UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO DETECCIÓN Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA E INSECTICIDA DE QUITINASAS PRODUCIDAS POR BACTERIAS DEL GÉNERO XENORHABDUS SP Sc-CR9 Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Biología para optar al grado y título de Maestría Académica en Biología FIORELLA GALIANO MURILLO Cuidad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii Dedicatoria A mi padre, que sin importar que tan lejos se encuentre, sigue iluminando mi camino. Agradecimientos Deseo agradecer a los miembros del Comité, Lidieth Uribe, Lorena Uribe y Juan José Araya por toda la ayuda y la colaboración brindada para el desarrollo de esta investigación. Al proyecto de investigación C1033 “Quitinasas extraídas de Xenorhabdus: potencial en control biológico” dentro del cual se desarrolló esta investigación. A Laura Brenes, por toda la ayuda especialmente con los análisis bioinformáticos. A todo el personal del laboratorio de Microbiología Agrícola del CIA, a Natalia Zúñiga y a Daniela Vidaurre. A Rebeca Vargas y Leida Castro por el apoyo y la ayuda brindada no solo a nivel académico sino también a nivel personal. A Fabiola Rosito, Heilyn Salas, Juan José Ortega y Vidal Salas por el apoyo en los trabajos de laboratorio. A Dios, a mi madre Martha Murillo y a Cristian Vargas por estar siempre a mi lado. Tabla de contenido Dedicatoria .......................................................................................................................................... ii Agradecimientos ................................................................................................................................. 3 Tabla de contenido .............................................................................................................................. 5 Resumen .............................................................................................................................................. 7 Tabla de cuadros ................................................................................................................................. 8 Tabla de figuras ................................................................................................................................... 9 Introducción ........................................................................................................................................ 1 Marco teórico ...................................................................................................................................... 4 Complejo entomopatógeno ............................................................................................................. 4 Bacterias del género Xenorhabdus .................................................................................................. 6 Producción de compuestos .............................................................................................................. 7 Enzimas quitinolíticas ...................................................................................................................... 7 Metabolismo de la quitina ............................................................................................................ 12 Quitinasas de microorganismos: producción y aplicaciones ......................................................... 12 Estudio genómico como recurso para la identificación de compuestos antimicrobianos ............ 15 Quitinasas en bacterias del género Xenorhabdus ......................................................................... 16 Xenorhabdus sp Sc-CR9 ................................................................................................................. 18 Objetivo General ............................................................................................................................... 19 Objetivos específicos ......................................................................................................................... 19 Metodología ...................................................................................................................................... 20 Material biológico utilizado .......................................................................................................... 20 Extracción de la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9 del nemátodo hospedero ............................... 20 Identificación de la bacteria .......................................................................................................... 21 Obtención de la fase II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 ....................................................................... 22 Determinación del consumo de N-acetilglucosamina ................................................................... 23 Determinación de producción de quitinasas ................................................................................. 23 Obtención quitina coloidal ........................................................................................................ 23 Evaluación de medios de cultivo a base de quitina ................................................................... 23 Crecimiento en medio líquido .................................................................................................... 24 Crecimiento en medio sólido ..................................................................................................... 24 Obtención del extracto enzimático............................................................................................ 25 Determinación de la actividad quitinolítica .............................................................................. 25 Determinación de la actividad biológica del extracto de proteínas .............................................. 26 Ensayo de inhibición de extensión de las hifas .......................................................................... 26 Prueba de inhibición de germinación de esporas de hongos .................................................... 26 Efecto del extracto proteico sobre larvas de Galleria mellonella .............................................. 27 Análisis in sílico para evaluar la presencia de quitinasas .............................................................. 27 Amplificación de genes codificantes de quitinasas ....................................................................... 28 Resultados y Discusión ...................................................................................................................... 29 Extracción de la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9 del nemátodo hospedero Steinernema costaricense e identificación molecular. ....................................................................................... 29 Obtención de la fase II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 ....................................................................... 30 Determinación de la producción de quitinasas ............................................................................. 31 Obtención de quitina coloidal.................................................................................................... 31 Evaluación de medios de cultivo a base de quitina ....................................................................... 32 Crecimiento en medio líquido .................................................................................................... 32 Crecimiento en medio sólido ..................................................................................................... 35 Determinación de la actividad biológica del extracto de proteínas .............................................. 39 Ensayo de inhibición de extensión de las hifas .......................................................................... 39 Prueba de inhibición de germinación de esporas de hongos .................................................... 41 Efecto del extracto proteico sobre larvas de Galleria mellonella .............................................. 42 Análisis in sílico de la maquinaria degradadora de quitina en Xenorhabdus sp Sc-CR9 ............... 44 Proteína de unión a quitina ....................................................................................................... 44 Quitinasas .................................................................................................................................. 44 β-N-acetilhexosaminidasas ....................................................................................................... 45 Regulón NagC ............................................................................................................................ 47 Amplificación de genes de quitinasas ........................................................................................... 51 Conclusiones ..................................................................................................................................... 54 Recomendaciones ............................................................................................................................. 55 Referencias Bibliográficas ................................................................................................................. 56 Anexo 1. ............................................................................................................................................. 65 Anexo 2 .............................................................................................................................................. 