ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia del cerebro de ratas de la cepa Wistar Standarization of a Protocol of Immunohistochemistry for the Detection of Brain Microglia in Wistar Rats Karol Ramírez Chan DDS, MSc, PhD¹,²; Jaime Fornaguera-Trías PhD²,³ 1. Facultad de Odontología, Universidad de Costa Rica, Costa Rica. 2. Centro de Investigación en Neurociencias, Universidad de Costa Rica, Costa Rica. 3. Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica, Costa Rica. Autor para correspondencia: Dra. Karol Ramírez Chan - karol.ramirez@ucr.ac.cr Recibido: 28-VI-2017 Aceptado: 29-VI-2017 Publicado Online First: 3-VII-2017 DOI: http://dx.doi.org/10.15517/ijds.v0i0.29698 RESUMEN Objetivo: Estandarizar un protocolo de inmunohistoquímica que se ha utilizado ampliamente en ratones de la cepa C57BL/6J para identificar microglia del sistema nervioso central en ratas de la cepa Wistar. Materiales y Métodos: La presente actividad de investigación se llevó a cabo en dos partes. En la primera parte se implementó un protocolo de inmunohistoquímica para identificar la microglia en el sistema nervioso central de 6 ratas de la cepa Wistar. Se utilizó un anticuerpo primario para rata y un anticuerpo secundario específico para el primario. Una vez establecido el protocolo en cerebro de ratas, se pasó a la segunda parte en donde se produjo un reto inmunológico con la aplicación intraperitoneal de lipopolisacárido en 2 ratas de la cepa Wistar, con el fin de evidenciar los cambios en la morfología de la microglia. Resultados y Discusión: Demostramos que sin realizar grandes modificaciones al protocolo original, este también puede utilizarse para la identificación de microglia en ratas adultas de la cepa Wistar. El establecimiento de este protocolo permitirá estudiar de una mejor manera la interacción bidireccional que se da entre el cerebro y el sistema inmunológico, en condiciones homeostáticas y ante diferentes estímulos fisiológicos y patológicos. PALABRAS CLAVE Inmunohistoquímica; Ratas cepa Wistar; Microglia. RAMÍREZ K., FORNAGUERA J., 2017: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia del cerebro de ratas de la cepa Wistar.-ODOVTOS-Int. J. Dental Sc., 19-3 (September-December): 45-59. 44 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 45 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia ABSTRACT Objective: Standardize a protocol of immunohistochemistry that has been widely used in C57BL/6J mice to identify microglia of the central nervous system in Wistar rats. Materials and Methods: This research activity was carried out in two parts. In the first part, a protocol of immunohistochemistry was implemented to identify microglia in the central nervous system of 6 Wistar rats. A primary antibody with reactivity to rat and a specific secondary antibody to the primary were used. Once the protocol was established in rats' brains, an immunological challenge was produced with the intraperitoneal application of lipopolysaccharide in 2 Wistar rats, in order to evidence the changes in microglia morphology. Results and Discussion: We demonstrate that without making major modifications to the original protocol, it can also be used to identify microglia in adult Wistar rats. In the near future, this immunostaining protocol will be applied to elucidate the bidirectional interaction between the brain and the immune system, under homeostatic conditions and different physiological and pathological stimuli. KEYWORDS Immunohistochemistry; Wistar rats; Microglia. INTRODUCCIÓN En cuanto a su función inmunológica, la microglia está constantemente resguardando Entre el sistema nervioso central (SNC) el microambiente que ¨vigilan¨, en defensa de y el sistema inmune existe una comunicación patógenos o daños al tejido cerebral o de la bidireccional evidente frente a diferentes estímulos médula espinal, por lo tanto, ejercen una función fisiológicos y patológicos. Uno de los componentes neuroprotectora. Al igual que otras células de más importantes del sistema neuroinmunológico origen mielopoyético, la microglia expresa una lo constituye la