UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 

SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO 

 
 
 

 
 
 

CAMBIOS FISIOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS ASOCIADOS CON EL 
OSCURECIMIENTO DE EXPLANTES NODALES IN VITRO DE 

BAMBUSA LAKO 
 

 

 

Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Posgrado en 
Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales para optar por el grado y título de 

Maestría Académica en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales con énfasis en 
Biotecnología  

 

 

 

YANELY MARISOL CANALES OCHOA 

 

 

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 

 

2023 

 



 
 

ii 
 

Dedicatoria 
 

En primer lugar, quiero dedicar el presente trabajo de tesis a Dios por cada una de las oportunidades 

que ha puesto en mi vida y por siempre sostener mi mano, espero cumplir su propósito en mi vida, 

siempre glorificarlo, confiar en su voluntad y en su infinita misericordia. En segundo lugar, a mis 

padres:  

 A mi madre Gladis Carminda Ochoa, por su amor y apoyo incondicional, su perseverancia, por 

siempre animarme a seguir adelante con buenos ánimos a pesar de las circunstancias, por sus 

enseñanzas, ser mi mejor ejemplo de humildad, perdón, bondad, templanza y fortaleza. Dios la 

guarde y la tenga gozando de su eterno descanso y le haga saber que este logro es parte de su 

esfuerzo y dedicado a ella con mucho amor.  

 A mi padre Mauricio Canales, por ser un padre incondicional y darme su apoyo para cumplir mis 

metas, por creer y confiar en mí en el corto tiempo que tuve el privilegio de tenerlo a mi lado, estoy 

segura de que estaría muy feliz y orgulloso por mis logros profesionales y personales. 

Las palabras no alcanzan para honrarlos con mi agradecimiento por todo lo que hicieron por mí, 

ya que esto no hubiese sido posible sin su presencia en mi vida.  

Eternamente agradecida 

Su hija: Yanely Marisol Canales Ochoa 

 

 

 

 

“Mira que te mando que te esfuerces y seas valiente; no temas ni desmayes, porque Jehová tu 

Dios estará contigo dondequiera que vayas” Josué 1:9 

 



 
 

iii 
 

Agradecimientos  
A mi mamá por sus consejos, por su apoyo emocional y por ser el motor que me impulsa a luchar 

por mis sueños. A mi hermana Linney y a mis hermanos Allan y Kevin, gracias por su comprensión 

y solidaridad. A mi gran amigo Gustavo Poveda Wong por su incondicional amistad, por su cariño, 

alegrar mis días, hacerme parte de su vida y por todo su apoyo durante estos años. A mi prima 

Tania Godoy Reyes por su apoyo incondicional desde el inicio hasta el final de esta etapa, le 

agradezco su amistad, su cariño, sus ánimos y ser un gran ejemplo a seguir. A las personas que 

estuvieron cerca y a la distancia durante este proceso, gracias por sus ánimos, su confianza y por 

los buenos momentos vividos.  

A mi directora de tesis Andrea Holst por compartirme sus conocimientos sobre el cultivo in vitro 

de bambú, por su paciencia y por su apoyo en cada una de las etapas de la maestría, a don Víctor 

Jiménez y a Paúl Solórzano por sus sugerencias y brindarme su ayuda cuando más lo necesité. A 

Paula Carvajal, por toda su ayuda desde el primer día en el laboratorio, por su guía en el 

planteamiento del anteproyecto y por cada una de sus valiosas sugerencias durante el proceso de 

tesis. A Miguel Benavides por sus enseñanzas en histología vegetal, por siempre animarme a 

mejorar y a confiar en mí. A Laura Vega y a la doctora Andrea Irías por sus sugerencias en los 

experimentos de las pruebas bioquímicas. Al profesor Luis Barboza Barquero por su hospitalidad 

y por atender mis dudas académicas. A Mariana Torres por sus sugerencias en la estadística de los 

datos y su amistad. En general agradezco a todo el personal del Centro para Investigaciones en 

Granos y Semillas (CIGRAS) por su gran espíritu de colaboración, por su solidaridad y amabilidad, 

cualidades que caracterizan al pueblo costarricense.  

Mi eterno agradecimiento a don Eric Guevara Berger por abrirme las puertas del CIGRAS aún sin 

tener ninguna experiencia en Biotecnología.  

Gracias al Servicio Alemán de Intercambio Académico por el financiamiento brindado y por la 

experiencia de estudiar en la Universidad de Costa Rica. Agradezco a todos aquellos que de alguna 

u otra manera contribuyeron a que esto fuera posible. 

 

 



 
 

iv 
 

 



 
 

v 
 

 



 
 

vi 
 

 

Tabla de contenido 
Dedicatoria………………………………………………………………………………………..ii 
Agradecimientos…………………………………………………………………………………iii 

Hoja de aprobación………………………………………………………………………………iv 

Certificado del poder generalísimo…………………………………………………………….…v 

Tabla de contenido……………………………………………………………………………….vi 

Resumen…………………………………………………………………………………………ix 

Summary……………………………………………………………………………………..…...x 

Lista de Cuadros…………………………………………………………………………………xi 

Lista de Figuras…………………………………………………………………………………xii 
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………...1 

2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………4 

2.1. Objetivo general……………………………………………………………………………...4 

2.2. Objetivos específicos………………………………………………………………………...4 
3. REVISIÓN DE LITERATURA……………………………………………………………..5 

3.1.1. Aspectos generales del bambú……………………………………………………………..5 

3.1.2. Tribu Bambusaea…………………………………………………………………………..6 

3.1.3. Bambusa lako………………………………………………………………………………6 

3.1.4. Floración y propagación del bambú………………………………………………………..7 
3.2. Cultivo in vitro de bambú……………………………………………………………………7 

3.3. Oscurecimiento durante el cultivo in vitro de plantas…………………………………….8 

3.3.1. Compuestos fenólicos en el oscurecimiento in vitro de plantas…………………...9 

3.3.2. Las PPO en el oscurecimiento in vitro de plantas………………………………..10 
3.3.3. ROS en el oscurecimiento in vitro…….………………………………………….11 

3.3.4. Efecto del SNP en el oscurecimiento in vitro de plantas…………………………11 

4. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………...…...16 

4.1. Localización del proyecto………………………………………………………………......16 
4.2. Material vegetal………………………………………………………………………..…...16 

4.3. Desinfección de tejidos……………………………………………………………..……16 

4.4. Establecimiento in vitro y brotación inicial…………………………………………..…….17 



 
 

vii 
 

4.5. Caracterización del color en los brotes in vitro de B. lako…………………………………18 

4.5.1. Establecimiento de la escala visual de oscurecimiento……………………………...18 
4.5.2. Caracterización del color en brotes in vitro de B. lako………………………….…...18 

4.5.3. Observación del tejido interno de los brotes in vitro de B. lako………………….….18 

4.6. Pruebas bioquímicas………………………………………………………………………..19 

4.6.1. Cuantificación de polifenoles totales (PT) en tejido in vitro de B. lako………….19 
4.6.2. Actividad de la enzima PPO en tejidos in vitro de B. lako…………………….....20 

4.6.3. Contenido de MDA en tejido in vitro de B. lako………………………………....22 

4.7. Histología…………………………………………………………………………...……23 

4.7.1. Fijación del tejido vegetal………………………………………………...………24 
4.7.2. Procesamiento del tejido vegetal………………………………………...……….24 

4.7.3. Inclusión de tejidos vegetales en parafina……………………………………......25 

4.7.4. Corte de tejidos vegetales y colocación en portaobjetos………………………....25 

4.7.5. Tinción de tejidos vegetales……………………………………………………...25 
4.8. Efecto del SNP en tejidos in vitro de B. lako…………………………………………....28 

5. RESULTADOS………………………………………………………………………....…30 

5.1.1. Descripción del oscurecimiento en brotes in vitro de B. lako……………………………30 

5.2. Optimización de pruebas bioquímicas en brotes in vitro de B. lako……………………….33 
5.2.1. Efecto de la reducción de la masa inicial sobre el contenido de PT en el tejido in vitro 
in vitro de B. lako…………………………………………………………………………………….33 
5.2.2. Efecto del almacenamiento a -80°C y del método de macerado del tejido sobre la 
actividad enzimática de la PPO en los brotes in vitro de B. lako…………………………..34 

5.3. Determinación del contenido de PT, actividad enzimática de PPO y MDA en los brotes in 
vitro de B. lako según la escala de oscurecimiento……………………………………………...36 

5.4. Cambios anatómicos en el tejido in vitro de B. lako en respuesta al oscurecimiento………38 

5.5. Localización de polifenoles y H2O2 en los brotes in vitro de B. lako………………………43 

5.6. Efecto del SNP en brotes in vitro de B. lako………………………………………………..46 
6. DISCUSIÓN………………………………………………………………………………….48 

6.1. Descripción del oscurecimiento en brotes in vitro de B. lako………………………………48 

6.2. Optimización de pruebas bioquímicas en brotes in vitro de B. lako………………………..49 

6.3. Determinación del contenido de PT, actividad enzimática de la PPO y MDA en brotes in 
vitro de B. lako según la escala de oscurecimiento……………………………………………...51 



 
 

viii 
 

6.4. Cambios anatómicos en el tejido in vitro de B. lako en respuesta al oscurecimiento………53 

6.5. Localización de polifenoles y H2O2 en los brotes in vitro de B. lako………………………53 
6.6. Efecto del SNP en los brotes in vitro de B. lako……………………………………………55 

7. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS A FUTURO……………………………………..56 

8. RECOMENDACIONES…………………………………………………………………...57 

9. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………...58 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

ix 
 

Resumen  
 

El término “oscurecimiento” engloba de manera general la oxidación por radicales libres de 

diferentes componentes celulares, así como la oxidación de compuestos fenólicos catalizados por 

la enzima polifenol oxidasa para producir quinonas, especies químicas muy reactivas, todo lo cual 

genera daño e incluso la muerte celular. El oscurecimiento en el cultivo de tejidos es un problema 

común, principalmente en especies leñosas. El bambú no está exento de esta limitación durante su 

cultivo in vitro. Una especie de importancia comercial y ambiental es Bambusa lako. Sin embargo, 

su propagación in vitro se ve limitada por la muerte de brotes en la fase de establecimiento debido 

al oscurecimiento. En este estudio se evaluó si el oscurecimiento de explantes nodales in vitro de 

B. lako estaba asociado con la acumulación de polifenoles, la actividad de la polifenol oxidasa y el 

estrés oxidativo evidenciado mediante el malondialdehído. Para la evaluación de estos parámetros 

bioquímicos primero se desarrolló una escala visual de oscurecimiento de cuatro grados. Se obtuvo 

un aumento en la concentración de fenoles totales y malondialdehído a medida que avanza el 

oscurecimiento. Por otro lado, también se encontró un aumento en la actividad de la polifenol 

oxidasa entre el grado verde y el completamente oscurecido. En adición a lo anterior, el análisis 

histológico evidenció una actividad metabólica activa en los brotes verdes dado que se encontró 

una mayor acumulación de almidón y proteína. Por otro lado, al buscar localizar los polifenoles y 

especies reactivas de oxígeno como el H2O2, se encontraron en los haces vasculares. Como 

propuesta innovadora y dado al efecto que tiene el nitroprusiato de sodio sobre el oscurecimiento 

in vitro, se evaluó el efecto de tres concentraciones de este compuesto (0,5 mM; 1,5 mM y 3,0 mM) 

sobre el crecimiento y el oscurecimiento de los brotes. No se encontró ningún efecto sobre la 

brotación, longitud de brote y número de brotes; además, tampoco fue efectivo para reducir el 

oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako durante siete semanas de cultivo.  

 

 

 

 



 
 

x 
 

Summary  
 

The term "browning" generally encompasses free radical oxidation of different cellular 

components, as well as the oxidation of phenolic compounds catalyzed by the enzyme polyphenol 

oxidase to produce quinones, highly reactive chemical species, all of which lead to cell damage 

and even cell death. Browning in tissue culture is a common problem, mainly in woody species. 

Bamboo is not exempt from this limitation during in vitro culture. One species of commercial and 

environmental importance is Bambusa lako. However, it’s in vitro propagation is limited by shoot 

death at the establishment stage due to browning. In this study, we evaluated whether browning of 

in vitro nodal explants of Bambusa lako was associated with polyphenol accumulation, polyphenol 

oxidase activity, and oxidative stress as evidenced by malondialdehyde. For the evaluation of these 

biochemical parameters, a four-grade visual darkening scale was first developed. An increase in 

the concentration of total phenols and malondialdehyde was obtained as the darkening progresses. 

On the other hand, an increase in polyphenol oxidase activity was also found between green and 

fully darkened grades. In addition to the above, histological analysis evidenced an active metabolic 

activity in the green shoots since a greater accumulation of starch and protein was found. On the 

other hand, when searching for polyphenols and reactive oxygen species such as H2O2, they were 

found in the vascular bundles. As an innovative proposal and given the effect of sodium 

nitroprusside on browning in vitro, the effect of three concentrations of this compound (0.5 mM; 

1.5 mM and 3.0 mM) on shoot growth and browning was evaluated. No effect was found on 

sprouting, shoot length and number of shoots; furthermore, it was also ineffective in reducing shoot 

browning in vitro of Bambusa lako during seven weeks of culture. 