66 Resumen El uso de agroquímicos representa un problema ambiental y de salud, ya que puede ocasionar problemas de resistencia, alteración al ambiente, contaminación y riesgo para la salud humana. Una alternativa diferente y más segura al uso de productos químicos es recurrir al control biológico en donde se utilizan estrategias y productos originados a partir de organismos vivos, para el control y supresión de plagas. Una opción viable es el uso del complejo entomopatógeno Steinernema-Xenorhabdus conformado por una simbiosis entre un nemátodo y una bacteria. Xenorhabdus es un género de enterobacterias productoras de compuestos con actividad antimicrobiana, antifúngica e insecticida. Entre estos compuestos podemos destacar la producción de enzimas quitinolíticas como las quitinasas y las N- acetilhexosaminidasas, las cuales son utilizadas por la bacteria para degradar la molécula de quitina para aprovecharla como fuente de carbono. La quitina es uno de los biopolímeros más abundantes en el planeta, es una parte constitutiva del exoesqueleto, membrana y matriz del intestino de los insectos además de las paredes celulares de los hongos. Debido a la importancia estructural que representa la quitina en estos organismos, se ha investigado el potencial de las quitinasas como agentes controladores de plagas y enfermedades. Por esta razón en la presente investigación se buscó evidenciar la producción de quitinasas por parte de la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9, para lo cual se estimuló la producción de estas enzimas con medios de cultivos suplementados con quitina coloidal (Medio Quitina y Medio Quitina-PL). Además, se evaluó la producción de las enzimas por parte de la fase II de la bacteria, para lo cual se indujo esta fase por medio de la adición de una alta concentración de sal (1,5%) al medio de cultivo. Se observó crecimiento de la fase I y II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en los medios líquidos evaluados, en el caso de los medios sólidos solo se obtuvo crecimiento en el medio Quitina-PL. A partir del cultivo líquido se aisló la fracción proteica obteniendo concentraciones de 0,715 mg/ml para la fase I y 5 mg/ml para la fase II. La actividad quitinolítica para la proteína obtenida a partir de ambas fases de la bacteria fue de 0,63 U/mg. Se evaluó la actividad biológica contra hongos (Botrytis sp y Fusarium sp), oomycetes (Pythium y Phytophthora) y larvas de Galleria mellonella y se observó que la exposición al extracto proteico causó efectos negativos en la germinación de esporas del hongo Fusarium sp. mientras que no se encontró ningún efecto negativo sobre el crecimiento de los otros hongos, oomycetes ni larvas de Galleria mellonella. Complementariamente a partir del análisis del genoma de Xenorhabdus sp Sc-CR9 se identificaron genes que podrían formar parte del sistema quitinolítico de esta bacteria. Xenorhabdus sp Sc-CR9 cuenta con genes que codifican para dos β-N-acetilhexosaminidasa, una proteína de unión a quitina y cuatro proteínas participantes de la ruta NAG, NagA, NagB, NagC y NagE (PTS GlcNac). Con los análisis realizados a nivel de cultivo, análisis genómico y el uso de imprimadores específicos se considera que Xenorhabdus sp Sc-CR9 produce enzimas que forman parte de la vía catabólica para la degradación de la quitina, sin embargo, es necesario realizar más estudios que permitan obtener datos concluyentes con respecto a la capacidad que tiene esta bacteria para la producción de quitinasas, las características particulares y la funcionalidad que podría tener esta proteína. Tabla de cuadros Cuadro 1. Actividad antimicrobiana de quitinasas extraídas de bacterias. ...................................... 13 Cuadro 2. Actividad antimicrobiana de quitinasas extraídas de hongos. ......................................... 14 Cuadro 3. Peso de las larvas antes de la exposición durante tres días a alimento suplementado con 100 µL de proteína y sobrenadante de Xenorhabdus sp Sc-CR9 fase I y II. ...................................... 42 Cuadro 4. Peso de larvas de Galleria mellonella antes y después de la exposición a alimento suplementado con 100 µL de proteína, y de sobrenadante de Xenorhabdus sp Sc-CR9 fase I y II. . 43 Tabla de figuras Figura 1. Ciclo de vida del nemátodo Steinernema ............................................................................ 5 Figura 2. Clasificación de las enzimas quitinolíticas de acuerdo con el sitio de acción. ..................... 9 Figura 3. Clasificación de las enzimas quitinolíticas en base a la secuencia de aminoácidos. .......... 10 Figura 4. Clasificación de las enzimas quitinolíticas en base a la secuencia de aminoácidos. .......... 11 Figura 5. Crecimiento de la bacteria aislada a partir de nemátodos Steinernema costaricense en medio LB (A) y NBTA (B). ................................................................................................................... 29 Figura 6. Análisis filogenético de las fases I y II de la bacteria obtenida a partir del nemátodo hospedero Steinernema costaricense. .............................................................................................. 30 Figura 7. Quitina coloidal obtenida utilizando el protocolo con HCl (A) y con Ácido Fosfórico (B). . 31 Figura 8. Curva de crecimiento de las fases I y II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en el medio Quitina-PL. ........................................................................................................................................................... 32 Figura 9. Curva de crecimiento de las fases I y II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en el medio Quitina. . 33 Figura 10. Cambio de fase de las bacterias en los cultivos en medios suplementados con quitina coloidal. Colonias de la fase I color amarillo y de la Fase II color blanca. ......................................... 34 Figura 11. Crecimiento de la fase I (A) y II (B) de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en medio Quitina-PL sólido. ................................................................................................................................................ 35 Figura 12. Crecimiento de la fase I de cepas de Xenorhabdus sp y Photorhabdus sp en caldo LB (A) y medio Quitina-PL (B). ........................................................................................................................ 36 Figura 13. Obtención de proteína a partir del cultivo de la fase uno en medio quitina (A) y de la fase dos en el medio quitina peptona levadura (B). ......................................................................... 37 Figura 15. Prueba de actividad biológica del extracto de proteína obtenido a partir del cultivo de la fase I de Xenorhabdus sp Sc-CR9 contra dos cepas de Fusarium sp. ................................................ 39 Figura 16. Prueba de actividad biológica del extracto de la proteína contra Botrytis sp. ................ 40 Figura 17. Prueba de actividad biológica del extracto de proteína obtenido a partir del cultivo de la fase II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 contra Botrytis sp (A) y Fusarium sp (B). ..................................... 40 Figura 18. Prueba de crecimiento en plato de Fusarium sp. A: Control con agua, B: Tratamiento con extracto de proteína, C: Tratamiento con suspensión de Xenorhabdus sp Sc-CR9. ......................... 41 Figura 19. Larvas de Galleria mellonella expuesta a la proteína obtenida del cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9 ..................................................................................................................... 43 Figura 20. Halo de degradación de quitina producido por el cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en el medio Quitina-PL sólido. ................................................................................................................... 45 Figura 21. Representación en 3D de la β-N-acetilhexosaminidasa producida por Xenorhabdus sp Sc- CR9. ................................................................................................................................................... 46 Figura 22. Representación en 3D de la β-N-acetilhexosaminidasa producida por Xenorhabdus sp Sc- CR9. ................................................................................................................................................... 46 Figura 23. Representación del fragmento del genoma de Xenorhabdus sp. Sc-CR9 que contiene los genes de la ruta NAG. ........................................................................................................................ 47 Figura 24. Utilización del N-Acetil-D-Glucosamina por parte de la fase I y II de Xenorhabdus sp. Sc- CR9. ................................................................................................................................................... 48 Figura 25. Crecimiento de Xenorhabdus sp Sc-CR9 junto con S. marcescens en Quitina ................. 49 Figura 26. Posible ruta catabólica de la quitina utilizada por Xenorhabdus sp. Sc-CR9 .................... 50 Figura 27. Electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR utilizando imprimadores degenerados para amplificar quitinasas ........................................................................................... 52 1 Introducción En la actualidad, la aplicación de agroquímicos para el control de plagas puede ocasionar problemas de resistencia, alteración del ambiente, contaminación y riesgo para la salud humana (Salazar et al, 2016). Por esta razón, existe un gran interés en la identificación de compuestos naturales que permitan el control biológico de plagas, lo que a su vez promueve la disminución en el uso de plaguicidas químicos. Como alternativa a los productos químicos, se puede recurrir al biocontrol, el cual hace uso de estrategias a partir de organismos y productos derivados de los mismos para el control o supresión de plagas (Okongo et al, 2019). Una de estas alternativas que se ha utilizado de manera exitosa son los nemátodos entomopatógenos los cuales constituyen un agente seguro para el control biológico, entre estos organismos encontramos el género Steinernema, capaz de establecer una relación simbiótica con bacterias del género Xenorhabdus (Askary, 2010). Un punto por destacar en esta relación es que sin la bacteria el nemátodo no tiene tanto éxito para matar a los insectos, evidenciando la importancia de la producción de compuestos químicos (toxinas, metabolitos secundarios, enzimas) por parte de la bacteria y el potencial que estos representan (Ehlers et al, 2005). La bacteria Xenorhabdus sp, produce toda una serie de compuestos con actividad antibacteriana, antifúngica e insecticida y entre estos se ha reportado la producción de quitinasas, las cuales son enzimas que degradan la quitina. La quitina es un polímero lineal conformado por moléculas de β- 1,4-N-acetilglucosamina. Es el segundo biopolímero más abundante en el planeta, se encuentra en el exoesqueleto de los insectos, hongos, algas, cangrejos, camarones, langostas y en las estructuras internas de otros vertebrados (Hamid et al, 2013). La membrana y matriz del intestino de los insectos está compuesta por un 3% a 13% de quitina, mientras que su cutícula contiene hasta 40% de su masa seca. Las paredes celulares de hongos consisten aproximadamente de 80% de polisacáridos entre los cuales también se encuentra la quitina (Okongo et al, 2019). A pesar de que la quitina es un producto tan abundante sus aplicaciones son muy limitadas especialmente por ser insoluble en agua o solventes orgánicos (Gao et al, 2018). Sin embargo, se ha observado que los productos obtenidos de su degradación (N- acetilquitooligosacaridos y N-acetil-D-glucosamina) pueden presentar variadas aplicaciones, como por ejemplo pueden ser usadas como fuentes de carbono para el crecimiento de bacterias 2 beneficiosas (bacterias ácido lácticas y bifidobacterias), ingredientes en comidas funcionales, aditivos en la industria alimenticia, preservantes de comida, agentes antibacterianos, en el recubrimiento de frutas y vegetales para bajar la tasa de respiración o como suplemento de bebidas gracias a su actividad antioxidante (Gao et al, 2018; Hou et al, 2019). Para poder obtener estos compuestos, es necesario degradar la quitina y por lo general se hace uso de métodos químicos que pueden generar problemas ambientales. Una alternativa al uso de estos químicos consiste en la bioconversión por medio de quitinasas. El uso de estas enzimas ha ganado importancia debido a que es un proceso amigable con el ambiente y puede ser