la enfermedad, se 

da una pérdida general de 5mc (Mastroeni et al., 2010).  

Se ha reportado hipometilación del ADN en la corteza entorrinal de pacientes 

enfermos al compararse con controles. Esta región del cerebro es una de las primeras 

regiones del cerebro que se ve afectada en la demencia de Alzheimer (Maestroeni et al., 

2010). Además, de acuerdo con la discordancia en la aparición de la enfermedad en 

gemelos monocigóticos mencionada anteriormente, se han encontrado diferencias en la 

metilación del ADN en neocorteza temporal de gemelos monocigóticos discordantes para la 

enfermedad. En un estudio, el individuo enfermo mostró menores niveles de 

inmunoreactividad de 5-metilcitosina, como un marcador de metilación, que su hermano 

gemelo sano (Maestroeni et al., 2009). 

La proteína tau hiperfosforilada es responsable de la formación de ovillos 

neurofibrilares característicos en la demencia de Alzheimer. La hiperfosforilación de la 

proteína resulta en el auto ensamblaje de ovillos formando agregados que participan en la 



	

	

8	

patogénesis de la enfermedad. Se ha encontrado hipometilación en el promotor de tau con 

la edad, sin embargo, hay variaciones en el estado de metilación en los sitios de unión de 

factores de transcripción. Por ejemplo, hay hipometilación en los sitios de unión de GCF 

(factor granulocitico quimiotáctico), responsable de la represión de promotores ricos en 

GC, mientras que sitios de unión al activador transcripcional SP1 se encontraron 

hipermetilados. Estos cambios podrían representar un “doble hit” en la actividad 

transcripcional del gen tau, lo que causa una disminución en su actividad (Tohgi et al., 

1999).  

En pacientes con Alzheimer de inicio tardío se ha encontrado una hipermetilación 

en regiones con baja densidad de CpG del promotor de la apolipoproteína E-e4 que, como 

se mencionó anteriormente, es uno de los principales alelos de riesgo en la enfermedad. 

Esto se encontró en tejido de corteza prefrontal postmortem y en linfocitos periféricos en 

pacientes con Alzheimer en comparación con los controles (Wang et al., 2008). Por su 

parte, Hutnick y colaboradores (2009) encontraron que la eliminación de la ADN metil 

transferasa 1 (DNMT1) en cerebro murino provoca una hipometilación significativa del 

ADN en neuronas corticales y del hipocampo, lo cual resulta en neurodegeneración 

manifestada en déficit severos en aprendizaje y comportamiento relacionado con la 

memoria pero no en funciones motoras y coordinación.  

En el Cuadro 1 se presenta una lista de los principales genes que se han encontrado 

diferencialmente metilados en individuos con demencia de Alzheimer al compararlos con 

individuos cognitivamente sanos.  

 

 

 

 

 

 

 



	

	

9	

Cuadro 1. Principales genes que presentan un estado alterado de metilación en la demencia de 

Alzheimer. Hipermet=Hipermetilado; Hipomet=Hipometilado 

 
 



	

	

10	

Reloj epigenético 

Existe evidencia de que hay marcas epigenéticas asociadas a la edad: genes o 

regiones genómicas se hipermetilan o hipometilan con la edad (Jung & Pfeifer, 2015). Se 

ha visto que la hipermetilación relacionada con la edad se da especialmente en islas CpG en 

promotores de genes importantes para el desarrollo (Horvath et al., 2012). A pesar de que 

se sabe que el perfil epigenómico varía entre tipos de tejidos, diversos estudios han 

demostrado que se dan marcas en sitios CpG independientemente del sexo y el tipo de 

tejido (Horvath, 2013).  Hay diversos biomarcadores de la edad que se han descrito con el 

tiempo como por ejemplo la longitud de los telómeros, sin embargo, el reloj epigenético ha 

resultado ser uno de los más exactos (Jylhävä, Pedersen, & Hägg, 2017). El reloj 

epigenético de Horvath (2013) es un modelo matemático que predice la edad midiendo los 

niveles de metilación del ADN en diferentes sitios del genoma, que se desarrolló usando 

8000 muestras de 82 distintos arreglos de metilación e incluye 51 tejidos sanos y tipos 

celulares. Esto permite predecir la edad independientemente del tejido que se esté usando 

(Horvath, 2013). 

 

Metodología 

Este proyecto se realizó mediante un convenio entre la Universidad de Costa Rica y 

el Instituto de Medicina Genómica de México (INMEGEN). El proyecto fue aprobado por 

el comité ético-científico (CEC) de la Universidad de Costa Rica (UCR) y cumple con las 

normas éticas internacionales.  