 

 

 

 

 

 



 
 

xi 
 

Lista de Cuadros 

Cuadro 1. Reportes del efecto del nitroprusiato de sodio en el cultivo in vitro de plantas y brotes 
de bambú………………………………………………………………………………………….13 
Cuadro 2. Curva patrón del ácido gálico para la determinación del contenido de fenoles totales en 
las muestras de tejido in vitro de B. lako………………………………………………………….20 
Cuadro 3. Concentración total de fenoles, con respecto al material vegetal inicial utilizado en los 
brotes in vitro de B. lako………………………………………………………………………….34 
Cuadro 4. Concentración de MDA con respecto al material vegetal inicial utilizado, en los brotes 
in vitro de B. lako…………………………………………………………………………………36 
 

  



 
 

xii 
 

Lista de Figuras 
Figura 1. Ejemplos de compuestos fenólicos que se encuentran en plantas. a. No flavonoides; b. 

Flavonoides, los compuestos presentados son los más abundantes dentro de cada subgrupo y grupo. 

*Derivados del ácido benzoico y **derivados del ácido hidroxicinámico. Tomado de Crozier et al. 

(2009)……………………………………………………………………………………………..10 

Figura 2. Plantas de B. lako establecidas previamente en el invernadero del CIGRAS………….16 

Figura 3. Zona distal, medial y basal de los brotes in vitro de B. lako para el análisis histológico, la 

localización de polifenoles y la enzima peroxidasa. Barra equivalente a 1 cm…………………..24 

Figura 4. Comportamiento del oscurecimiento de los brotes de B. lako durante siete semanas de 

cultivo desde su establecimiento en condiciones in vitro en medio de cultivo MS. Después de dos 

semanas de introducción in vitro se colocaron en condiciones de luz indirecta y a la cuarta semana 

se colocaron en condiciones de luz directa. Se evaluaron 36 brotes……………………………....30 

Figura 5. Escala de oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako y sus principales colores 

representados en códigos decimales RGB. a. Grado 1; b. Grado 2; c. Grado 3; d. Grado 4. Barra 

equivalente a 1 cm. Los valores entre paréntesis representan el código RGB (R, G, B)…………31 

Figura 6. Detalle de la apariencia interna de la base de los brotes in vitro de B. lako en los cuatro 

grados de oscurecimiento. a. grado 1, b. grado 2, c. grado 3 y d. grado 4. La imagen mostrada a la 

izquierda muestra la zona del brote que fue disectado. A la derecha se presenta el brote 

diseccionado. Barra de los brotes sin diseccionar equivalente a 0,5 cm y diseccionados equivalentes 

a 1,5 cm (ampliados a 3x) y 0,75 cm (ampliados a 1,5x)…………………………………………32 

Figura 7. Porcentaje de brotes in vitro de B. lako en los diferentes grados de oscurecimiento durante 

siete semanas de cultivo in vitro………………………………………………………………….33 

Figura 8. Efecto del método de maceración, y del almacenamiento a una temperatura de -80°C 

sobre la actividad de la PPO en los brotes in vitro de B. lako. Letras iguales indican que no hay 

diferencias estadísticamente significativas, según una prueba de separación de medias de Tukey. 

Barras indican el error estándar (n=3). NL: Con mortero y nitrógeno líquido; MC: Con molino de 

café y sin nitrógeno líquido. Las barras indican el error estándar…………………………………35 

Figura 9. a. Concentración de fenoles totales (PT) en términos de equivalentes de ácido gálico, b. 

actividad enzimática de la PPO y c. concentración de MDA, según los diferentes grados de 

oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako. Letras diferentes indican diferencias 



 
 

xiii 
 

estadísticamente significativas, según una prueba de Tukey (PT) o Kruskall-Wallis (PPO y MDA) 

(n=3). Las barras indican error estándar………………………………………………………….37 

Figura 10. Diagrama de dispersión de la correlación de Pearson entre la actividad de la PPO 

U/min.g) y la concentración de fenoles totales (mg/g) de los grados de oscurecimientos de los 

brotes in vitro de B. lako………………………………………………………………………….38 

Figura 11. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 1. a. 

d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. c. f. i. Zona basal de los brotes. a. 

b. d. e. f. g. h. i. escala de barra equivalente a 20 µm; c. escala de barra equivalente a 50 µm. ep: 

epidermis; prt: proteína; ps: polisacáridos, en este caso gránulos de almidón; pq: parénquima; ev: 

elementos de los vasos; hv: haces vasculares; nu: núcleo; x: xilema; fl: floema. Coloración azul 

indica la presencia de proteína y fucsia la presencia de carbohidratos……………………………39 

Figura 12. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 2. a. 

d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. c. f. i. Zona basal de los brotes. a. 

c. g. h. i. escala de barra equivalente a 20 µm; b. d. e. f. escala de barra equivalente a 50 µm. ep: 

epidermis; prt: proteína; pq: parénquima; hv: haces vasculares; x: xilema; fl: floema. Coloración 

azul indica la presencia de proteína y fucsia la presencia de carbohidratos………………………40 

Figura 13. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 3. a. 

d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. a. b. c. g. h. i. escala de barra 

equivalente a 20 µm; d. f. escala de barra equivalente a 50 µm. e. escala de barra equivalente a 100 

µm. ep: epidermis; prt: proteína; pq: parénquima; hv: haces vasculares; x: xilema; fl: floema. 

Coloración azul indica la presencia de proteína y fucsia la presencia de carbohidratos………….41 

Figura 14. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 4. a. 

d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. a. b. c. g. h. i. escala de barra 

equivalente a 20 µm; d. escala de barra equivalente a 100 µm. e. f. escala de barra equivalente a 50 

µm. e. escala de barra equivalente a 100 µm. ep: epidermis; prt: proteína; pq: parénquima; ev: 

elementos de los vasos; hv: haces vasculares; x: metaxilema; fl: floema. Coloración azul indica la 

presencia de proteína y fucsia la presencia de carbohidratos……………………………………..42 

Figura 15. Localización de polifenoles, con la prueba de Hoepfner-Vorsatz en los, a. haces 

vasculares de la zona distal del brote en grado 2 y b. área basal del brote en grado 3, del tejido de 

B. lako. c. Compuestos polifenólicos presentes en el control positivo (frijol - Brunca); x: xilema; 



 
 

xiv 
 

fl: floema; cp; compuesto fenólicos; tst: testa; ctl: cotiledón. Coloración café indica presencia de 

polifenoles. Barras equivalentes a 20 µm…………………………………………………………43 

Figura 16. Localización de polifenoles, con la tinción de azul de toluidina, en los haces vasculares 

del tejido in vitro de B. lako. a. Grado 1, zona basal del brote; b. Grado 2, zona basal del brote; c. 

Grado 3, zona basal del brote y d. Grado 4, zona distal del brote. x: xilema; cp; compuestos 

fenólicos; fl: floema; fb; fibras; pxl: protoxilema. Azul claro muestra la presencia de polifenoles. 

Cortes transversales de 12-15 µm, barras equivalentes a 20 µm…………………………………44 

Figura 17. Localización de peróxido de hidrógeno con DAB en los haces y tejidos vasculares de 

los brotes in vitro de B. lako.  a. Zona basal de brote en grado 1; b. y c. Zona basal de brote en 

grado 2; d. Zona basal de brote en grado 3; e. y f. Zona basal y zona distal de brote en grado 4, 

respectivamente. Barras equivalentes a 20 µm. Color cobrizo indica localización de la enzima 

peroxidasa en el tejido. H2O2: peróxido de hidrógeno; m: xilema; fl: floema; tjv: tejido 

vascular…………………………………………………………………………………………...45 

Figura 18. Raíz de rábano, utilizado como control positivo en la prueba de DAB en brotes in vitro 

de B. lako. Barra equivalente a 50 µm. Localización de peróxido de hidrógeno indicada en color 

café: H2O2: peróxido de hidrógeno………………………………………………………………..45 

Figura 19. a. Efecto de los diferentes tratamientos de SNP sobre a. la brotación in vitro de B. lako, 

según una prueba de Chi cuadrado de Pearson; b. el promedio de brotes por yema, según una prueba 

de Chi cuadrado de Pearson y c.  la longitud del brote más largo luego de dos semanas de cultivo 

in vitro de B. lako desde su establecimiento, según una prueba de Tukey. n=36 (0 mM), n= 43 (0,5 

mM), n= 34 (1,5mM) y n= 31 (3,0 mM)………………………………………………………….46 

Figura 20. Efecto del SNP sobre el oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako. a. Porcentaje 

de explantes de B. lako en 0 mM de SNP, b. 0,5 mM de SNP, c. 1,5 mM de SNP y d. 3,0 mM, de 

acuerdo con un análisis de Chi-cuadrado. Cada color corresponde al grado de oscurecimiento según 

la escala visual. Se utilizó el siguiente número de réplicas biológicas. 0 mM = 36; 0,5 mM = 43; 

1,5 mM = 34; 3 mM = 31…………………………………………………………………………47



 



1 
 

 
 

 

1. INTRODUCCIÓN 
El bambú pertenece a la subfamilia Bambusoideae, una de las 12 subfamilias de las 

gramíneas (Poaceae) (Judziewicz et al. 1999). Aproximadamente existen de 60 a 75 géneros, 

con cerca de 1500 especies de bambú distribuidas en el planeta y clasificadas en tres tribus: 

Arundinarieae, Bambuseae y Olyreae (Liese 2001; BPG 2012). El 64% se encuentra en el 

sudoeste de Asia, el 33% en América Latina y el resto en África y Oceanía. No existen 

reportes sobre la presencia de especies nativas de bambú en Europa y la Antártida (Dransfield 

1981).  

 

El bambú es usado en la construcción por sus propiedades mecánicas y físicas, en el sector 

aeroespacial, la alimentación, la industria textil, la pulpa y el papel, el arte y el diseño, en la 

producción de biocombustibles y en la elaboración de gas metano y etanol en cantidades 

comerciales (Akinlabi et al. 2017). El género Bambusa representa uno de los grandes 

recursos naturales renovables, así como también presenta diversos beneficios 

medioambientales, tales como que son grandes captadores de carbono, presentan tolerancia 

a temperaturas adversas y sus rizomas contribuyen a disminuir la erosión del suelo 

superficial, entre otros (García-Ramírez et al. 2011). Bambusa lako es una especie dentro de 

este género, nativo de Indonesia, conocido como bambú negro del Timor, apreciado en la 

industria maderera, ornamental y por su importancia para el ambiente (Widjaja, 1997; 

Lantican 2009; Roxas 2012). Existe interés por la propagación del bambú a escala comercial, 

pero ésta se ha visto limitada por la baja tasa de germinación, por la pérdida de viabilidad de 

las semillas y por la poca disponibilidad de material para su reproducción por división de 

rizomas o esquejes (Liese 1987; Banik 1995; van Dam et al. 2018). 

 

El cultivo in vitro representa una alternativa para la propagación masiva del bambú. A pesar 

de que existen protocolos eficientes para la propagación in vitro de algunas especies de 

bambú (Gielis y Oprins 2002; Sandhu et al. 2018), en el caso de B. lako no se han reportado 

protocolos exitosos. La principal causa es atribuida a la muerte de los brotes por 

oscurecimiento durante la fase de establecimiento in vitro (Zamora-Chacón 2015). El 

oscurecimiento es un problema común en el cultivo de tejidos in vitro de plantas, 



2 
 

 
 

especialmente en plantas leñosas. Incluso este fenómeno se ha mencionado también en 

algunas otras especies de bambú durante su propagación in vitro, tales como Dendrocalamus 

latiflorus Munro, Phyllostachys nigra, Gigantochloa atroviolaceae y Bambusa balcooa 

Roxb (Huang et al. 2002, Das y Pal 2005; Bisht et al. 2010). 

 

El oscurecimiento en el cultivo de tejidos vegetales generalmente está relacionado con la 

acumulación de polifenoles y su polimerización enzimática mediada por la polifenol oxidasa 

(PPO) (Amiot et al. 1996). De igual manera se relaciona con el estrés oxidativo provocado 

por las condiciones in vitro, las cuales, además, promueven anomalías anatómicas y 

fisiológicas en las plantas in vitro (Rajput et al. 2020). El malondialdehído (MDA) es un 

subproducto de la peroxidación lipídica inducida por radicales de oxígeno y enzimas, y es 

utilizado como biomarcador del estrés oxidativo en plantas (Davey et al. 2005). Aunque se 

han reportado diversas estrategias para sobrellevar este fenómeno, por ejemplo, agregar 

compuestos antioxidantes al medio o realizar un subcultivo frecuente del tejido, se sugiere 

explorar otras alternativas debido al costo y tiempo que estas implican (Dutta-Mudoi et al. 

2013; Zheng et al. 2020).  

