UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO REGULACIÓN DE GENES IMPLICADOS EN LA VIRULENCIA DE BRUCELLA ABORTUS MEDIANTE EL SISTEMA DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES DE DOS COMPONENTES BVRR/BVRS Tesis sometida a la Consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Doctorado en Ciencias para optar al grado y título de Doctorado Académico en Ciencias OLGA LILLIANA RIVAS SOLANO Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii DEDICATORIA A mi hijo Sebastián, a mi esposo Randall y a mis papás Vilma y Alejandro. Les agradezco infinitamente su gran amor, paciencia y apoyo incondicional. iii AGRADECIMIENTOS A mi tutora Caterina Guzmán Verri, por la oportunidad de realizar este trabajo y crecer a nivel profesional, por su dedicación para guiar mi proyecto de investigación y por todas sus enseñanzas a lo largo de mi formación doctoral. A los miembros de mi Comité Asesor, Esteban Chaves Olarte y Edgardo Moreno Robles, por la rigurosidad de sus correcciones orientadas a mejorar la calidad científica de esta tesis y sus publicaciones. A mis compañeros de laboratorio y amigos Nazareth Ruiz Villalobos, Amanda Castillo Zeledón, Pamela Altamirano Silva, Marcela Suárez Esquivel, César Jiménez Rojas y Reinaldo Pereira Reyes; por su amistad, cariño, risas, comilonas, amigos secretos y otras actividades sociales, consejos, apoyo moral y múltiples favores. Al personal del Programa de Investigación en Enfermedades Tropicales de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional por todo su apoyo, en especial a Elías Barquero Calvo y Lauren Esquivel Arce. Al personal del Centro de Investigación y Extensión en Enfermedades Tropicales de la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica por todo su apoyo, en especial a Carlos Chacón Díaz, Danilo Solano Quesada y Marlen Cordero Serrano. Al personal del Centro de Investigación en Biotecnología del Instituto Tecnológico de Costa Rica; en especial a Fabián Villalta Romero, Kattia Núñez Montero y Olman Gómez Espinoza por su colaboración; a Rossy Guillén Watson y Kattia Núñez Montero por estar anuentes cubrirme en otras labores cuando lo necesité; a Miguel Rojas por sus consejos y por estar pendiente de mi avance; y a mi jefe Carlos Alvarado Ulloa, por su comprensión, empatía y múltiples permisos. iv Al personal de la “Unité de Recherche en Biologie des Microorganismes”, de la “Université de Namur” en Bélgica, por su apoyo durante mi pasantía doctoral; en especial a Xavier De Bolle, por abrirme las puertas de su laboratorio; y a Mathilde Van Der Henst, por su disposición a ayudarme con aspectos logísticos, técnicos y culturales. A los entes financiadores por su apoyo económico para la realización de esta Tesis: Programa de Becas del Departamento de Gestión del Talento Humano del Instituto Tecnológico de Costa Rica; Vicerrectoría de Investigación y Extensión del Instituto Tecnológico de Costa Rica; Fondo Especial para la Educación Superior del Consejo Nacional de Rectores; y Programa de Innovación y Capital Humano para la Competitividad del Ministerio de Ciencia y Tecnología. v “Esta Tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Doctorado en Ciencias de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Doctorado Académico en Ciencias”. __________________________________________ Ph.D. Adrián Pinto Tomás Representante de la Decana Sistema de Estudios de Posgrado __________________________________________ Ph.D. Caterina Guzmán Verri Tutora __________________________________________ Ph.D. Esteban Chaves Olarte Lector __________________________________________ Ph.D. Edgardo Moreno Robles Lector __________________________________________ Ph.D. Silvia Molina Castro Representante de la Directora del Programa de Posgrado en Doctorado en Ciencias __________________________________________ Olga Lilliana Rivas Solano Sustentante vi La presente tesis está basada en los siguientes artículos de investigación original, publicados o aceptados para publicación: I. Rivas-Solano, O., Van der Henst, M., Castillo-Zeledón, A., Suárez-Esquivel, M., Muñoz-Vargas, L., Capitan-Barrios, Z., et al. (2022). The regulon of Brucella abortus two-component system BvrR/BvrS reveals the coordination of metabolic pathways required for intracellular life. PLOS ONE,17, e0274397. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274397 II. Castillo-Zeledón, A., Rivas-Solano, O., Villalta-Romero, F., Gómez-Espinoza, O., Moreno, E., Chaves-Olarte, E., Guzmán-Verri, C. The Brucella abortus two- component system response regulator BvrR binds to three DNA regulatory boxes in the upstream region of omp25. Frontiers in Microbiology, 14, 1241143. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1241143 III. Rivas-Solano, O., Núñez-Montero, K., Altamirano-Silva, P., Ruiz-Villalobos, N., Barquero-Calvo, E., Moreno, E., Chaves-Olarte, E., Guzmán-Verri, C. (2023). A bvrR/bvrS Non-Polar Brucella abortus Mutant Confirms the Role of the Two- Component System BvrR/BvrS in Virulence and Membrane Integrity. Microorganisms, 11, 2014-2024. https://doi.org/10.3390/microorganisms11082014 Publicaciones adicionales de divulgación: I. Rivas-Solano, O. (2015). Brucella abortus: patogénesis y regulación génica de la virulencia. Revista Tecnología en Marcha, 28(2), 61-73. II. Rivas-Solano, O. (2015). Proyecto de investigación básica genera conocimiento sobre virulencia de Brucella abortus. InvestigaTEC, (22), 21. III. Rivas-Solano, O. (2018). Proyecto interdisciplinario de investigación genera conocimiento sobre los mecanismos de adaptación a la vida intracelular de Brucella abortus. InvestigaTEC, (31), 2. IV. Rivas-Solano, O. (2018). Proyecto de investigación genera conocimiento sobre la regulación transcripcional de la virulencia en el patógeno zoonótico Brucella abortus. InvestigaTEC, (32), 2. V. Rivas-Solano, O. (2019). Proyectos interuniversitarios y multidisciplinarios relacionados con el patógeno zoonótico Brucella abortus realizados en el CIB. Tecnología en Marcha, 32(10), 77-84. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274397 https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1241143 https://doi.org/10.3390/microorganisms11082014 vii TABLA DE CONTENIDOS Contenido Página Portada i Dedicatoria ii Agradecimientos iii Hoja de aprobación v Resumen en español viii Abstract ix Lista de figuras x Lista de cuadros xi Lista de abreviaturas xii Capítulo I: Introducción 1 Capítulo II: Objetivos y Hipótesis 23 Capítulo III: Metodología 24 Capítulo IV: Resultados 40 Capítulo V: Discusión 100 Capítulo VI: Conclusiones 109 Bibliografía General 110 Anexos 135 viii RESUMEN EN ESPAÑOL B. abortus es un patógeno zoonótico intracelular-extracelular facultativo. Su virulencia se relaciona con su capacidad para invadir y replicarse dentro de células hospederas. Estudios previos con mutantes por transposición en los genes bvrR y bvrS que constituyen el sistema de dos componentes BvrR/BvrS, han demostrado que estas cepas son atenuadas y que BvrR/BvrS regula más de 100 genes relevantes para la virulencia. Sin embargo, no se han reportado mutantes por deleción para comparar fenotipos, y confirmar que la atenuación observada se debe directamente a la ausencia de BvrR/BvrS. No se conoce si BvrR/BvrS regula todos esos genes de forma directa, pues algunos de ellos codifican factores de transcripción. Entre los pocos genes cuya expresión se ha demostrado que está regulada positivamente por BvrR/BvrS, destacan: omp25, que codifica para una proteína de membrana externa conservada en Brucella con funciones estructurales e inmunomoduladoras; y el circuito de virulencia BvrR-VjbR-VirB, que es necesario para el tránsito intracelular, la replicación bacteriana, la salida de la célula hospedera y la infección de nuevas células. Además, en Brucella, pocas regiones promotoras han sido estudiadas. En esta tesis, construimos una cepa mutante de B. abortus con una doble deleción en bvrR/bvrS y demostramos que presenta un fenotipo atenuado similar al de las mutantes por transposición, lo que contribuye a validar el papel de BvrR/BvrS en la virulencia. También demostramos bvrR y bvrS pertenecen a un operón de 16 genes cuya organización transcripcional se encuentra conservada solo en miembros del orden Rhizobiales capaces de transitar entre ambientes extra e intracelulares, lo que respalda la importancia de este operón para la virulencia. Además, estudiamos el regulón de BvrR en condiciones que simulan el ambiente intracelular e identificamos regiones genómicas que se pueden unir a BvrR y que están asociadas a genes diana posiblemente regulados de forma directa por BvrR y con funciones relevantes para la virulencia. Confirmamos unión directa de BvrR corriente arriba los siguientes genes relacionados con la virulencia: omp25, tamA, pckA y bvrR, lo que implica autoregulación del operón bvrR/bvrS. Reportamos un sitio de unión a BvrR en el promotor del operón virB, el cual también es regulado por otros factores de transcripción adicionales. Contrario a lo reportado en Sinorhizobium meliloti con ortólogos de BvrR y del regulador transcripcional TetR2, no encontramos interacción directa entre BvrR y tetR2, el cual regula la expresión de vjbR en B. abortus en conjunto con otros factores de transcripción, incluyendo BvrR, lo que podría indicar un evento evolutivo relacionado con virulencia, pues S. meliloti es un endosimbionte. Además, caracterizamos la región reguladora de omp25 como prototipo de región regulada por BvrR y encontramos que presenta tres sitios de unión a BvrR y dos sitios de inicio de la transcripción, lo que sugiere una regulación diferencial en respuesta a condiciones ambientales. En conclusión, nuestros resultados contribuyen a comprender mejor la regulación génica de la virulencia a través de BvrR/BvrS en B. abortus. ix ABSTRACT B. abortus is an intracellular extracellular zoonotic pathogen. Its virulence depends on its ability to invade host cells and replicate within them. Previous studies with two transposition mutants in the genes bvrR and bvrS, both encoding the Two- Component System BvrR/BvrS, revealed attenuation of the mutant strains, and a role of BvrR/BvrS in the regulation of more than 100 virulence-related genes. However, deletion mutants have not been constructed to compare phenotypes, and to confirm that the attenuation is a consequence of the lack of BvrR/BvrS. It is unknown if all these target genes are directly regulated by BvrR/BvrS, because some of them encode other transcriptional regulators. The gene omp25, is among the few known positively regulated target genes. It encodes an outer membrane protein conserved in Brucella and it has structural and immunomodulatory roles. Other known target genes are vjbR and virB. The virulence circuit BvrR-VjbR-VirB is necessary for intracellular trafficking, bacterial replication, cell egress and infection of new cells. Moreover, in Brucella, few promoter regions have been studied. In this work, we constructed a B. abortus mutant strain with a double deletion in the genes bvrR and bvrS, which is attenuated like both transposition mutants, contributing to establish the role of BvrR/BvrS in virulence. We also demonstrated that bvrR and bvrS belong to an operon of 16 genes whose transcriptional organization is conserved in Rhizobiales members capable of transiting between extracellular and intracellular environments, which reinforces the relevance of this operon for virulence. Additionally, we studied the regulon of BvrR under conditions mimicking the intracellular environment and we identified genomic regions bound to BvrR and associated to virulence-related target genes possibly regulated directly by BvrR. We confirmed the direct binding of BvrR to the upstream region of the virulence-related genes: omp25, tamA, pckA and bvrR, implying autoregulation of the bvrR/bvrS operon. We also reported a BvrR binding site on the promoter of the virB operon. This operon is also regulated by other transcription factors. Contrary to what has been reported for Sinorhizobium meliloti, the transcriptional regulator TetR2 does not interact directly with BvrR. TetR2 regulates vjbR expression in B. abortus along with other transcription factors, besides BvrR. This could be related to a virulence- related evolutive event because S. meliloti is an endosymbiont. Moreover, we also characterized the regulatory region of omp25, as a prototype of a region directly regulated by BvrR, and we found three BvrR binding sites within it, suggesting differential regulation in response to environmental conditions. In conclusion, our results contribute to a better understanding of the gene regulation of virulence through BvrR/BvrS in B. abortus. x LISTA DE FIGURAS Figura Página Figura 1. Esquema del ciclo de B. abortus en bovinos (hospedero de preferencia) y humanos (hospedero accidental) resumido en 10 pasos. 