microglia, que son las células variedad de receptores para el reconocimiento de primarias de defensa del SNC. La microglia patógenos, para neurotransmisores y también para se deriva de células mieloides primitivas, las hormonas (11, 12). La activación de la microglia cuales, durante la embriogénesis, migran del saco es desencadenada por diferentes estímulos y embrionario al SNC y permanecen en el cerebro a provoca un cambio en su morfología, haciendo lo largo de toda la vida (1 ,2 ,3). En condiciones que sus procesos celulares se retraigan y se vean homeostáticas o de equilibrio dinámico, la hipertróficas (13). microglia mantiene un estado proliferativo bajo, sin embargo, continuamente actúan como centinelas, El lipopolisacárido (LPS) es el componente ¨monitoreando¨ el ambiente a través de una mayoritario de la membrana externa de las bacterias activa extensión y retracción de sus procesos o Gram negativas y es el antígeno superficial más ramificaciones celulares (4). La microglia responde importante de estos microorganismos. El LPS rápidamente cuando hay algún daño extendiendo está compuesto por una región lipídica y una sus procesos celulares (5, 6). Estudios recientes glicosídica con funciones separadas y/o sinérgicas han reportado que la microglia tiene una función lo que hace de esta molécula uno de los factores significativa en el mantenimiento de la sinapsis de virulencia más complejos (14). El LPS ha sido neuronal (7), participan en la remoción de neuronas ampliamente utilizado como una herramienta para que han pasado por un proceso de apoptosis (8) y activar la microglia y las células del sistema inmune juega un papel importante en la modificación de la periférico (15). Se ha demostrado consistentemente conectividad neuronal (9, 10). que la administración periférica de LPS induce la 46 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 47 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia activación de estas células en todo el cerebro (16). la cognición y desórdenes emocionales, tales Esta activación se manifiesta en cuestión de horas, como la ansiedad y la depresión (21, 22, 23) observándose un pico máximo desde las 8 hasta consideramos de gran relevancia, en esos mismos las 24 horas, dependiendo de la concentración de contextos, estudiar las características y actividad la endotoxina aplicada (16). En su estado activado, de la microglia, para entender mucho mejor el la microglia adquiere funciones similares a las del funcionamiento cooperativo del sistema nervioso macrófago, incluyendo la proliferación celular, y el inmunológico en las ratas. funciones fagocíticas y la producción de citoquinas pro inflamatorias, citoquinas anti-inflamatorias La estandarización de esta técnica se llevó (17), quimiocinas y mensajeros secundarios tales a cabo en dos partes. En la primera parte se como óxido nítrico y prostaglandinas. El LPS es implementó un protocolo de inmunohistoquímica un ligando específico del receptor TLR4 y se ha para identificar la microglia del SNC. Esta técnica convertido en una sustancia muy popular para comúnmente se ha utilizado en ratones de investigar las respuestas de las células gliales diferentes cepas y el objetivo, como se mencionó a estímulos neuroinflamatorias, simulando el anteriormente, fue validarla en ratas albinas, de entorno neuronal en diferentes trastornos del la cepa Wistar. Una vez establecido el protocolo sistema nervioso central (18). en cerebro de ratas, se pasó a la segunda parte en donde se produjo un reto inmunológico con Con el objetivo de estudiar las funciones a la aplicación intraperitoneal aguda de LPS, nivel molecular y morfológico de la microglia durante para evidenciar los cambios morfológicos de la condiciones homeostáticas y neuroinflamatorias, se microglia. Para estudiar los mecanismos que han establecido diversos protocolos para identificar interactúan en la respuesta inflamatoria en el SNC, las células gliales y macrófagos del cerebro en es crucial identificar la microglia, ya que son las modelos animales experimentales (19). Una vez principales células efectoras en este