 

Se ha mencionado que el nitroprusiato de sodio (SNP, por sus siglas en inglés) inhibe la 

actividad de las enzimas PPO, fenilalanina amoniaco liasa (PAL) y peroxidasa (POD), que 

están asociadas a niveles altos de compuestos fenólicos y a la producción de etileno, lo cual 

resulta en la reducción del oscurecimiento y lignificación externa en brotes de bambú (Xu et 

al. 2009; Xu et al. 2010; Yang et al. 2010; Hesami et al. 2018; Pandey et al. 2020). En 

adición, al ser el SNP un donador de óxido nítrico (NO), tiene un efecto como regulador de 

crecimiento y contribuye al crecimiento y desarrollo de los tejidos in vitro (Pandey et al. 

2020; Pradhan et al. 2020). Aunque sus efectos dependen de las concentraciones y genotipo 

(Sarropoulou et al. 2014). 

 

Por tanto, con la presente investigación se caracterizó el oscurecimiento en los brotes in vitro 

de B. lako para determinar si se asociaba a la acumulación de polifenoles, la actividad de la 

PPO y/o al estrés oxidativo evidenciado por MDA. Por otro lado, se evaluaron los cambios 

histológicos causados por el oscurecimiento en los brotes in vitro de B. lako y, por último, 



3 
 

 
 

como estrategia innovadora, se estudió el efecto de varias concentraciones de NSP sobre la 

brotación inicial durante el establecimiento in vitro de B. lako, tanto en parámetros de 

crecimiento como en el oscurecimiento del tejido. 

  



4 
 

 
 

2. OBJETIVOS 

2.1. Objetivo general 

Caracterizar los cambios fisiológicos y bioquímicos relacionados con el oscurecimiento en 

tejidos in vitro de Bambusa lako. 

2.2. Objetivos específicos 

1. Evaluar si el oscurecimiento de los tejidos in vitro de Bambusa lako está relacionado con 

el contenido de fenoles, la actividad de la enzima polifenol oxidasa y el estrés oxidativo 

evidenciado mediante el contenido de malondialdehído.  

2. Describir, mediante histología, los cambios anatómicos asociados al oscurecimiento de 

los brotes de Bambusa lako durante la fase de establecimiento in vitro. 

3. Evaluar el efecto de la adición de nitroprusiato de sodio al medio de cultivo sobre el 

oscurecimiento de los brotes de Bambusa lako durante su establecimiento in vitro. 

  



5 
 

 
 

3. REVISIÓN DE LITERATURA 

3.1.1. Aspectos generales del bambú  

El bambú es una planta perenne herbácea o leñosa, que forma parte del grupo de las 

angiospermas, al orden de las monocotiledóneas y pertenece a la subfamilia Bambusoideae, 

una de las 12 subfamilias de las gramíneas (Poaceae) (Judziewicz et al. 1999). Se clasifica 

en tres tribus: Arundinarieae, Bambusaea y Olyreae (BPG 2012). Se estima que existen 60-

75 géneros y 1250-1500 especies de bambú distribuidas, de manera general, 64% en el 

sudoeste de Asia, 33 % en América Latina y el resto en África y Oceanía. Sin embargo, no 

existen reportes de especies nativas de bambú en Antártida y Europa, pero sí se ha 

mencionado la propagación de especies de bambú introducidas en el último continente 

(Dransfield 1981; Liese 2001).  

El bambú es considerada una planta versátil, ya que crece de manera óptima a temperaturas 

entre 20 °C y 30 °C y en altitudes entre 100 y 800 m sobre el nivel del mar (m.s.n.m.); aunque 

se puede encontrar en altitudes mayores a 3000 m.s.n.m. Además, crece en todo tipo de suelo, 

menos en suelos salinos (Mohah et al. 2022). Se caracteriza por tener un sistema de rizoma 

bien desarrollado, que permite su clasificación en dos grupos principales y uno intermedio: 

paquimorfo o simpodial, leptomorfo o monopodial e intermedio o antipodia. Poseen un tallo 

aéreo que brota del rizoma, conocido como culmo, compuesto por haces vasculares 

colaterales y aproximadamente 52% de tejido parenquimático, 40% de fibra y 8% de células 

conductoras, siendo estas características similares entre diferentes especies. Por encima de la 

línea nodal y en posición dística del culmo se encuentran las yemas, estas presentan un 

carácter vegetativo o reproductivo (Grosser y Liese 1971; Banik 1995; Liese 1998; Londoño 

2002).  

Por sus propiedades mecánicas y físicas, el bambú es considerada una planta multiusos, 

debido a la composición de su material, que puede ser usado en la construcción, en el sector 

aeroespacial, en la alimentación de animales y humanos, en la industria textil y de confección, 

en la pulpa y el papel, el arte y el diseño, en la producción de biocombustibles y en la 

elaboración de gas metano y etanol en cantidades comerciales (Akinlabi et al. 2017). En 

países como Colombia y Costa Rica, el bambú, al revestirlo con concreto y yeso, ha 

demostrado ser una forma barata y efectiva de construir viviendas a prueba de terremotos. 



6 
 

 
 

En Filipinas y Hawai, se desarrollan tecnologías para el uso del bambú en la construcción de 

edificios a prueba de ciclones (Turnbull 2008).  

3.1.2. Tribu Bambusaea 

La tribu Bambusaea, se divide en dos clados, bambúes leñosos neotropicales y bambúes 

leñosos paleotropicales. A su vez, los bambúes neotropicales se clasifican en tres subtribus, 

Arthrostylidium, Chusqueinae y Guaduinae, y los bambúes leñosos paleotropicales se 

clasifican en cuatro subtribus Bambusinae, Hickeliinae, Melocanninae y Racemobambosinae 

(Sungkaew et al. 2009). Esta tribu se dividide en 360 especies agrupadas en 20 géneros, de 

los cuales un género y dos especies se encuentran en la zona templada norte de Estados 

Unidos, el resto se clasifica en cuatro subtribus, tres endémicas nuevas de América 

(Arthrostylidiinae, Chusqueinae y Guaduinae) y una, Arundinariinae, común al Viejo y al 

Nuevo Mundo distribuidas desde México hasta Chile (Londoño 1990). Los bambúes 

pertenecientes a esta tribu presentan sistemas complejos de rizoma, culmos lignificados, 

comúnmente huecos, hojas muy bien diferenciadas, un excelente desarrollo de 

ramificaciones aéreas. Además, presentan espiguillas bisexuales y tienen ciclos de floración 

gregarios (Dransfield y Widjaja 1995; BPG 2012).  

3.1.3. Bambusa lako 

Una especie de interés comercial es B. lako, ya que sus culmos son usados para la 

construcción y elaboración de muebles tradicionales (Roxas 2012). Además, por su hábito 

de crecimiento, es un bambú de bajo riesgo invasivo (Lieurance et al. 2018). B. lako, es 

originario de Indonesia, donde su nombre local “lako” significa negro en tetún (idioma oficial 

de Timor Oriental), en referencia a sus culmos negros o violáceos. Es una especie perenne 

que forma culmos bastante compactos con cañas erectas, recurvas en el ápice, que pueden 

alcanzar los 20 m de altura en las zonas tropicales, pero en otras zonas se mantienen más 

bajas y tienen un diámetro de 4-10 cm (Widjaja 1997).  

Widjaja (1997) describe que B. lako presenta ramas en el culmo inferior, aurículas 

prominentes de las vainas del culmo y rayas amarillentas a verdosas en los culmos jóvenes. 

Dudas en la taxonomía de ciertos grupos llevó a realizar estudios taxonómicos moleculares. 

Los resultados y análisis de un estudio de polimorfismo de longitud de fragmentos 

amplificados determinaron que pertenece al género Gigantochloa (Loh et al. 2000).  



7 
 

 
 

3.1.4. Floración y propagación del bambú 

Las especies de bambú pertenecientes a la tribu Bambuseae se caracterizan por tener ciclos 

de floración largos con reproducción monocárpica, es decir que al florecer posteriormente 

mueren. Esta característica depende de la especie (Soderstrom 1981). Se ha mencionado que 

la floración del bambú puede ocurrir de forma esporádica, es decir que solo uno o varios 

miembros de una misma población florecen, o de forma gregaria, cuando la floración de una 

especie ocurre en un mismo momento y en diferentes lugares. Algunas especies de bambú 

permanecen en un estado vegetativo por décadas o puede que hasta por un siglo (Zheng et 

al. 2020).  

Convencionalmente, el bambú se propaga por semillas, considerado un método fácil y de 

bajo costo (Banik 1995). Sin embargo, presenta limitaciones como la baja frecuencia de 

floración y la forma gregaria en que esta ocurre dentro de una población, la baja tasa de 

germinación de las semillas y, debido a su heterogeneidad genética, no siempre reproducen 

las características de las plantas madre (Banik 1995; Liese 1987; van Dam et al. 2018). En 

cambio, los métodos de propagación vegetativa mediante propágulos y rizomas permiten la 

obtención de plantas idénticas a la madre, no obstante, presentan desventajas, tales como que 

la floración y la muerte ocurran en un periodo corto después de la propagación (Banik 1995). 

Además, estos métodos requieren mucha mano de obra por su volumen, son de difícil manejo 

y transporte, presentan crecimiento lento y una baja tasa de multiplicación y de supervivencia 

(Ray y Ali 2017). 

3.2. Cultivo in vitro de bambú 

El cultivo in vitro de tejidos consiste en tomar la porción de una planta, comúnmente 

llamados explantes (hoja, ápice, inflorescencias etc.) y colocarla en un medio de cultivo 

nutritivo basal que reúne las condiciones para su desarrollo y crecimiento. Esta técnica 

permite obtener plantas libres de enfermedades, genéticamente uniformes y de forma masiva, 

con respecto a los métodos tradicionales de propagación (Rajput et al. 2020). Dadas las 

desventajas para propagar el bambú a través de los métodos convencionales, el cultivo in 

vitro es una alternativa para su propagación a gran escala. Se han desarrollado métodos 

viables y eficientes para la propagación de plantas de diversas especies de bambú a escala 



8 
 

 
 

comercial, y en programas de mejoramiento genético y la conservación de germoplasma 

(Gielis y Oprins 2002; Sandhu et al. 2018).  

La proliferación de brotes a través de yemas axilares de bambú es el método más usado para 

la producción a gran escala (Jiménez y Guevara 2007; George y Debergh 2008), 

principalmente porque la mayoría de las plantas producidas son genéticamente estables 

(Schoofs 1992; Gielis y Oprins 2002). Este método involucra la selección y desinfección del 

explante, la inducción de brotación de yemas en un periodo de oscuridad, crecimiento de 

brotes en condiciones de luz, división de plantas para la multiplicación in vitro y el subcultivo 

frecuente en recipientes de mayor tamaño, enraizamiento y aclimatación (Jiménez et al. 

2021). 

En el caso del género Bambusa, se han reportado protocolos exitosos de propagación in vitro, 

tales como los desarrollados para Bambusa vulgaris ´Striata´ (Ramanayake et al. 2006), 

Bambusa nutans Wall. ex Munro (Negi y Saxena, 2011a), Bambusa tulda (Sharma y Sarma, 

2013), entre otras especies. En cuanto a B. lako, no existen reportes de un protocolo exitoso 

para su propagación in vitro debido a la mortalidad de brotes in vitro provocada por la 

respuesta al oscurecimiento durante la fase de brotación (Zamora-Chacón, 2015). 

3.3. Oscurecimiento durante el cultivo in vitro de plantas 

El oscurecimiento representa uno de los factores más serios y frecuentes desde el inicio y 

durante el establecimiento in vitro de plantas, especialmente en plantas leñosas (Saxena 1990; 

Azofeifa 2009). Esta respuesta provoca que la capacidad regenerativa disminuya, que se 

produzca crecimiento deficiente y en casos extremos la muerte de los explantes (Azofeifa 

2009). La severidad del oscurecimiento varía según la especie, tejido u órgano, edad de la 

planta, medio nutritivo y otras variables del cultivo in vitro (Huang et al. 2002; Wang et al. 

2016). El cultivo in vitro de bambú no está exento de esta respuesta, ya que se ha reportado 

en diferentes estudios de micropropagación in vitro de especies de bambú como 

Dendrocalamus latiflorus Munro, Phyllostachys nigra, Gigantochloa atroviolacea y 

Bambusa balcooa Roxb la muerte de brotes o plántulas por causa del oscurecimiento, 

convirtiéndolo en una barrera para establecer protocolos eficientes y rentables en la 

micropropagación de bambú (Huang et al. 2002; Das y Pal 2005; Bisht et al. 2010).  



9 
 

 
 

Se ha mencionado que el oscurecimiento in vitro está relacionado con la acumulación de 

compuestos fenólicos, con la acumulación de especies de oxígeno reactivo (ROS, por sus 

siglas en inglés) y niveles altos de la actividad enzimática de la PPO (Xu et al. 2015). En la 

literatura se han sugerido diversas estrategias para sobrellevar esta respuesta en el cultivo in 

vitro de plantas, tales como el uso de compuestos antioxidantes (Das y Pal 2005; Zheng et 

al. 2020), utilizar medio líquido para una mayor dispersión de sustancias tóxicas (Saxena 

1990; Saxena y Bhojwani 1993; Ramanayake y Yakandawala 1997; Shirin y Rana 2007; 

Azofeifa 2009) y subcultivar de manera frecuente los explantes o plántulas; sin embargo, este 

último método es poco rentable ya que demanda mucho tiempo y mano de obra (Azofeifa 

2009; Dutta-Mudoi et al. 2013). 