6 Figura 2. Modelo propuesto para el tránsito intracelular de Brucella spp. en macrófagos. 9 Figura 3. Funcionamiento general de los principales mecanismos de regulación transcripcional de los procariotas. 14 Figura 4. Funcionamiento del TCS BvrR/BvrS. 17 Figura 5. Resultado de EMSA entre BvrR-P y una sonda de ADN que corresponde a la región corriente arriba de los genes tetR2 y rpIL (control negativo). 143 xi LISTA DE CUADROS Cuadro Página Cuadro 1. Especies reconocidas del género Brucella. 1 Cuadro 2. Lista de cepas y plásmidos utilizadas en esta Tesis. 24 Cuadro 3. Genes blanco en común entre los reguladores transcripcionales BvrR, VjbR, CtrA y MucR. 143 xii LISTA DE ABREVIATURAS LPS: Lipopolisacárido T4SS: Sistema de Secreción Tipo IV RE: Retículo endoplásmico eBVC: Vacuola endosomal que contiene a Brucella rBVC: Vacuola replicativa que contiene a Brucella aBVC: Vacuola autofágica que contiene a Brucella TCS: Sistema de dos componentes QS: “Quorum sensing” OM: membrana externa OMP: Proteína(s) de membrana externa ChIP-Seq: Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina EMSA: Ensayo de Movilidad Electroforética CTS: Caldo Tripticasa Soya ATS: Agar Tripticasa Soya LB: Caldo Luria Bertani Suc: Sacarosa Km= kanamicina Gm= Gentamicina Amp= ampicilina Spc: espectinomicina Cm: Cloranfenicol UFC: Unidades Formadoras de Colonias PTS: Sistema de fosfotransferencia PTSNtr: PTS relacionado al nitrógeno TCA: Ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos 1 CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ● Descripción del género Brucella El género Brucella (Meyer & Shaw, 1920) está constituido por bacterias cocobacilares, Gram negativas, aerobias, no mótiles, no esporuladas y no encapsuladas (Corbel & Brinley-Morgan, 1984). Estas bacterias se comportan como patógenos intracelulares/extracelulares facultativos, causando una enfermedad zoonótica denominada brucelosis (Spink, 1956; Corbel, 2006). Filogenéticamente, se clasifican en la clase Alphaproteobacteria, orden Rhizobiales, junto con patógenos de plantas y mamíferos, simbiontes y organismos de vida libre (Moreno et al., 1990; Batut et al., 2004). Esta diversidad de estilos de vida implica que la biología de Brucella spp. se ha visto influenciada por una prolongada coevolución con los humanos, promovida principalmente por la domesticación y consumo de productos animales (Moreno, 2014). El genoma de Brucella spp., carece de plásmidos y se compone de dos cromosomas circulares, uno de 2.1 Mb (cromosoma 1) y otro de 1.2 Mb (cromosoma 2) que codifican aproximadamente 3500 genes (Michaux et al., 1993). Los miembros de este género presentan un alto grado de similitud a nivel genético, razón por la cual, durante varias décadas, se propuso que este género estaba constituido por una única especie con múltiples biovariedades. Sin embargo; por razones científicas, epidemiológicas y de bioseguridad; actualmente, se reconocen catorce especies (Cuadro 1) que varían en su preferencia de hospedero y grado de patogenicidad para los humanos, los cuales se consideran hospederos accidentales (Moreno, 2021; Whatmore & Foster, 2021). Cuadro 1. Especies reconocidas del género Brucella. Especie Preferencia de hospedero Patogenicidad para los humanos Referencias bibliográficas B. melitensis Cabras Alta Bruce, 1887. B. abortus Ganado vacuno Alta Bang, 1906. 2 B. suis Cerdos Alta Huddleson et al., 1929. B. ovis Ovejas Ninguna Buddle, 1956. B. neotomae Rata del desierto Alta Stoenner & Lackman 1957. Suárez-Esquivel et al., 2017 B. canis Perros Moderada Carmichael & Bruner, 1968. B. ceti Cetáceos Desconocida Ewalt et al., 1994. Roos et al., 1994. Foster et al., 2007.2 B. pinnipidialis Pinípedos Desconocida Roos et al., 1994. Foster et al., 2007. B. microti Zorros y roedores1 Desconocida Scholz et al., 2008. B. innopinata Ranas Alta De et al., 2008. Tiller et al., 2010. Scholz et al., 2023 B. papionis Babuinos Desconocida2 Schlabritz-Loutsevitch et al., 2009. Whatmore et al. 2014. García-Méndez et al., 2019. B. vulpis Zorro rojo de Australia Desconocida Hofer et al., 2012. Scholz et al., 2016. B. amazoniensis Desconocida Alta About et al., 2023 3 B. nosferati Murciélagos Desconocida Hernández-Mora et al., 2023 1: B. microti también se ha aislado del suelo; 2: B. papionis puede infectar trofoblastos humanos in vitro. Fuente: Adaptado de Banai & Corbel (2010); Godfroid, et al. (2011); Moreno (2021) y Whatmore & Foster (2021). Algunas especies descritas en el cuadro 1 aún no han sido formalmente aceptadas por el Subcomité de Taxonomía de Brucella. Adicionalmente a lo descrito en el cuadro 1, existen otras especies que también esperan reconocimiento como tales y que se han aislado de una gran variedad de animales, incluyendo roedores, ranas, reptiles y peces (Moreno, 2021; Whatmore & Foster, 2021). Las especies del género Brucella con capacidad de infectar mamíferos terrestres, incluyendo humanos, generalmente se conocen como clásicas por ser las primeras que se describieron (Banai & Corbel, 2010). También pueden clasificarse en lisas o rugosas, respectivamente en función de la presencia o ausencia del antígeno O en el lipopolisacárido (LPS) de su membrana externa (OM), cuya relación con la virulencia se describirá más adelante (Bowden et al., 1993; Moriyón & López-Goñi, 1998; Banai & Corbel, 2010). ● Características de la brucelosis La brucelosis es una enfermedad endémica en países del Mediterráneo, Norte y Este de África, Medio Oriente, Asia, Centro y Suramérica (Corbel, 2006). La Organización Mundial de la Salud considera a la brucelosis como una de las siete zoonosis más extendidas a nivel mundial y menos priorizada por los sistemas de salud (http://www.who.int/zoonoses/neglected_zoonotic_diseases/en/index.html). Brucella afecta una gran variedad de animales, tanto domésticos, como de producción y de vida silvestre. En mamíferos terrestres, presenta tropismo por el sistema reproductor. En los machos, la infección puede ocasionar epididimitis, orquitis o atrofia testicular; mientras que las hembras infectadas desarrollan abortos, retención de placenta, infertilidad y disminución en la producción de leche (Songer & Post, 2005). En placentas de rumiantes, la replicación bacteriana intracelular destruye los trofoblastos y las bacterias se diseminan a los tejidos y fluidos http://www.who.int/zoonoses/neglected_zoonotic_diseases/en/index.html 4 cercanos, causando la pérdida prematura del feto en gestación. En las regiones afectadas, la brucelosis causa importantes pérdidas económicas (Moreno, 2002: Moreno, 2014). La transmisión de animal a animal se da generalmente por ingestión de material contaminado después del aborto, ya que las bacterias son eliminadas a través del feto, las membranas fetales y las secreciones uterinas. También se ha descrito transmisión sexual (Corbel, 2006). De esta manera se reanuda el ciclo de infección, replicación intracelular y muerte de la célula hospedera (Anderson et al., 1986a; Anderson et al., 1986b). En mamíferos marinos, los síntomas de la brucelosis incluyen placentitis, abortos, mortalidad neonatal, abscesos, meningoencefalitis, meningitis y neurobrucelosis. El análisis post mortem de animales infectados ha revelado fibrosis, daño vascular, infiltrados inflamatorios con linfocitos y macrófagos, congestión pulmonar y edema, así como erosiones gástricas (CFSPH & IICAB, 2009; Hernández-Mora et al., 2008). La brucelosis humana se caracteriza por síntomas inespecíficos como malestar, anorexia y postración. En ausencia de tratamiento, estos síntomas pueden persistir por semanas o meses. Algunos signos reportados son fiebre intermitente, engrosamiento del hígado, bazo o nódulos linfáticos (Corbel, 2006). La diseminación y multiplicación de Brucella en los nódulos linfáticos, bazo, hígado, médula ósea y órganos sexuales ocurre, principal pero no exclusivamente, por medio de los macrófagos (Ko & Splitter, 2003). La infección puede tornarse crónica y presentar complicaciones osteoartículares, gastrointestinales, hepatobiliares, pulmonares, genitourinarias, cardiovasculares y neurológicas, entre otras consecuencias potencialmente mortales (Corbel, 2006). Las vías de transmisión al ser humano incluyen la ingestión de productos lácteos no pasteurizados, el contacto directo con animales infectados y la inhalación de aerosoles bacterianos (Godfroid et al., 2005). El costo del tratamiento en humanos implica una inversión sostenida por parte de los sistemas de salud, ya que consiste en una terapia combinada de varios antibióticos durante periodos desde tres hasta ocho semanas (Akova et al., 1993; Ariza et al., 1985; FAO & WHO, 1986). ● Patogénesis y ciclo de vida intracelular de Brucella 5 En una gran parte de los patógenos bacterianos conocidos se han descrito factores de virulencia considerados como clásicos, por ejemplo: cápsulas, fimbrias y exotoxinas, entre otros. Sin embargo, la mayoría de estos factores no se han encontrado en Brucella. La virulencia de esta bacteria pareciera estar determinada por su habilidad para internalizarse, sobrevivir y replicarse dentro de los fagocitos profesionales y no profesionales de una gran variedad de hospederos, ya sea preferidos o accidentales (Moreno & Moriyón, 2002; Moreno & Gorvel, 2004). Una vez que Brucella penetra sus células hospederas, lleva a cabo un complejo tránsito intracelular compuesto por varias etapas secuenciales, durante las cuales transita en los compartimentos de las vías endocítica, secretora y autofágica de las células hospederas, logrando modificar y explotar dichos compartimentos al liberar moléculas efectoras por medio del sistema de secreción tipo IV (T4SS) VirB, el cual se describirá más adelante. Los efectores liberados modulan las funciones y la maquinaria del hospedero, primeramente, para convertir la vacuola endosomal que contiene a la bacteria en un compartimento derivado del retículo endoplásmico (RE) que permite la replicación bacteriana, y posteriormente, en una vacuola autofágica que permite la salida de la célula hospedera para colonizar nuevas células (Celli, 2019). B. abortus usualmente ingresa al hospedero a través de las mucosas (Figura 1). Posteriormente atraviesa la submucosa y coloniza los ganglios linfáticos cercanos, a partir de los cuales puede diseminarse sistémicamente, mediante fagocitos, hacia otros órganos, para establecer una infección crónica (Enright, 1990; Moreno y Barquero, 2020). 