sistema de detectadas, estas células pueden ser analizadas la respuesta neuroinmunológica ante diferentes utilizando diferentes técnicas de laboratorio para estímulos, mediante su activación y liberación de hacer una caracterización inmunológica, genética y moléculas tales como citoquinas, quimiocinas, y protéica (19). Por ejemplo, si se quieren evidenciar factores de crecimiento (17). los cambios morfológicos que se dan por la activación de microglia, se puede recurrir a técnicas de METODOLOGÍA inmunotinción utilizando una molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba-1) (20). Los procedimientos experimentales se realizaron respetando la reglamentación del Uno de los modelos animales más populares Ministerio de Ciencia y Tecnología de Costa Rica para el estudio biológico y molecular es sin lugar a para el cuidado y uso de animales de laboratorio duda el modelo en roedores de laboratorio. Gracias y fueron aprobados porel Comité Institucional a estos modelos experimentales, se ha podido Para El Cuido y Uso de Animales (CICUA) de la entender la respuesta inmunológica del SNC. Universidad de Costa Rica. En muchas investigaciones relacionadas con el funcionamiento de la microglia se han utilizado los Como se mencionara arriba, se intenta ratones como sujetos experimentales, pero dado estandarizar un protocolo previamente utilizado en que otros experimentos utilizan la rata como sujeto ratones de la cepa C57BL/6J (24), para identificar para estudiar el desarrollo y la función del SNC microglia de la corteza e hipocampo de ratas y periférico y su relación con el comportamiento, macho de la cepa Wistar de mediana edad (330 46 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 47 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia días). Se utilizaron en total 8 animales macho el hipocampo y la corteza parietal cerebral. provenientes del Bioterio del Laboratorio de Ensayos Luego, los cortes se colocaron en porta objetos Biológicos (LEBI) de la Universidad de Costa Rica. y se guardaron a 4 °C hasta el día del análisis. Fueron trasladados al laboratorio del Centro de El día del marcaje, los cortes que estaban en los Investigación en Neurociencias (CIN) y alojados portaobjetos fueron sacados de refrigeración y bajo condiciones control estándar (3 animales utilizando PBS fueron "soltados" e incluidos en por jaula en una caja #5 transparentes, 37.5 x 22 un recipiente de 6 pozos con 1X PBS (por sus x18 cm) con un ciclo luz-oscuridad de 12 horas siglas en inglés Solución Salina Buferizada) (de (6:00 am-6:00 pm); temperatura 25°C ± 1.20°C; 3 a 4 cortes por pozo) para hacer el lavado. Se humedad relativa 78-87% y aproximadamente lavaron los cortes con 1x PBS durante 3 minutos. 10 recambios de aire por hora. Los animales Se realizó un bloqueo inespecífico con 3% leche tuvieron acceso libre a agua y alimento durante descremada 3% /0.3% triton en 100 mls de 1X todo el periodo de alojamiento. Todas las jaulas PBS y se incubó durante una hora a temperatura fueron limpiadas, el material de cama (burucha ambiente. Luego se procedió a remover la de madera) reemplazado, y el alimento y comida solución de bloqueo aspirando con una pipeta. Se rellenado dos veces por semana. incubaron los cortes de tejido cerebral por 24 hrs a 4°C con el anticuerpo primario Anti-Iba1 de la Primera Parte: Se utilizaron 6 animales casa comercial abcam (cabra), 1:1000 con 1x PBS de mediana edad (330 días post-natal) a los para la detección de las células de la microglia. cuales se les realizó una perfusión intracardiaca. Se utilizó como marcador la proteína Iba1, que Brevemente se anestesiaron mediante administración se expresa de forma específica en macrófagos intraperitoneal de Ketamina (75mg/kg) y Xilacina y en células de la microglia, y que es regulada (10mg/kg). Se llegó al tórax, en donde se practicó positivamente ante la activación de dichas células una punción en el ápex cardiaco con una cánula (25). Se lavó 3 veces con 1x PBS. Cada lavado de 27G y se realizó una incisión en la aurícula tuvo una duración de 5 minutos. Para Iba-1: se usó derecha del corazón