3.3.1. Compuestos fenólicos en el oscurecimiento in vitro de plantas  

Los compuestos fenólicos constituyen los metabolitos secundarios más comunes de las 

plantas. Están involucrados en procesos fisiológicos, ya que participan en distintas etapas del 

desarrollo vegetal, actúan en la defensa contra patógenos, depredadores o radiación 

ultravioleta y generalmente se reporta su ubicación en las vacuolas. Se caracterizan por 

poseer al menos un anillo de benceno que lleva uno o más grupos hidroxilo. En la naturaleza 

se pueden encontrar aproximadamente 8000 fenoles, provenientes en su mayoría de la ruta 

metabólica del ácido siquímico y el metabolismo de los fenilpropanoides (Holderbaum et al. 

2010; Selvarajan et al. 2018). Se clasifican como flavonoides y no flavonoides, que incluyen 

ácidos fenólicos, lignanos y estilbenos (Figura 1). Los flavonoides presentan en su estructura 

dos anillos de benceno unidos entre sí por un puente de tres carbonos, y se subdividen en 12 

grupos, dentro de algunos ejemplos comunes están los flavonoles, flavonas, flavan-3-oles, 

antocianinas, flavanonas, isoflavonas, y dihidrochalconas (Crozier et al. 2009; Sharma et al. 

2019).  

Sumado a lo anterior, los polifenoles participan en procesos de respuesta a estrés abiótico y 

biótico y su acumulación en el tejido vegetal se ha asociado con el oscurecimiento en el 

cultivo in vitro de plantas (Dalal et al. 1992). También se ha sugerido que la sobreproducción 

de compuestos fenólicos y su polimerización por enzimas oxidativas está relacionado con la 

reducción de la tasa de sobrevivencia de plántulas in vitro (Huang et al. 2002; Hesami et al. 

2018).  



10 
 

 
 

 

Figura 1. Ejemplos de compuestos fenólicos que se encuentran en plantas. a. No flavonoides; 
b. Flavonoides, los compuestos presentados son los más abundantes dentro de cada subgrupo 
y grupo. *Derivados del ácido benzoico y **derivados del ácido hidroxicinámico. Tomado 
de Crozier et al. (2009). 

 

3.3.2. Las PPO en el oscurecimiento in vitro de plantas  

Las PPO son metaloproteínas que contienen cobre. Polimerizan diversos compuestos 

fenólicos, lo que conlleva al oscurecimiento en plantas, razón por la que son consideradas 

enzimas críticas en la tecnología de alimentos. Son clasificadas según su mecanismo de 

acción y especificidad de sustratos en: catecol oxidasas, tirosinasas y lacasas. Las catecol 

oxidasas median la oxidación de o-difenoles a o-quinonas; las tirosinasas poseen actividades 

de cresolasa y por último las lacasas oxidan una gran gama de compuestos aromáticos (Yoruk 

y Marshall 2007).  

Las PPO participan en el mecanismo de defensa de las plantas, ya que son inducidas 

principalmente por heridas, ataques de insectos y señales relacionadas con la defensa 

provocada por algunas fitohormonas y su localización se reporta en los plastidios (Durán et 

al. 2002; Selvarajan et al. 2018; Aziz et al. 2019). Estudios han establecido la existencia de 

un vínculo en la regulación de la actividad de las PPO y la cantidad de polifenoles, ya que el 

aumento de la actividad enzimática de estas enzimas está asociado al oscurecimiento in vitro 

de plantas, a la desorganización celular y a la eventual muerte celular (Tang y Newton, 2004; 

Poudyal et al. 2008; Huang et al. 2002).  



11 
 

 
 

3.3.3. ROS en el oscurecimiento in vitro 

Las ROS son un subproducto del metabolismo aeróbico de las plantas, e incluyen radicales 

libres y moléculas no radicales producidas en diferentes compartimentos de las plantas como 

los cloroplastos, peroxisomas, mitocondrias y apoplastos. El anión superóxido (O2 -), el 

oxígeno singlete (1O2), el radical hidroxilo (OH) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) 

representan los principales ROS de las plantas (Mansoor et al. 2022). Las plantas bajo 

condiciones de estrés producen grandes cantidades de ROS involucradas en la regulación de 

procesos vinculados con el crecimiento, el desarrollo y en la coordinación de respuestas al 

estrés biótico y abiótico (Mittler et al. 2004; Schippers et al. 2016).  

Se ha indicado que el oscurecimiento también está relacionado con un desequilibrio entre la 

formación de ROS y el sistema de defensa antioxidante (Turrens 2003). Para evitar el 

deterioro en la célula por altos niveles de H2O2, los organismos expresan la enzima POD para 

la detoxificación de H2O2, sin embargo, el aumento en la actividad de esta enzima también 

puede causar la muerte celular y subsecuentemente el oscurecimiento in vitro (Abohatem et 

al. 2011).  

De igual manera, un incremento desproporcionado de las concentraciones de las ROS resulta 

en la peroxidación lipídica o daño oxidativo celular (Foyer y Noctor 2009). La peroxidación 

lipídica es un indicador del estrés oxidativo en los tejidos y se ha cuantificado mediante la 

reacción del MDA con dos moléculas de ácido tiobarbitúrico (Hodges et al. 1999). Altos 

niveles de MDA en el cultivo in vitro se han asociado con una reducción en las tasas de 

crecimiento y desarrollo morfogenético; además, el MDA puede reaccionar y provocar 

alteraciones en el ADN, proteínas, fosfolípidos y unirse a componentes del medio de cultivo 

(Adams et al. 1999). 

3.3.4. Efecto del SNP en el oscurecimiento in vitro de plantas 

El NO es una molécula bioactiva, volátil, incolora y soluble en agua que regula algunas 

funciones en las plantas, tales como germinación de semillas, formación de raíces 

adventicias, floración, cierre de estomas, y senescencia; también media la respuesta al estrés 

biótico y abiótico y aumenta la actividad antioxidante contra el estrés oxidativo (Crawford y 

Guo 2005; Khan et al. 2017). El SNP se ha utilizado como donante de NO de bajo costo 

(Zandonadi et al. 2010). Algunos resultados indican que su adición exógena durante el 



12 
 

 
 

cultivo in vitro tiene efectos positivos (Cuadro 1) (Jafari y Daneshvar 2019; Subiramani et 

al. 2019; Pandey et al. 2020), ya que, al ser un donador de NO, tiene un efecto como 

regulador de crecimiento y contribuye al desarrollo de los tejidos in vitro (Pandey et al. 2020; 

Pradhan et al. 2020). Aunque los resultados dependen de las concentraciones y genotipo 

(Sarropoulou et al. 2014). 

Se ha mencionado que el SNP inhibe la actividad de las enzimas PPO, PAL y POD, enzimas 

asociadas a niveles altos de fenoles, así como la producción de etileno, lo cual resulta en la 

reducción del oscurecimiento y lignificación externa en brotes de bambú, además de proteger 

la membrana plasmática. De igual manera el NO puede evitar la transformación de fenoles 

en quinonas al hacerlos reaccionar con compuestos quelantes de iones metálicos (Xu et al. 

2009; Xu et al. 2010; Yang et al. 2010; Hesami et al. 2018; Pandey et al. 2020). 



13 
 

 
 

Cuadro 1. Reportes del efecto del nitroprusiato de sodio en el cultivo in vitro de plantas y brotes de bambú. 

Material vegetal Tratamiento Resultados Referencia 

Brotes de 
crisantemo 

0,83 a 6,71 µM 
de SNP  

Con 1,67 µM SNP + 2,22 µM BA se generó la mayor inducción en el 
número de brotes. 
 

Arun et al. (2017) 

Semillas in vitro de 
soya 

0, 10, 20, 30, 40 
y 50 µM de SNP 
 

Mayor brotación con 30 μM SNP + 4,44 μM BA. Alta resistencia al 
estrés salino y sobrevivencia de brotes con 50 μM SNP + 4, 44 mM 
BA. 
 

Karthik et al. 
(2019) 

Callos de 
Valeriana 
jatamansi 

5, 10, 15, 20, 30 
µM de SNP 
 

Con 1,5 mg/L de NAA + 15 µM de SNP se obtuvo mayor frecuencia 
de callos. Disminución de hiperhidricidad y oscurecimiento al usar 20 
y 30 µM SNP. Mayor inducción de brotes y enraizamiento con 10% 
agua de coco + 15 µM SNP.  
 

Pandey et al. 
(2020) 

Callos de 
Dioscorea opposita 
 

0, 10, 20, 40, 
100, 150 μM de 
SNP 

Con 20-40 µM de SNP disminuye la concentración de H2O2 y aumenta 
la inducción de callos, disminuye la actividad de catalasa y la POD y 
aumenta la actividad del superóxido dismutasa; promueve la 
acumulación de prolina y glutatión y reduce el oscurecimiento. 
 

Xu et al. (2009) 

Callos de Ficus 
religiosa 

10, 20, 30, 40 y 
50 μM de SNP 

La concentración de 50 μM SNP disminuyó el oscurecimiento, la 
actividad de la PPO, SOD y CAT y aumentó la concentración de 
prolina. 
 

Hesami et al. 
(2018) 

 

 



14 
 

 
 

Cuadro 1. (Cont.) 

Material vegetal Tratamiento Resultados Referencia 

Stevia rebaudiana 

Bertoni 

 

50, 100, 250 y 500 

μM de SNP y 0,05, 

0,1, 0,3 y 0,5 mM 

de putrescina 

Los tratamientos con mayor eficacia fueron 10% PEG + 50 μM SNP + 

0,05 mM putrescina (T10) y 10% PEG + 100 μM SNP + 0,05 mM 

putrescina (T14). En ellos se observó rápida producción de primordios 

y mayor número de raíces, la longitud de raíces y sobrevivencia.  

 

Pradhan et al. 

(2020) 

Brotes de  

Arachis hypogaea  

(M-13 y 

PBS24030) 

5, 50, 100 y 500 

µM de SNP y en 

combinación con 3 

mg/L BA 

Inducción de brotes por parte de SNP solo (100 µM) o en combinación 

(50 µM + BA). A concentraciones bajas mejora la actividad 

antioxidante, ya que aumenta la actividad enzimática de CAT, SOD y 

APX con la finalidad de proteger a las plantas del estrés oxidativo.  

 

Verma et al. 

(2014) 

Puntas de brotes de 

Rubus idaus 

50 y 100 µM de 

SNP + 100 mM de 

NaCl 

Los valores más altos para el número de brotes y hojas, altura de brotes, 

peso fresco, peso seco, biomasa, carotenoides se obtuvieron con 50 µM 

de SNP. La mejor cantidad de prolina se encontró en el control y la 

menor cantidad de azúcar soluble total con 50 y 100 µM de SNP y con 

NaCl 100 mM + SNP 100 µM se encontró un aumento en la actividad 

de SOD.   

Ali et al. (2017) 

 

  



15 
 

 
 

Cuadro 1. (Cont.) 

Material vegetal Tratamiento Resultados Referencia 

Hojas de cerezo 

CAB-6P, Gisela 6 

y MxM 14 

0, 10, 20, 30, 40 o 50 µM 

SNP + 17,6 μM de BA y 

2,68 μM de NAA 

CAB-6P: 10 µM de SNP mayor número de brotes. Con 30 µM de 

SNP brotes con mayor longitud e inducción de brotes y con 50 µM 

SNP se obtuvo el mejor enraizamiento. Gisela 6: La inducción de 

brotes mejoró en un 40% con 40 µM de SNP, también indujo 

formación de raíces y con 30 µM SNP produjo callos más grandes. 

MxM 14: con 30 µM de SNP se obtuvo el mayor número de brotes 

y mayor producción de raíces, tasa de inducción y con 40 µM SNP 

raíces y brotes más largos.  Mejor tamaño, tasa de inducción y peso 

fresco en callos se observaron en concentraciones de 30 µM SNP 

(CAB-6P) y 40 µM SNP (MxM14). 

Sarropoulou et 

al. (2014) 

Brotes pelados de 

bambú 

 0,1, 0,5 y 1,0 mM de 

SNP 

El tratamiento con 0,5 mM disminuyó la actividad enzimática de 

PAL, PPO y POD por lo que retrasó el oscurecimiento de los brotes.  

Yang et al. 

(2010) 

APX: ascorbato peroxidasa; BA: benciladenina; CAT: catalasa; NAA: ácido nalftalenacético; PAL: fenilalanina amonio liasa; PEG: 
polietilenglicol; POD: peroxidasa; PPO: polifenol oxidasa; SNP: nitroprusiato de sodio; SOD: superóxido dismutasa. 



16 
 

 
 

4. MATERIALES Y MÉTODOS  

4.1. Localización del proyecto 

La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología, del Centro para 

Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS) de la Universidad de Costa Rica, Ciudad 

Universitaria Rodrigo Facio, San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa Rica. 