6 Figura 1. Esquema del ciclo de B. abortus en bovinos (hospedero de preferencia) y humanos (hospedero accidental) resumido en 10 pasos (Tomado de Moreno y Barquero, 2020). Paso 1: B. abortus usualmente ingresa al hospedero a través de las mucosas. Paso 2: Posteriormente, fagocitos profesionales como los macrófagos, células dendríticas (CD) y leucocitos polimorfonucleares (PMNs) ingieren la bacteria. Paso 3: A través de los fagocitos, la bacteria se desplaza hacia los ganglios linfáticos cercanos. Paso 4: A través del sistema retículo endotelial, la bacteria se disemina hacia otros órganos, como los pulmones, bazo, hígado y médula ósea. Paso 5: En animales preñados, B. abortus invade y se replica dentro de los trofoblastos de la placenta, causando placentitis. Paso 6: En el último trimestre de gestación, la replicación bacteriana dentro de los trofoblastos ocasiona abortos. Pasos 7 y 8: El feto abortado se convierte en una fuente de infección para otros animales y humanos. Paso 9: El ciclo abortivo continúa si el nuevo animal infectado está preñado (línea discontinua). Si la hembra no está preñada este paso no ocurre. Paso 10: Los humanos pueden infectarse por contacto directo con las 7 secreciones de los animales enfermos o por la ingesta de productos lácteos no pasteurizados y/o contaminados. ● Mecanismos de invasión de la célula hospedera Brucella emplea distintas estrategias para entrar a sus células hospederas. En macrófagos, la cadena O del lipopolisacárido (LPS) liso de las bacterias no opsonizadas interactúa con moléculas receptoras ubicadas en la membrana, como FcR, C3bR, MannoR y fibronectina, entre otros. Brucella también puede ser ingerida por medio de balsas lipídicas o mediante un mecanismo de fagocitosis tipo “zipper”, el cual se caracteriza por la inducción de rearreglos moderados en la membrana y el citoesqueleto de la célula hospedera, aunque no se da un reclutamiento extensivo de actina (Porte et al., 2003; Moreno & Gorvel, 2004). Los macrófagos también pueden ingerir brucelas opsonizadas a través de receptores de Fc, de complemento o de fibronectina (Moreno & Gorvel, 2004). En células intestinales M y epiteliales, también se ha constatado el ingreso de Brucella por medio del mecanismo tipo “zipper”. En células HeLa, Brucella se une a receptores en la membrana y penetra por fagocitosis con reclutamiento moderado de actina y activación de GTPasas pequeñas como Cdc42, Rac y Rho. La bacteria se une en mayor cantidad y se internaliza más eficientemente cuando las células HeLa se tratan con el factor citotóxico necrotizante (CNF), el cual induce la formación de pliegues y fibras de estrés en la membrana de la célula hospedera (Guzmán-Verri et al., 2001). Generalmente, los fagocitos profesionales logran internalizar un alto número de bacterias debido a su naturaleza fagocítica. Sin embargo, la eficiencia de internalización en fagocitos no profesionales suele ser baja, lo que sugiere que no todas las células son permisivas, o bien que no todas las bacterias son capaces de unirse a fagocitos no profesionales (Celli et al., 2003). ● Tránsito intracelular y salida de la célula hospedera Una vez que Brucella se internaliza en la célula hospedera, logra escapar la vía endocítica y se localiza en un compartimento endosomal no replicativo denominado eBVC (vacuola endosomal que contiene a Brucella), el cual interactúa brevemente con los lisosomas, pero escapa de ellos y se transforma en una vacuola 8 con pH ácido (Celli et al., 2003). Es decir, tanto en macrófagos como en células epiteliales, Brucella inhibe o retrasa la fusión de fagosomas y lisosomas, que es una de las características de la vía endocítica (Ko & Splitter, 2003). Posteriormente, la eBCV interactúa prolongadamente con el RE e inclusive se fusiona de forma limitada con esta organela, lo cual conlleva a la adquisición de algunas de sus propiedades, como por ejemplo el pH neutro. Así, la eBCV se transforma en una organela derivada del RE que permite la replicación bacteriana (Celli et al., 2003). Esta vacuola se denomina rBCV (vacuola replicativa que contiene a Brucella). Cabe recalcar que, en macrófagos, la mayoría de las bacterias ingeridas son dirigidas a los fagolisosomas y solamente muy pocas logran alcanzar el RE que es su nicho replicativo. Por el contrario, en células epiteliales, la mayoría de las bacterias ingeridas son dirigidas al RE y en menor proporción a los lisosomas (Moreno & Gorvel, 2004). Sin embargo, independientemente del tipo de fagocito, una vez que la bacteria se encuentra dentro de la rBCV, permanece protegida de antibióticos y factores bactericidas del hospedero como el complemento y los anticuerpos, lo cual facilita el establecimiento de una infección crónica (Roop et al., 2009). Luego de la replicación de la bacteria, la rBCV se convierte en un compartimento con características autofágicas abreviado como aBCV (vacuola autofágica que contiene a Brucella). La formación de la aBCV requiere algunas proteínas que están implicadas en el inicio de la autofagia, pero es independiente de proteínas asociadas a la elongación. La aBCV es necesaria para completar el ciclo intracelular de Brucella y para la salida de la célula y la diseminación hacia nuevas células, lo que demuestra que esta bacteria es capaz de apropiarse selectivamente de los complejos de iniciación de la autofagia para tomar control de la célula hospedera y promover la infección (Starr et al., 2012). Brucella también logra reconocer algunas señales de estrés (acídico o nutricional) a nivel intracelular para regular su propia expresión génica e incluso modificar algunas funciones de los fagocitos profesionales. Por ejemplo, puede inducir resistencia a la apoptosis en macrófagos, así como inhibir la capacidad de presentación de antígenos de las células dendríticas (Roop et al., 2009). En la Figura 2 se ilustran los eventos 9 celulares y moleculares asociados al tránsito intracelular de Brucella spp. en macrófagos (Celli, 2019). Figura 2. Modelo propuesto para el tránsito intracelular de Brucella spp. en macrófagos (Tomado de Celli, 2019). Una vez que los macrófagos ingieren a la bacteria por fagocitosis, ésta reside durante las primeras 8-12 h post-infección dentro de una vacuola unida a la membrana. Esta vacuola experimenta un proceso de maduración endosomal, mediante interacciones secuenciales con los endosomas tempranos (EE), los endomas tardíos (LE) y los lisosomas (LYS), pero logra escapar de la fusión con los lisosomas, convirtiéndose en un compartimento acidificado denominado eBCV. La pequeña GTPasa del hospedero Rab7 contribuye a la maduración de la eBCV. Las condiciones físico-químicas de este compartimento promueven la expresión del T4SS VirB, el cual trasloca proteínas efectoras (rojo) que median las interacciones de la eBCV con el sitio de salida del RE, así como la adquisición de membranas derivadas del RE y el aparato de Golgi. Estos eventos conllevan a la biogénesis de la vacuola rBCV, que permite la replicación bacteriana. Las proteínas del hospedero Sar1, IRE1α, Yip1A, Atg9, WIPI1 y el complejo COG, 10 contribuyen a la biogénesis de la rBCV. Entre las 12 y 48 h post-infección, ocurre la replicación bacteriana dentro de la rBCV. Posteriormente, la rBCV es capturada dentro de estructuras similares a autofagosomas, de forma dependiente del T4SS VirB y se convierte en la vacuola autofágica aBCV. La formación de ésta última requiere de las proteínas autofágicas del hospedero beclin1, ULK1 y Atg14. La aBCV presenta características de autolisosoma y es necesaria para que la bacteria pueda salir de la célula hospedera e infectar nuevas células. ● Determinantes bacterianos asociados a la virulencia de Brucella En Brucella las OMPs se clasifican en tres grupos de acuerdo con su peso molecular. El denominado Omp 1 está constituido por OMP de 88-94 kDa. El Omp 2 está integrado por porinas de 36-38 kDa. Por último, el grupo Omp 3, también conocido como familia Omp25/Omp31, incluye ocho proteínas cuyas secuencias génicas se encuentran altamente conservadas en alfaproteobacterias como Rhizobium, Bartonella y Agrobacterium. Estas proteínas están implicadas en la interacción hospedero-patógeno (Vízcaíno & Cloeckart, 2012) y su expresión se encuentra regulada por ortólogos del TCS BvrR/BvrS. Dentro de esta familia, se consideran más relevantes las OMP de 25-27 kDa y las de 31-34 kDa, que están codificadas respectivamente por los genes omp25 y omp31. En B. abortus, Omp25 tiene un papel estructural en la unión al peptidoglicano (Godessart et al., 2021) y se ha propuesto que también interactúa con la proteína SLAMF1 presente en la superficie de células dendríticas, inhibiendo su maduración y capacidad de producir citoquinas inflamatorias, lo cual contribuye a la persistencia bacteriana (Degos et al., 2020). Otro determinante bacteriano relacionado con la interacción hospedero- patógeno, son las adhesinas autotransportadoras que facilitan la unión a las mucosas del hospedero durante la etapa inicial de la infección bacteriana. Mutantes en las adhesinas autotransportadoras denominadas OmaA, BmaC, BtaE, BtaFy BigA presentan una unión reducida a células epiteliales (Roop et al., 2021). En particular, BtaE puede unirse al ácido hialurónico de las mucosas del hospedero y presenta una localización polar en la célula bacteriana, específicamente en el nuevo polo que se forma luego de la división celular (Roop et al., 2021). Esta observación 11 en conjunto con el hecho de que Brucella realiza un arresto del ciclo celular en la fase G1 durante las primeras 4-6 post-infección mientras se encuentra dentro de la eBCV (Deghelt et al., 2014), sugiere que BtaE podría contribuir a formar un polo adhesivo (Roop et al., 2021). En Brucella, así como en otras alfaproteobacterias, se ha descrito el T4SS VirB (Delrue et al., 2001). Como se mencionó, Brucella utiliza este sistema para la traslocación de efectores de virulencia a la célula hospedera que le permiten a la bacteria escapar de la vía endocítica y transitar hacia su nicho replicativo (Backert & Meyer, 2006). Los mutantes para el T4SS VirB no pueden controlar las interacciones de la eBCV con el RE y permanecen en compartimentos inmaduros que eventualmente se fusionan con los lisosomas. Por lo tanto, el T4SS VirB es esencial para el establecimiento de un nicho intracelular seguro que posibilite la sobrevivencia a largo plazo de la bacteria (Celli et al., 2003). Además, la expresión del T4SS VirB se activa nuevamente cuando la bacteria pasa de la rBCV a la aBCV, por lo que se ha postulado que también participa en el proceso de salida de la célula hospedera (Altamirano-Silva et al., 2021). El LPS de Brucella presenta particularidades que contribuyen a la sobrevivencia intracelular, entre ellas, una baja actividad biológica ya que no induce signos de sepsis, fase de respuesta aguda, reclutamiento de neutrófilos ni producción significativa de citoquinas. El LPS de Brucella confiere resistencia a péptidos catiónicos bactericidas producidos por el hospedero y no activa la vía alterna del complemento (Moreno & Moriyón, 2002; Ko & Splitter, 2003; Roop et al., 2009). Generalmente la inmunidad innata reconoce los patrones moleculares asociados a patógenos ubicados en la envoltura celular (Janeway et al., 2002). Pero, en el caso del LPS de Brucella, se requieren grandes cantidades para activar la señalización a través del receptor tipo Toll 4 (Lapaque et al., 2006; Moreno et al., 1981; Rasool et al., 1992). Por lo tanto, mediante cambios en los PAMPs, Brucella ha logrado desarrollar una estrategia sigilosa que le permite alcanzar su nicho replicativo antes de la activación de mecanismos antimicrobianos de inmunidad innata (Barquero-Calvo et al., 2007). 