para facilitar el drenaje de la Donkey anti goat (green, 488), 1:500 con 1%BSA/ sangre, que luego fue siendo sustituida por suero PBS (de la casa commercial Life Technologies). fisiológico. La perfusión se realizó inicialmente Se colocó DAPI en una proporción de 1:500 para con solución salina (0.9%) a 4°C; utilizada marcar los núcleos de las células. El proceso de como solución de lavado. Cuando se observó incubación fue de 24 horas a 4°C. Se lavó 3 veces un blanqueamiento de los órganos, se cambió a con 1XPBS. Cada lavado duró 5 minutos. Los solución fijadora de formaldehido al 4% y fosfatos. cortes fueron colocados en portaobjetos, en donde Se utilizó un volumen de aproximadamente se dejaron secar por un periodo de 1 a 2 horas. 200ml de cada solución, por animal,. Al finalizar Posteriormente los cortes fueron protegidos con el protocolo, luego de pasar el fijador, se extrajo una lámina cubre objetos con fluoromount-G (de el cerebro y se almacenó en un tubo cónico con la casa commercial Southern Biotech). Una vez así 20 mL de solución de infiltración. Posteriormente, los cortes estuvieron listos para ser analizados al los cerebros se transfirieron a una solución de microscopio de fluorescencia, (Nikon Intensilight sacarosa al 30 % y se mantuvieron en ese medio y C-HGFI) con el cual se tomaron diferentes fotos a 4°C durante 72 horas aproximadamente. de los cortes de las dos regiones cerebrales escogidas a aumentos de 10x, 20x y 40x. Posteriormente y utilizando un criostato, se realizaron entre 5 a 10 cortes coronales de Cabe recalcar que dado que se estaba 30um de espesor en dos regiones cerebrales: tratando de realizar una estandarización de la 48 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 49 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia técnica, no se escogieron imágenes de regiones excluyendo la tinción de fondo (27). Es decir, el particulares del hipocampo o de la corteza parietal área ocupada por inmunoreactividad Iba-1 se en cada uno de los cortes analizados, sino que determinó midiendo el número de píxeles por encima se escogieron, a manera de ejemplo, aquellas de un valor umbral establecido y expresado como un imágenes de los cortes en las que se vieran porcentaje del total de píxeles en el campo del claramente las células marcadas. microscopio (28). En cada imagen representativa se reportó el área proporcional según el análisis Segunda Parte: se utilizaron las dos ratas hecho por Image J para esa imagen en específico. restantes (aproximadamente de 330 días de edad) El área proporcional reportada para cada imagen que se mantuvieron en las mismas condiciones que coincidió con los rangos reportados en la literatura los animales de la primera parte. Se les administró (24, 27, 29, 30). A la hora de valorar los resultados intraperitonealmente LPS a diferentes dosis: a una obtenidos es importante reiterar que en este rata se le administró una dosis de 0.5mg/kg y a experimento se intentó estandarizar un protocolo la otra una dosis de 1mg/kg (en un volumen de normalmente utilizado en ratones, para ratas de la 2.4 microgramos de LPS por microlitro de agua cepa Wistar. Es un estudio de carácter puramente destilada). El propósito de utilizar estas dosis fue descriptivo y no se realizaron análisis estadísticos intentar establecer una dosis ideal para estimular para comparar los diferentes cortes analizados. la activación de microglia, basada en la literatura (16). Luego de 16 horas, los animales fueron RESULTADOS eutanasiados y perfundidos como se describió en la Primera Parte. Posteriormente el protocolo eso ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO DE LA de inmunomarcaje y la toma de fotografías de las EXPRESIÓN DE IBA 1 EN CEREBRO DE RATA imágenes también fue el mismo descrito para la primera parte. Las secciones de hipocampo y corteza cerebral se prepararon de acuerdo al protocolo Las imágenes en la primera y en la segunda descrito en la sección de materiales y métodos. En parte fueron analizadas utilizando un programa de el parénquima del hipocampo (Figura 1) y corteza libre acceso para el