Estimation de dosis genica mediante PCR-multiplex y electroforesis capilar fluorescente en posibles portadoras de deleciones en el gen de la distrofina, Costa Rica 1998- 2000 Jorge Azofeifa, Vanessa M. Sancho-Fernandez Eliologos, genetistas, Institute de Investigaciones en Salud (INISA) y Escuela de Biologia, Universidad de Costa Rica Correspondencia: Dr. Jorge Azofeifa, Institute de Investigaciones en Salud (INISA), Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria, San Jose, Costa Rica. Fax: ++506 2075130; correo electrOnico: azoferfa@brologia.ucr.ac.cr Acta Pediatrica Costarricense 2001.Volirmen 15, Numero 2. Objetivo. Estimar Ia dosis genica en el gen de Ia distrofina a mujeres a riesgo de ser portadoras de deleciones. Sitio de realization. INISA y Escuela de Biologia, Universidad de Costa Rica. Materiales y metodos. Se obtuvo ADN de 15 mujeres, emparentadas por linea materna con pacientes afectados con DMD o BMD causadas por deleciones en el gen de Ia distrofina, y que por lo tanto podrian ser portadoras de esas mutaciones, para amplificar de 7 a 9 regiones del gen por medio de PCR-multiplex. Para estimar Ia dosis genica, se marco uno de los imprimadores (el F) de cada par con el fluorocromo 6-FAM; los productos de amplificacion se separaron y se cuantifrcaron por electroforesis capilar fl uorescente. Resultados. Todas las posibles portadoras mostraron dosis genicas como las de mujeres sin deleciones. Conclusiones. El resultado indica que todos los pacientes son producto de mutaciones de novo, lo que es inesperado, pues datos de otros paises muestran que ese es el caso de a solo 1/3 de los pacientes. Ademas, Ia evaluation ofrece mejores elementos de juicio para brindar consejo genetico. Palabras clave: Distrofina, Duchenne, Becker- Kiener, portadoras, deleciones, herencia ligada al cromosoma X, PCR, electroforesis capiiar fiuorescente, dosis genica. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) (1, 2) y la distrofia muscular de Becker- Kiener (BMD) (3) representan en conjunto mas del 40% de la prevalencia total estimada de distrofias musculares (4). Ambas enfermedades son alelicas, esto es, producidas por mutaciones en el mismo gen, el de la distrofina par lo que se les conoce coma distrofinopatias (5). El modo de herencia es recesivo, ligado al cromosoma X (6, 7) por lo que los afectados son mayoritariamente varones que reciben la mutation en el cromosoma X heredado de sus madres (2, 6, 7), aunque un 8% de las mujeres heterocigotas, esto es, portadoras, presentan diversos sintomas (8). El gen, que es el mas grande descubierto hasta ahora, esta compuesto por al menos 79 exones y abarca 2.4 megabases (9) de la region Xp21 (10). El producto genico,• la distrofina, es, en su forma mas extensa, una proteina de 427 kDa que se encuentra en la cara interna del sarcolema asociada a un complejo de proteinas conocidas coma el complejo de glicoproteinas asociado a la distrofina (DAGC) (11). La DMD es la mas frecuente con una incidencia de 1:3500 nines varones nacidos vivos (4) y Ia mas severe de ambas formas de distrofinopatia, terminando su progresion con la muerte de los pacientes alrededor de los 20 afios de edad (5). La BMD, con una incidencia de 1:18500 (4) es menos severe; algunos de los pacientes Ilegan incluso a reproducirse (7). La mayor parte, dos tercios, de las mutaciones que causan las distrofinopatias son deleciones, o perdidas de material genetico del gen (12). Del 5 al 10% de los casos (13), con un notable 14% en Japan (14), son duplicaciones. El resto se deben a mutaciones de punto(15) e inversiones (16). El conocimiento de la estructura genica y del patron de mutaciones ha permitido desarrollar tecnicas moleculares para detectar Ia mayor parte de las mutaciones utilizando PCR-multiplex (17, 18), una variante de la PCR que permite amplificar, en una Dnica reaction, haste nueve segmentos del gen de la distrofina. Como la 64 distribucitin de las deleciones no es aleatoria, sino que se concentra alrededor de 2 regiones,. Ia utilizaciOn de los dos combinaciones de imprimadores permite detectar mas del 98% de las deleciones (18). Este metodologia se utilizo para buscar deleciones en pacientes aparentemente distrofinopaticos en Costa Rica (19). Una variante de la PCR-multiplex se puede user pare evaluar si mujeres que, por ser parientes en primer grado per parte materna de pacientes con deleciones, podrian ser portadoras de esas mismas mutaciones y asi ser madres potenciales de ninos afectados con estas graves enfermedades. La mutation que los pacientes reciben de sus madres puede haberse heredado porque ella es portadora o porque la mutation se ha producido de novo, esto es, en la linea germinal de la madre. SegLan sea el case, las consecuencias pare el consejo genetico son diversas. Vale recordar que por probabilidades, la