12 En S. meliloti, el gen bacA, codifica un transportador ABC que importa pequeños péptidos ricos en cisteína desde la planta hacia su citoplasma, con el fin de que estos péptidos no dañen la membrana celular. Además, estos péptidos contribuyen a la diferenciación de la célula vegetativa en un bacteroide fijador de nitrógeno (Roop et al., 2021). Los mutantes de B. abortus en bacA son atenuados y tienen niveles reducidos de ácidos grasos de cadena muy larga en su lípido A, induciendo respuestas inflamatorias más fuertes en ratones que la cepa parental, lo que probablemente explica su atenuación (Roop et al., 2021). Se cree que BacA también puede proteger a las cepas de Brucella de los péptidos antimicrobianos que encuentran durante sus interacciones con fagocitos hospedadores de manera similar a la función desempeñada por su ortólogo en S. meliloti (Roop et al., 2021). Otro determinante bacteriano relacionado con la modulación de la respuesta inmune del hospedero, es un polímero cíclico ubicado en el espacio periplásmico, compuesto por entre 17 y 20 residuos de glucosa y conocido como β-1,2-glucano cíclico, el cual, en macrófagos, contribuye a prevenir la fusión con los lisosomas y a la cronicidad de la infección (Roop et al., 2021). La mayoría de las cepas de Brucella presenta la capacidad genética de producir flagelos, pero carecen de genes de quimiotaxis y solo algunas cepas utilizan los flagelos para la función de movilidad. Las cepas de B. melitensis con mutaciones en los genes flagelares fliF y flgF son atenuadas en ratones y cabras preñadas, lo que sugiere que podrían desempeñar un papel en virulencia. Se cree que los flagelos podrían contribuir a la virulencia mediante la modulación de la respuesta inmune del hospedero, ya que la flagelina de Brucella no es reconocida por el receptor tipo Toll 5, lo que contribuye a la estrategia patogénica. Además, una vez dentro del citoplasma del hospedero, estimula una respuesta inflamatoria que facilita el establecimiento de infecciones crónicas (Roop et al., 2021). Por último, se ha postulado que ciertas adaptaciones fisiológicas al ambiente intracelular tienen relación con la virulencia, entre ellas, los ajustes en metabolismo del carbono y el nitrógeno para aprovechar las fuentes disponibles en el ambiente intracelular (Ronneau et al., 2016; Barbier et al., 2018). De acuerdo con Barbier y colaboradores (2011), el éxito en la adaptación de Brucella al ambiente intracelular 13 radica en su capacidad para ajustar su metabolismo de forma muy controlada, ya que esto le permite utilizar los nutrientes específicos que están disponibles en cada nicho por donde transita durante su ciclo de vida. Para su metabolismo central, B. abortus utiliza de preferencia azúcares de cuatro carbonos como el eritritol, el cual es catabolizado a triosa fosfato. Las hexosas por su parte pueden ser catabolizadas a través de la vía de las pentosas-fosfato; por medio de una vía glucolítica Embden- Meyerhof-Parnas incompleta, ya que Brucella carece de la enzima fosfofructoquinasa, y mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). Las vías de Entner–Doudoroff y el ciclo del glioxilato también parecieran ser potencialmente funcionales. Se cree que varios sistemas de transporte y degradación de carbohidratos son necesarios para la sobrevivencia intracelular de Brucella. Por otra parte, los transportadores para la captación de aminoácidos y péptidos también parecen ser necesarios durante la infección. Estos hallazgos sugieren que la bacteria podría utilizar carbohidratos, pero también aminoácidos y péptidos como fuentes de energía y/o carbono durante su ciclo infeccioso (Barbier et al., 2011). ● Regulación de la expresión de genes implicados en la virulencia Generalmente las bacterias están expuestas a condiciones ambientales cambiantes y para poder adaptarse deben ajustar sus patrones de expresión génica. Los genes bacterianos están organizados como operones, que son un conjunto de genes que se encuentran bajo el control de un mismo promotor, por lo que su transcripción puede ser apagada o encendida de manera simultánea para dar una respuesta rápida a los cambios ambientales (Ralston, 2008). Los procariotas emplean distintos mecanismos para regular la expresión de sus genes. A nivel transcripcional (Figura 3), destacan los sistemas de transducción de señales de dos componentes (TCS) y el “quorum sensing” (QS), entre otros. 14 A. B. Figura 3. Funcionamiento general de los principales mecanismos de regulación transcripcional de los procariotas (Tomado de Bretl et al., 2011; Ng & Bassler, 2009). A. En general, los TCS comprenden una proteína integral de membrana con actividad histidina quinasa que constituye el componente sensor y una proteína citoplasmática separada conocida como componente regulador. La proteína sensora tiene dos dominios, uno extracelular que reconoce señales externas y otro citoplasmático que transduce la señal al interior celular. Cuando una señal es reconocida por el dominio extracelular del componente sensor, se produce un cambio conformacional en el mismo, lo cual desencadena una autofosforilación del dominio citoplasmático en un residuo conservado de histidina. El sensor fosforilado interactúa con su proteína contraparte reguladora, estimulando la fosforilación de residuos de aspartato en su dominio receptor. Éste, una vez fosforilado, puede unirse al ADN mediante su dominio efector regulando la transcripción de genes blanco (Dale & Park, 2004). B. En general, el QS es un mecanismo de comunicación celular para sincronizar la expresión génica en una población bacteriana. Consiste en la liberación al medio externo de pequeñas moléculas autoinductoras. Conforme aumenta la densidad poblacional, aumenta la 15 concentración extracelular del autoinductor hasta alcanzar un umbral determinado. En este punto la molécula señal es reconocida por receptores y como consecuencia, se activan o reprimen factores de transcripción citoplasmáticos que regulan la expresión génica de forma coordinada en la población bacteriana (Bassler, 1999). Se estima que en Brucella podrían existir alrededor de quince TCS (Lavín et al., 2010). Uno de los más caracterizados es BvrR/BvrS, (“Brucella virulence- related”). Dicho sistema está constituido por BvrS que es el componente sensor localizado en la membrana celular y por BvrR que es un factor de transcripción citoplasmático (López-Goñi et al., 2004). Sola-Landa et al. (1998) generaron y caracterizaron dos cepas mutantes de B. abortus, una para bvrR y otra para bvrS. Ambas mutantes se obtuvieron mediante la inserción de un transposón que interrumpió el marco de lectura de cada gen, seguida de una selección por sensibilidad a Polimixina B. Estas mutantes también son sensibles a otros péptidos bactericidas y presentan mayor permeabilidad a surfactantes, en comparación con la cepa silvestre. Además, muestran una invasión celular reducida, tráfico intracelular deficiente y ausencia de virulencia en ratones (Guzman-Verri et al., 2002; Sola-Landa et al., 1998). Al tratar células HeLa con CNF para promover la internalización y, posteriormente, infectarlas con la cepa mutante en bvrS, se observa, luego de 24 h de internalización, que las células bacterianas pierden integridad y sólo se distinguen restos celulares, es decir que las bacterias con mutaciones en este sistema no logran alcanzar su nicho replicativo (Chaves-Olarte et al., 2002). Estas mutantes han sido utilizadas en varios estudios previos sobre el papel del TCS BvrR/BvrS en la virulencia de B. abortus, determinándose que este sistema regula la estructura del LPS, la expresión de proteínas periplásmicas y de proteínas de la familia Omp 3, también conocida como Omp25/Omp31 (Viadas et al., 2010; Wang et al., 2009, Guzmán-Verri et al., 2002; Manterola et al., 2007). En un análisis proteómico de fragmentos de membrana externa liberados espontáneamente por las mutantes en el TCS BvrR/BvrS en comparación con la cepa parental, se identificaron 60 proteínas de espacio periplásmico y 25 OMP diferencialmente expresadas, entre ellas cinco de la familia Omp 3, cuya expresión estaba disminuida (Lamontagne et al., 2007). Esta observación, también fue 16 respaldada por un estudio de transcriptómica que analizó la expresión génica en las mutantes por transposición, en comparación con la cepa parental, encontrando una expresión diferencial de 127 genes, entre ellos genes involucrados en la biogénesis de la envoltura celular y la membrana externa como omp25a y omp25d, lipoproteínas, biosíntesis de LPS y ácidos grasos, proteínas de respuesta al estrés, chaperonas y genes flagelares (Viadas et al., 2010). Además, se evidenció la expresión diferencial de genes que codifican transportadores ABC, genes relacionados con virulencia, metabolismo del carbono (como pckA) y desnitrificación, así como genes que codifican otros reguladores transcripcionales como VjbR, ExoR y OmpR (Viadas et al., 2010; figura 4). Con base en los estudios de proteómica y transcriptómica de Lamontagne et al. (2007) y Viadas et al. (2010), respectivamente, se propone que el TCS BvrR/BvrS permite a la bacteria ajustar su envoltura celular y su metabolismo para adaptarse a los cambios ambientales que ocurren durante el tránsito intracelular y sugieren que la virulencia de Brucella no se puede atribuir a moléculas individuales, sino que debe ser entendida como un fenómeno multifactorial en el cual participan de forma coordinada muchos elementos discretos (Lamontagne et al., 2007; Viadas et al., 2010). Como se indicó, el TCS BvrR/BvrS ejerce un control transcripcional sobre la expresión del operón virB (Martínez-Núñez et al., 2010). El TCS BvrR/BvrS también afecta positivamente la transcripción de un regulador transcripcional de tipo QS similar a LuxR denominado VjbR (“Vacuolar Jacking Brucella Regulator”) (Martínez- Núñez et al., 2010). Estudios previos han demostrado que, al ingresar a las células hospederas, la proteína reguladora BvrR se activa por fosforilación (BvrR-P) en el aspartato 58. Esta activación ocurre en respuesta a señales intracelulares encontradas en compartimentos tempranos, como pH ácido y escasez de nutrientes. La fosforilación de BvrR conlleva a un aumento en la expresión de VjbR y VirB. Se ha observado que la transcripción del operón virB inicia cuando la BCV se acidifica. A las 5 h post infección alcanza una expresión máxima pero luego la transcripción es rápidamente reprimida (Sieira et al. 2004). La activación in vitro del circuito de virulencia BvrR-P/VjbR/VirB rescata a B. abortus de la inhibición de la replicación intracelular inducida por el tratamiento de las células con bafilomicina, 17 demostrando la relevancia de este mecanismo para la supervivencia y replicación bacteriana intracelular. Se propone que B. abortus percibe la transición del entorno extracelular al intracelular a través del TCS BvrR/BvrS, permitiendo que la bacteria transite de forma segura hacia su nicho replicativo. Este circuito se activa al inicio de la infección (0-6 h post-infección) para permitir el tránsito intracelular de la eBCV hacia la rBCV, así como también al final de la infección (48 h post-infección) para propiciar la salida de la célula hospedera y el comienzo de un nuevo ciclo infeccioso (Altamirano-Silva et al., 2018). Figura 4. Funcionamiento del TCS BvrR/BvrS (Adaptado de Lamontagne et al., 2007; Viadas et al., 2010; Altamirano-Silva et al., 2018). El modelo ilustra la coordinación intracelular realizada por B. abortus al durante la infección bacteriana. Una vez que la bacteria ingresa a la célula hospedera, BvrS detecta señales del ambiente intracelular como pH ácido y escasez de nutrientes, lo que desencadena su autofosforilación. Posteriormente, el grupo fosfato es transferido a BvrR, posibilitando la unión a los promotores de sus genes blancos, entre omp25 y otras OMPs, lipoproteínas, genes para la acilación del lípido A del LPS, transportadores ABC, el sistema de fosfotransferencia (PTS), genes implicados en el metabolismo 18 del carbono y el nitrógeno, proteínas de estrés y chaperonas, vjbr y otros reguladores transcripcionales, así como el operón virB. El T4SS VirB secreta efectores que le permiten a la bacteria transitar dentro de la célula hospedera hasta alcanzar su nicho replicativo derivado del RE. Los mutantes en vjbR presentan un fenotipo atenuado en cultivos celulares (macrófagos y células HeLa) y en ratones infectados experimentalmente (Delrue, et al., 2005). Además, presentan cambios en la superficie celular (Uzureau et al., 2007). En B. melitensis, Vjbr regula la expresión de algunas OMP implicadas en la virulencia (Uzureau et al., 2010; de Jong et al., 2008), incluyendo Omp25 (Roop et al., 2021). En B. abortus, VjbR activa directamente la transcripción del T4SS VirB mediante unión al promotor del operón virB y a la región intergénica entre virB1 y virB2. También activa la transcripción de vceA y vceB que codifican para dos efectores del T4SS VirB (de Jong et al., 2008). Por último, está implicado en la regulación de genes flagelares (Léonard et al., 2007) y del gen que codifica la adhesina autotransportadora BtaE (Kleinman et al., 2017). Sin embargo, el impacto