procesamiento de imágenes cerebral (Figura 2) se encontraron células que (Image J), utilizando un protocolo de la Universidad reaccionaron positivamente al anticuerpo Iba-1 de Chicago del Centro Integrado de Microscopia, (específico para microglia). En la Figura 1C con creado por Christine Labno. Específicamente, para flecha amarilla, se observa una de estas células cuantificar los cambios fenotípicos en la microglia, con un citoplasma escaso y con prolongaciones se llevó a cabo un análisis digital de las imágenes en delgadas. Esta morfología es distintiva y es las que se observaban mejor las células marcadas consistente con descripciones clásicas de con el anticuerpo Iba-1 (de ahora en adelante microglia ramificada. El área porcentual que imágenes representativas) (26). Se estableció un ocupa la microglia en la Figura 1A es de 1.74 % límite para el marcaje positivo para cada imagen y en la Figura 2A es de 0.71%. En las Figura y se realizó un escaneo densitométrico de estos 2C se muestra con una flecha roja un ejemplo límites establecidos, utilizando el programa ImageJ de células que también se encontraron con del Instituto Nacional de Salud de los Estados morfología similar a los macrófagos, con un Unidos. El área proporcional se reportó como núcleo redondo, citoplasma abundante y procesos el área porcentaje de área en el límite positivo cortos y delgados, también consistente con la para cada imagen representativa, incluyendo morfología de la microglia. La distribución de el cuerpo celular y los procesos celulares, pero la microglia fue generalizada en ambos tejidos, 48 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 49 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia es decir estaba distribuida por todo el corte Estas células, tienen un cuerpo alargado y se de tejido cerebral. Además de la microglia adhieren cerca de los vasos sanguíneos. Basados ramificada, las células perivasculares también en su morfología y localización y por la descripción se marcaron positivamente para Iba1 como se que se da en estudios clásicos (31), parece ser observa en la Figura 3C con una flecha roja en microglia perivascular. El área porcentual que un corte representativo de la corteza izquierda. ocupa la microglia en esta imagen es de 2.11%. A B C Figura 1. Hipocampo Derecho. Microscopía de fluorescencia que muestra el inmunomarcaje de microglia en el parénquima de un corte coronal de cerebro de rata de mediana edad de 30 μm de grosor, tomado a una magnificación de 20X. En A se observa el antígeno Iba1 (verde) de la microglia detectado con el anticuerpo primario anti-Iba1 unido a un anticuerpo secundario con el marcador Alexa Fluor 488 acoplado. En B se observan los núcleos de las células que fueron marcados con DAPI (azul). En C Traslape de las imágenes A + B = C. La flecha amarilla muestra microglia ramificada y en el recuadro se muestra la imagen ampliada de la misma. A B C Figura 2. Corteza Derecha. Microscopía de fluorescencia que muestra el inmunomarcaje de microglia en el parénquima de un corte coronal de cerebro de rata de mediana edad de 30 μm de grosor, tomado a una magnificación de 20X. En A se observa el antígeno Iba1 (verde) de la microglia detectado con el anticuerpo primario anti-Iba1 unido a un anticuerpo secundario con el marcador Alexa Fluor 488 acoplado. En B se observan los núcleos de las células que fueron marcados con DAPI (azul). En C Traslape de las imágenes A + B = C. La flecha roja muestra microglia con una morfología parecida a los macrófagos cerebrales y en el recuadro se muestra la imagen ampliada de esta célula. 