mitad de los hijos varones de las mujer portadoras de una mutacian en un rasgo ligado al cromosoma X padecen de la enfermedad, y la mitad de sus hijas seran portadoras al igual que ellas, por el contrario, si las mujeres no son portadoras tienen un riesgo equivalente a la incidencia de Ia enfermedad en la poblacion, lo que senala la importancia de determiner el status de estas mujeres para efectos de consejo genetic° La variante de la tecnica consiste en marcar los productos de amplification por PCR con una molecule fluorescente, lo que permite cuantificar el nOmera de molecules amplificadas segue sea la intensidad de la sena! durante la electroforesis capilar. Dos molecules rendiran el doble de seal fluorescente que una molecule. De este manera, una mujer normal tendria dos copies completes del gen de la distrofina y cada copia sirve de base pare que, per medio de la PCR, se amphfrquen molecules marcadas. Por el contrario, una mujer con deleciOn en uno de los dos genes de la distrofina tiene solo una copia complete del gen, por lo que solo tendra la mitad de las molecules, con respecto a una mujer normal, sirviendo come base pare la amplificaciOn de molecules marcadas. Asi, a partir de esa anica copia, se produce la mitad de molecules marcadas que produce una mujer normal en un proceso similar. Entonces, el nUmero de molecules marcadas producidas per medio de PCR es un reflejo de Ia dosis genica que tiene Ia mujer e indica si ella, Ia posible portadora, acarrea la misma delecion encontrada en el paciente indice de su familia. En este trabajo se estimaron las dosis geracas a mujeres emparentadas en primer grado, por via materna, con pacientes con deleciones en el gen de la distrofina, lo que les produce DMD o BMD (19), con el fin de tener mas y mejores elementos de juicio para brindarles consejo genetic° y para estimar el impacto de las mutaciones de novo en la incidencia de las deleciones en este gen en Costa Rica. MATERIALES Y METODOS Los sujetos de estudio. En un estudio anterior (19) se logrO determiner que algunos pacientes con DMD o BMD sufren Ia enfermedad per cause de deleciones en el gen de Ia distrofina. Esto permitia identificar a 15 mujeres, parientes en primer grado por via materna de 6 de estos pacientes, que tienen por lo tanto altas posibilidades de ser portadoras de las mutaciones que afectan a los pacientes indice de sus respectivas families. Elias son Ia madre, 8a,y tres hermanas, 8b, Sc y 8d, del paciente 8 (se usara el nOrnero del paciente designed° en Sancho et al.(19)), quien tiene una deleciOn del exan 19; la madre, 3a, y tres hermanas 3b, 3c y 3d, del paciente 3, quien tiene una delecion del exon 44; la madre, 13a, del paciente 13, que tiene una delecion que abarca del eV:in 3 a! 25; la madre, 6a, y una hermana, 6b del paciente 6, afectado con una delecion que involucra a Ia region de los exones 45 al 50; la madre, 17a, /a ha, 17b, y la abuela materna, 17c, del paciente 17, con deleciOn de los exones 45 al 52; y Ia madre, 24a, del paciente 24, con delecion de los exones 45 al 50. En ninguno de los cases hay antecedentes de distrofinopatias. Muestras de ADN de estas mujeres se extrajeron de sangre total (Vacutainers con EDTA) usando el rnetodo de sal (20) y se usaron para cuantificar sus dosis genicas amplificando diversas regiones del gen de la distrofina mediante PCR-multiplex, usando los imprimadores y el principio disenados por Chamberlain et al. (17), y separando y cuantificando los productos de amplificacian mediante electroforesis capilar fluorescente (21). Los valores de referencia normales se obtuvieron determinando la dosis genica a 12 mujeres independientes, sin antecedentes de distrofinopatias en sus families. Ademas, se probe Ia sensibilidad del metodo estimando la dosis genica de una portadora obligada de una delecion (dos hermanos suyos ya fallecieron victimas DMt y su hijo mayor este tambien afectado y tiene una delecion de 37 exones, del 6 al 42 (19)), y de dos controles normales, una senora y un hombre. Tambien se hicieron amplificaciones de los pacientes indice y del hijo de la portadora obligada coma controles negatives de la amplification de sus exones deletados. 