 

Selección de la muestra y diagnóstico 

La muestra se seleccionó del estudio “Fenotipos del proceso de envejecimiento 

cognitivo exitoso en la población fundadora de Costa Rica” que se realizó entre 2005 y 

2016, aprobado por el CEC de la UCR. Está compuesta por nonagenarios provenientes del 

Valle Central de Costa Rica. Los participantes fueron referidos por médicos de la 

Asociación Costarricense de Médicos Especialistas en Geriatría. Una vez contactados y 

posterior a la firma del consentimiento informado, fueron evaluados por un único geriatra y 



	

	

11	

clasificados como con o sin demencia y deterioro cognitivo, con base en la Clasificación 

Clínica de Demencia (CDR por sus siglas en inglés), el Mini-Examen del Estado Mental 

(MMSE por sus siglas en inglés) y el historial clínico.  

La prueba CDR evalúa memoria, orientación, juicio, resolución de problemas, 

cuidado personal y pasatiempos. La información se obtiene tanto del paciente como de una 

persona cercana al mismo y la puntuación va de 0 a 3 (Morris 1997). De acuerdo con la 

prueba CDR, se catalogaron sin demencia a las personas que obtuvieron un puntaje de cero, 

con deterioro cognitivo moderado a las personas con un valor de 2 y con deterioro severo a 

quienes obtuvieron  un valor de 3.  

El MMSE es una prueba corta muy usada para el seguimiento clínico de la 

demencia. Se realizan preguntas  para evaluar orientación, memoria inmediata, atención y 

cálculo, recuerdo diferido, y lenguaje y construcción. Una puntuación entre 27 y 30 indica 

ausencia de deterioro cognitivo y valores menores a 6 indican demencia severa (Folstein, 

Folstein & McHugh, 1975).  

Se seleccionaron 32 individuos para el análisis de metiloma, 21 de ellos no 

afectados y 11 con la enfermedad. Como criterio de inclusión se tomó que las personas 

fueran mujeres, con una edad entre 90 y 103 años, con al menos un embarazo. La edad fue 

verificada por medio de la cédula de identidad. Se incluyeron personas con escolaridad 

entre 0 a 9 años y que fueran casadas o viudas. Además todas vivían con sus familiares. 

Otro aspecto tomado en cuenta en la selección de las muestras fue que la menopausia se 

presentara entre los 50 y los 55 años y que no hubieran recibido terapia de reemplazo 

hormonal con estrógenos. Con respecto al diagnóstico de estado cognitivo, en el grupo de 

personas con demencia se incluyeron a quienes tuvieron un valor de 3 en la prueba de CDR 

y de 0 a 6 en MMSE, mientras que en el grupo de mujeres sin demencia se  incluyeron 

quienes tuvieron valores de 0 y 27-30, respectivamente. Se excluyeron personas con 

antecedentes de accidente cerebrovascular o presencia de alguna enfermedad que 

potencialmente cause otros tipos de demencia.  

Extracción de ADN y metiloma 

Se tomó una muestra de aproximadamente 60 mililitros de sangre por venopunción 

periférica, de la cual se extrajo el ADN por el método de sacarosa (Cheung et al., 1993). La 



	

	

12	

obtención del perfil epigenético se llevó a cabo por medio del chip Infinium Methylation 

EPIC (Illumina, Estados Unidos), que abarca aproximadamente 850 000 sitios de 

metilación a lo largo del genoma y abarca regiones enhancer, cuerpos de genes, promotores 

e islas CpG. El primer paso consiste en tratar el ADN con bisulfito usando el kit “Zymo EZ 

DNA Methylation” (Zymo Research, Estados Unidos). En este proceso, las citosinas no 

metiladas se convierten en uracilos, mientras que las citosinas metiladas permanecen sin 

ningún cambio. El siguiente paso es la amplificación del ADN tratado con bisulfito para lo 

cual se requiere la desnaturalización y neutralización de las muestras (Frommer et al., 

1992). Seguidamente, el ADN ya desnaturalizado se amplifica isotérmicamente durante 

toda una noche, de esta forma se amplifica todo el genoma, es decir, todas las regiones se 

amplifican de manera homogénea (Hosono, 2003). Después es necesario realizar una 

fragmentación del producto amplificado por medio de enzimas; este proceso se da 

basándose en un punto final para prevenir la sobrefragmentación de la muestra a analizar 

(Illumina 2015). Una vez fragmentado el ADN, se debe realizar una precipitación con 

isopropanol, seguido de una centrifugación a 4°C para colectar todo el material. Luego se 

debe resuspender el ADN precipitado en un búfer de hibridación (Illumina 2015). 