50 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 51 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia A B C Figura 3. Corteza Izquierda. Microscopía de fluorescencia que muestra el inmunomarcaje de microglia en el parénquima de un corte coronal de cerebro de rata de mediana edad de 30 μm de grosor, tomado a una magnificación de 20X. En A se observa el antígeno Iba1 (verde) de la microglia detectado con el anticuerpo primario anti-Iba1 unido a un anticuerpo secundario con el marcador Alexa Fluor 488 acoplado. En B se observan los núcleos de las células que fueron marcados con DAPI (azul). En C Traslape de las imágenes A + B = C. La flecha roja muestra microglia perivascular y en el recuadro la imagen ampliada de esta célula. EXPRESIÓN DE IBA1 EN MICROGLIA ACTIVADA es de 4.44% y en la imagen representativa de EN RESPUESTA A LPS hipocampo de la rata inyectada con 1.0 mg/kg de LPS (Figura 4G), el área porcentual ocupada por la Luego de la administración intraperitoneal microglia es de 11.12% . Se observa un cambio de de LPS se observaron cambios prominentes en morfología más evidente con la dosis de 1mg/kg la morfología de la microglia en el hipocampo (Figura 4G,4I, 5G y 5I), sin embargo ya se observa (Figura 4) y la corteza cerebral (Figura 5). El activación de microglia con la dosis de 0.5mg/ cambio de morfología consistió en retracción de kg (Figura 4D, 4F, 5D y 5I). Finalmente, el área los procesos o ramificaciones y la conversión a porcentual ocupada por la microglia en la imagen un fenotipo ameboide. El área porcentual de representativa de corteza cerebral control (Figura la microglia en la imagen representativa del 5A) es de 2.28%, en la imagen representativa de hipocampo control (Figura 4A) es de 1.69%, en corteza cerebral de la rata inyectada con 0.5mg/kg la imagen representativa del hipocampo de la de LPS (Figura 5D) es de 5.92% y de 16.77% para rata inyectada con 0.5mg/kg de LPS (Figura la imagen representativa de corteza cerebral de la 4D), el área porcentual ocupada por la microglia rata inyectada con 1.0 mg/kg de LPS (Figura 5G). 50 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 51 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia A B C D E F G H I Figura 4. Hipocampo Izquierdo. Microscopía de fluorescencia que muestrael inmunomarcaje de microglia en el parénquima de un corte coronal de cerebro de rata de mediana edad de 30μm de grosor, tomado a una magnificación de 20X. En A, D y G, se observa el antígeno Iba1 (verde) de la microglia detectado con el anticuerpo primario anti-Iba1 unido a un anticuerpo secundario con el marcador Alexa Fluor 488 acoplado. En B, E y H se observan los núcleos de las células que fueron marcados con DAPI (azul). En C, F e I Traslape de las imágenes. CON=Control; LPS= lipopolisacárido. 52 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 53 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia A B C A B C A B C Figura 5. Corteza Izquierda. Microscopía de fluorescencia que muestra el inmunomarcaje de microglia en el parénquima de un corte coronal de cerebro de rata de mediana edad de 30 μm de grosor, tomado a una magnificación de 20X. En A, D y G, se observa el antígeno Iba1 (verde) de la microglia detectado con el anticuerpo primario anti-Iba1 unido a un anticuerpo secundario con el marcador Alexa Fluor 488 acoplado. En B, E y H se observan los núcleos de las células que fueron marcados con DAPI (azul). En C, F e I Traslape de las imágenes. CON=Control; LPS= lipopolisacárido. 52 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 53 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia DISCUSIÓN asegurarlo debería validarse este protocolo en diferentes condiciones, en diferentes regiones La microglia son las células principales cerebrales, entre otras. Actualmente, la técnica de de defensa del cerebro y juegan un papel crítico inmunohistoquímica es una de las más utilizadas en la mediación de las respuestas inmunes para identificar las células de microglia. Para ello, celulares del SNC. Consecuentemente, una parte existen anticuerpos contra proteínas específicas de fundamental de cualquier intento por entender estas células. La molécula adaptadora de unión a cómo funciona el cerebro como un todo, es la calcio ionizado 1 (Iba1) es una proteína específica investigación de estas células y de su relación con de células de microglia y macrófagos cerebrales, las otras células nerviosas. Con este propósito, los que no se expresa ni en neuronas, ni tampoco en marcadores inmunohistoquímicos han emergido astrocitos (31) y es muy utilizada como marcador como una de las herramientas