utilizado para aplicaciones biotecnológicas, como agentes controladores de organismos patógenos de cultivos (Hamid et al, 2013; Gao et al, 2018). Se pueden obtener quitinasas a partir de una gran variedad de organismos, sin embargo, la producción bacteriana de estás enzimas presenta un mayor potencial ya que se ha reportado una rápida producción entre las primeras 18 y 24 horas, mientras que la producción en cultivos de otros organismos como es el caso de hongos generalmente se extiende por una mayor cantidad de tiempo, como se ha reportado para Penicillium aculeatum y Trichoderma harzianum que producen la enzima después de las 72 horas de incubación. Este comportamiento responde a que las bacterias se reproducen por fisión binaria por lo que se multiplican de forma más rápida mientras que la reproducción de los hongos que son eucariotas toma un mayor tiempo (Sandhya et al, 2004; Okongo et al, 2019). A pesar de que ya se han extraído y descrito quitinasas a partir de diferentes microorganismos, se ha probado que estos compuestos pertenecen a un grupo de enzimas diverso con variedad de estructuras moleculares, especificidad de sustratos y mecanismos catalíticos (Chen et al, 1996). De manera que, enzimas producidas por microorganismos de un mismo género, pueden tener grandes diferencias con respecto a la especificidad de sustratos y su rol fisiológico por lo que es de vital importancia estudiar el potencial de biocontrol de la mayor cantidad de quitinasas y así contar con un espectro mucho más amplio para el control de plagas. Esta diversidad de fuentes y de quitinasas también puede representar variedad de procesos de degradación de la quitina lo que a su vez puede representar un medio para la obtención de mayor variedad de productos nuevos que pueden tener aplicaciones innovadoras. Tomando en cuenta lo antes mencionado, la actividad quitinolítica de Xenorhabdus sp resulta de gran interés ya que puede ser una estrategia para el biocontrol de insectos y hongos mediante la 3 degradación de las estructuras de quitina de estos organismos, razón por la cual en la presente investigación se buscó conocer más acerca de la producción de quitinasas por parte de Xenorhabdus sp Sc-CR9 y el posible potencial que puedan presentar estas enzimas para el combate de hongos e insectos plaga. 4 Marco teórico Complejo entomopatógeno El complejo Steinernema-Xenorhabdus consiste en una simbiosis que ocurre entre un género de nemátodos y bacterias entéricas. El nemátodo tiene un ciclo de vida integrado que comprende dos fases: una de vida libre en el suelo y otra patogénica dentro del insecto hospedero. El ciclo consiste en estadios de huevo, juveniles 1, 2, 3, 4 y adulto (Figura 1), siendo el estadío juvenil 3, también conocido como infectivo juvenil (IJ), la única etapa de vida libre del nemátodo fuera del insecto hospedero. Los IJs se encuentran encapsulados en una doble cutícula que mantiene su boca y ano cerrados, características que les permiten persistir en el suelo por largos periodos de tiempo mientras asechan a su presa (Murfin et al, 2015; Sivaramakrishnan & Razia, 2021). Los nemátodos transportan las células de Xenorhabdus en una vesícula ubicada en la parte anterior del intestino del IJ, en donde la bacteria puede adherirse (Stilwell et al, 2018). Al presentarse condiciones ambientales favorables los IJs buscan hospederos susceptibles, al ser detectados, los juveniles se desprenden de la cutícula externa, iniciando la fase patogénica en el momento en que el juvenil entra al insecto hospedero a través de aperturas naturales como la boca, el ano y los espiráculos (Sivaramakrishnan & Razia, 2021). Una vez dentro del hospedero el nemátodo invade a través de la pared intestinal hasta llegar al hemocele en donde libera a la bacteria simbionte. La bacteria empieza a producir metabolitos secundarios que además de suprimir la función inmune de la larva tienen un efecto letal que producen la muerte por septicemia del insecto, 24 a 48 horas después de la infección. La bacteria se reproduce de manera rápida descomponiendo los tejidos, haciendo de la larva un ambiente idóneo con una amplia disponibilidad de nutrientes para el crecimiento y reproducción del nemátodo. Durante este proceso la bacteria mantiene un ambiente protegido para el nemátodo al producir compuestos antimicrobianos con efecto antibacteriano, antifúngico y nematicida que inhiben el crecimiento de otros organismos competidores (Sivaramakrishnan & Razia, 2021). Bajo estas condiciones dentro del cadáver de la larva, el nemátodo termina su etapa patogénica y pasa a su cuarto estadio conocido como etapa de recuperación, para luego pasar a la primera generación de adultos que van a ser hembras ponedoras de huevos o machos, estos continúan 5 reproduciéndose hasta dos o tres generaciones. El consumo de los nutrientes junto con el incremento de la densidad poblacional del nemátodo provoca que se desencadene el desarrollo de IJs que se vuelven a asociar con la bacteria simbionte. La colonización de la vesícula del nemátodo por parte de la bacteria es especie-específica e inicia con más de 40 células viables. Al establecerse el estadio de los IJs las primeras bacterias colonizadoras entran en una proliferación limitada hasta que el nicho de la vesícula se llene. Finalmente, los infectivos juveniles salen del cadáver e inician nuevamente el ciclo (Martens & Goodrich-Blair, 2005; Sivaramakrishnan & Razia, 2021). En esta asociación mutualista la bacteria contribuye con factores de virulencia, permitiendo la reproducción del nemátodo y brindando protección contra competidores, patógenos y depredadores. A cambio, el nemátodo sirve como vector de transmisión de la bacteria entre hospederos, además de que la actividad sinérgica con la bacteria hace que el complejo nemátodo- bacteria tenga una mayor virulencia contra insectos (Murfin et al, 2015). Figura 1. Ciclo de vida del nemátodo Steinernema. Modificado de Sivaramakrishnan & Razia, 2021. 6 Bacterias del género Xenorhabdus Xenorhabdus sp es un bacilo Gram-negativo perteneciente a las γ-proteobacterias de la familia Enterobacteriaceae, que presentan flagelos, no forman esporas y son anaerobios facultativos (Martens & Goodrich-Blair, 2005; Hinchliffe et al, 2010; Guerra et al, 2014). Durante el ciclo de vida de la bacteria se da una disociación de fases, la cual es espontánea, con características totalmente diferentes entre ellas (Pérez et al, 2006). La fase I o activa se caracteriza porque las bacterias son móviles, producen proteasas, fosfolipasas, antibióticos e inclusiones protoplásmicas paracristalinas compuestas por cristales proteínicos. La fase simbionte o fase II es la que normalmente se asocia con el nemátodo, en esta fase la bacteria produce una reducida cantidad de compuestos y no tiene motilidad (Dreyer et al, 2018). Una propiedad que permite diferenciar entre estás fases es que en la fase I la bacteria tiene la capacidad de unirse a colorantes específicos como el azul de bromotimol, mientras que la fase dos no se une a colorantes (Dreyer et al, 2018). Por esta razón es que se utiliza el medio NBTA el cual está suplementado con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) y azul de bromotimol, las colonias de la fase I pueden reducir el TTC y absorber el azul de bromotimol por lo que toman un color azul, mientras que las colonias de bacterias en fase II reducen el TTC pero no son capaces de absorber el azul de bromotimol dando una coloración roja a estas colonias (Zang et al 2022). Esta diferencia de fases no ha evidenciado cambios a nivel de ADN y se ha descrito para todas las especies. Se ha propuesto que la fase II representa una forma de vida libre de la bacteria ya que podría tener la capacidad de adaptarse a las condiciones presentes en el suelo (Volgyi et al, 1998). Smigielski et al (1994) demostraron que la fase II de la bacteria presenta mayor flexibilidad para la utilización de nutrientes y está más adaptada para sintetizar la mayoría de las estructuras complejas de la célula bacteriana en ambientes en los que la disponibilidad es limitada. Al comparar la respuesta de ambas fases a la carencia de nutrientes se observó que bacterias de la fase II son capaces de obtener nutrientes de manera más rápida y efectiva, además de que esta posee la maquinaria metabólica necesaria para convertir los nutrientes en los compuestos que necesita para el crecimiento y la proliferación (Smigielski et al, 1994). 7 Producción de compuestos Para que Xenorhabdus sp pueda cumplir su papel dentro de la simbiosis, produce una diversidad de compuestos a lo largo de su ciclo de vida, algunos de estos con actividad antibiótica como xenorhabdinas, xenorxides, xenocoumacinas, derivados de indol, nematofina y xenorhabdicina (Fodor et al, 2010; Pranaw et al, 2014; Dreyer et al, 2018). Otros compuestos incluyen toxinas y enzimas extracelulares como lipasas, esterasas, quitinasas, fosfolipasas y proteasas (Pranaw et al, 2014). La producción de estos compuestos confiere una ventaja competitiva a la bacteria y al nemátodo al inhibir el crecimiento de otras bacterias, hongos y levaduras (Chen et al, 1996). Estos metabolitos presentan un amplio rango de bioactividad que es de especial interés en las áreas de medicina y agricultura, ya que cuentan con capacidad antibiótica, antimicótica, insecticida, nematicida, antiprotozoaria, citotóxica, antiulcerosa, antineoplásica y antiviral (Wang et al, 2011; Dreyer et al 2018). Entre los compuestos producidos por las bacterias del género Xenorhabdus que presentan potencial para ser utilizados en control biológico se encuentran las enzimas quitinasas cuya función es la degradación de la quitina (Mahmood et al, 2020). La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza, consiste en una cadena larga lineal de unidades de N-acetilglucosamina que se encuentran unidas por enlaces β-1,4 (Fuhrmann & Zuberer, 2021). Existen tres formas cristalinas de la quitina: α quitina con cadenas antiparalelas, β quitina con cadenas paralelas y γ quitina que presenta una mezcla entre cadenas paralelas y antiparalelas (Kumar et al, 2022). Este compuesto constituye parte de la pared celular de los hongos, de la cutícula de los insectos, además de encontrarse en la periferia del intestino del insecto. Debido a la importancia estructural que representa la quitina en estos organismos, se ha investigado el potencial de las quitinasas como agentes controladores de plagas (Mahmood et al, 2020). Enzimas quitinolíticas Las enzimas quitinolíticas son enzimas degradadoras de quitina, son parte del grupo de las glucosidasas, tienen un tamaño entre los 20 y 90 KDa y están presentes en un amplio rango de organismos como bacterias, hongos, levaduras, plantas, actinomicetes, artrópodos y humanos (Chen et al, 1996). Presentan un pH óptimo en un rango de 5 a 8 y temperatura óptima en el rango de 37 a 60 °C (Zhang et al, 2018). 