Para la hibridación, se debe dispensar el ADN ya fragmentado y resuspendido en el 

chip e incubarlo en el “Illumina hybridization oven” durante una noche. Los fragmentos de 

ADN se unen a una posición específica de locus. Luego de esto se realiza un lavado donde 

el ADN no hibridado, o hibridado inespecíficamente se elimina y así el chip se tiene listo 

para la tinción y extensión. Cuando el ADN se encuentra hibridado en el chip, se da una 

extensión de una sola base usando el capturado como templete y se incorporan sondas para 

determinar el genotipo de cada una de las posiciones. Finalmente, un sistema de escaneo 

(Illumina iSan Sysrem o BeadArray Reader) usa un láser para excitar el fluoróforo de cada 

posición del chip, de esta forma el escáner genera una imagen de alta resolución de la luz 

emitida por los fluoróforos (Illumina 2015). 

La proporción de metilación del ADN en un sitio CpG particular se conoce como 

valor beta de metilación (β) y se calcula tomando la proporción de la señal de metilación 

(C) y de la señal de no metilación (T) por medio de la siguiente fórmula: β=intensidad de la 

señal de metilación/(intensidad de la señal de no metilación+intensidad de la señal de 

metilación+100). De esta forma, un valor de β de 0 se interpreta como que ese sitio CpG se 



	

	

13	

encuentra completamente desmetilado y un valor de 1 significa que el sitio está 

completamente metilado (Bibikova et al., 2011). Estos valores de β junto con el valor de p 

asociado son generados por el sistema de escaneo (Illumina 2015). El trabajo de laboratorio 

para la obtención del perfil de metilación de los individuos fue llevado a cabo en las 

instalaciones del INMEGEN en la Ciudad de México.  

Para el análisis estadístico se usó el programa R, específicamente el paquete minfi 

(Aryee et al., 2014). Se realizó el control de calidad para detectar si existió algún fallo en el 

proceso para alguna de las muestras. Seguidamente se realizó el filtrado de sondas que 

puedan afectar los resultados como aquellas que pueden hibridar en varios sitios. Además, 

se eliminaron las sondas que corresponden a secuencias donde se encuentran SNPs 

conocidos; esto se hace debido a que en caso de no eliminarlos, no habría claridad de si las 

diferencias en señales se deben a una diferencia real en metilación o a una diferencia en la 

secuencia genética que provocara que la sonda se uniera de forma diferente en algunos 

individuos. Adicionalmente, se eliminaron las sondas cuya intensidad no es 

estadísticamente significativa a la intensidad de fondo del microarreglo, así como las 

sondas que fallaron en más de un 50% de las muestras (Wright et al., 2016). Por último, se 

realizó la normalización de FunNorm con el fin de eliminar la variación no deseada lo cual 

se controla por medio de la variabilidad de las sondas control que se encuentran en el 

microarreglo (Fortin et al., 2014). 

Como parte del análisis de los datos, se calculan las proporciones celulares de las 

muestras donde se incluyen los linfocitos CD8+ T y CD4+ T, células NK, células B, 

monocitos y granulocitos. Esto se hace usando el algoritmo de Houseman (Houseman et al., 

2012). Adicionalmente, se usó el programa R para el cálculo de la predicción de edad de 

metilación según el reloj epigenético de Horvath. El método parte de la metilación de 353 

sitios CpG que es usada para el cálculo de la edad de metilación usando una función de 

calibración (Horvath, 2013). Para evaluar la correlación en el grado de metilación entre 

cerebro y sangre de los genes diferencialmente metilados entre personas con y sin 

demencia, se usó la herramienta computacional BECon la cual indica la correlación por 

sitio CpG usando una base datos de metilación de ADN en muestras pareadas de sangre y 

de tres regiones de cerebro postmortem (Edgar et al., 2017).  



	

	

14	

Para la determinación de las regiones diferencialmente metiladas entre ambos 

grupos se usaron dos metodologías: DMRcate and ChAMP-Bumphunter, los cuales utilizan 

un algoritmo matemático diferente (Peters et al., 2016; Morris et al., 2013). Para ambos 

métodos se utilizó un valor de significancia de 0.05 como límite para determinar las 

regiones a incluir en el análisis. El resultado de ambas metodologías indica la posición 

genómica inicial y final de cada una de las regiones diferencialmente metiladas, tomando 

como referencia la versión hg19 del genoma humano. Se compararon las regiones 

encontradas y se escogieron aquellas que fueron encontradas en común por ambos 

programas. Después de obtener las regiones, se realizó una búsqueda de las mismas en el 

UCSC Genome Browser, para identificar cuales genes se encuentran en dichas regiones. 

Seguidamente se realizó un revisión bibliográfica sobre las funciones de los genes, así 

como sobre el eventual rol de ellos en la patología de la demencia de Alzheimer.  