más valiosas de microglia (34). Es una proteína pequeña de 17 de los neurocientíficos. Utilizando anticuerpos kDa formada por 147 aminoácidos, que marca el contra diferentes componentes celulares, se cuerpo celular y las dendritas de las células. pueden identificar células que expresan un fenotipo y, más aún, se puede obtener información El gen Iba1 se encuentra dentro del complejo acerca de sus características morfológicas y mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase III expresión de proteínas específicas. Por ejemplo, (35). Los CMH también son utilizados para detectar el inmunomarcaje permite demostrar antígenos microglia. Hay tres tipos de CMH: de clase I, II y presentes en las células o tejidos utilizando III y específicamente el de clase II es un marcador anticuerpos. Esta técnica se basa en la capacidad de células activas presentadoras de antígenos, de los anticuerpos de unirse específicamente a involucradas en la respuesta inmune. La microglia los correspondientes antígenos y esta reacción se comporta como una célula presentadora de es visible sólo si el anticuerpo está marcado con antígeno en el cerebro, por lo que la utilización una sustancia que absorbe o emite luz o produce de CMH también es útil para estudiar la actividad coloración (32). La técnica de inmunohistoquímica de estas células (36). La desventaja de utilizar el evidencia una molécula o familia de moléculas marcador CMH es que éste se expresa únicamente presentes en una sección histológica y muestra en una subpoblación de estas células (37,38). A su distribución tisular “in situ" (32). Así mismo, la pesar de esto, el marcador más utilizado para conjugación o combinación de los anticuerpos con detectar la microglia activada en cortes post- enzimas o con sustancias fluorescentes permite mortem de cerebro humano, particularmente en detectar cantidades de moléculas presentes en los cerebros con alguna patología asociada, es el tejidos (33,32). antígeno leucocitario humano HLA-DR (un tipo de receptor del CMH clase II). La microglia que En estudio se estandarizó un protocolo para da positivo al HLA-DR adquieren una variedad de el reconocimiento de las células de la microglia morfologías cuando son activadas por diferentes utilizando inmunohistoquímica. Este protocolo estímulos, no solo patológicos, sino también por normalmente se ha utilizado en ratones para los diferentes estados de diferenciación y por los mismos fines y no le hicimos modificaciones la localización que tienen en el cerebro (13). sustanciales para poder detectar estas células El marcador Iba1 junto con CD68 se utilizan en otros roedores. Estos resultados entonces ampliamente para identificar la microglia en cerebros amplían el rango de acción de un mismo protocolo de humanos post-mortem, sin embargo, con estos e incluso podrían permitir proyectar resultados dos marcadores no se pueden evidenciar los a especies diferentes. Por supuesto para poder cambios específicos en el fenotipo (13). 54 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 55 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia Otras proteínas que se han utilizado para el Parkinson (50,51). De hecho, ya hay estudios marcaje de microglia son proteínas específicas de clínicos piloto que han estudiado el impacto que macrófagos: ED-1, ED-2 y ED-3 (39). Sin embargo, tiene la inhibición de la microglia (por ejemplo, con la desventaja de utilizar estas proteínas es que Minociclina) en la progresión de enfermedades estudios previos han documentado que la señal de neurodegenerativas (52,51,54,55). De tal forma el ED-1 coincide con la de Iba1, pero no reacciona LPS, como estimulante del sistema inmunológico, contra la microglia ramificada (37). También se resulta útil y válido para estudiar los mecanismos han utilizado las proteínas OX41, OX42 (40, 41, relacionados con la activación de la microglia. 