4.2. Material vegetal  

Se utilizaron yemas de plantas adultas de B. lako, las cuales fueron previamente establecidas 

por división de rizomas en el invernadero del CIGRAS (Figura 2). El riego de las plantas fue 

por goteo y se aplicó 1 g de fertilizante granular (Rosafert 12-12-17+2, Abonos Superior, 

Costa Rica) cada mes en la base de cada planta. También se comenzó a aplicar, dos semanas 

antes de cada introducción, 2 g/L de Agri-mycin® (Pfizer, México) en combinación con 2 

g/L benomil (Benomil® 50 WP, Fulton Industrial Chemical Company, Taiwan) cada dos o 

tres días al follaje de las plantas, para reducir la carga de microorganismos al momento de 

realizar la desinfección para su establecimiento in vitro (Zamora-Chacón 2015). 

 

Figura 2. Plantas de B. lako establecidas previamente en el invernadero del CIGRAS. 

 

4.3. Desinfección de tejidos  

El protocolo de desinfección se basó en la metodología propuesta por Jiménez et al. (2006), 

con algunas modificaciones, las cuales se describen a continuación: con la ayuda de una tijera 

de podar desinfectada se seccionaron ramas laterales de B. lako. Posteriormente, se llevaron 

al laboratorio y se cortaron en segmentos de un solo nudo, con una yema visible y prominente, 



17 
 

 
 

de aproximadamente 2,0 – 3,0 mm de diámetro y 25 – 35 mm de longitud, se les removió 

cuidadosamente la vaina de la hoja y se limpiaron con algodón impregnado de etanol al 70% 

para después ser sumergidos en una solución alcalina de Extran MA 01 (0,1% v/v) (Merck, 

Darmstadt, Alemania) durante 10 min a 100 rpm. A continuación, se realizó una inmersión 

en 2 g/L de Agri-mycin® (Pfizer, México) en combinación con 2 g/L benomil (Benomil® 

50WP, Fulton Industrial Chemical Company, Taiwán) durante 50 min a 100 rpm. 

Seguidamente, se realizó una inmersión en etanol al 70% durante 2 min, después se 

sumergieron en hipoclorito de sodio (NaOCl 1,5% v/v) con dos gotas de Tween 80 Sigma® 

(Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) por cada 100 mL, durante 15 min a 100 rpm. Por 

último, los explantes se lavaron con agua destilada estéril de 3 a 5 veces en la cámara de flujo 

laminar y los extremos de los explantes se cortaron con la ayuda de un bisturí para eliminar 

los extremos dañados luego de la desinfección. 

4.4. Establecimiento in vitro y brotación inicial 

Se utilizaron las sales minerales del medio Murashige y Skoog (MS) (1962) para el 

establecimiento de los explantes en medio sólido. El medio MS se suplementó con tiamina-

HCl (0,1 mg/L), piridoxina-HCl (0,5 mg/L), ácido nicotínico (0,5 mg/L), glicina (2,0 mg/L), 

mioinositol (100 mg/L), SM (Supresor Microbiológico, Laboratorios Químicos Arvi, 

Cartago, Costa Rica; 2 ml/L), thidiazurón (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) (0,7 mg/L) 

y sacarosa (3% m/v). El pH se ajustó a 5,8 con KOH. El medio se solidificó con 0,2% (m/v) 

de PhytagelTM (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania). Se dispensaron 10 ml de medio en 

tubos de cultivo de 25 x 150 mm y por último se autoclavó por 20 min a 1,5 kg cm2.  

En la cámara de flujo laminar y en condiciones asépticas, se colocó una microestaca de forma 

vertical en el medio de cultivo, con el extremo basal hacia abajo y con el nudo al nivel del 

medio. Seguidamente, se cerraron los tubos de cultivo con tapas de plástico y se sellaron con 

adhesivo de plástico (película autoadherible Darnel). Inicialmente, se colocaron en oscuridad 

a 25°C hasta observar la brotación. Después se transfirieron a condiciones de luz indirecta, y 

al presentar una coloración verde, se colocaron en condiciones de luz directa con un 

fotoperiodo de 12 h (33,88 μmol m-2s-1) a 25°C (Jiménez et al. 2006). El subcultivo de los 

brotes se hizo en intervalos de tres semanas, tal y como lo realizaron Negi y Saxena (2011b).  

 



18 
 

 
 

4.5. Caracterización del color en los brotes in vitro de B. lako  

4.5.1. Establecimiento de la escala visual de oscurecimiento 

Se evaluaron 36 brotes de B. lako dos veces por semana durante dos meses para establecer 

los grados de oscurecimiento más representativos del proceso en las diferentes etapas de 

crecimiento de los tejidos. En primera instancia, se estableció en qué parte del tejido inició 

el oscurecimiento y posteriormente se determinaron cuatro grados de oscurecimiento 

tomando en cuenta la coloración del tejido y la forma en que avanzó en los brotes. Esta escala 

de oscurecimiento se basó en el trabajo de Martínez-Torres (2020).  Al identificar los grados 

de la escala se procedió a documentar el proceso mediante fotografías.   

4.5.2. Caracterización del color en brotes in vitro de B. lako 

La caracterización del color de los brotes in vitro de B. lako, ocasionados por oscurecimiento, 

se realizó de la siguiente forma. Se tomaron fotografías digitales utilizando una cámara Nikon 

289 modelo D71000 de los brotes in vitro de B. lako correspondientes a cada grado de 

oscurecimiento de la escala visual previamente establecida. A continuación, en el editor de 

fotografías Adobe Photoshop (Versión 23.3.2), se eliminó el fondo y se obtuvieron las 

imágenes individuales de los brotes in vitro de B. lako en los diferentes grados de 

oscurecimiento. Posteriormente, y debido a que la descripción del color a través de la 

percepción visual humana del color rojo a verde es variada (Merbs y Nathans, 1992), se 

utilizó la herramienta geotests.net diseñada por Jégou (2013). Este es un software de acceso 

público, simple y económico que permite obtener los valores RGB hexadecimales de manera 

cuantitativa y objetiva de los seis colores principales de cada imagen de los diferentes grados 

de oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako.  

4.5.3. Observación del tejido interno de los brotes in vitro de B. lako 

Para evaluar el oscurecimiento del tejido interno de los brotes in vitro de B. lako, se 

diseccionaron de forma longitudinal y con ayuda de un bisturí, dos brotes por cada grado de 

oscurecimiento previamente establecidos en la escala visual. El tejido de los brotes se 

inspeccionó utilizando un estereoscopio (Olympus SZ2-ILST, Tokio, Japón) y se documentó 

a través de fotografías con una cámara de un celular Redmi Note 10 Pro de 108 MP.  



19 
 

 
 

 4.6. Pruebas bioquímicas  

4.6.1. Cuantificación de polifenoles totales (PT) en tejido in vitro de B. lako 

Se cuantificó la cantidad de PT en los diferentes grados de oscurecimiento establecidos en la 

escala según el protocolo descrito por Ainsworth y Gillespie (2007). Sin embargo, debido a 

la poca disponibilidad de material vegetal, fue necesario evaluar el efecto de reducir la 

cantidad inicial de tejido vegetal a utilizar, a continuación, se describe el protocolo.  

a. Extracción de Polifenoles: 

Se trituraron de 6 a 10 brotes con nitrógeno líquido, posteriormente el tejido macerado se 

incubó a una temperatura de -80°C hasta realizar el ensayo. Se experimentó con dos 

cantidades de tejido vegetal: 0,25 y 0,50 g colocados en un tubo Eppendorf de 2 ml, al que 

seguidamente se le agregó 1,6 y 0,8 ml de metanol al 95% (v/v) a 4 °C, respectivamente, y 

dos balines de acero inoxidable. Las muestras se homogenizaron por 1 min a 30 Hz en el 

molino mecánico (modelo MM400 de Retsh, Hann, Alemania) y se removieron los balines 

de acero inoxidable. Las muestras se extrajeron por 48 h a temperatura ambiente y en 

oscuridad, después de transcurrido este tiempo, se centrifugaron a 13 000 rpm durante 5 min 

a temperatura ambiente y con la ayuda de una micropipeta, se recolectó el sobrenadante en 

un tubo Eppendorf de 2 ml. En tubos Eppendorf de 2 mL se prepararon las siguientes 

soluciones:  

• Muestra de interés: 100 µL muestra (sobrenadante recolectado previamente) más 200 

µL de Folin-Ciocalteu (FC) al 10% (v/v) en agua.  

• Estándar: 100 µL ácido gálico 5 mM diluido en metanol al 95% (v/v) más 200 µL FC.  

• Blanco: 100 µL metanol más 200 µL FC.  

Seguidamente, las soluciones se homogenizaron en un vortex durante 1 min, posteriormente 

a cada una se les adicionó 800 µL de carbonato de sodio (Na2CO3) 700 mM y se incubaron 

por 2 h a temperatura ambiente.   

b. Preparación de curva estándar de ácido gálico y análisis espectrofotométrico  

Después de las dos horas de incubación, se preparó la curva estándar de ácido gálico con seis 

puntos de concentración que iban desde 0 hasta 0,086 mg/mL en una placa de 96 pocillos. 



20 
 

 
 

En el cuadro 2 se muestran las concentraciones utilizadas del estándar de ácido gálico (0,456 

nmol/µL) y blanco para completar 200 µL por cada pocillo. En el caso de los pocillos que 

contenían las muestras en estudio, se utilizaron 200 µL de volumen. Tanto para los puntos 

de la curva estándar como para las muestras, se realizaron tres réplicas biológicas y tres 

repeticiones instrumentales. Por último, se midió la absorbancia en un lector 

espectrofotométrico de microplacas Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, 

MA, USA) a una longitud de onda de 765 nm.  

Cuadro 2. Curva patrón del ácido gálico para la determinación del contenido de fenoles 
totales en las muestras de tejido in vitro de B. lako 

 Concentración de 

ácido gálico (mg/mL)   

Volumen del estándar de ácido 

gálico (0,456 nmol/µL) (µL) 

Volumen de blanco de 

metanol al 95% (v/v) (µL) 

0 0 200 

0,017 44 156 

0,034 88 112 

0,051 132 68 

0,068 176 24 

0,086 200 0 

  

A partir de la curva se calculó la concentración de ácido gálico, y se utilizó la siguiente 

fórmula para calcular la cantidad total de fenoles en las muestras de tejido in vitro de B. lako:  

𝑃𝑃𝑃𝑃 =
𝐴𝐴𝐴𝐴 ∙  𝑉𝑉 
𝑀𝑀

  ∙  𝐹𝐹𝐹𝐹 

Donde PT es la concentración de polifenoles totales (mg/g) que se expresan en términos de 

miligramos de ácido gálico por gramo de muestra, AG es la concentración de ácido gálico 

calculada a partir de la curva patrón (mg/mL), V es el volumen de metanol utilizado para la 

extracción (mL), M es la masa de tejido utilizado (g) y FD corresponde al factor de dilución, 

que es este caso fue de 11.  

4.6.2. Actividad de la enzima PPO en tejidos in vitro de B. lako 

La metodología empleada para determinar la actividad de la PPO en el tejido in vitro de B. 

lako se basó en la descrita por Zhang y Shao (2015) y Huang et al. (2002). Tomando en 



21 
 

 
 

consideración que para realizar la prueba bioquímica de la PPO en brotes in vitro de B. lako 

se tenía previsto recolectar las muestras a medida que se presentaban los grados de 

oscurecimiento determinados en la escala y no se podían hacer todas las mediciones 

simultáneamente, se estudió si el método de macerado y si el almacenamiento del tejido 

vegetal de B. lako a una temperatura de –80°C provocaban cambios en la determinación de 

la actividad enzimática. El tejido se maceró utilizando nitrógeno líquido con ayuda de un 

mortero y pistilo, o un molino de café. Se almacenaron tres repeticiones biológicas de ambos 

métodos de maceración durante treinta días, la actividad enzimática se midió en intervalos 

de 0, 7, 15 y 30 días.   

a. Extracción de la enzima PPO en tejidos in vitro de B. lako 

Con ayuda de un bisturí previamente desinfectado se seccionaron aproximadamente 6 a 7 

brotes in vitro de B. lako en fragmentos pequeños. Posteriormente en un molino de café 

durante 5 min se trituró el tejido vegetal, por otro lado, con la ayuda de un pistilo, un mortero 

y nitrógeno líquido se maceró el tejido vegetal. En una balanza analítica se pesó 0,25 g de 

tejido (de cada uno de los métodos de molienda) en un tubo Eppendorf de 2 mL, se agregaron 

dos balines de acero inoxidable y 1 mL de 0,2 de buffer de fosfato de sodio a pH 6,8, 

almacenado a 4 °C. En un molino mecánico (modelo MM400 de Retsh, Hann, Alemania) se 

homogenizó durante 1 min a 30 Hz. Con la ayuda de una micropipeta se agregaron 250 µL 

del buffer de extracción con la intención de lavar los balines de acero y completar el volumen 

para la extracción de la enzima (1,25 mL), en este paso los balines de acero se retiraron del 

tubo Eppendorf con un imán y una pinza limpia. Luego se homogenizó la muestra en un 

vortex por 1 min y se centrifugó a 4°C durante 20 min a 10 000 rpm. Se recolectaron 100 µL 

el sobrenadante y se transfirieron a un tubo Eppendorf nuevo. Las muestras se colocaron en 

un bloque frío y una cubeta con hielo para conservar la enzima mientas se realizaba el 

análisis.  

b. Análisis espectrofotométrico  

Se adicionaron 90 µL de 3,8 mM de 3,4 – Dihidroxifenilalanina (L-DOPA)  (Sigma-Aldrich, 

Steinheim, Alemania) preparado con el buffer de extracción; seguidamente se agregaron 10 

µL de extracto enzimático por triplicado en cada pocillo de una microplaca. A continuación, 

se realizó la lectura cada minuto durante una hora en un espectrofotómetro Multiskan GO 



22 
 

 
 

(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) a una longitud de onda de 490 nm y a 

25°C. Los resultados se expresaron como unidades de actividad enzimática, donde una 

unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que causa una unidad 

de cambio en la absorbancia por minuto, la fórmula aplicada se basó en la reportada por Zhu 

et al. (2020) que se describe de la siguiente manera: 

𝐴𝐴𝐴𝐴 =  
� ∆𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴

∆𝑡𝑡
� ∙  𝑉𝑉𝑉𝑉

𝑉𝑉𝑉𝑉 ∙  𝑚𝑚 ∙  0,001 ∙  𝑉𝑉
 

Donde, AE es la actividad enzimática, reportada en U/min·g, ∆Abs/∆t representa la 

pendiente de la curva, Vt corresponde al volumen total de la extracción (mL), Ve el volumen 

del extracto enzimático (mL), m la masa de tejido empleado (g), 0,001 es definido como el 

cambio de transformación de sustrato por minuto y t corresponde al tiempo en minutos de 

lectura de actividad enzimática.  