 

Objetivo General:  

Determinar si existen diferencias en los perfiles de metilación en sangre entre 

personas nonagenarias costarricenses con y sin demencia de Alzheimer a lo largo de todo el 

genoma 

 

Objetivos Específicos:  

1. Identificar los patrones de metilación a lo largo de todo el genoma en un grupo de 

nonagenarios con y otro sin demencia de Alzheimer 

2. Comparar el metiloma en personas nonagenarias con y sin demencia de Alzheimer 

para identificar regiones diferencialmente metiladas entre los grupos 

3. Identificar los genes presentes en las regiones diferencialmente metiladas que 

podrían estar involucrados en la patología de la enfermedad 

4. Determinar por medio de herramientas computacionales la correlación entre sangre 

y cerebro en el grado de metilación de los genes identificados  

 



	

	

15	

Artículo: 

Comparative whole genome DNA methylation profiling in Costa Rican nonagenarians 

with and without dementia: significant difference between chronological and 

epigenetic age and further evidence for a role of PM20D1  

C. Coto-Vílchez1, G. Chavarria-Soley1,2, D. Valerio3, L. Mora-Villalobos2, AD. Genis-

Mendoza4, JJ. Martínez-Magaña4, JM. Silverman5, H. Nicolini4, H. Raventós1,2.  

1) Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica, 

San José, Costa Rica; 2) Escuela de Biología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa 

Rica; 3) e Hospital Nacional de Geriatría y Gerontología de Costa Rica, San José, Costa 

Rica; 4) Instituto Nacional de Medicina Genómica, México; 5) Department of 

Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA 

 

ABSTRACT: Alzheimer’s disease (AD) is a complex disorder that results from a 

combination of genetic and non-genetic risk factors. There are genetic variants that may be 

protective against the development of dementia at advanced ages. Most epigenetic and 

non-epigenetics studies of successful cognitive aging have focused on individuals with and 

without dementia in the age range 65-85, but there is less information on epigenetic 

markers of normal cognitive aging. In this study, we compared whole blood DNA 

methylation profiles of Costa Rican nonagenarians, 21 cognitively healthy (mean age 93, 

SD=2.8) and 11 with AD (mean age 95, SD=3.4), using the Infinium MethylationEPIC 

BeadChip. First, we calculated the epigenetic age of the participants based on Horvath's 

epigenetic clock. On average, the epigenetic age was 73 years in both groups, which 

represents a difference of 23 years between the epigenetic age and the chronological age in 

the case of cognitively healthy people and of 22 years in the case of people with dementia. 

We also used two different approaches; DMRcate and Bumphunter, to identify 

differentially methylated regions (DMRs). The analysis revealed 11 DMRs between 

groups, which contain five genes and two pseudogenes. These genes are involved in cell 

cycle regulation, embryogenesis, synthesis of ceramides, and migration of interneurons to 

the cerebral cortex. One of the five differentially methylated genes is PM20D1. In 

accordance with other studies, we found that the gene is hypermethylated in AD. Previous 



	

	

16	

studies have found that this gene is associated with AD, and it is a QTL for both expression 

and methylation.  

 

INTRODUCTION  

Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia in the elderly. It is 

a complex disorder that results from a combination of genetic and non-genetic risk factors, 

in which the environment plays an important role in its development. Age is the main risk 

factor for developing AD: the disease is present in 1–3% of those between ages 60 and 70, 

3–12% of those between ages 70 and 80, and 25–35% of those older than age 85 (Farrer et 

al., 1997; (Hudspeth et al., 2013; Mayeux & Stern, 2012). Some risk factors for AD are 

modifiable, that is, they are relevant for prevention. Factors such as smoking, years of 

education, cognitive stimulation, exercise, and diet have been found to play a role in the 

disease (Norton et al., 2014; Scarmeas et al., 2009; Chodosh et al., 2002).  

Multiple genes have been identified with variants that increase the risk for late onset 

AD (Cuyvers & Sleegers, 2016). Furthermore, there are also genetic variants that may be 

protective against the development of dementia at advanced ages (Suri, Heise, 

Trachtenberg & Mackay, 2013). The level of protection in each individual depends on the 

effect of multiple factors such as aging, genetics (protective and risk variants), lifestyle, 

cardiovascular health, and others. It has been proposed that individuals with a positive 

balance of protective factors can reach advanced ages without developing dementia 

(Vemuri et al., 2017). 

Genes with variants that protect against late life dementia may overlap with genes 

with variants that increase the risk. That is the case of apolipoprotein E (APOE) gene, 

which is a risk factor for dementia and cardiovascular disease (Myers & Nemeroff, 2012). 