que tiene la unión de la molécula señal (homoserín lactona) en la actividad reguladora de VjbR es contrario a lo que se observa en los reguladores de QS clásicos, por lo que se ha postulado que VjbR y su molécula señal conforman un circuito regulador que permite a las brucelas intracelulares percibir las limitaciones espaciales de las BCVs para regular sus genes blanco de manera temporal (Roop et al., 2021). Además, se ha constatado que la actividad reguladora de VjbR en algunos promotores depende de otros factores de transcripción, que en algunos casos aún no han sido identificados (Kleinman et al., 2017). Como se mencionó, la expresión de genes flagelares en Brucella está controlada por el regulador de QS VjbR. Sin embargo, se cree que el efecto de VjbR en estos genes flagelares está mediado por el regulador de respuesta FtcR, ya que la expresión del gen ftcR está parcialmente bajo el control de VjbR y la inactivación de ftcR ocasiona una disminución en la expresión de los genes fliF, flgE y fliC. Estos genes codifican respectivamente el anillo MS, el gancho y el monómero del filamento flagelar en Brucella. Consecuentemente, la inactivación de ftcR también reduce la virulencia de Brucella. FtcR está codificado en el primer locus flagelar de 19 B. melitensis. Tanto la secuencia de ftcR como su contexto genómico están conservados en Alphaproteobacteria (Léonard et al., 2007). Además de VjbR, en Brucella se ha reportado otro regulador de QS, denominado BlxR (“Brucella LuxR-like regulator”), el cual también es conocido como BabR (Rambow-Larsen et al., 2008). VjbR activa la transcripción de blxR y por el contrario BlxR reprime la expresión de vjbR. Además, existen 27 genes blanco que son regulados por ambos mecanismos de QS. Para el 55% de ellos, los dos reguladores actúan de forma opuesta. Según la etapa de la infección, pareciera existir una interregulación entre Vjbr y BlxR (Rambow-Larsen et al., 2008; Uzureau et al., 2010). Se cree que VjbR actúa al inicio de la infección, posibilitando la adaptación temprana a las condiciones de estrés que predominan en la eBCV, disminuyendo el metabolismo básico para evitar la replicación bacteriana mientras la vacuola madura, y promoviendo el ensamblaje del T4SS, que es importante para alcanzar el nicho replicativo. BlxR, por su parte, actúa en etapas posteriores de la infección para reactivar el metabolismo y permitir la replicación (Uzureau et al., 2010). También regula la expresión de genes flagelares (Roop et al., 2021). Sin embargo, los mutantes en babR no presentan atenuación en modelos experimentales, por lo que, aún no está claro el papel de BabR en la virulencia de Brucella spp. (Roop et al., 2021). En la regulación del operón virB también participan otros factores de transcripción como IHF (“Integration Host Factor”), HutC (“Histidine Utilization pathway”) y MdrA (“MarR-like sodium deoxicholate-responsive activator”). Los dos primeros se unen al promotor del operón virB, aumentando su expresión (Arocena et al., 2010; Sieira et al., 2010). Sieira et al. (2012) mencionan que IHF es una proteína asociada al nucleoide y HutC es un regulador de la familia GntR que relaciona la expresión del operón virB con el catabolismo de histidina. Por otro lado, MdrA es un regulador de la familia de factores de transcripción MarR, que regula genes de virulencia, genes implicados en el catabolismo de compuestos aromáticos y genes de respuesta a estrés (Wilkinson & Grove, 2006). MdrA se une a dos sitios diferentes en el promotor del operón virB y regula su expresión de acuerdo con la fase de crecimiento. La función de MdrA es redundante a la de HutC. Además, 20 compite con IHF y HutC por la unión al promotor del operón virB. Como es común en la familia de reguladores MarR, la presencia de un ligando disocia al regulador de su sitio de unión. En el caso de MdrA el ligando identificado es el deoxicolato de sodio, lo que indica que in vivo MdrA podría responder a señales ambientales (Sieira et al., 2012). Por otra parte, MucR es un regulador global de tipo de dedos de zinc que actúa principalmente como represor de la transcripción (Roop et al., 2021). En B. abortus 2308, los mutantes en mucR son atenuados y se ha demostrado que MucR regula genes implicados en el establecimiento y mantenimiento de la integridad de la envoltura celular, la biosíntesis de polisacáridos, la homeostasis del hierro, la plasticidad del genoma y la regulación de la transcripción (Caswell et al., 2013). Algunos de sus genes blanco específicos son el operón virB, omp25, babR y genes flagelares. Una de las funciones principales de MucR es trabajar en conjunto con activadores de la transcripción antagonistas para garantizar la adecuada expresión temporal de estos genes durante la infección. Los homólogos de MucR en Agrobacterium tumefaciens y S. meliloti ejercen funciones similares (Roop et al., 2021). En Caulobacter, MucR colabora con el regulador transcripcional CtrA para regular el ciclo celular (Fumeaux et al., 2014), y dado que los genes del ciclo celular son conservados en Alphaproteobacteria, es probable que MucR desempeñe la misma función en Brucella. El regulador transcripcional CtrA es un regulador maestro del ciclo celular en Brucella (De Bolle et al., 2015). CtrA controla la expresión de genes involucrados en la replicación del ADN, la segregación cromosómica y la división celular (Francis et al., 2017). La adecuada coordinación de la expresión de estos genes es importante para mantener la persistencia intracelular de estas bacterias en las células de mamíferos (De Bolle et al., 2015). CtrA también controla la expresión de omp25 y genes involucrados en la biosíntesis de LPS, lo que también se relaciona con la virulencia de Brucella (Francis et al., 2017). Por último, las pequeñas moléculas de ARN con función reguladora (sRNA) desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica a nivel post transcripcional. Los sRNA llevan a cabo sus funciones reguladoras al unirse a 21 los transcritos de ARNm de sus genes blanco, lo que puede ya sea bloquear o aumentar su traducción (Roop et al., 2021). Los primeros sRNA identificados y caracterizados en Brucella fueron AbcR1 de 110 nucleótidos y AbcR2 de 116 nucleótidos (Caswell et al., 2012b; Sheehan & Caswell,2017). Ambos desempeñan funciones redundantes en el control de la expresión de genes que codifican transportadores ABC involucrados en el transporte de aminoácidos y poliaminas y genes relacionados con la interacción con el hospedero. Además, una cepa de B. abortus con una doble deleción en AbcR1 y AbcR2 es atenuada. Otros miembros del orden Rhizobiales también presentan ortólogos de AbcR1 y AbcR2 con funciones similares (Sheehan & Caswell, 2018). ● Regiones promotoras caracterizadas en Brucella En Brucella, la región promotora mejor caracterizada es la del operón virB, dada su relevancia para la virulencia. La transcripción comienza a 27 pb corriente arriba del gen virB1. La secuencia reguladora se extiende a lo largo de 430 pb corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Durante el crecimiento vegetativo, la región de ADN que abarca desde la posición -130 hasta +1 es suficiente para activar la transcripción, mientras que la región que abarca desde la posición -430 hasta -353 está involucrada en una regulación negativa (Sieira et al., 2004). Como se comentó, la expresión de este gen está bajo un control muy estricto, en el que ocurren tanto eventos de activación como de represión coordinados de forma temporal según la etapa de la infección. En este control participan varios factores de virulencia que responden a diferentes tipos de señales y condiciones, incluyendo: IHF, HutC, BvrR, VjbR, BabR, MdrA (Sieira et al., 2013) y el represor MucR. Éste último se une en regiones ricas en AT, aunque con baja afinidad (Borriello et al., 2020). Por otra parte, en B. abortus, la región promotora del gen btaE presenta sitios de unión para los reguladores IHF, HutC y MdrA. El sitio de inicio de la transcripción de btaE se ubica a 40 pb corriente arriba del codón de inicio. Sin embargo, cabe mencionar que el promotor de btaE presenta una alta variabilidad entre las diferentes especies y cepas de Brucella, lo que podría tener relación con eventos de especiación (Sieira et al., 2017). Finalmente, el promotor babR en B. abortus presenta regiones ricas en AT y tiene sitios de unión para la 22 chaperona de sRNA denominada Hfq (Caswell et al., 2012a) y MucR (Borriello et al., 2020). El sitio de inicio de la transcripción de babR se encuentra a 119 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio. 23 CAPÍTULO II: OBJETIVOS Y HIPÓTESIS ● Objetivo general: Establecer un modelo con base experimental que describa cómo el TCS BvrR/BvrS regula la expresión de genes implicados en la virulencia de B. abortus. ● Objetivos específicos: 1. Identificar regiones promotoras en el genoma de B. abortus que se encuentran directamente reguladas por el TCS BvrR/BvrS. 2. Describir la relación del TCS BvrR/BvrS con otros sistemas de regulación de la expresión génica. 3. Caracterizar la región promotora que codifica para la proteína Omp25 como región prototipo regulada por TCS BvrR/BvrS. 4. Establecer si hay diferencias fenotípicas entre una cepa mutante de B. abortus con la deleción en los genes bvrR/bvrS y dos cepas mutantes generadas previamente por la inserción de un transposón en cada gen por separado. ● Hipótesis: El TCS BvrR/BvR regula de forma directa la expresión de un conjunto de genes relevantes para la vida intracelular de B. abortus, lo cual tiene relación con la virulencia de este patógeno. 24 CAPÍTULO III: METODOLOGÍA ● Lista de cepas y plásmidos: Las cepas y plásmidos utilizadas en esta Tesis se detallan en el cuadro 2. Cuadro 2. Lista de cepas y plásmidos utilizadas en esta Tesis. Cepas bacterianas / Plásmidos Fenotipo / Características Fuente / Referencia B. abortus 2308W Cepa parental, LPS liso, NalR, virulenta Suárez-Esquivel et al., 2016 B. abortus 3aZ Derivada de 2308W, portadora de la fusión transcripcional cromosomal Pomp25::lacZ, GmR, AmpR Guzmán-Verri et al., 2002 B. abortus B392 Derivada de 2308W, portadora del p392, KmR Castillo-Zeledón, 2010 B. abortus B262 Derivada de 2308W, portadora del p262, KmR Castillo-Zeledón, 2010 B. abortus B151 Derivada de 2308W, portadora del p151, KmR Castillo-Zeledón, 2010 B. abortus BpMR15 Derivada de 2308W, portadora del pMR15, KmR Castillo-Zeledón, 2010 B. abortus bvrR::Tn5 Derivada de 2308, bvrR::Tn5, LPS liso, KmR, atenuada Sola-Landa et al., 1998 B. abortus bvrS::Tn5 Derivada de 2308, bvrS::Tn5, LPS liso, KmR, atenuada Sola-Landa et al., 1998 B. abortus ΔbvrRS Derivada de 2308W, ΔbvrRS, LPS liso, atenuada Este estudio Escherichia coli XL1Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 Δ(lac- Sambrook, 1989 25 proAB) [F´ proAB lacIqZΔM15]. TN10(Tet´) E. coli E392 Derivada de XL1Blue, portadora del p392, KmR Castillo-Zeledón, 2010 E. coli E262 Derivada de XL1Blue, portadora del p262, KmR Castillo-Zeledón, 2010 E. coli E151 Derivada de XL1Blue, portadora del p151, KmR Castillo-Zeledón, 2010 pMR15 Vector de alto número de copias, gen lacZ sin promotor, KmR Gober & Shapiro, 1992, Cortesía de M. Roop. p392 Derivado de pMR15, con un fragmento clonado de 521 pb correspondientes a 392 pb de la región corriente arriba de omp25 y las primeras 127 pb de la secuencia codificante, KmR Castillo-Zeledón, 2010 p262 Derivado de pMR15, con un fragmento clonado de 391 pb correspondientes a 262 pb de la región corriente arriba de omp25 y las primeras 127 pb de la secuencia codificante, KmR Castillo-Zeledón, 2010 p151 Derivado de pMR15, con un fragmento clonado de 280 pb correspondientes a 151 pb de la región corriente arriba de omp25 y las primeras 127 pb Castillo-Zeledón, 2010 26 de la secuencia codificante, KmR pNTPS138 Vector suicida, oriT, sacB KmR M.R.K. Alley, sin publicar pΔbvrRS Derivado de pNTPS138, ΔbvrRS, KmR Cortesía de Clayton C. Caswell NalR= resistente a ácido nalidíxico, GmR= resistente a gentamicina, AmpR= resistente a ampicillina, KmR= resistente