37), OX3, OX6, OX18, ED1, Mac-1, F4/80 y 5D4, todas estas se expresan en microglia, monocitos y CONCLUSIONES macrófagos (42). El protocolo que se usó en este trabajo Cuando hay señales de activación, como normalmente se ha implementado para estudiar la con LPS, la microglia cambia su morfología de microglia en ratones y específicamente de la cepa “ramificadas” a “desramificadas”, se encojen sus C57BL/6J. Lo único que se modificó del protocolo prolongaciones, y el soma o cuerpo celular se original fue el tipo de anticuerpo primario con hipertrofia (13). Estos cambios morfológicos son reactividad específica a la rata y por lo tanto también evidentes con la técnica de inmunohistoquímica, y el anticuerpo secundario contra la especie del la manera más evidente de detectar este cambio anticuerpo primario, en este caso cabra. Logramos de morfología es utilizando Iba1 (43). Además, demostrar que sin realizar grandes modificaciones cuando la microglia se activa se transforma a al protocolo original (24), este puede también un fenotipo ameboide, adquiriendo así funciones utilizarse para la determinación de la microglia en similares a los macrófagos (44,45). Se ha descrito ratas adultas macho de la cepa Wistar. que diferentes estímulos y/o señales inhibitorias regulan la activación de la microglia y si no hay El protocolo permite analizar la densidad una estimulación crónica, la microglia vuelve a microglial y la morfología de esa microglia. Se su fenotipo de “monitoreo”, el cuerpo celular se podrían hacer entonces estudios comparativos vuelve de nuevo ovalado y los procesos se tornan entre los tipos de microglia ramificada y ameboide largos y ramificados (46). en diferentes regiones cerebrales y la relación de estos parámetros con por ejemplo patologías, El LPS es una endotoxina bacteriana que activa cambios en el ambiente de los individuos e la microglia y puede llegar a causar neurodegeneración incluso en sus interacciones sociales. El estudio (47). Una sola inyección sistémica de LPS puede simultáneo de cambios en la microglia y en otras inducir la activación crónica de la microglia y células nerviosas, como neuronas y astrocitos, dependiendo de la dosis, esta activación puede de seguro permitirá establecer hipótesis sobre la acompañarse por pérdida de neuronas (48). Inclusive interacción entre células diversas en el sistema se ha reportado que el LPS aumenta la activación nervioso central, y su importancia funcional tanto de la microglia y concomitantemente acelera la en salud como en enfermedad. Eventualmente progresión de enfermedades neurodegenerativas conocer mejor las interacciones y los cambios (49). Entre las enfermedades neurodegenerativas celulares que se dan podría ayudarnos a encontrar que se han implicado con microglia activada están: y desarrollar terapéuticas para la prevención o el la Enfermedad de Alzheimer y la Enfermedad de tratamiento de enfermedades del SNC. 54 ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No.19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. ODOVTOS-Int. J. Dent. Sc. | No. 19-3: 45-59, 2017. ISSN:1659-1046. 55 ODOVTOS-International Journal of Dental Sciences Ramírez & Fornaguera: Estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para detectar microglia AGRADECIMIENTO 7. Wake H., Moorhouse A. J., Jinno S. et al. Resting microglia directly monitor the Los autores agradecen a la Ing. Adriana functional state of synapses in vivo and Saborío y la Lic. Andrea Mora por la ayuda técnica determine the fate of ischemic terminals. The en el desarrollo de esta actividad de investigación. Journal of neuroscience: the official journal También agradecemos el préstamo del microscopio of the Society for Neuroscience 2009; 29 por parte del Laboratorio de Investigación y (13): 3974-80. Capacitación en Ciencias de la Facultad de 8. Sierra A., Encinas J. M., Deudero J. J. et al. Odontología, Universidad de Costa Rica. El LPS fue Microglia shape adult hippocampal neurogenesis donado por el Dr. Edgardo Moreno del Instituto through apoptosis-coupled phagocytosis. Clodomiro Picado, Universidad de Costa Rica. Cell stem cell 2010; 7 (4): 483-95. 9. Tremblay M., Lowery R. L., Majewska A. CONFLICTO DE INTERÉS K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Nada por aclarar. 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