The APOE-ε4 allele increases risk of dementia, and the APOE-ε2 allele protects against it 

(Corder et al., 1993; Corder et al., 1994). Protective genetic variants may explain cases of 

high levels of AD neuropathology found in brains of very long-lived cognitively intact 

individuals (Berlau, Corrada, Head & Kawas 2009). However, some studies have found 

that the association between APOE-ε4 allele and dementia declines with age in individuals 

older than 80 years old, suggesting a survivor effect model for successful cognitive aging 



	

	

17	

(SCA) in old age (Scacchi et al., 1995; Valerio et al., 2014). Therefore, the study of SCA 

should focus on the identification of protective factors in genetic studies, but this is more 

difficult than identifying risk factors for dementia (Silverman & Schmeidler, 2018).  

In the last years, epigenetic modifications of the genome have gained attention in 

complex diseases such as AD, and the identification of epigenetically dysregulated genes 

has been increasing (Sanchez-Mut & Gräff, 2015). For example, important genes in the 

context of AD physiopathology, such as amyloid precursor protein (APP), have been found 

to be differentially methylated between individuals with and without dementia. However, 

only the ankyrin 1 (ANK1), sorbin and SH3-domain-containing 3 (SORBS3), and histone 

deacetylase 2 (HDAC2) genes have been reported as dysregulated by independent studies in 

humans (Sanchez-Mut & Gräff, 2015).  

There is abundant evidence of alterations in methylation patterns in individuals with 

dementia compared with non-affected ones, but information about epigenetic markers of 

normal cognitive aging is lacking (Mastroeni et al., 2011; Spiegel, Sewal & Rapp 2014). 

Moreover, most epigenetic and non-epigenetics studies of SCA have focused on individuals 

between 65 and 85 years old, and representation of nonagenarians or centenarians has been 

scarce (Depp & Jeste, 2006).  

Nondemented individuals aged 90 years and above are an interesting population to 

study protective factors for dementia. Their first-degree relatives have been observed to 

maintain intact cognitive function in comparison to relatives of younger, nondemented 

elderly. Also, high heritability of cognitive functions such as memory has been identified in 

this population (Silverman et al., 2008; Greenwood et al., 2011). 

 

The aim of this study is to identify differentially methylated regions (DMRs) in the 

genomes of a sample of cognitively healthy individuals and a sample of individuals with 

AD, all of them over 90 years of age, from the Central Valley of Costa Rica (CVCR). 

 

 

 



	

	

18	

METHODS 

Sample selection:  

The subjects were recruited in the studies “Successful Cognitive Aging and Cardiovascular 

Risk Factors in the Central Valley of Costa Rica”, funded by a NIH Fogarty International 

Center & National Institute on Aging grant (R21TW009258), and P01-AG02219 grant 

funded by the Alzheimer’s Association. Both projects were reviewed and approved by the 

Institutional Review Board of the University of Costa Rica and the Mount Sinai Medical 

School. The study was explained to each subject and written informed consent was 

obtained. If the subject was unable to give consent because of cognitive impairment, 

consent was obtained from the spouse or the primary relative caretaker.  

All subjects were clinically assessed by a medical geriatrician and a psychologist 

with a general medical examination, the Clinical Dementia Rating scale (CDR) and the 

Mini-Mental State Examination (MMSE) (Hughes et al., 1982; Folstein, Folstein & 

McHugh, 1975). In the CDR, clinical information is collected from both an informant and 

the subject. A CDR score of zero indicates no dementia or a recent decline in cognition or 

functioning, and a score of 3 indicates dementia. In the MMSE, a score between 27 and 30 

indicates absence of cognitive impairment, and values below 6 indicate severe dementia. 

Diagnosis of AD was defined by the geriatrician based on the clinical history and the CDR 

and MMSE scores. Patients with a history of stroke or the presence of a disorder other than 

AD that potentially causes dementia were excluded.  

 For this study, we only included female probands over 90 years old, with between 0 

and 9 years of schooling, at least one pregnancy, married or widowed, menopause between 

50 and 55 years of age, and without hormone replacement therapy with estrogen.  

These criteria were used to make the sample as homogeneous as possible. 

Sample preparation and data collection:  

Whole blood was collected by peripheral venipuncture from participants and DNA 

was extracted using the sucrose method (Cheung et al., 1993). DNA was bisulfite converted 

with the Zymo Research EZ DNA Methylation™ Kit (Irvine, CA, USA). We obtained 

genome-wide methylation profiles using the Infinium HumanMethylationEPIC BeadChip 

(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).  