a kanamicina. ● Condiciones de crecimiento: Todos los procedimientos con cultivos de B. abortus se llevaron a cabo de acuerdo con el "Reglamento de Bioseguridad de la CCSS 39975–0", 2012, según el "Decreto Ejecutivo #30965-S", 2002 y el protocolo de investigación SIA 0652–19 aprobado por la Universidad Nacional de Costa Rica. Los medios de cultivo utilizados en esta Tesis fueron los siguientes: Caldo Tripticasa y Soya a pH 7.2 (CTS), Agar Tripticasa y Soya (ATS), medio limitado en nutrientes (33 mM KH2PO4, 60.3 mM K2HPO4, 0.1% de extracto de levadura) a un pH de 5.5 ajustado con ácido cítrico, Caldo Luria Bertani (LB) (Sambrook, 1989), S.O.C. (2% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2.5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4 y 20 mM de glucosa) y Agar Columbia suplementado con 5% (v/v) de sangre de oveja. Cuando fue necesario, se agregaron los siguientes suplementos a los diferentes medios de cultivo: 10% (p/v) de sacarosa (Suc), 30 µg/mL de kanamicina (Km), 20 μg/mL de gentamicina (Gm), 100 μg/mL de ampicilina (Amp), 100 µg/mL de espectinomicina (Spc) y 30 µg/mL de cloranfenicol (Cm). Los cultivos bacterianos se incubaron a 37°C, agitándose constantemente a 200 rpm cuando fue necesario (Suárez-Esquivel et al., 2016). Para las curvas de crecimiento, se prepararon inóculos de 7 x 109 UFC en un volumen final de 20 ml de CTS. Las densidades ópticas se midieron a 420 nm cada 2 a 4 h. ● Extracción de ARN, RT-PCR y análisis de conservación del operón bvrR/bvrS: 27 Para el análisis de co-transcripción de los genes corriente abajo de bvrR, se realizó una extracción de ARN total y una RT-PCR según lo descrito previamente (Martínez-Núñez et al., 2010), a partir de cultivos de B. abortus 2308W crecidos en CTS hasta las fases de crecimiento logarítmico y estacionario. En el anexo 1 se detallan los cebadores utilizados para este propósito. Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa siguiendo procedimientos estándar (Sambrook, 1989). Los amplicones obtenidos se secuenciaron utilizando el kit “Big Dye Terminator 3.1” (Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de conservación de los ortólogos del operón bvrR/bvrS en representantes de Alphaproteobacteria se realizó utilizando BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990). Se utilizó el genoma de B. suis 1330 como referencia para esta comparación, ya que ha sido resecuenciado y es uno de los genomas de Brucella de mayor tamaño. Se utilizó Artemis (Rutherford et al., 2000) y la Herramienta de Comparación Artemis para visualizar los resultados (Carver et al., 2005). Los genes 16S rRNA se utilizaron para la reconstrucción filogenética molecular mediante el método de Máxima Verosimilitud basado en el modelo Tamura-Nei (Tamura & Nei, 1993), para inferir la historia evolutiva de los genomas seleccionados de Alphaproteobacteria. El árbol de consenso de bootstrap inferido a partir de 500 réplicas (Felsenstein, 1985) se tomó para representar la historia evolutiva de los taxones analizados. El análisis involucró 17 secuencias nucleotídicas (Anexo 2). Se eliminaron todas las posiciones que contenían gaps y datos faltantes. Hubo un total de 1191 posiciones en el conjunto de datos final. De acuerdo con informes anteriores (Williams et al., 2007), se introdujo en el análisis un grupo externo conformado por Escherichia coli, Ralstonia solanacearum y Geobacter sulfurreducens; sin embargo, se recortó del árbol para mejorar la resolución visual. Los análisis evolutivos se llevaron a cabo en MEGA7 (Kumar et al., 2016). El operón bvrR/bvrS se examinó a través del alineamiento bwa (Li et al., 2009) y el mapeo SMALT v.0.5.8 (http://www.sanger.ac.uk/resources/software/smalt/) en 126 genomas de B. abortus para evaluar la presencia y el nivel de identidad de los genes incluidos en la región, http://www.sanger.ac.uk/resources/software/smalt/ 28 utilizando como referencia una región inferida de B. suis 1330. Además, se registró manualmente el número de SNPs, inserciones y deleciones en cada uno de los genes. ● Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq): El ensayo de ChIP-Seq se llevó a cabo como se describió anteriormente (Francis et al., 2017) con las siguientes modificaciones. La cepa B. abortus 2308W y su cepa derivada con una mutación por transposición en bvrR (control negativo) se cultivaron hasta la mitad de la fase de logarítmica en CTS. Los cultivos crecidos de cada cepa se dividieron en dos partes iguales. Una parte se incubó durante cinco minutos en un medio limitado en nutrientes a un pH de 5.5 ajustado con ácido cítrico. Estas son condiciones de estrés descritas previamente para inducir la fosforilación de BvrR (Altamirano-Silva et al., 2018). La otra parte de las cepas cultivadas se incubó en CTS fresco durante 5 minutos como una condición de control adicional en la que se esperaba que la fosforilación de BvrR ocurriera solo de manera transitoria (condiciones ricas) (Altamirano-Silva et al., 2018). El entrecruzamiento proteína-ADN se realizó según lo descrito anteriormente (Francis et al., 2017) y se detuvo agregando glicina hasta una concentración final de 125 mM, de acuerdo con lo reportado para otro regulador de Brucella (Kleinman et al., 2017). Después de agregar un tampón de lisis con lisozima (10 mg/ml), las bacterias se lisaron en el Disruptor Celular Genie Scientific Industries, a 2800 rpm durante 1 h a 4°C, seguido de una incubación de 16 h con buffer ChIP a 37°C. El lisado se sonicó en hielo en el Disruptor Celular Digital Branson Sonifier S-450D 400W, aplicando 25 pulsos de 30 segundos al 30% de amplitud y 30 segundos de pausa. Se utilizó un anticuerpo de conejo policlonal anti-BvrR (Martínez-Núñez et al., 2010) y cuentas magnéticas recubiertas con proteína A para la inmunoprecipitación. El ADN se extrajo utilizando un protocolo estándar de precipitación con isopropanol (Sambrook, 1989). La construcción de bibliotecas y la secuenciación por Illumina HiSeq 2500 HT se realizaron en el Core de Genómica de Leuven, Bélgica. El sistema Bluepippin (Sage Science) se utilizó para seleccionar fragmentos de ADN de aproximadamente 220 pb que se secuenciaron en modo pareado. Los resultados de secuenciación se analizaron utilizando herramientas de bioinformática disponibles en la plataforma 29 del Proyecto Galaxy (https://usegalaxy.org/) (Afgan et al., 2016). El promedio y la varianza de lecturas por nucleótido se calcularon en R Studio (http://www.rstudio.com) para establecer un valor de Z medido en términos de desviaciones estándar de la media, según lo descrito por otros autores (Francis et al., 2017; Poncin et al., 2019). Para cada condición probada, las señales de ChIP- Seq consideradas significativas fueron aquellas que cumplían con todos los siguientes criterios de selección: 1-Tener un recuento de lecturas por nucleótido por encima del umbral (Z ≥ 3), 2-Estar ausente en el control negativo, y 3-Tener una longitud mínima de siete nucleótidos consecutivos. La visualización interactiva de las señales de ChIP-Seq para la condición de estrés se construyó utilizando la Biblioteca de Visualización Bokeh (http://www.bokeh.pydata.org) y un código Python personalizado. Se utilizó el buscador genómico Artemis (Rutherford et al., 2000) para buscar los genes más cercanos que rodean las señales significativas de ChIP- Seq. Para las señales significativas de ChIP-Seq ubicadas cerca del inicio de dos genes divergentes, ambos genes se consideraron como posibles genes blanco de BvrR. Para las señales significativas de ChIP-Seq ubicadas dentro de secuencias codificantes, se consideraron los genes correspondientes y sus genes adyacentes corriente abajo como posibles genes diana de BvrR. La anotación de funciones de todos los genes diana potenciales de BvrR identificados por ChIP-seq fue curada manualmente utilizando la nomenclatura COG y comparando entre las condiciones. Los genes blanco potenciales encontrados bajo condiciones de estrés se utilizaron como entrada para realizar un análisis exhaustivo de las vías metabólicas con BioCyc (Karp et al., 2017; Caspi et al., 2016) y curación manual. Las secuencias de ADN de las señales significativas de ChIP-Seq se extrajeron de Artemis y se utilizaron como entrada para el descubrimiento de motivos con GLAM2 (Frith et al., 2008) para deducir una secuencia de consenso reconocida por BvrR (Bailey et al., 2009). ● Ensayo de Movilidad Electroforética (EMSA): La proteína recombinante BvrR se purificó y se fosforiló in vitro con carbamoil fosfato según lo descrito previamente (Martínez-Núñez et al., 2010; Altamirano-Silva et al., 2018). La interacción directa entre BvrR fosforilada (BvrR-P) y las regiones de https://usegalaxy.org/ http://www.rstudio.com/ http://www.bokeh.pydata.org/ 30 ADN de interés se analizó por EMSA, según lo reportado anteriormente (Altamirano- Silva et al., 2018). Las sondas de ADN se prepararon mediante amplificación por PCR o por síntesis química de oligonucleótidos (Invitrogen, USA) como se explicará más adelante. El marcaje de las sondas se realizó con el kit “DIG Gel Shift kit 2nd generation kit” (Roche®). Las sondas marcadas se incubaron con concentraciones crecientes de BvrR-P, siguiendo el protocolo descrito “DIG Gel Shift kit 2nd generation kit” (Roche®). Dependiendo del tamaño de la sonda de ADN, las mezclas de ADN-proteína se separaron mediante electroforesis nativa en gel de poliacrilamida durante 1 h (40 pb), 1.5 h (200 pb) o 2.5 h (>200 pb), a 150V y 4°C. Los geles fueron transferidos a membranas de nylon con carga positiva y los resultados se visualizaron mediante un inmunoensayo enzimático utilizando el kit “DIG Gel Shift kit 2nd generation kit” (Roche®). Las señales quimioluminiscentes obtenidas se registraron en una película de rayos X. En el estudio del regulón de BvrR, se seleccionaron los siguientes genes blanco: tamA (BAW_10045), pckA (BAW_12005), bvrR (BAW_12006), omp25 (BAW_10696) y virB1 (BAW_20068), los cuales se amplificaron por PCR utilizando respectivamente los pares de cebadores bruAb1.0048.3 y bruAb1.0048.3, 3- 200pck3 y 3-200pck3, 3-200bvrR3 y 3-200bvrR5, omp25 For y omp25 Rev y pvirdownI y pvu229 (Anexo 1). La sonda tamA se desnaturalizó durante 10 minutos a 95 °C antes de cada ensayo. Como controles negativos, se incluyeron regiones del gen ribosomal rplL (BAW_11206) y del gen dhbR (BAW_21104), las cuales se amplificaron por PCR utilizando respectivamente los pares cebadores L12.F y L12.R y dhbprom3 y dhbprom5 (Anexo 1). Para los EMSAs competitivos, las sondas que mostraron una interacción positiva con BvrR-P en los EMSAs directos se marcaron y se incubaron con BvrR-P (0,6 µM) y un exceso de misma sonda sin marcar (competidor), o por separado, con un exceso de la sonda usada como control negativo sin marcar. En el análisis del motivo de unión de ADN, se diseñaron y sintetizaron químicamente diez oligonucleótidos de ≈40 pb que cubrían una región de 226 pb del promotor de virB1 que se sabía que se unía directamente a BvrR (Martínez- 31 Núñez et al., 2010), con la particularidad de que cada oligonucleótido presentó un traslape de ≈20 pb con el siguiente (Anexo 1). Para la caracterización de la región promotora de omp25, las sondas se obtuvieron mediante PCR utilizando los siguientes pares de cebadores: omp25.262 y omp25.152 o omp25.262 y omp25.122 (Anexo 1). Como control negativo, se utilizó el gen ribosomal rpIL (Anexo 1) Además, se hizo un EMSA competitivo utilizando como sonda la región corriente arriba del gen omp25, amplificada por PCR con los cebadores omp25 For y omp25 For (Anexo 1). Además se diseñaron y sintetizaron químicamente oligonucleóticos que abarcaban esa región (Anexo 1). Estos oligonucleótidos se usaron inicialmente como competidores sin marcar. Posteriormente, los que compitieron se marcaron y se usaron como sondas en un EMSA directo contra BvrR-P. ● Mapeo de los sitios de inicio de transcripción: Se extrajo ARN total de B. abortus 2308W como se describió anteriormente (Martínez-Núñez et al., 2010) y se sometió a análisis de extensión de cebador de