8 El catabolismo de la quitina ocurre en dos pasos, un corte inicial del polímero de la quitina por parte de las quitinasas del cual se obtienen monosacáridos de N-acetilglucosamina, quitobiosa o quitooligosacáridos, los productos obtenidos dependen del tipo de quitinasa que actúa en el corte de la molécula (Scigelova & Crout, 1999, Yang et al, 2006; Kumar et al, 2022). En un segundo paso, estos oligosacáridos son cortados por las β-N-acetilhexosaminidasa también conocidas como quitobiasa o β-N-acetilglucosaminidasa, las cuales hidrolizan el extremo no reductor del N-acetil-β- ꓓ-glucosamina dando como resultado la N-acetilglucosamina y monosacáridos (Scigelova & Crout, 1999, Yang et al, 2006). Las enzimas quitinolíticas se han clasificado de varias maneras dependiendo de los criterios que se tomen en cuenta, a continuación, las categorías que se han propuesto. Una de las clasificaciones se basa en el sitio de acción que tengan las enzimas quitinolíticas con respecto a la cadena de quitina. Las endoquitinasas cortan de manera aleatoria a lo largo de la parte interna de la cadena. Entre las endoquitinasas se encuentran las quitinasas, endoquitidextrinasas y las quitosanasas, algunos sustratos y productos obtenidos por la acción de estas enzimas se presentan en la figura 2. Las exoquitinasas cortan la cadena de quitina en los extremos, por lo que este grupo comprende enzimas que cortan la cadena de quitina en el extremo reductor, enzimas que cortan en el extremo no reductor y las β-N-acetilhexosaminidasas. Las exoquitinasas de extremo reductor son codificadas por el gen chiA y las de extremos no reductores son codificadas por el gen chiB (Poria et al, 2021). 9 Figura 2. Clasificación de las enzimas quitinolíticas de acuerdo con el sitio de acción. Otras clasificaciones se basan en la secuencia de aminoácidos, se han propuesto seis clases determinadas por características como pH isoeléctrico, péptido señal, secuencia del extremo N- terminal y ubicación de la enzima. El detalle de cada grupo se presenta en la figura 3. Enzimas quitinolíticas Endoquitinasas: cortan de manera aleatoria en sitios internos de la molécula Quitinasas: generan oligomeros de N-acetilglucosamina Endo-quitodextrinasas: hidroliza quitodextrina generando Diacetilquitobiosa Quitosanasas: endohidrólisis de los enlaces β-(1-4) generando quitosan acetilado Exoquitinasas: cortan en los extremos de la molécula Extremo reductor: actúan en quitina y quitodextrina hidrolizando enlaces glicosídico de Diacetilquitobiosa y liberan disacáridos. Gen: chiA Extremo no reductor: actúan en quitina y quitodextrina hidrolizando enlaces glicosídico de Diacetilquitobiosa. Gen: chiB β-N-acetilhexosaminidasa 10 Figura 3. Clasificación de las enzimas quitinolíticas en base a la secuencia de aminoácidos. Una última clasificación también basada en la secuencia de aminoácidos reúne a las enzimas quitinolíticas en tres grupos de familias de Glicosil-Hidrolasas (GH) de acuerdo con la base de datos CAZy (Poria et al, 2021). Algunos detalles de la clasificación por familias se presentan en la figura 4. Enzimas quitinolíticas Clase I Extremo N-terminal rico en cisteína, peptido señal rico en valina y leucina. Se subdividen en dos clases. Ácidos Básicos Clase II Ausencia del extremo N-terminal rico en cisteína, solo exoquitinasas. Quitinasas de plantas, hongos y bacterias. Clase III Dominio catalítico GH18 con plegamiento de barril (β/α)8. Con tres elaces disulfuro conservados. Clase IV Tamaño significativamente más pequeño. Características similares al grupo I. Clase V Clase VI Todavía no están suficientemente caracterizadas 11 Figura 4. Clasificación de las enzimas quitinolíticas en base a la secuencia de aminoácidos. Existe una gran variedad de organismos productores de enzimas quitinolíticas, que a su vez utilizan estas enzimas para diferentes procesos. Por ejemplo, las bacterias las utilizan para la obtención de fuentes de carbono y generación de energía, además de ser factores de virulencia. Los hongos las utilizan en los procesos de morfogénesis, desarrollo, esporulación y germinación de esporas. En el caso de los hongos entomopatógenos también producen quitinasas para degradar la cutícula del hospedero permitiéndole la entrada al hongo. En insectos se sintetizan las quitinasas para realizar una degradación controlada de sus cutículas como parte del proceso de regeneración. Mientras que las plantas producen estas enzimas como una respuesta de defensa al ataque de patógenos. Los vertebrados también utilizan las enzimas quitinolíticas en procesos de digestión de alimentos ricos en quitina (Kumar et al, 2022). En las bacterias del género Xenorhabdus, se ha propuesto que las quitinasas pueden estar involucradas en el proceso de ruptura de la superficie externa del cadáver del insecto, durante el proceso de infección del nemátodo, en el momento en que los infectivos juveniles salen para continuar con su ciclo de vida en el suelo. También se ha propuesto que las quitinasas pueden contribuir a la apertura de los huevos del nemátodo. La actividad proteolítica puede jugar un papel tanto en la inactivación del sistema de defensa del insecto como en la utilización de nutrientes por parte del nematodo al convertir algunas proteínas del insecto en aminoácidos (Chen et al, 1996). Familias Glicosil-Hidrolasas (GH) Quitinasas GH18, GH19, GH23 y GH48. Dominio catalítico con estrutura 3D de barril (β/α)8.Glutamato es el protón donador y el oxígeno carbonil del grupo aceramido actúa como nucleófilo. β-L-N-acetilhexosaminidasa GH3, GH5, GH20, GH84, GH109 y GH116. Hidrolizan el extremo no reductor de N-acetil-D- hexosamina. Quitosanasas GH5, GH7, GH8, GH46, GH75 y GH80. Deacetilizan la quitina a quitosano. Las producen ciertas bacterias. 12 Metabolismo de la quitina Para la degradación de la quitina hay bacterias que cuentan con una maquinaria enzimática especializada. En el proceso intervienen enzimas y estructuras celulares que permiten descomponer la quitina hasta obtener moléculas que pueden ser utilizadas por la bacteria como fuente de energía. El catabolismo de la quitina se ha descrito para bacterias como Vibrio, E.coli, Shewanella, Alteromonas y Saccharophagus (Yang et al, 2006). Este proceso metabólico inicia al activar los genes que median la despolimerización de la quitina, los cuales están presentes en la superficie de la célula y codifican quitinasas que son las encargadas de la hidrólisis. El corte de estas enzimas se puede dar ya sea en los extremos o en el interior de la molécula, produciendo quitooligosacáridos que luego son transportados a través de la membrana hacia el interior de la célula, mediante el sistema de transporte fosfotransferasa (PTS) codificado por el gen nagE. Este sistema de transporte es específico para N-acetilglucosamina y a la vez que transporta esta molécula la fosforila (Plimbridge, 2001; Yang et al, 2006). NagE es un gen conservado que forma parte del operón nag presente en enterobacterias, vibrionales y algunas α- y β- proteobacterias (Yang et al, 2006). El proceso de degradación continúa en el interior de la célula, mediante dos enzimas codificadas por los genes nagA y nagB. Estas enzimas catalizan la degradación de la molécula mediante una ruta bioquímica de tres pasos: fosforilación, deacetilación e isomerización, hasta obtener el intermediario fructosa 6-fosfato. Esta ruta también conocida como NAG se ha conservado tanto en bacterias quitinolíticas como en bacterias no quitinolíticas como por ejemplo en E. coli. La mayor parte de los genes que codifican las enzimas quitinolíticas, el sistema de transporte y las proteínas de unión a quitina están regulados por la ruta NAG (Yang et al, 2006). El proceso de degradación de quitina es de gran importancia en el reciclaje de nutrientes en muchos ecosistemas (Kumar et al, 2022), ya que permite el mantenimiento y balance entre el carbono y el nitrógeno insoluble que se encuentra en la quitina (Li & Greene, 2010). Quitinasas de microorganismos: producción y aplicaciones Los quitooligómeros de bajo peso molecular obtenidos por efecto de la degradación de la quitina por parte de las quitinasas pueden ser utilizados en la industria, agricultura y medicina. Las quitinasas están tomado importancia gracias a su rol en el biocontrol de fitopatógenos fúngicos e 13 insectos plaga. Además de jugar un papel importante en el control de mosquitos y como parte del sistema de defensa de plantas contra patógenos (Chen et al, 1996). En la literatura se ha reportado la extracción de quitinasas a partir de organismos como bacterias y hongos, estas a su vez se han probado para detectar la capacidad que tienen para inhibir patógenos de cultivos, como se observa en el cuadro 1 y 2 en donde se resumen algunos ejemplos. Cuadro 1. Actividad antimicrobiana de quitinasas extraídas de bacterias. Fuente Patógeno que inhibe Cultivos afectados Referencia Paenibacillus ehimensis Colletotrichum gloeosporioides Helecho hoja de cuero, limón criollo, papaya, carambola y mango (Barquero et al, 2013). Seo et al, 2016 Paenibacillus elgii Cladosporium sphaerospermum, C. tenuissimum, Botrytis cinerea (parcialmente) Pera Tomate Kim et al, 2017 Serratia marcescens Colletotrichum gloeosporioides Botrytis cinerea Helecho hoja de cuero, limón criollo, papaya, carambola y mango (Barquero et al, 2013) Gutiérrez et al, 2011 Someya et al, 2001 Serratia proteamaculans Fusarium oxysporum, Aspergillus niger Banano, culantro, tomate, lechuga, limón. Mehmood et al, 2009 Bacillus Pumilus Aspergillus flavus, A. niger, A. fumigates, Ceratorhiza hydrophila, Fusarium oxysporum, F. solani Scirpophaga incertulas Arroz Rishad et al, 2016 Gurav et al, 2017 Bacillus thuringiensis Aspergillus niger Aedes aegypti Manzana Thamthiankul et al, 2001 Mehmood et al, 2010 Yan et al, 2008 Bacillus subtilis Macrophomina phaseolina Fusarium culmorum Repollo, papa, caña de azúcar, ajo, arroz y otros cereales Pandya et al, 2014 Senol et al, 2014 Bacillus cereus Fusarium oxysporum, Pythium ultimum Banano, culantro, tomate Wang et al, 2010 Saccharothrix yangliengesis Valsa mali Manzana Lu et al, 2017 Enterobacter sp Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxi, Rhizopus nigricans Melón, melocotón, fresa, maíz. Dahiya et al, 2005 Bacillus licheniformis Aspergillus flavus, A. niger, A. ochraceous, A. alliaceous, Mucor sp, Fusarium verticillioides Eldana saccharina Caña de azúcar, cítricos, chile, algodón. Toharisman et al, 2005 Okongo et al, 2019 Streptomyces sp Aspergillus ochraceus, Fusarium verticillioides Maíz, maní, tabaco, algodón. Okongo et al, 2019 Nawani & Kapadnis, 2004 14 Fuente Patógeno que inhibe Cultivos afectados Referencia F. oxysporum Pseudomonas fluorescens Pyricularia grisea Arroz, centeno, cebada y trigo. Radjacommare et al, 2004 Xenorhabdus bovienii Botrytis cinerea Uva, fresas, rosas. Chen et al, 1996 Xenorhabdus nematophila Alternaria brassicicola, Verticillium dahliae, Coniothyrium diplodiella Helicoverpa armigera Repollo chino Algodón Uvas Liu et al, 2019 Cuadro 2. Actividad antimicrobiana de quitinasas extraídas de hongos. Fuente Patógeno que inhibe Cultivos afectados Referencia Thermomyces lanuginosus Aspergillus flavus, A. niger, A. ochraceous, A. alliaceous, Mucor sp, Fusarium verticillioides Eldana saccharina Caña de azúcar, cítricos, chile, algodón. Okongo et al, 2019 Trichoderma harzianum Botrytis cinerea Colletotrichum gloeosporioides Helecho hoja de cuero, limón criollo, papaya, carambola y mango Deng et al, 