	

	

19	

Data processing was made with minfi R package (Aryee et al., 2014). Quality 

control was first performed to detect samples that fail to adequately detect DNAm (in our 

case, all samples passed quality control). Then, we removed probes that could cross-

hybridize or overlap with SNPs, which could confound results. Probes with a detection p> 

0.05, and probes that failed in more than 50% of the samples were removed. The total 

number of probes post-filtering was 794,770. We used FunNorm normalization to remove 

unwanted variation by regressing out variability explained by the control probes present on 

the array (Fortin et al., 2014). To estimate cell-type proportions including CD8+ T 

lymphocytes, CD4+ T lymphocytes, natural killer cells, B cells, monocytes, and 

granulocytes, we applied Houseman’s algorithm using the minfi R package (Houseman et 

al., 2012).  

The proportion of DNAm at a particular CpG site (β values) was ascertained by 

taking the ratio of the methylated (C) to unmethylated (T) signal, using the formula: β = 

intensity of the methylated signal/(intensity of the unmethylated signal + intensity of the 

methylated signal + 100). β values range from 0 (completely unmethylated) to 1 

(completely methylated) (Bibikova et al., 2011).  

Prediction of epigenetic age 

The Horvath method in R was used to determine DNAm-based age prediction. This 

method uses a weighted average of DNA methylation at 353 clock CpG sites, which is then 

transformed to DNAm age using a calibration function (Horvath, 2013). Mean differences 

between cohorts were assessed using the Kruskal–Wallis test. 

Identification of differentially methylated regions 

We applied two different methods to identify DMRs between nonagenarians with 

and without dementia: DMRcate and ChAMP-Bumphunter (Peters et al., 2016; Morris et 

al., 2013). We assigned a p-value cutoff of 0.05 to determine DMRs in both DMRcate and 

Bumphunter. This was the significance threshold for including DMRs in the final DMR list. 

We used the FDR method to adjust for multiple tests.  

Once the DMRs were identified, we used the web application BECon to verify the 

correlation between the methylation in blood and the methylation in brain for each one of 

the CpG sites of the DMRs (Edgar, Jones, Meaney, Turecki & Kobor, 2017). This tool uses 



	

	

20	

a DNAm database from paired samples of blood and three postmortem brain regions 

from individuals to show how informative DNAm from the blood is for brain DNAm. 

 

RESULTS 

Epigenetic age 

The average epigenetic age of the AD group was 73 (SD=5.99), and the average 

chronological age was 95 (SD=3.36). In the SCA group, the average epigenetic age of the 

AD group was 73 (SD=5.85), and the average chronological age was 93 (SD=2.77). Neither 

the epigenetic age nor the difference between epigenetic age (p=0.42) and biological age 

(p=0.53) differ between groups (p=0.42) Nevertheless, when analyzing the sample as a 

whole, a significant difference was obtained between chronological and epigenetic age 

(p=0.0487).  

Differentially methylated regions 

We assayed DNAm profiles of 32 females, of which 21 were cognitively healthy 

(mean age 93, SD=2.8) and 11 had AD (mean age 95, SD=3.4). The age range is between 

90 and 103 years old. No statistically significant differences were found in the cellular 

composition between the dementia and the SCA group, in any of the cell types, so this 

variable was not included in the analysis. After detection of DMRs with the DMRcate and 

Bumphunter methods, we chose the 11 DMRs that both methods found in common for 

further analysis (Table 1). Four of the 11 DMRs are hypomethylated in SCA group 

compared with the dementia group, while seven of them are hypermethylated. The mean 

length of the DMRs was 603 bp, with 197 bp in the shortest region and of 1736 bp in the 

longest. On average, in the 11 DMRs observed, there were 11 CpG sites per region, with a 

range of 6 to 18 CpG sites. Five out of the 11 DMRs include known genes, and two include 

pseudogenes. The results of the correlation in blood and brain methylation for each of the 

regions are shown in Table 1.  

 

 

 



	

	

21	

DISCUSSION  

DNA methylation levels have been proposed as biomarkers of aging, since 

chronological age correlates with DNA methylation in most human tissues and cell types 

(Horvath, 2013; Horvath & Raj, 2018). In addition, this measure has predictive value for 

all-cause mortality and, estimated from blood extracted DNA, correlates with measures of 

cognitive and physical fitness in 70 year-olds (Marioni et al., 2015a; Marioni et al., 2015b). 

Although we found a 20-year difference between chronological and epigenetic age in all 

our samples, no difference was observed between the SCA and AD groups using Horvath’s 

DNAm age predictors. This is in contrast with the results in brain tissue of Levine et al. 

(2015), who found that postmortem DNAm age in dorsolateral prefrontal cortex was 

associated with neuropathological variables and pre-mortem measures of cognitive decline 

among individuals with AD. 