65 Las muestras de todas las personas se obtuvieron con su consentimiento informed° o el de sus representantes legales. Reacciones de amplificacitin por PCR-mOltiplex. Las amplificaciones se hicieron utilizando coma base Ia combination de 9 pares imprimadores (exones 4, 8, 12, 17, 19, 44, 45, 48 y 51) y el perfil de PCR de Chamberlain et al. (17) con los ajustes apuntados por Sancho et al. (19). Dos modificaciones adicionales se hacen necesarias pare poder evaluar la dosis *lice con electroforesis fluorescente. La primera es la utilization de uno de los imprimadores, (el F) del par correspondiente a cada exon a amplificar, marcado con un fluorocromo, en este caso 6- carboxifluoresceina o 6-FAM, en el extrema 5' de la molecule. Este modification permite tener una Unica sand fluorescente por molecule amplificada. La segunda modification fue la de reducir el ribmero de ciclos de amplification a 18, lo que hace que el riPmero de molecules obtenidas a ese punto sea proporcional al mamero de molecules iniciales, seen, las correspondientes al numero de regiones del gen, o dosis genica, al encontrarse la PCR en su fase logaritmica ya que amplificaciones de mas de 20 ciclos no guardan este relation (21). Asi, las portadoras de deleciones amplificaran la mitad de las molecules en Ia region a prober, dosis genica simple, con respecto a las mujeres con dos genes normales, cornpletos, dosis genicas dobles. Los controles de sensibilided de la prueba y las pacientes de los pacientes 8, 3 y 13 se amplificaron con 7 pares de imprimadores reduciendo asi el nivel de Complejidad de la reaction. Se dejaron por fuera a los exones 45 y 48 que en estas personas eran innecesarios pare efectuar Ia evaluation. Las pacientes de los pacientes 6, 17 y 24 se amplificaron con los 9 pares de imprimadores, pues el exon 45 era de los que habia que probar como posible deletado en esas families. Electroforesis capilar El anolisis mediante electroforesis capilar se hizo con un Analizador Genetic° ABI 310 (Applied Biosystems) utilizando el programa ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Data Collection, version 1.0.4 de la Corporation Perkin Elmer (1997), para la recoleccion de lo datos. El proceso fue gobernado con un computador Power PC de Macintosh equipado con un procesador G3. Los productos de amplification se diluyeron para las electroforesis capilares asi: amplificado 3p1; marcador de tamafio molecular (ROX 500 o ROX 1000) 0.5p1; formamida desionizada 10,5p1. Las diluciones se desnaturalizaron por 5 minutos a 95°C, pasandose la muestra de inmediato a hielo. La separaciOn de fragmentos se hizo en capilares de 47 cm x 50pm (No. 402839) utilizando el polimero "Performance Optimized Polymer 4 (POP4)" (No. 402838). Como sr:Audi:5n amortiguadora se use "310 Genetic Analyzer Buffer con EDTA" (No. 402824) diluida a 1X. El modulo utilized° fue GS STR POP (1m1) con 5 segundos de inyeccion a 15 kV. Las corridas fueron a 15kV por tiempos de entre 25 y 45 minutos. La matriz empleada fue la "Matrix Filter D" que se incluye en el programa como parte de su grupo basic°. Determination de la dosis genica en candidates a ser portadoras de deleciones Para determiner la dosis genica se usaron los valores de las areas de las sefiales correspondientes a los amplificados de cada exon. El procedimiento consistio en obtener rezones dividiendo el valor del area de cada exon entre los valores de las areas de los dernas exones. De esta manera se reducen los errores de variation entre diferentes reacciones de amplification. Los valores de las razones obtenidas en las posibles portadoras de deleciones se dividieron entre las razones correspondientes a los promedios de las 12 mujeres control. Si la mujer no es portadora de deleciones, sus razones han de ser equivalentes a las del promedio de las mujeres control, obteniendose por lo tanto valores de 1. Si por el contrario, la mujer es portadora de una delecion, los valores de sus exones deletados con respecto al promedio de las mujeres normales seran de 0.5 cuando el exon deletado sea el numerador, de 1.0 cuando la deletion involucra a varios exones, par lo que ambos estarian en dosis simples y las razones entre ellos son equivalentes a Las dosis dobies en las mujeres normales, o de 2.0 cuando el exon deletado sea el denominador. Estos valores se calcularon con el programa Excel 2000 (Microsoft, 1999) RESULTADOS Validation del metodo A. Los pacientes El metodo de electroforesis capilar fluorescente se probO incialmente en su especificidad para detectar los productos de amplificacion de la PCR-mOltiplex con controles normales y con pacientes que presentaron deleciones (Figura 1). De este manera se tienen controles positivos, los genes de los pacientes sin deletion y las regiones del gen no deletadas en los pacientes, y controles negativos, las regiones deletadas en los pacientes indice. El electroferograma de los productos de 66 C 4B: Sample5 / 26-3-01-Dys 11 / 26-3-01-Dys 11 del 6-42 150 .180 210 240 270 300 330 .360 .390 420 450 A 80- 0- B mujer normal exen 8 exon 4 exon 44 exon 51 exert 12 exon 17 axon 19 MIA 286 : Sample30 / 26-3-01-Dys 28 / 26-3-01-Dys 28 del 19 80: 0: 80: 0: mg 14B : Sample15 / 26-3-01-Dys 65 / 26-3-01-Dys 65 D. 80 0- del 3-25 NIB 16B: Sample17 / 26-3-01-Dys 80 / 26-3-01-Dys 80 Figura 1: Electroferogramas de los productos de amplification de PCR-multiplex usando 7 pares de imprimadores de una mujer control y tres pacientes afectados