2019 Sandhya et al, 2005 Aspergillus terreus Aspergillus niger, A. oryzae, Rhizoctonia solani, Candida albicans, Fusarium solani Hortalizas, flores, tomate y chile. Farag et al, 2016 Pichia pastori Rhizopus stolonifer Botrytis squamosa Fresa Ajo Yan et al, 2008 Metarhizium anisopliae Bermisia tabaci Algodón Anwar et al, 2019 Las quitinasas además de inhibir directamente plagas también pueden ser utilizadas como aditivos para suplementar insecticidas o fungicidas y aumentar su acción, lo que a su vez permite disminuir la concentración de otros químicos (Hamid et al, 2013). Las bacterias del género Photorhabdus también se encuentran dentro del grupo de bacterias que forman complejos entomopatógenos con nemátodo. Al igual que Xenorhabdus, estas bacterias presentan dos fases fenotípicas distintas. Dominelli et al (2022), proponen que la fase II de las células de Photorhabdus son capaces de adaptarse a las condiciones del suelo para sobrevivir luego que el nemátodo deja el cadáver de la larva hospedera y uno de los mecanismos que utiliza es la producción de compuestos antifúngicidas como enzimas quitinolíticas. En estudios realizados por estos autores, encontraron que al exponer las células en fase II a exudados radicales se dio un aumento de la transcripción de quitinasas y proteínas de unión a quitina por lo que los autores 15 sugieren que esta puede ser una señal de que las bacterias utilizan estas enzimas como recurso para proteger a la planta. Photorhabdus luminescens cuenta con tres genes que codifican para quitinasas chi2A, chi2B y chi2C, cuyas proteínas pertenecen a la familia GH 18. Las proteínas Chi2A y CPB (proteína de unión a quitina) actúan de manera sinérgica para conferir a la bacteria actividad antifúngica, de manera que la quitinasa Chi2A tiene la función de hidrolizar la quitina de hongos mientras que CPB es esencial para unirse a la molécula de quitina para así degradar completamente la pared celular del hongo. Al probar el efecto de estas proteínas contra Fusarium graminearum los autores demostraron que se produce una inhibición del crecimiento de este hongo patógeno (Dominelli et al, 2022). Estudio genómico como recurso para la identificación de compuestos antimicrobianos Los estudios basados en el genoma completo se han convertido en una herramienta versátil para el entendimiento de aspectos como la interacción entre genes y la relación que podrían tener con el ambiente. El conocimiento de la información genética completa de los microorganismos permite un acercamiento al entendimiento de las capacidades metabólicas que confieren la variedad de genes presentes en los genomas bacterianos, por ejemplo, se puede evidencia la presencia de genes responsables de la virulencia de bacterias o genes que dirigen la producción de metabolitos bioactivos como toxinas, antimicrobianos, enzimas, entre otros. La posibilidad que existe en la actualidad para secuenciar genomas completos también permite la identificación de patrones que reflejen posible divergencia y convergencia evolutiva además de identificar relaciones filogenéticas. El análisis de dominios proteicos puede utilizarse para identificar y predecir posibles nichos ocupados por los diferentes organismos. Chaston et al (2011) secuenciaron el genoma de X. nematophila y X. bovienii para compararlos con los genomas de Photorhabdus luminescens y Photorhabdus asymbiotica. El análisis de estos genomas aportó evidencia de divergencia evolutiva entre los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus, a pesar de que comparten estilos de vida similares, al ser ambos géneros simbiontes de nemátodos entomopatógenos (Chaston et al, 2011). 16 Estudios como los de Hong et al (2015) y Li et al (2021), se basan en la secuenciación y ensamblaje de los genomas para la presencia de compuestos antimicrobianos como toxinas y metabolitos secundarios. El estudio del genoma de bacterias del género Xenorhabdus representan un importante acercamiento al descubrimiento y utilización de genes junto con sus productos en la investigación de nuevos compuestos aplicables en el campo agrícola. En este trabajo se utilizó esta herramienta para la búsqueda de genes que codifican para la degradación de la quitina. Quitinasas en bacterias del género Xenorhabdus Diferentes estudios han reportado la producción de quitinasas en bacterias del género Xenorhabdus. Chen et al (1996) observaron la existencia de actividad endo y exoquitinasa en X. nematophila y X. bovienii. La proteína aislada produjo la hidrólisis de la quitina y al probar el efecto antifúngico contra Botrytis cinerea se produjo la inhibición de la germinación de conidias y de la elongación del tubo germinal, además de la lisis de la pared celular y distorsión del tubo germinal. Morgan et al (2001), al realizar un análisis de secuencias de genes insecticidas de X. nematophilus, reportan una pequeña región de ADN que codifica para una proteína de 648 aminoácidos, esta presenta similitud a las secuencias de las quitinasas, la cercanía de este gen a otros que codifican para toxinas los hace concluir que estos genes conforman una isla de patogenicidad que podría estar involucrada en la actividad insecticida de esta bacteria. Al realizar pruebas con larvas de Pieris brassicae se produjo una rápida y marcada disminución en la alimentación y la muerte en 24 horas. Mahmood et al (2018) expresaron y purificaron una proteína con la capacidad de hidrolizar quitina aislada a partir del cultivo de X. nematophilus. Esta proteína mostró actividad endo y exoquitinasa, además de inhibir el crecimiento de las hifas de Fusarium oxysporum y Alternaria alternate bajo condiciones in vitro. Liu et al (2019) caracterizan dos quitinasas de X. nematophila, que están codificadas por los genes chi60 y chi70. Estas proteínas pertenecen a la familia GH18, Chi60 presenta un peso molecular de 65kDa y Chi70 78kDa, ambas con un pH óptimo de 6. Estas enzimas presentaron acción insecticida contra Helicoverpa armigera, al inhibir el crecimiento de las larvas y antifúngica contra los hongos patógenos Alternaria brassicola, Verticillium dahliae y Coniothyrium diplodiella, se observó 17 inhibición de la extensión de las hifas (especialmente en V. dahliae), distorsión del micelio, afectación de la germinación de esporas y de la elongación del tubo germinal (Liu et al, 2019; Liu et al 2022). Nuevamente el grupo de investigación de Mahmood et al (2020) reportaron una quitinasa producida por X. nematophila, para caracterizar esta enzima clonaron y expresaron la proteína en E. coli. El gen identificado codifica una única proteína de 76 kDa con actividad endo y exoquitinasa. Esta quitinasa presentó toxicidad hacia la larva de Helicoverpa armigera, produciendo inhibición del crecimiento, del desarrollo e incluso la muerte de la larva. A raíz de estos descubrimientos los autores sugieren que la quitinasa de X. nematophila podría ser utilizada como un agente biológico para el control de plagas, por su capacidad de hidrolizar por completo la estructura de la quitina (Mahmood et al, 2020). Los autores reportan esta proteína como una nueva quitinasa para X. nematophila, sin embargo, con la revisión genómica realizada el gen que codifica esta proteína es el chi70 ya reportado por Liu et al (2019). Siguiendo la línea de investigación del gen chi70, el grupo liderado por Mahmood (2022) reportan la generación de plantas transgénicas de tabaco que expresan el gen de la quitinasa de X. nematophila. Al realizar bioensayos de alimentación de larvas de H. armigera con las líneas de tabaco que expresaban altos niveles de la quitinasa mostraban porcentajes de entre el 93 y 100 % de mortalidad de las larvas al producir efectos negativos en el crecimiento y desarrollo. Por otro lado, se ha reportado otra proteína de unión a quitina con efecto insecticida en este género bacteriano. Joshi et al (2008) logran aislar la proteína XnGroEl producida por la X. nematophila, que es liberada al medio a través de vesículas de la membrana externa. Las proteínas de GroEl descrita para bacterias como E. coli, pertenecen a una familia muy conservada de chaperonas cuya función principal es facilitar el plegamiento de las proteínas en la célula, sin embargo, al evaluar la toxicidad de XnGroEl en larvas de Helicoverpa armigera, esta proteína retardó el crecimiento y en ocasiones produjo la muerte de las larvas al administrase de forma oral. Esta toxicidad se ha dicho que puede estar ligada a la capacidad que presenta la proteína para unirse a quitina. La actividad insecticida es una propiedad única de esta proteína a diferencia de las otras GroEL y se ha propuesto que es producto de sustituciones polares en el dominio apical de la proteína, las cuales alterar la naturaleza de los residuos y le confieren la actividad insecticida. XnGroEL al presentar la capacidad de unirse a la molécula de quitina interactúa con el revestimiento peritrófico de las larvas evitando su crecimiento y desarrollo (Joshi et al, 2008). 18 Como se puede observar la mayoría de los estudios se centran en las quitinasas de la especie X. nematophila, lo que deja un amplio campo de exploración del resto de especies de este género de bacterias, incluyendo a Xenorhabdus sp Sc-CR9. Xenorhabdus sp Sc-CR9 El nemátodo Steinernema costaricense (Uribe-Lorío et al, 2005; 2007) ha sido descrito como una especie autóctona de Costa Rica, y al igual que todos los nemátodos entomopatógenos presenta una simbiosis con bacterias del género Xenorhabdus. El aislamiento de esta bacteria se ha identificado como Xenorhabdus sp Sc-CR9 y mediante estudios bioquímicos y filogenómicos realizados por el Área de Microbiología Ambiental del CIBCM se ha propuesto como una nueva especie de este género. Este grupo de investigación ha llevado a cabo diferentes estudios relacionados con la cepa Sc-CR9, que han tenido como resultado la secuenciación y el ensamblaje del genoma completo, que representa un importante recurso para conocer más acerca de la información genética de esta bacteria, lo cual permitiría identificar mecanismos y recursos con potencial para usos biotecnológicos incluyendo el control biológico. Además, como parte de las actividades del proyecto de investigación VI B8-215 “Xenorhabdus sp y Photorhabdus temperata: bacterias entomopatógenas como fuente de antimicrobianos novedosos” mediante la técnica de MALDI-TOFF, se determinó la presencia de quitiobiosas dentro del perfil proteico del sobrenadante del cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9, sin embargo, hasta el momento no se han aislado enzimas de esta naturaleza a partir de esta cepa. Dado que las enzimas quitinolíticas producidas por microorganismos pueden presentar grandes diferencias con respecto a la especificidad de sustratos y su rol fisiológico es de vital importancia estudiar el potencial de biocontrol de las diferentes especies de bacterias. El uso directo de las quitinasas para el combate de enfermedades ha dado resultados promisorios, razón por la cual nace la iniciativa del proyecto “Quitinasas extraídas de Xenorhabdus: potencial en control biológico”, con el fin de profundizar en el tema estudiando las enzimas quitinolíticas de Xenorhabdus sp Sc-CR9. El presente estudio se centra en investigar la presencia de quitinasas mediante análisis tanto de proteínas producidas por la bacteria como del genoma con el fin de determinar si existe actividad biológica contra hongos e insectos, contribuyendo a un mayor conocimiento sobre la biología de una especie nueva para la ciencia. 