acuerdo con un protocolo descrito (Lloyd et al., 2005). En el Anexo 1 los cebadores utilizados para este fin. ● Ensayos de huella de ADNasa I: En el estudio del regulón de BvrR, el mismo amplicón de 226 pb analizado por EMSA se amplificó utilizando el cebador pvirdownI marcado con 6- carboxifluoresceína en el extremo 5´ (5´-FAM) (Anexo 1), bajo las condiciones descritas previamente (Sieira et al., 2004). En la caracterización de la región promotora del gen omp25, la misma región de 193 pb utilizada en el EMSA competitivo se marcó con hexaclorofluoresceína (HEX) o 5´-FAM (Anexo 1). Los fragmentos marcados se purificaron del gel con el kit “Qiaquick PCR purification kit” (Qiagen) y se mezclaron con BvrR-P como se describió anteriormente para EMSA. Posteriormente se realizó una digestión con ADNasa I y se secuenciaron según lo descrito previamente (Zianni et al., 2006). Las bases protegidas de la digestión se identificaron utilizando el software Peak Scanner de 32 Applied Biosystems al sobreponer los electroferogramas de los fragmentos de ADN digeridos y no digeridos. ● Construcción de fusiones transcripcionales y ensayos de actividad de β-galactosidasa: Los cebadores utilizados en este estudio se detallan en el Anexo 1. Se amplificó un fragmento de ADN del genoma de B. abortus 2308W (Número de Acceso en GenBank ERS568782), que abarcaba la región omp25 desde -392 hasta +127 y dos fragmentos más pequeños desde -262 hasta +127 y desde -151 hasta +127, mediante PCR, y se purificó con el kit “QIAquick® Gel Extraction Kit” (Qiagen). Los amplicones y el vector pMR15 (Cuadro 3) se escidieron por separado con BamHI (10U/μl) y XbaI (10U/μl) (Thermo Fisher Scientific, USA) durante 18 h a 37⁰C. Las enzimas de restricción se inactivaron a 80⁰C durante 20 minutos. Los fragmentos de ADN se ligaron con el vector pMR15 utilizando la ligasa de ADN T4 (5U/μl) (Thermo Fisher Scientific, USA) a temperatura ambiente durante 16 h, para obtener los plásmidos p392, p262 y p151 (Cuadro 2). Luego, los plásmidos se electroporaron en la cepa de E. coli XL1-Blue para generar las cepas E392, E262 y E151 (Cuadro 2) utilizando el Manipulador de Células Electro ECM 630 BTX®. Las colonias con los nuevos plásmidos se seleccionaron utilizando kanamicina y se examinaron con los cebadores omp25lacZF y omp25lacZR (Anexo 1). Se aisló el ADN plasmídico y se electroporó en B. abortus 2308W utilizando el Manipulador de Células Electro ECM 630 BTX® para obtener las cepas B392, B262 y B151 (Cuadro 2). El vector pMR15 también se electroporó en B. abortus como control de actividad no promotora (cepa BpMR15, Cuadro 3). Los ensayos de β-galactosidasa se realizaron con modificaciones a lo descrito previamente (Guzmán-Verri et al., 2002). Las bacterias se cultivaron hasta la fase exponencial, se permeabilizaron con 0.5% de SDS y 6% de cloroformo durante 10 minutos a 28⁰C, y se incubaron con ONPG (O-Nitrofenil-β-D-galactopiranósido) durante 10 minutos a 28⁰C. La reacción se detuvo con carbonato de sodio 1M, se midió la absorbancia a 420 nm y la actividad específica se expresó como nmol de O-nitrofenol producido/min × mg de proteína (Unidades Miller). La actividad de β-galactosidasa reportada se corrigió con base en la actividad residual obtenida de la cepa con el vector vacío BpMR15. Se utilizó 33 una cepa de B. abortus con una fusión cromosómica lacZ:omp25 previamente construida (3aZ) como control positivo de la actividad del promotor (Guzmán-Verri et al., 2002, Cuadro 2). Se realizó un análisis estadístico de una vía ANOVA seguido de una prueba de comparaciones múltiples de Turkey utilizando GraphPad Prism versión 8.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). ● Anisotropía de fluorescencia Los ensayos de anisotropía de fluorescencia se realizaron según lo reportado por otros autores (Owen y McMurray, 2009) con algunas modificaciones. La proteína recombinante BvrR según lo descrito para los EMSA y diluida en serie en buffer de unión (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, 0.1 M de NaCl). El oligonucleótido (173.133omp25-O, Anexo 1)) se marcó en el extremo 5' con FAM y se mezcló con su respectivo oligonucleótido complementario sin marcar (173.133omp25-ORC, Anexo 1) a una concentración final de 50 mM. Los oligonucleótidos Oligo rplL-O (marcado con FAM en el extremo 5') y el oligo complementario Oligo rplL-ORC (Anexo 1) se utilizaron como control negativo a una concentración final de 50 mM. También se prepararon muestras en blanco sin proteína para estimar la fluorescencia de fondo. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 37 °C en un lector de microplacas CytationTM 3 (Biotek, Instruments). La anisotropía de fluorescencia se midió con los filtros polarizados adecuados y los resultados se representaron gráficamente siguiendo un modelo de unión específica de un sitio (Favicchio et al., 2009) y utilizando GraphPad Prism (Hulme y Trevethick, 2010). ● Docking Molecular Las interacciones entre BvrR y sus tres sitios de unión se exploraron mediante docking molecular utilizando el servidor HDOCK (parámetros por defecto) (Yan et al., 2017). La secuencia Fasta de BvrR (UniProt: Q2YQY4) se utilizó como molécula receptora de entrada, y las siguientes secuencias: caja 1 (TTGTGTAAGGAGAATGCCAT), caja 2 (GATATGTCACCCCTGTCAGCGCGG), caja 3 (CTCGACAGATTATCTCCACACAATGGGGCA) se utilizaron como moléculas ligandos de entrada. Antes del acoplamiento libre, el software seleccionó la estructura cristalina del regulador de respuesta similar a OmpR, KdpE (RCSB PDB: 4KFC), de E. coli, como plantilla de modelado para la estructura de BvrR 34 (Seq_ID % = 29.4). Para garantizar la confiabilidad del modelo generado por HDOCK, se analizó su calidad utilizando el parámetro QMEANDisCo (Studer et al., 2020) y trazados de Ramachandran. El modelo se comparó con los generados por SWISS-MODEL (Waterhouse et al., 2018), I-TASSER (Yang et al., 2015) y AlphaFOLD (Jumper et al., 2021; Varadi et al., 2021). Las estructuras cristalinas de las siguientes proteínas con dominios de unión al ADN se utilizaron como controles positivos para los experimentos de acoplamiento: una proteína de unión al ADN de B. abortus (RCSB PDB: 4QPJ) y la proteína KdpE de E. coli. Como controles negativos, se utilizaron las estructuras cristalinas de las siguientes proteínas que carecen de dominios de unión al ADN: una hidrolasa de B. suis 1330 (RCSB PDB: 6NQ4) y un inhibidor de la hidrolasa de peptidoglicano de B. abortus (RCSB PDB: 7DPY). Para la interpretación, se consideraron puntuaciones de acoplamiento inferiores a -200 y puntuaciones de confianza superiores a 0.7 como un buen rendimiento y una alta probabilidad de unión entre las moléculas analizadas respectivamente. La herramienta NUCPLOT (Luscombe et al., 1997) se utilizó para analizar y visualizar un esquema de color de interacción en 2D de los resultados de HDOCK. ● Construcción de la cepa B. abortus ΔbvrRS Los genes bvrR (BAW_12006) y bvrS (BAW_12007) de la cepa parental B. abortus 2308W se mutaron utilizando una estrategia de eliminación de genes no polar sin marca previamente descrita (Caswell et al., 2012a; 2012b) con modificaciones. Se amplificó un fragmento corriente arriba (Up) de bvrR de aproximadamente 1 kb al segundo codón de la secuencia de codificación de bvrR (coordenadas 2010312 a 2011285) con los cebadores bvrRS-Up-For y bvrRS-Up- Rev (Anexo 1). Se amplió un fragmento corriente abajo (Dn) de bvrS que contenía los dos últimos codones de la región codificante de bvrS y aproximadamente 1 kb corriente abajo (coordenadas 2013910 a 2014911) con los cebadores bvrRS-Dn- For y bvrRS-Dn-Rev (Anexo 1). El fragmento Up se cortó con BamHI (Thermo Fisher Scientific, USA) y el fragmento Dn se cortó con PstI (Thermo Fisher Scientific, USA). Ambos fragmentos se trataron con polinucleótido kinasa en un buffer de ligasa y se incluyeron en una mezcla de ligación única con el pNPTS138 (Cuadro 2) digerido 35 con BamHI/PstI. Este es un vector suicida que expresa resistencia a kanamicina (Km) y el gen sacB para la contraselección con sacarosa (Suc). El plásmido resultante se llamó pΔbvrRS (Cuadro 2) y carecía de una región de 2623 pb ubicada entre los fragmentos Up y Dn en el genoma de la cepa parental y que correspondía a la mayoría de las secuencias codificantes de bvrR y bvrS (coordenadas 2011286 a 2013909). Se electroporaron 1-3 μl de pΔbvrRS (resuspendido en agua destilada) en 40 μl de células competentes de B. abortus 2308W preparadas según lo descrito por otros autores (Caswell et al., 2012a; 2012b). La electroporación se realizó en un electroportador de células BTXTM con los siguientes parámetros: 2.5 kV a 400 ohmios y 50 mF. Después de la electroporación, se agregó 1 ml de medio SOC y las células se incubaron durante toda la noche. Luego, se inocularon volúmenes de 100-200 μl en ACS + Km para seleccionar clones que portaran pΔbvrRS. Las placas se incubaron durante 6-10 días. Se seleccionaron colonias individuales, se transfirieron a CTS y se incubaron durante toda la noche. Se inocularon volúmenes de 50, 100 y 200 μl en ATS + 10% Suc para seleccionar clones que integraran el constructo Up-Dn en el cromosoma de la cepa parental mediante recombinación alélica. Las placas se incubaron durante 3-6 días. Se eligieron colonias individuales y se hicieron réplicas exactas en ATS + 10% Suc y ATS + Km, para seleccionar clones SucR y KmS que se esperaba que hubiesen perdido ambos genes bvrR y bvrS, así como el vector suicida. Las placas se incubaron durante 2-3 días. Los clones SucR y KmS se examinaron mediante PCR de colonias con los cebadores bvrRS-Con-For y bvrRS-Con-Rev (Anexo 1) en una reacción con DreamTaq PCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, USA). Los cebadores "Con" amplifican un fragmento de 3332 pb en la cepa parental (coordenadas 2011017 a 2014349) y un fragmento de 709 pb en la cepa mutante B. abortus ΔbvrRS. Los clones que dieron el resultado esperado para la cepa mutante también se sometieron a una PCR con el par de cebadores bvrR_bv1 (Anexo 1), los cuales amplifican un fragmento de 63 pb de la secuencia codificante de bvrR en la cepa parental (coordenadas 2011468 a 2011531) y no se espera que amplifiquen ningún producto de PCR en la cepa mutante. Los clones mutantes seleccionados en función de la presencia del amplicón Con de 709 pb y la ausencia del amplicón bv1 de 63 pb se 36 sometieron también a pruebas de identificación bioquímica y confirmación adicional mediante secuenciación de ADN Sanger, Southern Blot, Western Blot y secuenciación de genoma completo, como se describe más adelante. ● Identificación bioquímica de la cepa B. abortus ΔbvrRS Se realizaron pruebas bioquímicas básicas según lo descrito por otros autores (Castillo-Zeledón et al., 2021), utilizando los posibles clones mutantes y la cepa B. abortus 2308W. Las pruebas realizadas incluyeron ureasa (1h y 24h), oxidasa, producción de H2S, reducción de nitrato, sensibilidad a 20 µg/ml de tionina (24h y 72h) y 20 µg/ml de fucsina básica (24h y 72h). La presencia de un LPS liso se verificó mediante la prueba de aglutinación de acriflavina según lo descrito por otros autores (Castillo-Zeledón et al., 2021). ● Southern Blot: La mutación fue confirmada mediante Southern Blot (Castillo-Zeledón et al., 2021), con algunas modificaciones. El ADN genómico de las cepas parentales y mutantes se extrajo utilizando el kit “Wizard® Genomic DNA Purification Kit” (Promega, USA). El ADN purificado fue digerido con las enzimas de restricción BshTI (AgeI) y MlsI (MscI) (Thermo Scientific, USA), con 25 U y 12,5 U respectivamente, cortando el ADN genómico de B. abortus 2308W en las posiciones 2011220 (a 60 bases del codón de inicio de bvrR) y 2014898 (a 983 bases del codón terminación de bvrS), generando fragmentos de 3679 pb y 1055 pb en la cepa parental y en las cepas mutantes de B. abortus ∆bvrRS. El ADN digerido de cada cepa se separó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,6% durante 2 h a 100 V, y el gel se transfirió a una membrana de nailon (Roche, Alemania). La sonda se generó