con diversas deleciones. Las flechas indican Ia ausencia de senales de aquellos exones que no amplificaron y por lo tanto se encuentran deletados. El panel 1A corresponde a una mujer normal donde aparecen los picos (senales) de los siete exones que amplifican para este grupo de irnprimadores. El panel 1B pertenece a un paciente que presenta delecion del exalt 19, por lo que, esta ausente el pico correspondiente a este exon. El panel 1C es de un paciente con una deleciOn que abarca los exones 6-42, por lo que no aparecen los picos de los exones 8, 12, 17 y 19. El panel 1D pertenece a un paciente afectado con Ia delecion de los exones 3-25, segan se muestra, estan ausentes los exones 4, 12, 8, 17 y 19. El area bajo los picos correspondientes a cada region amplificada es lo que sirve para cuantificar la dosis genica de las posibles portadoras. amplificaciOn de una mujer normal (panel 1A) muestra los siete picos correspondientes a cada uno de los exones amplificados, mientras que en los paneles 1B, 1C y 1D faltan los picos correspondientes segOn la delecion que tiene cada uno de los pacientes, B. Estimation de la dosis genica de una portadora obligada y de dos controles normales Para comprobar la sensibilidad del metoda en la detection de diferencias de dosis genica, se evaluaron las muestras de una portadora obligada de una delecion de los exones 6 al 42 y de dos controles normales, una mujer y un varon. El Cuadra 1 presenta las rezones de las areas de los distintos picos de estas muestras con respecto a las correspondientes a los promedios de las mujeres normales, las que se comparan los valores esperados (E). En el caso de la portadora obligada los valores coinciden con los esperados de acuerdo a la delecion presente en su hijo, mientras que los controles normales rnuestran valores equivalentes a los de los promedios de las mujeres normales, lo que muestra que el metodo es lo suficientemente confiable pare la cuantificaciOn de dosis genica 67 Posibtes portadoras dado que segun antecedentes de otros paises, estos son solo 1/3 de los casos observados. En et Cuadro 2 se muestran las razones obtenidas pare aquellas posibles portadoras cuya dosis genica se estim6 con el subgrupo de 7 pares de imprimadores. Para Ia familia del paciente n'8, se analizaron las razones obtenidas pare su madre (8a) y sus tres hermanas (8b, 8c, 8d). Los valores para cede exam tienden a 1 con excepciOn de algunos valores que involucran al exon 19. Para este exon los valores son algo superiares a 1, cuando se encuentra como numerador e inferiores cuando este como denominador. Esta variaciOn se observe para ese exon a lo largo de todo el estudio; de hecho, es de los que mayor desviaciOn estandar tiene en la estimacian de los promedios normales (dates no mostrados). Sin embargo, al considerarse en conjunto todas las razones obtenidas, se puede concluir que ni la madre ni las hermanas son portadoras de la deleciOn, pues las razones que con el se obtienen no se aproximan a los valores esperados en caso de que ellas to fueran, todo lo contrario se alejan de ese valor hacia los esperados en mujeres normales. El Cuadro 2 muestra tambien las razones de las familiares del paciente 3, madre (3a) y hermanas (3b, 3c, y 3d), asi como los de la madre (12a) del paciente 12. Las razones do todas son practicamente de 1, o sea, las correspondientes a mujeres con dosis genica normal, El Cuadro 3 presenta las razones obtenidas para aquellas posibles portadoras cuya dosis genica se estimO con los 9 pares de imprimadores; estas son, la madre, 6a, y la hermana, 6b, del paciente 6; la madre, 17a, una tia materna, 17b, y la abuela materna, 17c, del paciente 17, y la madre, 24a, del paciente 24. Las valoraciones indican que ninguna de ellas es portadora de la delecian encontrada en los pacientes Indic° de sus families. Merecen consideracOn aparte algunos de los valores obtenidos con las razones que involucran al exon 45 en la senora 17a, que podrian indicar que se trata de una portadora (45/19, 45/17, 45/8, 45/12, 45/44 y 45/4, 19/45 y 17/45). Esa posibilidad se descarta si se toma en cuenta que ella serfa portadora de una delecian del exon 45 al 52, que involucraria a los exones 48 y 51 inctuidos en la combination de imprimadores empleada y que rinden valores de mujer con dosis genica normal. Adernas, los valores de alrededor de 0.5 se observan aun en aquellas relaciones en que se esperan valores de 1.0, io que indica que esos valores se deben a algun artificio tecnico. Vistas en conjunto, los dates obtenidos indican que todos los pacientes indices parecen deber las deleciones que los afectan a mutaciones de novo, es decir ocurridas en la linea germinal de sus madres, resultado inesperado, DISCUSiON La disponibilidad de tecnicas que permiten el analisis de los defectos geneticos al nivel del