19 Objetivo General Evidenciar la producción de quitinasas por parte de la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9, con el fin de determinar la actividad antifúngica e insecticida de estas enzimas. Objetivos específicos 1. Analizar el extracto enzimático obtenido a partir del cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9 con el fin de detectar la presencia de quitinasas bacterianas. 2. Evaluar la actividad biológica de las quitinasas aisladas a partir del cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9 para determinar su capacidad antagónica contra hongos e insectos. 20 Metodología La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Agrícola del Centro de Investigaciones Agronómicas (CIA) y en el Área de Microbiología Ambiental del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM) de la Universidad de Costa Rica. Material biológico utilizado Se utilizó la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9, la cual fue extraída a partir de ejemplares del nemátodo Steinernema costaricense (Uribe-Lorío et al, 2005; 2007), cedidos por el Área de Microbiología Ambiental del CIBCM. Como control positivo para algunas de las pruebas se utilizó una cepa de Serratia marcescens, perteneciente a la colección del Laboratorio de Microbiología Agrícola del CIA. Para las pruebas de actividad biológica se utilizaron 3 hongos: dos cepas de Fusarium sp y una de Botrytis sp, además de dos Oomycetes: Pythium sp y Phytophthora sp, pertenecientes a la colección del Laboratorio de Microbiología Agrícola. Además, se utilizaron ejemplares de Galleria mellonella del pie de cría del Laboratorio de Microbiología Agrícola. Para el análisis genómico se utilizó el ensamblaje del genoma de Xenorhabdus sp Sc-CR9 cedido por Área de Microbiología Ambiental del CIBCM. Extracción de la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9 del nemátodo hospedero El aislamiento de la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9 a partir del nemátodo Steinernema costaricense, se inició con la desinfección de ejemplares de este organismo, para lo que se tomó 1 ml de la solución de nemátodos en un tubo graduado de centrífuga de 1,5 mL y se agregó 0,5 mL de hipoclorito de sodio al 1%, seguidamente se agitó en un vortex (Daigger vortex genie 2) durante 1 min y luego se centrifugó (eppendorf Centrifuge 5415 C) durante 2 min a 14000 rpm. Una vez que se obtuvo una acumulación del nemátodos en el fondo del tubo cónico formando un botón, se desechó el sobrenadante y se hicieron dos lavados del botón con agua estéril para lo cual se agitó en un vortex y se centrifugó durante 1 min a 14000 rpm desechando el sobrenadante. El botón de nemátodos se resuspendió en 250 µL de Caldo de Lisogenia (LB) (Vidaurre et al, 2016). 21 La suspensión se colocó en un plato Petri de vidrio estéril y de forma mecánica utilizando un policía se maceraron los nemátodos, con un asa bacteriológica se tomó material y se rayaron dos placas Petri con agar nutritivo (OXOID), medio estándar para el cultivo de bacterias. Las placas se incubaron a 28°C durante 48 horas en incubadora (Friocell MMM). Se tomó una colonia con una morfología redondeada y de color amarillo, característica de la fase activa de la bacteria Xenorhabdus sp Sc- CR9 y se rayó con un asa bacteriológica en otra placa Petri con agar tripticasa soya (Merk), esto se repitió en dos ocasiones más para asegurar el aislamiento de una cepa pura (Vidaurre et al, 2016). Adicionalmente la bacteria se cultivó en una placa Petri con agar nutritivo enriquecido con 0,0025% (m/v) de azul de bromotimol y 0,004% (m/v) de cloruro de trifeniltetrazolio (Medio NBTA), para asegurarse que se estaban utilizando las bacterias en fase activa, las cuales se caracterizan por tomar una tonalidad azul en este medio en particular (Tailliez et al, 2014). Identificación de la bacteria Para corroborar que se estuviera trabajando con bacterias del género Xenorhabdus se realizó la identificación molecular mediante la secuenciación del gen ARN 16S ribosomal. Para esto, primeramente, se realizó una extracción de ADN utilizando la matriz InstaGene (Biorad), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Se tomaron dos colonias de la bacteria crecida en medio ATS y se diluyeron en 1 mL de agua desionizada estéril con ayuda del vortex, la solución se centrifugó durante 3 min a 11000 rpm obteniendo un botón de la bacteria, el sobrenadante fue descartado. Al botón de bacteria se le agregaron 200 µL de la matriz de InstaGene y se incubó durante 20 min a 56 °C. Al terminar la incubación la solución se agitó con un vortex durante 10 s y se incubó a 100 °C durante 8 min. Al terminar esta segunda incubación se agitó en un vortex durante 10 s y se centrifugó a 11000 rpm durante 3 min. La calidad del ADN obtenido en la extracción se confirmó corriendo un gel de agarosa al 1,2% durante 45 min a 90 voltios. Con el ADN obtenido se amplificó un fragmento del gen ARN 16S mediante la Reacción en Cadena de al Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) utilizando los imprimadores universales 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) y 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT) (Weisburg et al., 1991). Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen de 25 µL con 200 μM de cada dNTPs (Thermo 22 Scientific), 1,25 mM de MgCl2 (Thermo Scientific), 0,4 μM de cada imprimador, 0,5 U de Taq ADN polimerasa (Thermo Scientific), 1XTaqbuffer (Thermo Scientific), y ~10 ng de ADN genómico. La amplificación se llevó a cabo con el programa y condiciones reportadas por Fontecha (2003). La correcta amplificación de los fragmentos de ADN se corroboró corriendo un gel de agarosa al 1,2% m/v durante 60 min a 90 voltios. Los productos de amplificación se purificaron con el kit Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, Madison, Wisconsin, Estados Unidos) y se secuenciaron utilizando el Servicio del Laboratorio de Secuenciación del CIBCM (UCR). Las secuencias obtenidas se ensamblaron con el software BioEdit Sequence Alignment Editor Versión 7.2 (Hall, 1999) y mediante el uso del algoritmo BLAST se buscó la homología haciendo uso de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se realizó un análisis filogenético alineando las secuencias con ClustalX (Larkin et al, 2007) en el programa MEGA (Tamura et al, 2013), como referencia se utilizaron cepas tipo y E. coli como grupo externo. Para calcular las distancias evolutivas se utilizó la inferencia de Neighbour joining y el árbol se visualizó con ITOL (https://itol.embl.de.com). Obtención de la fase II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 Para obtener la fase II de la bacteria, se tomó una colonia de la fase I y se inoculó en 50 mL de caldo nutritivo al que se le adicionó 1,5% de cloruro de sodio. Se incubó el caldo durante 48 horas a 28 °C y 180 rpm. Después de las 48 horas se realizó un recuento en placa, para lo cual se cultivó la bacteria en el medio ATS, en donde las bacterias de la fase I presentaban una coloración amarilla y las de la fase dos son blancas. Se tomó una colonia blanca y se rayó en una placa Petri con medio NBTA, en el cual la fase II toma una coloración roja. Para corroborar la identidad de la bacteria se realizó la identificación molecular con la amplificación y secuenciación del gen ARN 16S, siguiendo la misma metodología presentada en la sección de identificación de la bacteria. 23 Determinación del consumo de N-acetilglucosamina Para determinar si Xenorhabdus sp Sc-CR9 tanto en la fase I como en la fase II, era capaz de utilizar la fuente de carbono N-acetilglucosamina se utilizaron los ecoplatos del sistema Biolog, que contienen diferentes fuentes de carbono. Se siguió el protocolo sugerido por el fabricante para las EcoPlates TM, el cual consiste en rayar la bacteria en una placa con agar nutritivo, incubarla durante 24 horas a 28 °C. A partir de este crecimiento en plato se preparó un inóculo en base al estándar proveído por el equipo. Se inocularon 100 µL de la suspensión de la bacteria en cada uno de los 96 pocillos de la placa de Biolog y se incubó a 28 °C durante una semana. Cada 24 horas se hicieron las lecturas correspondientes y se cuantificó la utilización de la fuente de carbono de interés. Determinación de producción de quitinasas Obtención quitina coloidal Para suplementar el medio de cultivo de las bacterias con quitina como única fuente de carbono es necesario llevar a cabo un proceso previo de preparación de la quitina. Para esto se evaluaron protocolos que utilizan dos tipos de ácidos: Ácido Clorhídrico (HCl) y Ácido Fosfórico. En el caso del HCl se siguió el protocolo de Khan et al (2010), para el cual se tomaron 4 g de quitina granulada a la que se le adicionaron 50 mL de HCl, la mezcla se puso a agitar durante 1 hora a 4 °C. Al terminar el período de incubación se realizaron lavados con agua destilada y se filtró al vacío. En el segundo protocolo se tomaron 5 g de quitina granular y se le añadieron 100 mL de ácido fosfórico. Se incubó la mezcla durante 90 min, a 45 °C y 200 rpm, luego se incubó durante 30 min a 18 °C y 200 rpm. Al terminar el periodo de incubación se añadieron 100 mL de etanol al 70% frío y se incubó durante 2 horas a 18 °C y 200 rpm. Por último, se tomó la mezcla y se filtró al vacío realizando varios lavados con agua desionizada. Evaluación de medios de cultivo a base de quitina Para evidenciar la producción de quitinasas por parte de Xenorhabdus sp Sc-CR9 se evaluaron dos medios: el medio quitina peptona levadura (Quitina-PL) (Rishad et al, 2017) conformado por: 1% 24 quitina coloidal; 0,5% peptona; 0,5% extracto de levadura; 0,1% KH2PO4; 0,01% MgSO47H2O y 1,5% agar bacteriológico (para el medio sólido) a un pH de 7 , y el medio Quitina de Murthy & Bleakley (2012), que contiene 2% quitina coloidal; 0,7 g/L K2HPO4; 0,3 g/L KH2PO4; 0,5 g/L MgSO4*5H2O; 0,01 g/L FeSO4*7H2O; 0,001 g/L ZnSO4; 0,001 g/L MnCl2 y 15 g/L agar bacteriológico (para el medio sólido) a un pH de 7. Se evaluó el crecimiento de ambas fases de la bacteria tanto en el líquido como en el sólido. Crecimiento en medio líquido A partir de cultivos en medio ATS de 4 días, se tomó una colonia y se inocularon 50 mL de medio LB, una vez observado crecimiento, se tomaron 5 mL y se inocularon 45 mL de los medios Quitina y Quitina-PL. Se incubó a 28 °C y 180 rpm durante 264 horas. Para determinar la sobrevivencia y multiplicación de la bacteria en los medios de cultivo líquido se realizó un recuento viable en plato mediante la elaboración de una curva de crecimiento para las bacterias crecidas en cada uno de los medios. Para esto se tomaron alícuotas cada 24 horas con las que se realizaron diluciones seriadas para hacer recuentos en placa cultivando la bacteria en medio ATS. Los resultados obtenidos se graficaron utilizando el programa Excel. Las curvas de crecimiento