4.6.3. Contenido de MDA en tejido in vitro de B. lako 

La metodología empleada para realizar la cuantificación de MDA se basó en la descrita por 

Balen et al. (2009). Al igual que para el contenido total de fenoles, se optimizó el protocolo 

con el objetivo de evaluar si había un efecto al disminuir la masa inicial vegetal. A 

continuación, se detalla el protocolo seguido. 

a. Extracción de MDA 

Se liofilizaron de dos a tres brotes in vitro de B. lako y se colocaron a - 40°C hasta ser 

procesados. Se experimentó con dos cantidades iniciales de tejido vegetal, 30 y 60 mg de 

muestra liofilizada, las cuales se agregaron en un tubo de Eppendorf de 2 mL. Se realizaron 

tres réplicas biológicas y tres repeticiones instrumentales por cada muestra. Seguidamente se 

maceraron con la ayuda de dos balines de acero inoxidable por 1 min a 30 Hz en el molino 

mecánico (modelo MM400 de Retsh, Hann, Alemania) y se retiraron los balines de acero. Se 

agregó 800 y 1600 µL de la solución de 0,25% (m/v) de ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) en 10% 

(m/v) de ácido tricloroacético (TCA), respectivamente. De forma inmediata, se 

homogenizaron por inversión y se calentaron durante 30 min en un baño María a 95°C dentro 

de la capilla de extracción. Para finalizar, las muestras se enfriaron durante 5 min en una 

cubeta con hielo para después centrifugarlas a 10 000 rpm por 10 min. 



23 
 

 
 

b. Análisis espectrofotométrico  

Se preparó una placa de 96 pocillos, se agregó 200 µL del blanco y cada muestra por 

triplicado en los pocillos de la placa. Se procedió a realizar la lectura de absorbancia en un 

lector espectrofotométrico de microplacas Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific Inc., 

Waltham, MA, USA) con absorbancias de 532 nm y 600 nm para corregir turbidez 

inespecífica. El contenido de lípidos peroxidados se expresó como el total de especies 

reactivas de TBA (TBARS, por sus siglas en inglés), principalmente MDA, por gramo de 

masa de muestra seca usando el coeficiente de extinción de 155 mM·cm-1. 

Para determinar la concentración de MDA se utilizó la ecuación de la Ley de Lambert-Beer, 

y se despejó para “c” de la siguiente manera:  

𝐜𝐜 =  
Ab 
ε ·  b 

 

En donde c es la concentración de MDA en la muestra (mM), Ab es la absorbancia corregida 

(Ab532 – Ab600) (nm), ε es el coeficiente de extinción molar que equivale a 155 mM·cm-1 y b 

es la longitud de la cubeta que es de 0,8 cm.  

Posteriormente se convirtió la concentración obtenida de MDA, donde c corresponde a 

mmol/L del cálculo anterior, a términos de mmol de la siguiente manera:  

𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 = 𝑐𝑐 · 1𝐿𝐿
1000 𝑚𝑚𝐿𝐿

· 0,2 𝑚𝑚L 

Una vez obtenida la concentración de MDA en mmol, se procedió a dividirla entre la masa 

en gramos de tejido utilizado para expresar la concentración de MDA en mmol/g. En este 

ensayo se realizaron tres réplicas biológicas y tres repeticiones instrumentales.  

4.7. Histología  

El proceso de histología vegetal en los brotes in vitro de B. lako se basó en el protocolo 

descrito por Benavides-Acevedo y Torres-Segura (2022). A continuación, se detalla la 

metodología empleada. 



24 
 

 
 

La caracterización histológica de los brotes in vitro de B. lako se realizó en las zonas distal, 

medial y basal de los brotes in vitro en cada grado de oscurecimiento, según la escala 

desarrollada (Figura 3).   

 
Figura 3. Zona distal, medial y basal de los brotes in vitro de B. lako para el análisis 
histológico, la localización de polifenoles y la enzima peroxidasa. Barra equivalente a 1 cm. 

 

4.7.1. Fijación del tejido vegetal  

El tejido vegetal se cortó en secciones de aproximadamente 2 cm y 0,5 cm (para luego realizar 

cortes longitudinales y transversales respectivamente), se colocaron en un cassette de 

procesamiento histológico y se fijaron en una solución de F.A.A. (10% formaldehido, 5% de 

ácido acético glacial y 85% de etanol al 70% v/v) por alrededor de 24 h a temperatura 

ambiente.  

 

4.7.2. Procesamiento del tejido vegetal  

Las muestras se deshidrataron en una serie de grados de etanol de la siguiente forma: etanol 

70% y etanol de 80% por 5 min, posteriormente se sumergieron en soluciones de etanol de 

90%, etanol de 95%, etanol de 100% y nuevamente etanol de 100%, por 10 min. 

Seguidamente, las muestras se colocaron en una solución 1:1 de etanol y xilol por 10 min, a 

continuación, se sumergieron en xilol por 10 min y nuevamente se sumergieron en xilol por 

10 min. Cada una de las soluciones se calentaron en el microondas por 2 min hasta alcanzar 

una temperatura entre 50-60 °C. Posteriormente, se colocaron en una solución 1:1 de xilol y 



25 
 

 
 

parafina por 20 min dentro de una estufa a 60°C; y finalmente se realizaron dos inmersiones 

seguidas en una solución de parafina (Paraplast®, Leica) a 60°C dentro de una estufa durante 

40 min. 

 

4.7.3. Inclusión de tejidos vegetales en parafina 

Las muestras se colocaron en un recipiente que contenía parafina de inclusión (Paraplast®, 

Leica) y este a su vez se colocó en una plantilla para evitar que la parafina de inclusión se 

solidificara. Cada cassette de procesamiento se tomó con la punta de una pinza previamente 

calentada. Las muestras se transfirieron y se colocaron en la posición espacial correcta, para 

obtener cortes transversales y longitudinales en un molde metálico previamente calentado y 

prellenado con parafina (Paraplast®, Leica). Seguidamente se calentó la superficie del 

cassette de procesamiento y se colocó sobre el molde metálico, y se rellenó con parafina. 

Posteriormente se almacenaron en el refrigerador por alrededor de 10 min. Finalmente, se 

separó el bloque de parafina con la muestra del molde metálico.   

 

4.7.4. Corte de tejidos vegetales y colocación en portaobjetos  

Los bloques de parafina se montaron (colocados en una cubeta con hielo para mantenerlos 

fríos) en un micrótromo de rotación (American Optical 820, Buffalo, USA). Los bloques de 

parafina en primera instancia se desbastaron con cortes de 60 µm, hasta ver la estructura de 

estudio. Seguidamente, se cambió de cuchilla y se ajustó el micrótromo a entre 8-12 µm para 

realizar los cortes. Los cortes se colocaron en un baño de flotación en agua (27-28°C), para 

expandir las láminas de parafina. A continuación, se colocaron en portaobjetos y se 

acomodaron en una canastilla metálica. Por último, la canastilla metálica se incubó en una 

estufa entre 45-60°C durante 60 min.   

 

4.7.5. Tinción de tejidos vegetales  

4.7.5.1. Tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) 

Los portaobjetos se desparafinaron colocándolos durante 2 min en soluciones de xilol, xilol, 

etanol (100%), etanol (100%), etanol (95%), etanol (70%) y se colocaron en una cubeta con 

agua por alrededor de 15 segundos. A continuación, se colocaron durante 15 min en ácido 



26 
 

 
 

peryódico al 1% m/v. Transcurrido este tiempo, se realizaron tres enjuagues con agua 

destilada. Con la ayuda de un gotero se cubrieron los portaobjetos con reactivo de Schiff y 

se dejaron reposar por 15 min; posteriormente se lavaron con agua corriente calentada a 45°C. 

Seguidamente los portaobjetos se sumergieron en azul de Coomassie por 30 min. Después 

de este tiempo se lavaron con agua y se deshidrataron y aclararon sumergiendo la canastilla 

de metal por 2 min en soluciones de etanol (95%), etanol (100%), etanol (100%), xilol y 

nuevamente en xilol. A continuación, la canastilla se mantuvo sumergida en xilol y, con la 

ayuda de una pinza, se tomó cada portaobjeto a los cuales se les situó un cubreobjetos con 

medio de montaje (Permount®). La tinción de PAS es utilizada para teñir polisacáridos 

simples y complejos, tales como la celulosa en la pared celular y reservas energéticas como 

gránulos de almidón (Chu 1963; Yu et al. 2021). 

 

4.7.5.2. Localización de polifenoles 

Se realizaron dos pruebas para determinar la localización de polifenoles, las cuales se detallan 

a continuación:  

a. Test Hoepfner-Vorsatz (Reeve 1951): 

La prueba se realizó en las zonas distal, medial y basal de los brotes en los diferentes grados 

de oscurecimiento, previamente procesados. El protocolo utilizado se detalla a continuación: 

las muestras se desparafinaron en dos cambios por 2 min en una solución de xilol, 

posteriormente las muestras se hidrataron en alcoholes de concentración decreciente por 2 

min, a continuación, en cada uno de los portaobjetos se colocaron gotas de una solución 

compuesta por: 10% de nitrito de sodio, 10% de ácido acético y 20% de urea. Después de 3 

min, se colocaron gotas de una solución 2 N de NaOH por 3 min.  

 

b. Test con azul de toloudina:   

La prueba se realizó en las zonas distal, medial y basal de los brotes en los diferentes grados 

de oscurecimiento, previamente procesados. El protocolo empleado se describe de la 

siguiente manera: los portaobjetos con las muestras se colocaron en una solución de 



27 
 

 
 

hipoclorito de sodio al 13% (v/v) durante 5 min y posteriormente en azul de toloudina 0,05% 

(diluido en agua) por 10 min (Elwers et al. 2010).  

A continuación, en ambas metodologías, los portaobjetos con el tejido se deshidrataron por 

2 min en alcoholes de concentración creciente, seguidamente se aclararon en dos cambios 

por 2 min en xilol y por último se realizó el montaje del cubreobjeto. Además, en las dos 

pruebas se utilizó frijol de variedad brunca como control positivo.  

4.7.5.3. Localización de peróxido de hidrógeno (H2O2)  

La prueba se realizó en las zonas distal, medial y basal de los brotes en los diferentes grados 

de oscurecimiento, previamente procesada para localizar la presencia de H2O2, se realizó la 

prueba de 3,3′-diaminobencidina (DAB) (Melvin et al. 2017) con algunas modificaciones 

que a continuación se describen: los portaobjetos con las muestras se incubaron en la estufa 

a 60°C por 20 min, seguidamente se desparafinaron en dos cambios consecutivos de 2 min 

en xilol, posteriormente se hidrataron en alcoholes de concentración creciente por 2 min. Las 

muestras se incubaron en oscuridad por 1 hora en DAB (preparado con 1,5 mL de sustrato 

DAB y con dos gotas del cromógeno DAB), posteriormente se sumergieron en agua por 

alrededor de 10 segundos, después se realizó una contratinción con eosina al 0,1% por 3 min. 

Seguidamente las muestras se deshidrataron en alcoholes de concentración creciente por 2 

min. A continuación, se aclararon en dos cambios consecutivos de 2 min en xilol y por último 

se procedió a realizar el montaje del cubreobjeto. Para esta prueba se utilizó como control 

positivo la raíz de rábano.  