ADN tiene impacto directo en el diagnostico diferencial y en el consejo genetic°, lo que a su vez tendria consecuencias positives en los sistemas de salud al poderse estimar el impacto epidemiolOgico de estos padecimientos y per lo tanto preparar al sistema pare enfrentarlos racionalmente. Asi, mientras la terapia genica siga siendo una promesa, la mejor forma de enfrentar estas enfermedades es la prevention; en este sentido, el consejo, genetico basado en pruebas mas discriminantes para determiner el genotipo de las posibles personas portadoras de genes de predisposition aumentada a enfermedades, deberia, en el mejor de los cases, contribuir a disminuir, primero, la carga emocional que pesa sobre las families con pacientes afectados con enfermedades geneticas y, segundo, la carga social que esos casos implican (22). El presente trabajo, que se derive de un estudio previo (19) es un primer paso para implementer tecnicas moleculares modernas, PCR-multiplex (17) , y electroforesis capilar fluorescente (21), en Costa Rica, con el fin de mejorar los critenos para ofrecer consejo genetic° a posibles portadoras de deleciones en el gen de la distrofina. La metodologia empleada result6 ser lo suficientemente especifica, como lo demostraron los controles negatives y positivos de deleciones (los pacientes indice de cada familia analizada y los controles normales) y lo suficientemente sensible para Ia determinaciem de diferencias en la dosis genica, como lo demostraron la pruebas en las muestras de la portadora obligada de una extensa delecion y las mujeres normales. Los valores algo atipicos observados con los exones 19 y 45 son probablemente debidos al hecho de que el perfit de las reacciones de amplification no es Optimo para todos los pares de imprimadores, esto es, no todos amplifican con la misma eficiencia pues sus ternperaturas aptimas de hibridaciOn y de polimerizacion difieren de un par a otro debido a sus diferentes secuencias. No obstante, la evaluaciOn conjunta de todas las pruebas, tomando en cuenta todas las variables disponibles, coma el conocimiento previo de la extension de la deleciOn en el paciente indice, come se hizo en el caso de la senora 17a y el exon 45, o el conocimiento del comportamiento de un exon en las muestras controles como el caso del exon 19 en la familia del paciente 8, permite alcanzar a conclusiones con un grade muy alto de Co nfi a bilidad. 68 En lo concemiente al consejo genetic°, los resultados permiten descartar, en gran medida, la posibilidad de que las mujeres a riesgo de ser portadoras de Ia delecien tengan una probabilidad significativamente aumentada de tener un hijo afectado por la misma mutation. No obstante, hay que tener en cuenta que las dosis genicas se evaluaron en tejido somatic° - leucocitos-, y que hay informes de que algunas mujeres pueden ser mosaicos (poseer celulas con la mutation y celulas normales) en sus tejidos germinales (23, 24). Un hallazgo inesperado fue el hecho de que ninguna de las mujeres a riesgo portara las deleciones que afectan a los pacientes indite de sus respectivas families. Esto se puede interpreter coma que las mutaciones que los afectan surgen por primera vez, de novo, en sus families, durante la oogenesis que produjo el Oyulo del que ellos se originan. SegOn la literature (25, 26) esto deberia ocurrir en solo un tercio de los casos. Aunque el niamero de families estudiadas es pequeno -seis-, si esa proportion se cumpliera tambien en Costa Rica, la probabilidad de que todos los pacientes estudiados seas mutaciones de novo seria muy baja, sea de (1/3)6 = 1.37 x 10-3. Este hallazgo senala un area de investigation muy interesante en epidemiologia genetica. Si lo observed° en este estudio se confirmara habria una indication de que Ia tasa de mutation en el gen de la distrofina es mas alta que en otros paises, coma parece ser en el norte, de la India (27) Este posibilidad se podria prober mediante la identification de un mayor nfirnero de pacientes con distrofinopatias, lo que edemas permitiria emptier el tamizaje de deleciones y asi aclarar otra aparente contradiccien observada anteriormente (19), que solo un 45% de los pacientes estudiados en Costa Rica presentan deleciones con respecto a lo descrito en otras cartes del rnundo (66%). Esto se puede lograr Unicamente con la colaboracidn de la comunidad medica nacional, en especial, la de los pediatras y neurologos, si refirieran a este tipo de paciente a la Unidad de Gendtica y Metabolismo del Hospital Nacional de Niaos CONCLUSIONES Todas las posibles portadoras mostraron dosis genicas que parecen compatibles con las de las mujeres sin deleciones. Esto anade mas y mejores elementos de juicio pare tomer en cuenta cuando se les brinde consejo genetic°. El resultado indica que todos los pacientes son producto de mutaciones de novo, lo que es inesperado, pues datos de otros paises muestran que solo 1/3 de los pacientes no heredan la mutation de madres portadoras. AGRADECIMIENTOS 'Al- senor Victor Castillo por su valioso trabajo tecnico. A los Ores. Manuel Saborio, Carlos de Cespedes y Ramiro Barrantes por su apoyo en diversas etapas del trabajo. La investigaciAn fue financiada por la Vicerrectorfa de Investigation de Ia Universidad de Costa Rica, Proyecto742-97- 253. Se conta tambien con Ia colaboracien de FUCODOCSA. REFERENCIAS 1. Duchenne GBA. De l'electrisation localisde et son Application a la Pathologic et a la Therapeutique. Pans: Bailliere et Fils, 1861. 