en ambos medios se llevaron a cabo de la misma manera para ambas fases de la bacteria. Crecimiento en medio sólido Una colonia de cada una de las fases de la bacteria se cultivó en una botella de 250 mL con 50 mL de caldo LB durante 48 horas, a 28 °C y 180 rpm. Para observar el crecimiento de la bacteria en medios a base de quitina se utilizaron tres métodos: • Se hizo un rayado de cada uno de los cultivos en el medio Quitina-PL. • Se tomó una alícuota de 100 µL del cultivo y se extendió sobre la superficie del medio Quitina-PL utilizando un asa de Digralsky. • Se colocaron gotas de la suspensión bacteriana (10 µL) en placas Petri con los medios Quitina y Quitina-PL. Todos los medios se incubaron a 28 °C durante 7 días. 25 Para evaluar si había un efecto sinérgico en la degradación de quitina por parte de Xenorhabdus, se hizo un cultivo dual en el medio Quitina donde se inocularon dos alícuotas de 10 µL de S. marcescens y 10 µL de Xenorhabdus sp Sc-CR9. Las gotas se dejaron secar y se incubaron a 28 °C durante 30 días. Obtención del extracto enzimático Para la obtención del extracto enzimático producido por Xenorhabdus sp Sc-CR9 en fase I, se preparó el inóculo tomando una colonia de una placa Petri con medio LB, esta se colocó con asa bacteriológica en 50 mL de caldo LB y se incubó a 28 °C durante 48 horas y 180 rpm. Después de las 48 horas, 10 mL del inóculo se añadieron a 90 mL del medio Quitina líquido, en total se inocularon 6 botellas con un volumen final de 100 mL cada una. Después de 7 días de incubación a 28 °C y 200 rpm, el cultivo se centrifugó a 6000 rpm durante 5 min. Luego se filtró el sobrenadante con una membrana de 0,2 µm. Se añadió sulfato de amonio hasta alcanzar una saturación del 70% y se dejó reposando a 4 °C durante 48 horas. Se filtró la mezcla y el precipitado obtenido se diluyó en 5 mL de agua desionizada estéril. El extracto obtenido se dializó durante 24 horas con agua desionizada, se tomó el producto obtenido y se congeló a -70 °C (Thamthiankul et al, 2001). Una vez congelado se liofilizó durante tres días a -50 °C y una presión de 0,04 mBar. El extracto obtenido se refrigeró para luego ser utilizado en la evaluación de la actividad quitinolítica y biológica. Para la obtención del extracto enzimático generado por la fase II de la bacteria se siguió el procedimiento descrito anteriormente, pero en este caso se evaluaron ambos medios suplementados con quitina coloidal. La cantidad de proteína obtenida al aislar el extracto enzimático se cuantificó mediante una evaluación directa de la absorbancia a una densidad óptica de 280 nm con el espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer). Determinación de la actividad quitinolítica La actividad quitinolítica de la enzima se determinó mediante la medición de la cantidad de N- acetilglucosamina (NAG) liberada de la descomposición de la quitina coloidal. Para esto se siguió la metodología utilizada por Akeed et al (2020). Se preparó una matriz de reacción constituida por 500 µL de quitina coloidal (1% en buffer de acetato de sodio 0,1 M; pH 5) y 400 µL de una solución de la 26 enzima con una concentración de 0,25 mg/100 µL para el extracto obtenido a partir del cultivo de la bacteria en la fase I y de 0,5 mg/100 µL para el extracto de la fase II. La suspensión obtenida se incubó a 50 °C por 1 hora. Después de la incubación se añadió 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y se incubó a 100 °C durante 10 min. Se enfriaron en baño de hielo y se centrifugó a 10000 rpm durante 10 min (eppendorf Centrifuge 5415 C). La absorbancia del sobrenadante se midió a 540 nm con un espectrofotómetro Jasco V-630. Se preparó una curva estándar utilizando N- acetilglucosamina en concentraciones de: 100, 200, 300, 400 y 500 µg/mL. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para catalizar la liberación de 100 µg de acetilglucosamina (Gunaratna & Bakasubramanian, 1994). Determinación de la actividad biológica del extracto de proteínas Ensayo de inhibición de extensión de las hifas Se siguió la metodología utilizada por Taira et al (2002) con algunas modificaciones, en donde a partir de un cultivo de 7 días de dos cepas de Fusarium sp, Botrytis sp, Pythium sp y Phytophthora, se tomó un disco de agar de 6 mm de diámetro con hifas del hongo y los oomycetes, se colocó en el centro de otra placa Petri con medio agar papa dextrosa más ácido (Difco). Se incubó durante 4 días a 28 °C. Después de la incubación se colocaron gotas de 10 µL de las suspensiones a analizar sobre el agar. Se evaluaron: sobrenadante del cultivo de las bacterias, el extracto de la enzima, suspensión de Xenorhabdus sp Sc-CR9, suspensión de S. marcescens, una mezcla de los cultivos de Xenorhabdus sp Sc-CR9 más S. marcescens y agua como control negativo. Los cultivos se incubaron a 28 °C durante 72 horas y diariamente se registró si se daba algún grado de inhibición de la extensión de las hifas. El ensayo se realizó por triplicado tanto con la fase I como con la fase II de la bacteria. Adicionalmente se utilizó como control positivo quitinasa de Streptomyces griseus (Sigma-Aldrich) en una concentración de 1 mg/mL y se colocó una gota de 10 µL en cultivos de Fusarium sp, Botrytis sp, Pythium sp y Phytophthora. Prueba de inhibición de germinación de esporas de hongos Para identificar si el extracto enzimático inhibía el crecimiento de las esporas del hongo Fusarium sp, se preparó una suspensión con esporas del hongo y se expuso al extracto de la enzima, el 27 sobrenadante del cultivo de la bacteria, una suspensión de la bacteria y agua como control negativo. Para esto se tomaron 10 µL de la suspensión de esporas y se depositaron en un portaobjeto, a esta suspensión se le agregaron 10 µL de las soluciones a evaluar, se realizaron tres repeticiones por tratamiento. Las soluciones utilizadas correspondían a la fase I y II de la bacteria. Los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente, bajo condiciones de humedad alta durante 72 horas, después de las cuales se tomaron alícuotas y se cultivaron en medio PDA más ácido durante 5 días. Efecto del extracto proteico sobre larvas de Galleria mellonella Se analizó la capacidad biocontroladora de los extractos proteicos de las diferentes fases de la bacteria en larvas de Galleria mellonella, haciendo uso de la metodología de Aly et al (2019) con algunas modificaciones. En una placa Petri de vidrio se pesó un gramo de dieta y se suplementó con 100 µL de tres tratamientos: extracto enzimático, sobrenadante del cultivo de la bacteria y agua como control negativo. Se pesaron y se colocaron 3 larvas por tratamiento, las cuales se mantuvieron 24 horas sin alimento previo al ensayo. Se dejaron durante 3 días a 28 °C, después de los cuales se procedió a pesar las larvas de cada uno de los tratamientos. Se realizaron ensayos separados para cada fase de la bacteria y se utilizaron tres réplicas por cada ensayo. Con los datos obtenidos se realizó el análisis estadístico correspondiente. Análisis in sílico para evaluar la presencia de quitinasas Con el objetivo de identificar si la bacteria cuenta con los recursos a nivel genómico para la producción de quitinasas se hizo una revisión del genoma de esta cepa a partir del ensamblaje facilitado por el Área de Microbiología Ambiental del CIBCM. Como un primer acercamiento se hizo una comparación de genomas de este género de bacterias disponibles en las bases de datos públicas utilizando el sistema de Múltiple Alineación de Genomas (Mauve, The Darling Lab versión 2.4.0). Para esto se realizó la anotación del genoma haciendo uso del programa Prokka (Seeman, 2014), complementariamente se hizo una caracterización funcional del genoma utilizando GhostKOALA (Kanehisa et al, 2016) de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Con la anotación se 28 buscaron proteínas con funciones similares a las quitinasas o que estuvieran relacionadas con la ruta metabólica de la quitina. Se realizó una búsqueda de genes que codificaran para quitinasas dentro del genoma de Xenorhabdus sp Sc-CR9, para lo cual se montaron dos bases de datos de referencia: una en la que se recopilaron secuencias de nucleótidos de genes de quitinasas de bacterias pertenecientes a los géneros de Photorhabdus, Xenorhabdus y Serratia y la otra con las secuencias de los aminoácidos. Para la búsqueda se hizo uso de la herramienta MMseqs2 (Turro et al, 2011). Las proteínas de interés se modelaron en 3D utilizando el servidor de Swiss-Model desarrollado por el Computational Structural Biology Group. Amplificación de genes codificantes de quitinasas La amplificación de los genes de quitinasas se realizó mediante PCR utilizando los imprimadores específicos para el gen chi70: P1 (CATCTCGAGATGTCTCAAAATGTTTATCG) y P2 (TAGGGATCCCTACGATTTACGACG) (Mahmood et al, 2020) y un set de imprimadores degenerados para amplificar genes que codifiquen quitinasas chiAfor.ext (GGIGGITGGACIYTIWSIGAYCCITT) y chiA.rev (ATRTCICCRTTRTCIGCRTC) (LeCleir et al, 2004). Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen de 50 µL con 20 mM de cada dNTPs (Thermo Scientific); 25 mM de MgCl2 (Thermo Scientific); 100 pmol de cada imprimador; 0,5 U de Taq ADN polimerasa (Thermo Scientific); 1X Taqbuffer (Thermo Scientific) y ~20 ng de ADN genómico. La amplificación se llevó a cabo con el programa y condiciones reportadas por LeCleir et al (2004) con algunas modificaciones, la temperatura de hibridación fue de 50 °C y el paso de extensión a 72 °C se realizó durante 3 min. La correcta amplificación de los fragmentos de ADN se corroboró corriendo un gel de agarosa al 1,2% m/v durante 90 min a 90 voltios. 29 Resultados y Discusión Extracción de la bacteria Xenorhabdus sp Sc-CR9 del nemátodo hospedero Steinernema costaricense e identificación molecular El aislamiento realizado a partir del nemátodo consistió en un cultivo con colonias características de Xenorhabdus: color amarillo en medio LB y de color azul en el medio NBTA (Figura 5 A y B), este color es propio de la fase I de la bacteria que, al ser cultivada en un medio suplementado con azul de bromotimol y cloruro de trifeniltetrazolio (TTC), presenta colonias de un color azul oscuro, lo cual se debe a la absorción del azul de bromotimol (Dreyer et al, 2018). Figura 5. Crecimiento de la bacteria aislada a partir de nemátodos Steinernema costaricense en medio LB (A) y NBTA (B). Al realizar el análisis filogenético basado en el gen ribosomal del 16S se observó que la bacteria aislada a partir del nemátodo presenta una estrecha relación con la cepa Xenorhabdus sp. Sc-CR9, con un 100% de boostrap, lo que corrobora que la bacteria aislada del nemátodo corresponde a la cepa en estudio. A B 30 Figura 6. Análisis filogenético de las fases I y II de la bacteria obtenida a partir del nemátodo hospedero Steinernema costaricense. Obtención de la fase II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 La fase II de Xenorhabdus sp. Sc-CR9 se logró obtener cuando se expuso el cultivo a una alta concentración de cloruro de sodio (1,5%). La presencia de colonias con dos coloraciones diferentes: amarillas y blancas en medio ATS, indican la presencia de las dos fases. Cuando se cultivaron las bacterias blancas en el medio NBTA se obtuvieron colonias con una coloración roja, consistente con lo reportado para la fase II del género Xenorhabdus, esto debido a que en esta fase la bacteria no es capaz de absorber pigmentos como el azul de bromotimol (Figura 5B) (Dreyer et al, 2018). Se logró demostrar mediante el análisis filogenético que las colonias aisladas como fase II, presentan una estrecha relación con la cepa Xenorhabdus sp. Sc-CR9 con un 100% de boostrap, corroborando que la fase II corresponde a la cepa en estudio. Estos resultados demuestran que la adición de una alta concentración de sal provoca el cambio de fase en esta cepa de Xenorhabdus. 