 

4.7.5.4. Análisis de las muestras fijadas 

Se procedió a observar las láminas fijas con un microscopio invertido (Zeiss, AxioVert A1) 

con el fin de determinar si existen diferencias en las estructuras celulares en los distintos 

grados de oscurecimiento. Durante la observación de las láminas se tomaron fotografías de 

las imágenes más representativas con la ayuda de una cámara Olympus y el software 

CellSens.  

 



28 
 

 
 

4.8. Efecto del SNP en tejidos in vitro de B. lako 

Se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de SNP sobre el desarrollo y 

oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako. El establecimiento in vitro de las 

microestacas de B. lako se realizó según el protocolo de desinfección y en el medio de cultivo 

sólido descritos anteriormente, suplementados con SNP (Sigma-Aldrich, Ateinheim, 

Alemania) a concentraciones de 0,5, 1,5 y 3 mM (Yang et al. 2010) y en presencia de un 

testigo. El SNP se adicionó al medio de cultivo por filtración (con filtros de jeringa de acetato 

de celulosa con un tamaño de poro de 0,2 μm) en la cámara de flujo laminar y se agitó en un 

vortex, luego del autoclavado. Se dispensaron 10 mL de medio de cultivo en tubos de cultivo 

de 25 x 150 mm. Se evaluó en cada tratamiento, el porcentaje de brotación, número de brotes, 

longitud del brote más largo y el grado de oscurecimiento según la escala establecida. Las 

evaluaciones se realizaron en dos momentos de cada semana desde la tercera hasta la séptima 

semana de cultivo in vitro.  

 

4.9. Diseño experimental y análisis estadístico  

La optimización de las pruebas bioquímicas, así como para el análisis de los brotes en los 

distintos grados de oscurecimiento, se utilizaron tres réplicas biológicas y tres repeticiones 

instrumentales. Los datos de las pruebas de PT y MDA no cumplieron con los supuestos de 

normalidad, por lo que se les aplicó una prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis. En cuanto 

a las pruebas de los métodos de maceración y almacenamiento de la actividad de la PPO. Los 

resultados mostraron tener una distribución normal, por lo que se les realizó una separación 

de medias mediante una prueba de Tukey.  

Los datos de las pruebas bioquímicas en los brotes in vitro de B. lako en los distintos grados 

de oscurecimiento para las pruebas de PPO y MDA, no cumplieron con los supuestos de 

normalidad, por lo que se les aplicó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. En 

cambio, los datos de los PT presentaron una distribución normal, por tanto, se realizó una 

separación de medias mediante una prueba de Tukey. Para determinar si la cantidad de 

polifenoles tenía un efecto en la actividad de la PPO en los brotes in vitro de B. lako en los 

diferentes grados de oscurecimiento se realizó una correlación de Pearson a una confiabilidad 

del 95%. 



29 
 

 
 

En cuanto al experimento de SNP se evaluaron tres tratamientos de SNP (0,5, 1,5 y 3 mM) 

en presencia de un testigo. Para los datos de brotación y número de brotes se realizó una tabla 

de contingencia y se aplicó un Chi cuadrado de Pearson. Por otro lado, la longitud de brotes 

cumplió con los supuestos de normalidad, por lo que se realizó una separación de medias 

mediante una prueba de Tukey. Para el análisis del efecto de los tratamientos de SNP sobre 

el oscurecimiento, se realizó una tabla de contingencia y se aplicó una prueba de Chi 

cuadrado de Pearson. Para las variables de crecimiento y desarrollo la unidad experimental 

fue de un explante. Para evaluar el efecto del SNP se utilizó la escala de oscurecimiento 

previamente establecida y para el control se utilizaron 36 réplicas biológicas; en cuanto al 

tratamiento 0,5 mM se emplearon 43; para el caso del tratamiento 1,5 mM se usaron 34 y 

para el tratamiento con 3,0 mM se evaluaron 31 réplicas biológicas. Los gráficos se 

elaboraron utilizando el software de Excel de Microsoft Office 365 y se utilizó el programa 

informático R (R Core Team 2020) para realizar el análisis estadístico a todas las pruebas 

anteriormente mencionadas.  

  



30 
 

 
 

5. RESULTADOS  

5.1.1. Descripción del oscurecimiento en brotes in vitro de B. lako  

Se evaluó el oscurecimiento en los brotes in vitro de B. lako durante siete semanas. A las 

cuatro semanas de cultivo in vitro el oscurecimiento de los brotes comenzó a ser evidente y 

su manifestación creció de manera exponencial en las siguientes semanas. Para la semana 

siete se reporta el 87% de oscurecimiento total en los brotes (Figura 4). 

 

Figura 4. Comportamiento del oscurecimiento de los brotes de B. lako durante siete semanas 
de cultivo desde su establecimiento en condiciones in vitro en medio de cultivo MS. Después 
de dos semanas de introducción in vitro se colocaron en condiciones de luz indirecta y a la 
cuarta semana se colocaron en condiciones de luz directa. Se evaluaron 36 brotes.  

Se identificó, de manera visual, que el oscurecimiento se origina en la base del brote y avanza 

hacia la zona apical del mismo. Inicialmente, se observó clorosis en el brote y en la punta de 

las hojas; posteriormente el brote se va tornando oscuro hasta cubrir su totalidad. Con el fin 

de describir los cambios bioquímicos y anatómicos provocados por el oscurecimiento en los 

brotes in vitro de B. lako, se estableció una escala visual con cuatro grados de oscurecimiento 

y, debido a la heterogeneidad del color en los brotes, se determinó una guía de los seis colores 

principales (Figura 5). A continuación, se detallan los cambios de coloración de los brotes in 

vitro de B. lako en los diferentes grados de oscurecimiento: 

Grado 1: Los brotes presentaron coloraciones verdes en el tallo y hojas (Figura 5a), el 

principal tono verde fue aquel con los valores R = 64; G = 137; B = 0. Asimismo, se observó 

una coloración café en la base del prófilo, justo en la unión con el explante inicial, con valores 

R = 142; G = 96; B = 35 (Figura 5a).  



31 
 

 
 

Grado 2: Los brotes presentaron una apariencia clorótica acentuada principalmente en la 

región de los nudos. En la punta de la hoja se observaron espectros de color amarillo, verde 

y café y en el prófilo de la base del brote se observó una coloración café. La coloración 

amarilla más pronunciada, según la guía de colores, corresponde a los componentes R = 142; 

G = 155; B = 8 y el color café pertenece a los valores R = 146; G = 104; B = 50 (Figura 5b).  

Grado 3: Los prófilos que envuelven los nudos presentaron un espectro de coloración café, 

el más intenso presentaba valores R = 137; G = 92; B = 47 y el menos intenso R = 179; G = 

156; B = 90. En cuanto a la hoja, se observaron coloraciones amarillas, siendo la más 

pronunciada la del código decimal R = 177; G = 171; B = 74, y verdes menos intensos en 

comparación a los brotes del grado 1. En la punta de ésta, se observó el color café más intenso 

(Figura 5c).  

Grado 4: Los brotes presentaron colores café de diferentes tonalidades, desde tenues hasta 

más oscuros. El color café más oscuro fue más evidente en la zona de unión con el explante 

madre, el área de los nudos, la zona distal del brote y las hojas. El espectro café más intenso 

corresponde al código decimal R = 112; G = 46; B = 16. En este grado los brotes no presentan 

ninguna coloración verde (Figura 5d).   

 

Figura 5. Escala de oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako y sus principales colores 
representados en códigos decimales RGB. a. Grado 1; b. Grado 2; c. Grado 3; d. Grado 4. 
Barra equivalente a 1 cm. Los valores entre paréntesis representan el código RGB (R, G, B). 

Al diseccionar longitudinalmente la base de los brotes, en cada grado de oscurecimiento, se 

observó que a nivel interno los brotes del grado 1 no presentaron oscurecimiento (Figura 6a). 

En el grado 2 los brotes se observan oscurecidos en la base; así como, en cada nudo (Figura 



32 
 

 
 

6b). En el caso de los grados 3 y 4, el tejido interno tiene una apariencia oscurecida, en mayor 

medida en el grado 4, que igualmente se acentúa en la región del nudo (Figura 6c y d).  

 

Figura 6. Detalle de la apariencia interna de la base de los brotes in vitro de B. lako en los 
cuatro grados de oscurecimiento. a. grado 1, b. grado 2, c. grado 3 y d. grado 4. La imagen 
mostrada a la izquierda muestra la zona del brote que fue disectado. A la derecha se presenta 
el brote diseccionado. Barra de los brotes sin diseccionar equivalente a 0,5 cm y 
diseccionados equivalentes a 1,5 cm (ampliados a 3x) y 0,75 cm (ampliados a 1,5x). 

Como se indicó anteriormente, durante las primeras tres semanas de cultivo, los brotes se 

mantuvieron en el grado 1. A la cuarta semana, el oscurecimiento se hizo evidente en los 

brotes in vitro, por lo que en este lapso se observaron brotes verdes (grado 1) y brotes con 

inicios de oscurecimiento (grado 2). Sin embargo, en la semana cinco fue posible observar 

brotes en los cuatro grados de la escala, por lo que el oscurecimiento en la población de brotes 

in vitro de B. lako fue más evidente, para esta semana se reporta el 41,67% de los brotes 

completamente oscuros, es decir en grado 4. El número de brotes en este grado fue 

exponencial hasta la semana siete, ya que el porcentaje de los brotes introducidos en grado 4 

era del 83,3%. Asimismo, en esta semana no se observaron brotes en grado 1, pero sí en los 

grados de oscurecimiento restantes (Figura 7).  

 



33 
 

 
 

 
Figura 7. Porcentaje de brotes in vitro de B. lako en los diferentes grados de oscurecimiento 
durante siete semanas de cultivo in vitro. 

5.2. Optimización de pruebas bioquímicas en brotes in vitro de B. lako  

5.2.1. Efecto de la reducción de la masa inicial sobre el contenido de PT en el tejido in 

vitro de B. lako 

Debido a que el oscurecimiento en los tejidos in vitro de B. lako se produjo en diferentes 

momentos a lo largo del tiempo, la disponibilidad de material vegetal fue una limitante para 

realizar las mediciones. Por lo tanto, se optimizó el método con la finalidad de reducir la 

masa inicial del material vegetal de 0,50 g a 0,25 g y proporcionalmente con el volumen de 

metanol (1,6 mL a 0,8 mL), y que esto era metodológicamente factible. Como era de esperar, 

se encontró que al reducir la masa inicial de tejido vegetal, se obtiene la misma concentración 

de PT (p = 0,20) (Cuadro 3). Por tanto, se logró reducir la masa inicial y se continuó 

utilizando 0,25 g para realizar la cuantificación de PT en los tejidos in vitro de B. lako. 

 

 

 



34 
 

 
 

Cuadro 3. Concentración total de fenoles, con respecto al material vegetal inicial utilizado, 

en los brotes in vitro de B. lako 

Material vegetal (g) Contenido total de fenoles 
(mg/g PF) * 

0,25 2,19 ± 0,29 a 

0,50 2,30 ± 0,12 a 

*Promedio ± error estándar. Letras iguales no presentan diferencias estadísticamente 
significativas de acuerdo con una prueba no paramétrica Kruskal-Wallis (n = 3). PF: peso 
fresco. 
 
5.2.2. Efecto del almacenamiento a -80°C y del método de macerado del tejido sobre la 

actividad enzimática de la PPO en los brotes in vitro de B. lako 

Debido a la dificultad para macerar los brotes in vitro de B. lako frescos, se evaluaron dos 

métodos de maceración y almacenamiento en el tiempo, para determinar si se producía un 

efecto sobre la determinación de la actividad de la PPO.  

La actividad de la PPO en el tejido in vitro de B. lako no se vio afectada por la maceración 

con mortero y nitrógeno líquido, y el almacenamiento de 0 a 30 días a -80°C (p = 0,49) 

(Figura 8). Sin embargo, el tejido macerado con molino de café sí presentó diferencias 

significativas (p=0,01) en la actividad de la enzima el día 15 de almacenamiento, en 

comparación con los días 0, 7 y 30 (Figura 8). Por lo tanto, en pruebas posteriores se continuó 

macerando el tejido in vitro de B. lako con nitrógeno líquido y el tejido se almacenó a            -

80°C mientras se recolectaron todos los grados de oscurecimiento hasta el análisis. 



35 
 

 
 

 

Figura 8. Efecto del método de maceración, y del almacenamiento a una temperatura de             
-80°C sobre la actividad de la PPO en los brotes in vitro de B. lako. Letras iguales indican 
que no hay diferencias estadísticamente significativas, según una prueba de separación de 
medias de Tukey. Barras indican el error estándar (n=3). NL: Con mortero y nitrógeno 
líquido; MC: Con molino de café y sin nitrógeno líquido. Las barras indican el error estándar. 

 

5.2.3. Efecto de la reducción de la masa inicial sobre la cantidad del MDA en los brotes 

in vitro de B. lako  

Al igual que en la prueba del contenido de PT, con el fin de disminuir la cantidad de tejido a 

utilizar con respecto a lo indicado por Balen et al. (2009), se realizó una prueba para 

determinar si era posible disminuir la cantidad de masa inicial al evaluar el contenido de 

MDA en brotes in vitro de B. lako. Se encontró que al comparar la cantidad de material 

vegetal (30,0 y 60,0 mg) empleada, con respecto a la concentración de MDA, existen 

diferencias significativas (p = 0,0013) (Cuadro 4). Por lo anterior, no fue posible disminuir 

la masa inicial para la prueba dado que provoca un efecto en la cuantificación de MDA en 

los brotes in vitro de B. lako. 