Nevertheless, our results are very interesting in the context of long-lived individuals 

studies. Costa Rica is the second country in America with the greatest longevity after 

Canada (Rosero-Bixby & Dow, 2009). At the age of 90, Costa Rican nonagenarians have a 

life expectancy of 4.4 years, which is half a year more than any other country of the world 

(Rosero-Bixby, 2008). As in other studies, epigenetic age was lower than chronological 

age; however, we found this difference to be greater. McEwen et al. (2017) studied DNA 

methylation in a sample from Nicoya, a Costa Rican high longevity region. No difference 

was found in epigenetic age between Nicoyans and a sample of people of other regions of 

Costa Rica. However, they reported a difference of -6.9 years between epigenetic age and 

chronological age when analyzing the whole sample and -12.7 years in centenarians. These 

results are consistent with the report of an epigenetically younger age in Hispanic 

populations (Horvath et al., 2016).  

Similar results have also been found in other populations, nonagenarians from 

Sydney, Australia showed a difference of -9.56 years between epigenetic and chronological 

age (Armstrong et al., 2017). Furthermore, centenarians from an Italian cohort were 8.6 

years younger than their chronological age, while their offspring have a lower epigenetic 

age than age-matched controls (Horvath et al., 2015). More research is required to 

understand the reasons for these differences.  



	

	

22	

The differentially methylated regions between SCA and AD found in this study are 

also interesting. Some of them have been reported to be associated to AD or related to 

pathways associated with AD. The gene known as peptidase M20-domain-containing 

protein 1 (PM20D1) was found to be hypomethylated in the SCA sample. This gene has 

been associated with AD, and additional evidence shows that it is both a methylation and 

an expression QTL (Heyn et al., 2013; GTEx Consortium, 2015; Sánchez-Mut et al., 2018). 

Recent evidence indicates that PM20D1 expression might provide a potential cellular 

defense mechanism against AD (Sánchez-Mut et al., 2018). In vitro assays showed an 

increased PM20D1 expression in neuroblastoma cells treated with reactive oxygen species 

(ROS) and amyloid-β (Aβ), emulating an AD model. On the other hand, an analysis of 

brain tissue in a mouse model of AD, which develops AD-related pathologies with age, 

such as amyloid plaques, astrogliosis and learning deficits, showed increased PM20D1 

expression in the frontal cortex at symptomatic stages of the disease in comparison with 

presymptomatic stages and controls. In addition, manipulation of PM20D1 levels showed 

that overexpression of PM20D1 reduced cell death and decreased Aß levels in in vivo and 

in vitro assays. 

Sánchez-Mut et al. (2018) found a significant enrichment of PM20D1 repression in 

AD, by analyzing DNA methylation and RNA expression. The repression occurs by a 

CCCTC-binding-factor-mediated chromatin loop that depends on an AD-associated 

haplotype. Genetic analysis of human brain cortex samples showed an allele-dependent 

correlation between the haplotype of two mQTL associated SNPs, rs708727 and rs960603, 

and PM20D1 promoter methylation. PM20D1 expression was increased in non-risk 

haplotype carriers with AD compared to non-risk haplotype carriers without AD. Also, as 

in most cases, PM20D1 expression was inversely correlated with the methylation of its 

promoter (Sánchez-Mut et al., 2018). 

Interestingly, PM20D1 has been associated with obesity and diabetes, which are risk 

factors for AD (Long et al., 2016; Larrick, Larrick & Mendelsohn, 2016; Profenno, 

Porsteinsson & Faraone, 2010). PM20D1 lies within the Parkinson disease 16 

(susceptibility) locus on chromosome 1, which has previously been associated with 

Parkinson’s disease (Simon-Sanchez et al., 2009). In addition, PM20D1 has been reported 

to be differentially methylated in individuals with obesity and in multiple sclerosis patients 



	

	

23	

(Feinberg et al., 2010; Maltby et al., 2017).  

The gene LHX6 encodes a member of a protein family that contains the LIM 

domain, a unique cysteine-rich zinc-binding domain. The protein is a transcription factor 

involved in embryogenesis and in the expression of a subset of genes involved in 

interneuron migration and development (Lavdas, Grigoriou, Pachnis & Parnavelas, 1999; 

Zhang et al., 2013). The gene is highly expressed in neural crest derived mesenchyme cells 

(Grigoriou, Tucker, Sharpe & Pachnis, 1998). In our sample this region was found to be 

hypermetylated.  

Another one of the differentially methylated genes, CERS3 is a member of the 

ceramide synthase family of genes, this region was found to be hypermethylated in our 

sample. This type of enzymes regulates sphingolipid synthesis by catalyzing the formation 

of ceramides from sphingoid base and acyl-coA substrates. Several lines of evidence 

suggest that there is a causal link between ceramide or sphingolipids levels and 

neurodegenerative diseases such as AD (Ben-David & Futerman, 2010). However, CERS3 

is the only one out of the six-ceramide synthases that is not expressed in brain tissue 

(Becker, Wang-Eckhardt, Yaghootfam, Gieselmann & Eckhardt, 2008). Its expression has 

been reported especially in testis and skin (Riebeling, Allegood, Wang, Merrill & 

Futerman, 2003; Mizutani, Kihara & Igarashi, 2005). In addition, the gene is associated 

with ichthyosis (Radner et al., 2013). 