utilizando los cebadores bvrRS-South (Anexo 1), amplificando un fragmento de 299 pb de la secuencia codificante del gen corriente abajo de bvrS (BAW_12008, coordenadas 2013977 a 2014276). El marcaje, hibridación y detección de la sonda se realizaron utilizando el kit “DIG DNA Labeling and detection kit” (Roche, Alemania). ● Western Blot: 37 La expresión de BvrS, BvrR y Omp25 se evaluaron por Western Blot (Castillo- Zeledón et al., 2021), con algunas modificaciones. Los cultivos bacterianos se incubaron durante un máximo de 32 h para evaluar la expresión de proteínas en diferentes fases de crecimiento. El control de carga fue Omp19. ● Secuenciación Sanger: El amplicón Con-mutante se secuenció mediante Secuenciación Sanger para confirmar la ausencia de bvrR y bvrS. También se secuenciaron las regiones recombinadas durante la eliminación de los genes bvrR y bvrS. La región de recombinación corriente arriba se amplificó con los cebadores pckA (Anexo 1), obteniendo un amplicón de 677 pb (coordenadas 2009968 a 2010645). La región de recombinación corriente abajo se amplificó con los cebadores revtrans20682069- 2.3 y revtrans20692070-2.5 (Anexo 1), obteniendo un amplicón de 628 pb (coordenadas 2014621 a 2015249). Todos los amplicones se secuenciaron utilizando el Kit “BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit” (Thermo Fisher Scientific, USA) y se enviaron al "Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular" de la Universidad de Costa Rica para la electroforesis capilar. Los resultados de la secuenciación se analizaron utilizando BLAST (Altschul et al., 1990) como blastn y con parámetros predeterminados para buscar su correspondencia en la secuencia genómica de B. abortus 2308, cromosoma I (Secuencia de Referencia del NCBI: NC_007618.1). ● Secuenciación del genoma completo: Para la secuenciación del genoma completo, el ADN genómico de B. abortus 2308W y B. abortus ∆bvrRS se según lo descrito más atrás para el Southern Blot. Las bibliotecas genómicas se prepararon con el kit “Rapid barcoding sequencing SQK-RBK004 kit” (Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido) para la secuenciación en una plataforma minION utilizando el software MinKNOW, según las recomendaciones del fabricante. El “Basecalling” y la conversión de los datos crudos al formato FASTQ se realizaron con Guppy v.3.6.0, mientras que la calidad de las lecturas se verificó con nanoplot 1.40.2 (De Coster et al., 2018). Las lecturas de baja calidad (Q<10 y longitud mínima de 1000) se filtraron con nanofilt 2.8.0 (De Coster et al., 2018). Los adaptadores y códigos de barras se recortaron con 38 Porechop 0.2.4. Las lecturas que pasaron la calidad se utilizaron para el ensamblaje del genoma completo con Unicycler v0.4.8 (Wick et al., 2017). Los genomas ensamblados se verificaron con QUAST 5.0.2 (Quality Assessment Tool for Genome Assemblies Version) (Gurevich et al., 2013) y CheckM v1.1.3 para verificar la integridad y contaminación (Parks et al., 2015). El proyecto se depositó en DDBJ/ENA/GenBank con los siguientes números de accesión: Bioproyecto PRJNA891361, ensamblajes CP109916-CP109917 y CP109914-CP109915 y datos crudos de secuenciación SRR21939256 y SRR21939255 para B. abortus 2308W y B. abortus ∆bvrRS, respectivamente. Los ensamblajes completos resultantes a nivel de cromosoma se compararon mediante BLAST (Altschul et al., 1990) con el tipo blastn y parámetros predeterminados para verificar las diferencias genómicas entre B. abortus ∆bvrRS y B. abortus 2308W. La cobertura del contenido genómico también se verificó mediante el mapeo de lecturas contra el genoma ensamblado utilizando la plataforma de mapeo de lecturas largas Vulcan 1.0.3 (Fu et al., 2021). Las visualizaciones genómicas se realizaron con la Herramienta de Comparación Artemis 18.2.0 (Carver et al., 2005). ● Pruebas de integridad de membrana: La sensibilidad a la acción bactericida del suero no inmune se llevó a cabo según lo descrito en la literatura (Castillo-Zeledón et al., 2021), con un período de incubación de 45 minutos con el suero no inmune en lugar de 90 minutos. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparaciones múltiples (Castillo-Zeledón et al., 2021). La concentración mínima inhibitoria a Polimixina B en CTS pH 7.0 y 6.0 fue determinada mediante el método de microdilución, según lo descrito en la literatura (Castillo-Zeledón et al., 2021). ● Ensayo de protección con gentamicina y cuantificación de la replicación intracelular: Se cultivaron macrófagos murinos RAW 264.7 (ATCC TIB-71) y células epiteliales HeLa (ATCC clon CCl-2) y se infectaron con cepas de B. abortus en fase de crecimiento exponencial, tal como lo describen otros autores (Altamirano-Silva et al., 2018; Castillo-Zeledón et al., 2021). El número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) viables de B. abortus intracelulares se determinó a las 0, 24 y 48 h 39 después de la infección. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparaciones múltiples (Castillo-Zeledón et al., 2021). 40 CAPÍTULO IV: RESULTADOS ● El regulón del TCS BvrR/BvrS revela una coordinación de vías metabólicas requeridas para la vida intracelular de B. abortus 1. Resumen: El TCS BvrR/BvrS está conservado en miembros de la clase Alphaproteobacteria y está relacionado con la expresión de genes requeridos para la interacción con el hospedero y la sobrevivencia intracelular. Sin embargo, se desconocía si esa regulación era directa o indirecta. Por lo tanto, nos interesamos por describir el regulón del TCS BvrR/BvrS. En primer lugar, reportamos que los genes bvrR y bvrS se cotranscriben con otros 14 genes corriente abajo, conformando un operón. La anotación de estos genes refleja funciones relacionadas con el metabolismo del nitrógeno, la reparación y recombinación del ADN, el arresto del ciclo celular y la respuesta al estrés. La sintenia de esta región entre miembros cercanos de Alphaproteobacteria sugiere un rol conservado en la coordinación y expresión de vías metabólicas relacionadas con el carbono y el nitrógeno. Adicionalmente, realizamos un análisis de ChIP-seq con anticuerpos contra BvrR después de exponer cultivos bacterianos a condiciones de estrés acídico y nutricional que simulan el ambiente intracelular. Como resultado, encontramos que BvrR se une directamente a más de 300 genes que codifican enzimas implicadas en vías metabólicas entrelazadas como la vía de las pentosas fosfato y la gluconeogénesis, además de la homeostasis de la envoltura celular, síntesis de nucleótidos, división celular y virulencia. Entre estos genes blanco seleccionamos los siguientes: virB1, bvrR, pckA, omp25 y tamA. Además, corroboramos por EMSA la unión directa de BvrR a las regiones corriente arriba de estos genes. Por último, desciframos un motivo de unión a ADN de 14 nucléotidos, cuya presencia logramos identificar en el sitio de unión a BvrR que delimitamos en la región promotora del gen virB1. Consideramos que comprender la regulación génica que ejerce BvrR en Brucella es esencial para dilucidar cómo la bacteria logra orquestar una respuesta fisiológica que conlleva a una estrategia patogénica sigilosa. 41 2. Introducción: El TCS BvrR/BvrS se relacionó inicialmente con la virulencia y la integridad de la OM de Brucella spp. (Sola-Landa et al., 1998; Guzmán-Verri et al., 2002; Manterola et al., 2005; Lamontagne et al., 2007; Martínez-Núñez et al., 2010; Viadas et al., 2010; Altamirano-Silva et al., 2018). Estudios posteriores revelaron que en la mutante por transposición en bvrR existían más de 100 genes con expresión alterada en comparación con la cepa parental (Viadas et al., 2010). Sin embargo, se desconocía si todos esos genes eran regulados de forma directa por el TCS BvrR/BvrS, o más bien indirecta, pues entre estos genes se encontraban otros factores de transcripción (Viadas et al., 2010). Por lo tanto, en la presente Tesis nos interesamos por estudiar el regulón controlado de forma directa por el TCS BvrR/BvrS. Para ello analizamos en primer lugar la organización transcripcional de los genes bvrR/bvrS. En Rhizobiales, se ha observado una sintenia conservada en las regiones genómicas que codifican los ortólogos del TCS BvrR/BvrS y varios genes corriente abajo, algunos de los cuales codifican un PTS relacionado al nitrógeno (PTSNtr) (Dozot et al., 2010; Bélanger et al., 2013; Sánchez-Cañizares et al., 2020). El PTSNtr es un mecanismo de regulación global utilizado para ajustar el metabolismo de acuerdo con las fuentes de carbono y nitrógeno disponibles y, en Rhizobium leguminosarum, actúa en conjunto con el TCS (Sánchez-Cañizares et al., 2020). En B. melitensis, un estudio previo había demostrado la cotranscripción de los genes que codifican para ambos sistemas (Dozot et al., 2010). Además, otro estudio previo de proteómica intracelular de B. abortus a diferentes puntos post- infección en macrófagos había revelado ajustes metabólicos consistentes con las diferentes condiciones encontradas en los compartimentos intracelulares en los cuales transita la bacteria (Lamontagne et al., 2009). En tiempos tempranos, B. abortus reprime la utilización de carbohidratos en el metabolismo del carbono, así como la síntesis de transportadores periplásmicos y proteínas; mientras que activa el uso de fuentes de energía alternativas basadas 42 principalmente en rutas anapleróticas y generación de glutamato por conversión enzimática de aminoácidos, y un tipo de respiración de baja tensión de oxígeno. Al mismo tiempo, la bacteria cambia la composición de su membrana y restringe la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos, probablemente para contrarrestar las condiciones de estrés de la vacuola temprana (Lamontagne et al., 2009). El T4SS VirB y los mecanismos que inhiben la apoptosis son críticos para la sobrevivencia en la BCV, la cual eventualmente se asocia con compartimentos del retículo endoplásmico a través de modificaciones en el LPS, glucanos β-cíclicos y efectores de VirB (Gorvel & Moreno, 2002). Aproximadamente a las 24 h post-infección, al alcanzar el retículo endoplásmico, el metabolismo bacteriano muestra signos de una completa adaptación al tipo de respiración de baja tensión de oxígeno, un aumento en la síntesis de transportadores de aminoácidos, péptidos y hierro. La síntesis de proteínas y ácidos nucleicos se reactiva y la topología de la OM se ajusta al nuevo ambiente. Después de dos días de vida intracelular, la bacteria se ha replicado extensivamente en una vacuola asociada al RE y ha restaurado, a niveles pre- infección, la mayoría de las proteínas diferencialmente expresadas (Lamontagne et al., 2009). Seguidamente, la bacteria alcanza un compartimento con características autofágicas que le permite salir de la célula hospedera e iniciar un nuevo ciclo de infección (Starr et al., 2012). En la presente Tesis demostramos primeramente la cotranscripción, en B. abortus 2308W, de los genes del TCS BvrR/BvrS y el PTSNtr junto con otros diez genes corriente abajo, lo que implica que ambos sistemas forman parte de un operón de 16 genes en total. Cabe resaltar que la anotación de los genes que componen este operón refleja funciones relacionadas con la transición entre los ambientes extra e intracelular. Adicionalmente, analizamos el grado de conservación de este operón en bacterias filogenéticamente relacionadas, encontrando una mayor sintenia en bacterias que transitan entre nichos extra e intracelulares como parte de su ciclo de vida, en comparación con las intracelulares obligadas, lo cual sugiere que el operón bvrR/bvrS es relevante para la adaptación de Brucella al ambiente intracelular, lo que a su vez tiene relación con la virulencia. 43 Por otra parte, una vez descrito el operón bvrR/bvrS, nos interesamos por describir el regulón del TCS BvrR/BvrS en condiciones fisiológicamente relevantes. En B. abortus, la activación por fosforilación del regulador BvrR es transitoria a lo largo de la curva de crecimiento en medio rico en nutrientes y con pH neutro, pero puede ser inducida por una breve exposición a un medio á