2. Duchenne GBA. Recherches sur la paralyse musculaire pseudohypertrophique ou paralyse mio-sclerosique. Arch Gen Med 1868; 11:5-25, 179-209, 305-21, 421-43, 552- 88. 3. 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Duchenne muscular dystrophy: pathogenetic aspects and genetic prevention. Hum Genet 1984; 66: 17-40. 27. Sinha S, Mishra S, Singh V, Mittel RD, Mittel B. High frequency of new mutations in North Indian Duchenne/becker muscular dystrophy patients. Clin Genet 1996; 50:327-31. ABSTRACT Objective. To quantitate gene doses at the dystrophin locus in women at risk of being carriers of deletions. Place where the work was performed: INISA and Escuela de Biologic, Universidad de Costa Rica. Materials and methods. Fifteen women were identified in a previous study to be at increased risk of being carriers of deletions at the dystrophin gene -they are first-degree relatives of patients suffering from DMD/BMD which owe their affection to deletions at the gene. DNAs of these women were used to amplify 7 to 9 regions of the gene by PCR-multiplex. To estimate gene doses the F- primer of each pair was labeled with 6-FAM and the amplification products were separated and quantitated by fluorescent eviller electrophoresis. Results. None of the 15 putative carriers showed evidence of carrying the deletions that affect the index patients in their families. Conclusions. All index patients in the families of the carriers analyzed are affected by de novo mutations, an unexpected result according to data of other countries. The data add another, very valuable criterion to offer genetic counseling to the putative carriers. Figura 1: Electroferagramas de los productos de amplificaciOn de PCR-mOltiplex usando 7 pares de imprimadores de una mujer control y tres pacientes afectados con diversas deleciones. Las flechas indican la ausencia de senates de aquellos exones que no amplificaron y par lo tanto se encuentran deletados. El panel 1A corresponds a una mujer normal donde aparecen los picas (senates) de los siete exones que amplifican pare este grupo de imprimadores. El panel 1B pertenece a un paciente que presents deletion del exon 19, por lo que, esta ausente el pica correspondiente a este exon. El panel 1C es de un paciente con una deleciOn que abarca los exones 6-42, por lo que no aparecen los picos de los exones 8, 12, 17 y 19. El panel 1D pertenece a un paciente afectado con la deleciOn de los exones 3-25, segen se muestra, estan ausentes los exones 4, 12, 8, 17 y 19. El area bajo los picas correspondientes a cada region amplificada es lo que sirve para cuantificar la dosis genica de las posibles portadoras. 70 Cuadro Validation del metodo de cuantificacion de dosis genica con electroforesis capilar fluorescente de los prolflIttos de amplification (siete pares de irnprimadores) de una portadora obligada y una mujer y un varon normales Razon" (exones) Portadora obligada (65A) (del 6-42) E Mujer control (GL-CR-06) Varen control (32-03-70) E 19/17 1,271 1 1201 1,281 1 19/51 0,622 0,5 1,155 1,163 1 19/8 1,325 1 1,269 1,240 1 19/12 1,325 1 1,059 1,190 1 19/44 0,555 0,5 1,224 1,170 1 19/4 0,616 0,5 1,293 1,290 1 19/total 0,775 1,205 1,212 17/19 0,714 1 0,756 0,708 1 17/51 0,480 0,5 0,943 0,890 1 17/8 0,814 1 1,057 0,985 1 17/12 0,996 1 0,843 0,888 1 17/44 0,430 0,5 1,005 0,900 1 17/4 0,466 0,5 1,036 0,969 1 17/total 0,598 0,984 0,928 51/19 1,503 2 0,809 0,804 1 51/17 2,042 2 1,039 1,101 1 51/8 1,672 2 1,105 1,092 1 51/12 2,089 2 0,899 1,024 1 51/44 0,885 1 1,052 0,998 1 51/4 0,983 1 1,113 1,103 1 51/total 1,239 1,038 1,050 8/19 0,875 1 0,713 0,7' 8 1 8/17 1,218 1 0,938 1,005 1 8/51 0,590 0,5 0,894 0,905 1 8/12 1,219 1 0,794 0.698 1 8/44 0,528 0.5 0,950 0,913 1 8/4 0,575 0,5 0,984 0,958 1 8/total 0,745 0,929 0,941 (contin0a) 71 Cuadro i (continuation): Validation del Intifada de cuantificacion de dosis genica Razor,' (exones) Portadora obligada (65A) del (6-42) E Mujer control (GL-CR-06) Vara?) control (32-03-70) E 12/19 0,718 1 0,899 0,800 1 12/17 0,891 i 1,124 1,067 1 12/51 0,463 0,5 1,076 0,964 1 12/8 0,776 1 1,191 1,054 1 12/44 0,417 0,5 1,151 0,978 1 12/4 0,457 0,5 1,201 1.066 1 12/total 0,578 1,126 1,008 44/19 1,675 2 0,759 0,794 1 44/17 2,294 2 0,982 1,096 1 44/51 1,114 1 0,938 0,988 1 44/8 1,880 2 1,045 1,088 1 44/12 2,334 2 0,845 0,994 1 44/4 1,089 1 1,037 1,082 1 44/total 1,386 0,976 1,029 4/19 1,555 2 0,740 0,742 1 4/17 2,078 2 0,934 0,999 1 4/51 1,017 1 0,899 0,907 1 4/8 1,707 2 0,997 0,993 1 4/12 2,129 2 0,810 0,912 1 4/44 0,908 1 0,953 0,913 1 4/total 1,263 0,935 0,943 " Los valores corresponden a los cocientes de las rezones de cada probando con respecto al promerlio de los cocientes correspondientes en los controles normales. E: razones esperadas, en el caso de la portadora segun la deletion y los controles normales como tales. 