36 
 

 
 

. 

Cuadro 4. Concentración de MDA con respecto al material vegetal inicial utilizado, en los 
brotes in vitro de B. lako  

Material vegetal (mg) Concentración de MDA 
(mmol/g PS) * 

60,0 0,015 ± 0,004b 

30,0 0,019 ± 0,004 a 

*Promedio ± error estándar. Letras diferentes dentro de una misma columna difieren entre sí 
de acuerdo con una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (n = 3). PS: Peso seco. 

 

5.3. Determinación del contenido de PT, actividad enzimática de PPO y MDA en los 

brotes in vitro de B. lako según la escala de oscurecimiento. 

La concentración de PT, en términos de equivalentes de ácido gálico, aumentó 

significativamente conforme avanza el grado de oscurecimiento de los brotes in vitro de B. 

lako (p = 5,3x10-4) (Figura 9a). Al evaluar la actividad enzimática de la PPO en los brotes in 

vitro de B. lako, se encontró que el grado 4 de oscurecimiento presenta una actividad 

enzimática mayor, con respecto al grado 1 (p = 0,037) (Figura 9b). En cuanto a la 

peroxidación lipídica de los brotes in vitro de B. lako, mediante la cuantificación de MDA, 

se encontró que los grados 3 y 4 de oscurecimiento obtuvieron los valores más altos de 

peroxidación lipídica, seguido del grado 2 y finalmente el grado 1 (p = 2,1x10-10) (Figura 9c). 



37 
 

 
 

 

Figura 9. a. Concentración de fenoles totales (PT) en términos de equivalentes de ácido 
gálico, b. actividad enzimática de la PPO y c. concentración de MDA, según los diferentes 
grados de oscurecimiento de los brotes in vitro de B. lako. Letras diferentes indican 
diferencias estadísticamente significativas, según una prueba de Tukey (PT) o Kruskall-
Wallis (PPO y MDA) (n=3). Las barras indican error estándar. 

 

 

 



38 
 

 
 

Al realizar la correlación de Pearson entre los grados de oscurecimiento de los brotes in vitro 

de B. lako se encontró un coeficiente de correlación positivo de r = 0,49 por lo que, los valores 

de la actividad de la PPO muestran una tendencia a incrementar a medida aumenta la cantidad 

total de fenoles (Figura 10).   

 

 

Figura 10. Diagrama de dispersión de la correlación de Pearson entre la actividad de la PPO 
U/min.g) y la concentración de fenoles totales (mg/g) de los grados de oscurecimientos de 
los brotes in vitro de B. lako. 

5.4. Cambios anatómicos en el tejido in vitro de B. lako en respuesta al oscurecimiento 

La caracterización histológica mediante la tinción de PAS de las partes distal y medial del 

grado 1 mostró la presencia de polisacáridos, en este caso reservas energéticas como gránulos 

de almidón en las células del parénquima (Figura 11a, b, d, e, g y h). No obstante, en la zona 

basal del brote no se observó la presencia de gránulos de almidón (Figura 11c, f y j). Por otro 

lado, las tres zonas presentaron tejido vascular distintivos de un tallo de una monocotiledónea 

y dispersos en el parénquima con señales de diferenciación (Figura 11c-i). De igual manera 

se observó diferenciación en zonas adyacentes a los haces vasculares (Figura 11d-f). La doble 

tinción con azul de Coomassie reveló la presencia de proteína en la epidermis, en el 

parénquima y haces vasculares de las partes distal y medial de tejido; sin embargo, se observa 

una tinción más marcada en la zona distal del brote en comparación con la zona medial 

(Figura 11a, b, d, e, g y h). 



39 
 

 
 

 
Figura 11. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 
1. a. d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. c. f. i. Zona basal de 
los brotes. a. b. d. e. f. g. h. i. escala de barra equivalente a 20 µm; c. escala de barra 
equivalente a 50 µm. ep: epidermis; prt: proteína; ps: polisacáridos, en este caso gránulos de 
almidón; pq: parénquima; ev: elementos de los vasos; hv: haces vasculares; nu: núcleo; x: 
xilema; fl: floema. Coloración azul indica la presencia de proteína y fucsia la presencia de 
carbohidratos. 

 

 

 

 

 



40 
 

 
 

A diferencia del grado 1, en el grado 2 la tinción de PAS reveló la ausencia de gránulos de 

almidón en las tres zonas de los brotes (Figura 12a-f). Además, se observó menor tinción de 

proteína, con respecto al grado 1, en la zona distal del tejido (Figura 12a, d y g). En el caso 

de la parte distal del tejido, las células del parénquima presentaron una distribución y 

engrosamiento desigual con respecto a las otras dos áreas del tejido (Figura 12a-c). Se 

observaron haces vasculares diferenciados a lo largo de los brotes en el grado 2 (Figura 12). 

Figura 12. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 
2. a. d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. c. f. i. Zona basal de 
los brotes. a. c. g. h. i. escala de barra equivalente a 20 µm; b. d. e. f. escala de barra 
equivalente a 50 µm. ep: epidermis; prt: proteína; pq: parénquima; hv: haces vasculares; x: 
xilema; fl: floema. Coloración azul indica la presencia de proteína y fucsia la presencia de 
carbohidratos. 



41 
 

 
 

Por otro lado, el tejido del grado 3 presentó algunas características similares con el grado 2. 
En las tres zonas del brote se observó ausencia de gránulos de almidón (Figura 13 a, b y c). 
En la zona distal del tejido se encontró proteína en las células del parénquima, en la epidermis 
y en los haces vasculares (Figura 13a y g); sin embargo, en las otras dos zonas no se encontró 
proteína. Se observaron células del parénquima más compactas en el tejido de la parte distal 
y basal, respecto a la parte medial (Figura 13a-c). Por otro lado, se puede apreciar una 
distribución de haces vasculares característica a la de un tallo de una monocotiledónea 
(Figura 13d-f).  

 

Figura 13. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 
3. a. d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. a. b. c. g. h. i. escala 
de barra equivalente a 20 µm; d. f. escala de barra equivalente a 50 µm. e. escala de barra 
equivalente a 100 µm. ep: epidermis; prt: proteína; pq: parénquima; hv: haces vasculares; x: 
xilema; fl: floema. Coloración azul indica la presencia de proteína y fucsia la presencia de 
carbohidratos. 



42 
 

 
 

Al igual que en el grado 2 y grado 3 la tinción de PAS en las zonas evaluadas de los brotes 

en grado 4 reveló ausencia de gránulos de almidón. Las células del parénquima de la base 

del brote no presentaban una apariencia compacta respecto al área distal del brote (Figura 

14a y c). La doble tinción con azul de Coomassie mostró la presencia de proteína en las 

células del parénquima, epidermis y haces vasculares del área distal del brote (Figura 14a y 

g); sin embargo, en las otras zonas no se encontró proteína.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 14. Histología de PAS en secciones transversales de brotes in vitro de B. lako en grado 
4. a. d. g. Zona distal de los brotes. b. e. h. Zona medial de los brotes. a. b. c. g. h. i. escala 
de barra equivalente a 20 µm; d. escala de barra equivalente a 100 µm. e. f. escala de barra 
equivalente a 50 µm. e. escala de barra equivalente a 100 µm. ep: epidermis; prt: proteína; 
pq: parénquima; ev: elementos de los vasos; hv: haces vasculares; x: metaxilema; fl: floema. 
Coloración azul indica la presencia de proteína y fucsia la presencia de carbohidratos. 



43 
 

 
 

5.5. Localización de polifenoles y H2O2 en los brotes in vitro de B. lako  

Con el fin de localizar los polifenoles en los brotes in vitro de B. lako se realizó la prueba de 

Hoepfner-Vorsatz en los cortes del tejido de la zona distal, medial y basal de los distintos 

grados de oscurecimiento; sin embargo, en la mayoría de las muestras el material vegetal se 

barrió de los portaobjetos al momento de realizar el aclarado con xilol. A pesar de lo anterior, 

se logró identificar polifenoles en la zona distal del tejido del grado 2 y en el área basal del 

grado 3. Se observó que los polifenoles se localizaron en las estructuras de los haces 

vasculares (Figura 15a y b), los mismos se muestran como una coloración café naranja. En 

este caso se utilizó como control positivo semilla de frijol de la variedad Brunca. Los 

compuestos polifenólicos se presentaron en la testa y parte del cotiledón (Figura 15c).  

 

Figura 15. Localización de polifenoles, con la prueba de Hoepfner-Vorsatz en los, a. haces 
vasculares de la zona distal del brote en grado 2 y b. área basal del brote en grado 3, del tejido 
de B. lako. c. Compuestos polifenólicos presentes en el control positivo (frijol - Brunca); x: 
xilema; fl: floema; cp; compuesto fenólicos; tst: testa; ctl: cotiledón. Coloración café indica 
presencia de polifenoles. Barras equivalentes a 20 µm. 

Al utilizar el método con azul de toloudina al 0,5% diluido en agua destilada y previamente 

incubadas en hipoclorito de sodio, probablemente se localizaron polifenoles en los haces 

vasculares del área basal del brote en el grado 1, grado 2, grado 3 y en la zona distal del grado 

4 los cuales se muestran como una coloración azul más clara. En todos los grados, la 

presencia de estos metabolitos se observó en el xilema, floema y fibras, además, en los grados 

2 y 4 se ubicaron también depositados dentro del floema. El grado 4 presentó una coloración 

menos intensa respecto a los otros grados (Figura 16a-c).  



44 
 

 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Figura 16. Localización de polifenoles, con la tinción de azul de toluidina, en los haces 
vasculares del tejido in vitro de B. lako. a. Grado 1, zona basal del brote; b. Grado 2, zona 
basal del brote; c. Grado 3, zona basal del brote y d. Grado 4, zona distal del brote. x: xilema; 
cp; compuestos fenólicos; fl: floema; fb; fibras; pxl: protoxilema. Azul claro muestra la 
presencia de polifenoles. Cortes transversales de 12-15 µm, barras equivalentes a 20 µm. 

 

Al localizar tanto el H2O2 en el tejido de B. lako utilizando DAB y una tinción de contraste 

con Eosina, se identificó de manera tenue una coloración cobriza característica del DAB en 

los haces vasculares del tejido basal del grado 1 (Figura 17a), del grado 2 (Figura 17b y c), 

grado 3 (Figura 17d) y grado 4 (Figura 17e) y en la zona distal (Figura 17f) del grado 4. Para 

esta prueba se utilizó como control muestras de raíces de rábano (Figura 18).  



45 
 

 
 

 
 

Figura 17. Localización de peróxido de hidrógeno con DAB en los haces y tejidos vasculares 
de los brotes in vitro de B. lako.  a. Zona basal de brote en grado 1; b. y c. Zona basal de brote 
en grado 2; d. Zona basal de brote en grado 3; e. y f. Zona basal y zona distal de brote en 
grado 4, respectivamente. Barras equivalentes a 20 µm. Color cobrizo indica localización de 
la enzima peroxidasa en el tejido. H2O2: peróxido de hidrógeno; m: xilema; fl: floema; tjv: 
tejido vascular. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 18. Raíz de rábano, utilizado como control positivo en la prueba de DAB en brotes in 
vitro de B. lako. Barra equivalente a 50 µm. Localización de peróxido de hidrógeno indicada 
en color café: H2O2: peróxido de hidrógeno.  

 



46 
 

 
 

 5.6. Efecto del SNP en brotes in vitro de B. lako 

No se observó efecto de la concentración de SNP sobre el porcentaje de brotación (p = 0,27) 

(Figura 19a), el número de brotes (p = 0,65) (Figura 19b), ni en la longitud del brote de mayor 

tamaño (p = 0,54) (Figura 19c).  

   
Figura 19. a. Efecto de los diferentes tratamientos de SNP sobre a. la brotación in vitro de B. 
lako, según una prueba de Chi cuadrado de Pearson; b. el promedio de brotes por yema, según 
una prueba de Chi cuadrado de Pearson y c.  la longitud del brote más largo luego de dos 
semanas de cultivo in vitro de B. lako desde su establecimiento, según una prueba de Tukey. 
n=36 (0 mM), n= 43 (0,5 mM), n= 34 (1,5mM) y n= 31 (3,0 mM). 

 

 



47 
 

 
 

El oscurecimiento avanzó de manera progresiva, esto se evidenció con la reducción de los 

brotes de B. lako en todos los tratamientos de SNP y el testigo (Figura 20).  Los brotes in 

vitro de B. lako cultivados en el control evidenciaron oscurecimiento a partir de la tercera 

semana respecto a los otros tratamientos (Figura 20a), sin embargo, no se reportan diferencias 

estadísticas (p = 0,32), por otro en el tratamiento con 0,5 mM de SNP en la semana cinco 

presentó una menor cantidad de brotes oscurecidos en comparación a los demás tratamientos