The gene vtRNA2-1, also known as nc886, encodes a non-coding RNA that 

represses PKR, a double-stranded RNA dependent kinase, involved in tumor-suppression 

(Jeon et al., 2012; Jeon, Johnson & Lee, 2012). This gene is often hypermethylated and 

repressed in cancers (Fort et al., 2018; Lee et al., 2014, Lee et al., 2014). Romanelli et al. 

(2014) showed that vtRNA2-1 region is variably maternally imprinted, namely, it has allele-

specific methylation and shows variable levels of methylation levels among tissues. In our 

sample this region was found to be hypermetylated. 

The Protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 2 Pseudogene, PPP1R2P1, is 

a pseudogene, in our sample the gene was hypomethylated. Evidence shows that 

PPP1R2P1 is expressed, but its function remains unknown (Korrodi-Gregório et al., 2013). 



	

	

24	

The last gene, PRSS22, encodes a member of the trypsin family of serine proteases. The 

enzyme is expressed in the airway epithelial cells in a developmentally regulated manner 

(Wong et al., 2001). We found this gene hypomethylated in our sample. DOC2GP is 

expressed mainly in heart, spleen and thyroid, while C17or98 only in testis (Fagerberg et 

al. 2014). 

Regarding the correlation between blood and brain methylation, it was very variable 

among the DMRs. The lowest correlation was of -0.004, and the highest was 0.701. Three 

out of the five DMRs that contain genes present a correlation above 0.55. The DMR with 

the highest correlation contains neither a gene nor a pseudogene. A limitation in the 

determination of the correlations was that the BECon tool does not have information for all 

the CpG sites of our DMRs, so the average correlation between blood and brain was 

calculated excluding some sites from the DMR regions. 

In conclusion, our work adds evidence to suggest that long-lived individuals have a 

lower epigenetic age than their chronological age. This work also supports the possible role 

of PM20D1 in	protection	against	AD, by showing the differential methylation in blood in 

a longer-lived population. Finally, we found other differentially methylated regions with 

genes involved in cell cycle regulation, embryogenesis, synthesis of ceramides, and 

migration of interneurons to the cerebral cortex, that might have a role in AD and SCA, 

which merit further studies.  

 

REFERENCES 

Armstrong, N. J., Mather, K. A., Thalamuthu, A., Wright, M. J., Trollor, J. N., Ames, D., ... 

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Table 1. Differentially methylated genomic regions between non demented and demented.  

 
Δβ: (Delta beta; absolute mean or max difference of β values between groups (Cognitive healthy–dementia) 
* Genome coordinates from Human Genome GRCh37/hg19 Assembly	

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	

	

34	

Conclusiones 

 

La mayoría de estudios tanto epigenéticos como no epigenéticos sobre 

envejecimiento cognitivo exitoso se realizan en individuos con y sin demencia de 

Alzheimer en edades entre los 65 y los 85 años. Sin embargo, hace falta información sobre 

procesos epigenéticos del envejecimiento cognitivo normal a edades más avanzadas. Es por 

esto que en la presente investigación se analizaron muestras de individuos con edad 

superior a los 90 años.  

Este trabajo presenta evidencia adicional a lo reportado por otros autores con 

respecto a que individuos longevos poseen una edad epigenética significativamente menor 

a su edad cronológica.  En la muestra total, la diferencia entre ambas edades es de 23 años, 

la cual es mayor a la reportada en otros estudios 

 

Con respecto a las regiones diferencialmente metiladas entre el grupo con 

Alzheimer y el grupo cognitivamente sano, por medio de dos diferentes metodologías se 

encontraron 11 de ellas, dentro de las cuales se encontraron cinco genes y dos pseudogenes. 

Los genes encontrados participan en regulación del ciclo celular, embriogénesis, síntesis de 

ceramidas y migración interneuronal a la corteza cerebral, los cuales podrían estar 

involucrados tanto en Alzheimer como en envejecimiento cognitivo exitoso.  

 

Esta investigación respalda el posible rol protector del gen PM20D1 en la 

enfermedad de Alzheimer. Otros estudios han encontrado el gen hipermetilado en tejido 

cerebral en AD, lo que coincide con el resultado obtenido del patrón de metilación en 

sangre. Este gen se ha asociado a AD y es un QTL tanto de expresión de metilación.  

 

 

 

 

 

 

 



	

	

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