72 Cuadro 2: Razones de dosis genica de mujeres a riesgo de ser portadoras de deleciones con respecto al promedio de las mujeres normales (siete pares de imprimadores). familia del paciente Razon* n" 8 (de1.19) E n*3 (del. 44) E n'13 (del. 3-25) (exones) 8a 8b 8c 8d 3a 3b 3c 3d 13a 19/17 0,932 1,112 1,122 1,261 0,5 0,866 1,161 0,981 0,919 1 1,204 1 19/51 0,989 1,142 1,146 1,367 0,5 0,937 1,067 0,960 0,978 1 1,068 0,5 19/8 0,989 1,156 1,099 1,294 0,5 0,812 1,088 1,063 0,852 1 1,130 1 19112 0,944 1,217 1,276 1,559 0,5 0,954 0,846 0,983 1,029 1 1,170 1 19/44 0,996 1,136 1,157 1,360 0,5 0,852 1,106 0,966 0,886 2 1,068 0,5 19/4 0,876 1,126 1,099 1,204 0,5 0,962 1,075 1,131 0,933 1 1,452 1 19/total 0,959 1,139 1,133 1,294 0,899 1,123 1,025 0,929 1,155 17/19 1,008 0,816 0,808 0,719 2 1,047 0,758 0,897 0,987 1 0,754 1 17/51 1,015 1,006 1,001 1,063 1 1,061 0,912 0,953 1,043 1 0,870 0,5 1718 1,098 1,039 0,979 1,026 1 0,937 0,935 1,082 0,926 1 0,939 1 17/12 1,002 1,045 1,086 1,182 1 1,052 0,683 0,940 0,950 1 0,929 1 17/44 1,092 1,007 1,017 1,063 1 0,970 0,934 0,966 0,950 2 0,875 0,5 17/4 0,924 0,974 0,942 0,918 1 1,068 0,878 1,094 0,976 1 1,160 1 17/total 1,044 1,004 0,990 1,006 1,015 0,943 1,019 0,991 0,941 51/19 1,003 0,819 0,816 0,684 2 0,998 0,844 0,955 0,955 1 0,876 2 51 /17 0,966 0,974 0,979 0,922 1 0,924 1,070 1,070 0,939 1 1,127 2 51/8 1,067 1,018 0,965 0,953 1 0,871 1,008 1,008 0,876 1 1,065 2 51/12 0,993 1,045 1,092 1,119 1 0,998 0,763 0,763 1,032 1 1,075 2 51 /44 1,061 0,988 1,002 0,98 1 0,902 1,009 1,009 0.898 2 0,993 1 51 /4 0,934 0,981 0,953 0,875 1 1.021 0,981 0,981 0,948 1 1,351 2 51/total 1.024 0,993 0,984 0,942 0,954 1,028 1,028 0,945 1,070 8/19 0,915 0,783 0,823 0,699 2 1,115 0,809 0,827 1,062 1 0,800 1 8/1 7 0,903 0,954 1,012 0,966 1 1,058 1,059 0,916 1,070 1 1,056 1 8/51 0,925 0,970 1,023 1,037 1 1,133 0,976 0,882 1,128 1 0,927 0,5 8/12 0,908 1,002 1,105 1,147 1 1,119 0,733 0,872 1,151 1 0,985 1 8/44 0,993 0,969 1,037 1,035 1 1,034 1,000 0,894 1,025 2 0,931 0,5 8/4 0,856 0,942 0,966 0,898 1 1,145 0,945 1,017 1,059 1 1,240 1 8/total 0,949 0,966 1,009 0.978 1,084 1,008 0,942 1,068 1,000 (continCia) 73 Cuadro 2 (continuation): Rezones de dosis genica de mujeres a riesgo de ser portadoras de deleciones (siete pares de imprimadores). familia del paciente R azon* n° 8 (del, 19) E n'3 (del. 44) E n°13 (del. 3-25) (exones) 8a 8b 8c 8d 3a 3b 3c 3d 13a 12/19 1,009 0,783 0,746 0,611 2 0,998 1,136 0,978 0,925 1 0,814 1 12/17 0,946 0,906 0,872 0,802 1 0,900 1,388 1,009 0,885 i 1,020 1 12/51 0,974 0,926 0,886 0,864 1 0,969 0.915 0,983 0,937 1 0,900 0,5 12/8 1,041 0,944 0,856 0,825 1 0,846 1,309 1,100 0,822 1 0,960 1 12/44 1,051 0,930 0,903 0,868 1 0,889 1,325 0,996 0,857 2 0,908 0,5 1214 0,913 0,910 0,847 0,759 1 0,992 1,272 1,151 0,892 1 1,220 1 12/total 1,005 0,927 0,879 0,821 0,932 1,338 1,050 0,893 0,970 44/19 0,932 0,818 0,803 0,683 2 1,091 0,823 0,942 1,049 0,5 0,870 2 44/17 0,904 0,980 0,971 0,928 1 1,018 1,053 1,018 1,039 0,5 1,128 2 44/51 0,929 0,998 0,984 0,999 1 1,093 0,976 0,987 1,097 0,5 0,993 1 44/8 1,000 1,025 0,956 0,960 1 0,961 0,995 1,113 0,969 0,5 1,067 2 44/12 0,925 1,046 1,078 1,120 1 1,094 0,739 0,983 1,135 0,5 1,070 2 44/4 0,862 0,973 0,932 0,868 1 1,108 0,949 1,142 1,034 0,5 1,334 2 44/total 0,955 0,995 0,972 0,944 1,047 1,007 1,053 1,041 1,073 4/19 1,092 0,850 0,871 0,795 2 0,995 0,881 0,837 1,025 1 0,659 1 4/17 1,034 0,993 1,028 1,054 1 0,906 1,091 0,876 0,991 1 0,834 1 4/51 1,070 1,020 1,049 1,143 1 0,980 1,019 0,856 1,055 1 0,740 0,5 4/8 1,146 1,042 1,016 1,092 1 0,857 1,032 0,959 0,926 1 0,791 1 4/12 1,065 1,068 1,149 1,281 1 0,980 0,778 0,860 1,090 1 0,797 1 4/44 1,146 1,016 1,061 1,138 1 0,892 1,041 0,864 0,956 2 0,741 0,5 4/total 1,098 1,015 1,034 1,078 0,937 1,052 0,912 1,006 0,798 Los valores corresponden a los cocientes de las razones de cada probando con respecto al promedio de los cocientes correspondientes en los controles norm ales. E: valores esperados para una mujer portadora segtin la delecion indicada en cada familia. del: deleciOn 74 Cuadro 3: Razes de dosis genica de mujeres a riesgo de ser portadoras de deleciones con respecto al promedio de las mujeres normales (nueve pares de imprimadores). familia del paciente Razon* n°6 (del. 45-50) E 52) n°17 (del. 45- E n° 24 (del, 45-50) (exones) 6a 6b 17a 17b 17c 24a 45148 1,072 1,001 1 0,543 0,802 1,681 1 1,134 1 45/19 0,859 0,808 0,5 0,517 0,859 1,509 0.5 1,112 0,5 45/17 0,960 0,956 0,5 0,564 0,877 1,661 0.5 1,425 0,5 45/51 0,937 0,932 0,5 0,498 0,888 1,670 1 1,553 0,5 45/8 1,047 1,008 0,5 0,545 0,914 1,538 0.5 1,152 0,5 45/12 0,753 0,804 0,5 0,531 0,933 1,389 0.5 1,215 0,5 46/44 1,038 1,008 0,5 0,508 0,918 1,557 0,5 1,173 0,5 45/4 0,926 0,943 0,5 0,504 0,862 1,454 0.5 1,256 0,5 45/Total 0,982 0,966 0,555 0,901 1,500 1,220 48/45 0,931 0.997 1 1,840 1,245 0,594 1 0,880 1 48/19 0,799 0,805 0,5 0,950 1,069 0,895 0,5 0,978 0,5 48/17 0,897 0,956 0,5 1,041 1,095 0.990 0.5 1,259 0,5 48/51 0,872 0,929 0,5 0,916 1,105 0,991 1 1,368 0,5 48/8 0,976 1,006 0,5 1,004 1,140 0,914 0,5 1,016 0,5 48/12 0,701 0,802 0,5 0,976 1,162 0,825 0,5 1,070 0,5 48/44 0,966 1,005 0,5 0,935 1,143 0,925 0.5 1,033 0,5 48)4 0,454 0,938 0,5 0,927 1,072 0,862 0,5 1,105 0,5 48/Total 0,915 0,964 1,022 1,123 0,891 1,075 19/45 1,062 1.129 2 1,766 1,062 0,605 2 0,821 2 19/48 1,140 1,131 2 0,959 0,852 1,018 2 0,931 2 19/17 1,015 1,074 1 0,991 0,927 1,000 1 1,164 1 19/51 0,999 1,056 1 0,882 0,946 1,014 2 1,280 1 19/8 1,099 1,124 1 0,951 0,959 0,919 1 0,934 1 19/12 0,829 0,941 1 0,971 1,027 0,871 1 1,033 1 19144 1,102 1,138 1 0,897 0,975 0,942 1 0,963 1 19/4 1,006 1,089 1 0,911 0,937 0,900 1 1,055 1 19/Total 1,050 1,097 0,986 0,964 0,913 1,007 17/45 1,026 1,030 2 1,746 1,124 0,593 2 0,691 2 17148 1,104 1,036 2 0,951 0,904 1,001 2 0,787 2 17/19 0,867 0,820 1 0,888 0,950 0,880 1 0,756 1 17/51 0,958 0,957 1 0,866 0,994 0,987 2 1,070 1 17/8 1,080 1,045 1 0,958 1,033 0,917 1 0,801 1 17/12 0,766 0,822 1 0,919 1,040 0,817 1 0,833 1 17/44 1,065 1,040 1 0,888 1,032 0,924 1 0,811 1 17/4 0,940 0,961 1 0,872 0,959 0,853 1 0,860 1 17/Total 1,008 0,996 0,970 1,014 0,890 0,844 (continua) 75 Cuadro 3 (continuacion): Razones de dosis genica de muieres a riesgo de ser portadoras de deleclones (nueve pares de imprimadores). familia del paciente Razdn* n'6 (del. 45-50) E 52) WI 7 (del. 45- E 24 (del. 45-50) (exones) 6a 6b 17a 17b 17c 24a 51/45 1,065 1,070 2 2,005 1,124 0,598 1 0,642 2 51/48 1,142 1,072 2 1,088 0,901 1,004 1 0,728 2 51/19 0,918 0,869 1 1,040 0,970 0,905 0,5 0,717 1 51/17 1,018 1,019 1 1,125 1,125 0,988 0,5 0,911 1 51/8 1,108 1,019 1 1,086 1,086 0,913 0,5 0,735 1 51/12 0,814 1,072 1 1,079 1,079 0,842 0,5 0,792 1 51/44 1,094 1,069 1 1,010 1,009 0,922 0,5 0,747 1 5114 0.999 1,023 1 1,025 1,025 0,880 0,5 0,818 1 51/Total 1,045 1,034 1,113 1,113 0,896 0,783 8/45 0,949 0,986 2 1,824 1,088 0,647 2 0,863 2 8/48 0,989 0,959 2 2,240 0,847 1,056 2 0,950 2 8/19 0,800 0,782 1 0,925 0,917 0,957 1 0,942 1 8/17 0,916 0,947 1 1,034 0,958 1,080 1 1,236 1 8/51 0,888 0,918 1 0,906 0,964 1,078 2 1,338 1 8/12 0,711 0,789 1 0,962 1,010 0,893 1 1,043 1 8/44 0,987 0,996 1 0,928 1,000 1,009 1 1,014 1 8/4 0,875 0,925 1 0,916 0,934 0,936 1 1,079 1 6/Total 0,932 0,953 1,013 0,981 0,970 1,053 12/45 1,292 1,210 2 1,835 1,043 0,701 2 0,801 2 12/48 1,387 1,212 2 0,996 0,836 1,179 2 0,908 2 12/19 1,159 1,021 1 0,990 0,936 1,104 1 0,930 1 12/17 1,238 1,154 1 1,032 0,912 1,161 1 1,139 1 12/51 1,213 1,130 1 0-915 0,927 1172 2 1,246 1 12/8 1,349 1,216 1 0,997 0,950 1,074 1 0,920 1 12/44 1,346 1,225 1 0,936 0,961 1,096 1 0,944 1 12/4 1,214 1,158 1 0,939 0,913 1,034 1 1.021 1 12/Total 1,275 1,175 1,024 0,945 1,056 0,982 44/45 0,961 0,989 2 1,962 1,087 0,640 2 0,850 2 44/48 1,031 0,990 2 1.065 0,872 1,077 2 0,964 2 44/19 0,826 0,800 1 1,015 0,934 0,967 1 0,946 1 44/17 0,924 0,946 1 1,107 0,953 1,065 1 1,212 1 44/51 0,900 0,921 1 0,976 0,964 1,069 2 1,319 1 44/8 1,008 0,999 1 1,072 0,995 0.987 1 0,981 1 44/12 0,727 0,799 1 1,045 1,019 0.893 1 1,037 1 44/4 0,891 0,933 1 0,991 0,938 0,932 1 1,069 1 44/Total 0,945 0,956 1,090 0,981 0,962 1,038 (continua) 76 Cuadro 3 (continuaclen): Rezones genicas de mujeres a riesgo de set portadoras de deleciones (nueve pares de imprimadores) familia del paciente Razon• n'6 (del. 45-50) E 52) n°17 (del. 45- E ri* 24 (del. 45-50) (exones) 6a 6b 17a 17b 17c 24a 4/48 1,067 1,048 2 1,958 1,145 0,679 2 0,786 2 4/45 1,143 1,048 2 1,062 0,917 1,141 2 0,890 2 4/19 0.941 0,870 1 1,039 1,010 1,052 1 0,898 1 4117 1,020 0,997 1 1,099 0,999 1,123 1 1,115 1 4/51 1,001 0,978 1 0,976 1,018 1,136 2 1,223 1 4/8 1,114 1,053 1 1,065 1,044 1,042 1 0,903 1 4112 0,815 0,855 1 1,054 1,085 0,958 1 0,969 1 4/44 1108 1,058 1 0,996 10,520 1,059 1 0,923 1 4/Total 1,050 1,014 1,090 1,035 1,021 0,961 " Los valores corresponden a los cocientes de las rezones de cada probando con respecto al promedio de los controles normales. E: valores esperados para una mujer portadora segiin la deleciOn indicada en cada familia. del: deletion 77