31 Determinación de la producción de quitinasas Obtención de quitina coloidal Al evaluar los dos protocolos para la obtención de quitina coloidal, se encontró que en el protocolo a base de HCl la consistencia de la quitina no fue la apropiada, ya que presentaba una textura grumosa no apta para la elaboración del medio de cultivo para la bacteria ya que no se disolvía con los demás componentes (Figura 7A). Cuando se utilizó el segundo protocolo a base de ácido fosfórico, sí se obtuvo la textura coloidal adecuada para la preparación del medio (Figura 7B), por lo que se eligió este protocolo para la preparación de la quitina coloidal usada en los medios suplementados con este compuesto. La capacidad de la bacteria control S. marcescens para crecer en el medio de cultivo a base de quitina, indica que este medio puede ser utilizado en la evaluación de la capacidad quitinolítica de las bacterias empleadas en este estudio, ya que S. marcescens ha sido ampliamente reportada como productora de quitinasas (Tuveng et al, 2017). Figura 7. Quitina coloidal obtenida utilizando el protocolo con HCl (A) y con Ácido Fosfórico (B). A B 32 Evaluación de medios de cultivo a base de quitina Crecimiento en medio líquido Al evaluar el crecimiento de Xenorhabdus sp. Sc-CR9 fase I y fase II en los medios Quitina y Quitina- PL líquidos, que contienen esta sustancia como principal fuente de carbono, se observó en ambos casos turbidez producto del crecimiento de la bacteria. Al examinar al microscopio los cultivos de ambos medios y ambas fases se encontraron bacilos pequeños con motilidad muy activa. Estos resultados indican que la bacteria es capaz de utilizar la quitina como fuente de carbono. La sobrevivencia y multiplicación de la bacteria (fase I y II) en ambos medios de cultivo líquidos a base de quitina, se registró mediante curvas de crecimiento (Figuras 8 y 9). Figura 8. Curva de crecimiento de las fases I y II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en el medio Quitina- PL. En el medio Quitina-PL (Figura 8) se observó crecimiento exponencial de la fase I de la bacteria de las 0 h hasta las 10 h, obteniéndose una población máxima de crecimiento de 1,4 x109 UFC/mL, seguido se obtuvo una fase exponencial con una duración de aproximadamente 14 horas. A partir de las 24 horas ocurrió una fase de muerte alcanzando una población final de 2,2x103 UFC/mL a las 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 50 100 150 200 250 300 Lo g U FC /m l Tiempo (horas) Fase I Fase II 33 264 horas, que fue la última lectura realizada. En el caso de la fase II (Figura 8), también se observó en las primeras 10 horas una fase exponencial obteniéndose una población de 2,3x109 UFC/mL, seguida de una fase estacionara que se mantuvo hasta las 24 horas, punto en el que la población empezó a disminuir de forma gradual. Entre las 96 y las 144 horas hubo un periodo de estabilidad de la población después de las cuales continuó el descenso obteniéndose una población de 9,3x102 a las 264 horas, última lectura. Durante las primeras 100 horas el comportamiento de ambas fases fue muy similar. Figura 9. Curva de crecimiento de las fases I y II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en el medio Quitina. En el caso del medio Quitina para la fase I se observó una caída progresiva de la población bacteriana hasta las 264 horas en donde se obtuvo una población de 1,1x105 UFC/mL. En el caso de la fase II se dio un descenso en la población hasta las 144 horas, a partir de las cuales se presenta una etapa exponencial alcanzando una población máxima de 1,9x106 UFC/mL, esta fase se alargó hasta las 216 horas, momento en el que inició el descenso de la población hasta las 264 horas, cuando se realizó el último análisis. El comportamiento de ambas fases de las bacterias difirió en este medio. Sin embargo, el último día de lectura, ambas fases tienen una población bacteriana de alrededor de 105 UFC/mL (Figura 9). 3 4 5 6 7 8 9 10 0 50 100 150 200 250 300 Lo g U FC /m L Tiempo (horas) Fase I Fase II 34 El crecimiento exponencial de la fase II en este medio evidencia que la bacteria está aprovechando la degradación inicial de la quitina, con formas de carbono que son utilizables por la bacteria. En los recuentos realizados a los cultivos de la fase I de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en el medio Quitina, se pudo observar la presencia de colonias amarillas (Fase I) y colonias blancas (Fase II) en el mismo cultivo de la bacteria como se muestra en la figura 10, esto podría ser producto del estrés generado por la presencia de quitina como fuente principal de carbono o a que la fase II posee una mayor capacidad para degradar la quitina. Al respecto, se ha propuesto que para cepas de Photorhabdus, la fase II está mejor adaptada para sobrevivir en ausencia del nemátodo, de manera que el paso de la fase I a la fase II podría ser una adaptación para que pueda sobrevivir la población de bacterias que queda en el cadáver del insecto después del proceso de infección del insecto hospedero (Joyce et al, 2006). Por otro lado, Dominelli et al (2022) demostraron que específicamente las células de la fase II de Photorhabdus presentan actividad quitinolítica, con la que inclusive puede degradar la pared celular de hongos. También se ha demostrado que la actividad quitinolítica de la fase II de P. luminescens es significativamente mayor en presencia de exudados producidos por raíces (Regaiolo et al, 2020) Figura 10. Cambio de fase de las bacterias en los cultivos en medios suplementados con quitina coloidal. Colonias de la fase I color amarillo y de la Fase II color blanca. Fase I Fase II 35 Crecimiento en medio sólido Al cultivar la fase I y II de la bacteria en el medio sólido Quitina-PL, utilizando tres técnicas diferentes: rayado por estría en placa, inoculación de una gota de 10 µL y distribución de 100 µL en la superficie de la placa, solo se obtuvo crecimiento al poner la gota de 10 µL (Figura 11). Figura 11. Crecimiento de la fase I (A) y II (B) de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en medio Quitina-PL sólido. Complementariamente se cultivaron las cepas PT01, MEX-20 y RW-14 de Photorhabdus y XSZ de Xenorhabdus, en el medio sólido Quitina-PL con el fin de corroborar si bacterias del género de Photorhabdus y otras especies del género de Xenorhabdus crecían de manera similar en estos medios (Figura 12). A B 36 Figura 12. Crecimiento de la fase I de cepas de Xenorhabdus sp y Photorhabdus sp en caldo LB (A) y medio Quitina-PL (B). Este caso en particular, en donde hay crecimiento bacteriano solamente al utilizar como inóculo una gota del cultivo, podría estar relacionado a que la interacción de las bacterias con materiales como la quitina influye en las respuestas metabólicas y fisiológicas de estos microorganismos, se ha reportado el uso de biofilms como un mecanismo que promueve la sobrevivencia de las bacterias al permitirles colonizar superficies de materiales compuestos por quitina, probablemente porque el biofilm tiene un importante rol en la acumulación de bacterias en superficies sólidas (Meibom et al, 2003; Margolis et al, 2009; Sahreen, 2022). La formación de biofilms se ha asociado con la protección de las bacterias durante periodos de estrés ambiental, por ejemplo, por cambios en el pH, presencia de sustancias tóxicas o poca disponibilidad de nutrientes (Meibom et al, 2003; Margolis et al, 2009; Sahreen, 2022). Un aspecto de relevancia en la formación de biofilms es la comunicación entre las células, el quorum sensing es un mecanismo de sincronización con el que se controla la expresión génica. Mediante el quorum sensing las bacterias regulan actividades fisiológicas como simbiosis, virulencia, motilidad y la formación de biofilms (Sahreen, 2022). Meibom et al (2003) demostraron que cuando bacterias como Vibrio cholerae crecen sobre un sustrato a base de quitina, expresan genes específicos entre los que se encuentra un gen que codifica para un pili. La expresión de PilA es inducida por la presencia de quitina y contribuye a la sobrevivencia de la bacteria durante el proceso de colonización y formación de biofilm sobre superficies compuestas de quitina. De igual manera Margolis et al (2009) encontraron que la formación de biofilm promueve la persistencia de la bacteria Francisella tularensis en superficies de B A 37 quitina. De manera que es posible que Xenorhabdus sp Sc-CR9 solo crezca en el medio Quitina-PL al poner a crecer una gota en donde el alto número de bacterias (aproximadamente 106 bacterias en los 10 µL) y el contacto cercano entre ellas propicia un crecimiento similar a un biofilm proveyendo a la población bacteriana los medios necesarios para sobrevivir en estas condiciones. Cuando se evaluó el crecimiento de Xenorhabdus sp Sc-CR9 en el medio Quitina sólido, no se obtuvo crecimiento de ninguna de las dos fases de la bacteria, lo que indica que para que Xenorhabdus sp Sc-CR9 pueda crecer en este medio, requiere de una fuente de aminoácidos y factores de crecimiento que son proveídos por la peptona y el extracto de levadura (Faramarzi et al, 2009; Wang et al, 2014). Mediante la optimización de un medio de cultivo para la producción de quitinasas por parte de la bacteria S. marcescens JPP1, Wang et al (2014) observaron que la máxima producción fue bajo condiciones de altas concentraciones de peptona. Obtención del extracto enzimático y determinación de la actividad quitinolítica A partir del cultivo de la fase I de la bacteria en el medio Quitina, utilizando la metodología de Thamthiankul et al (2001), se obtuvo una concentración de 0,715 mg/mL de proteína (Figura 13A). En el caso del cultivo de la fase II en el medio quitina no se obtuvo extracto de la proteína. Por esta razón se realizó el aislamiento de la proteína de la fase II, en el medio Quitina-PL, en este caso se obtuvo una concentración de 5mg/mL (Figura 13B). Figura 13. Obtención de proteína a partir del cultivo de la fase uno en medio quitina (A) y de la fase dos en el medio quitina peptona levadura (B). A B 38 Para determinar la actividad quitinolítica de las proteínas se realizó una curva con concentraciones de 100-500 µg/mL de N-acetilglucosamina como estándar para la medición de los azúcares reductores (Figura 14). Figura 14. Curva estándar de N-acetilglucosamina. Al realizar la medición de la actividad enzimática de la proteína obtenida a partir del cultivo de la fase I de la bacteria en el medio quitina, se obtuvo una densidad óptica de 0,0351 a 540 nm. Indicando que en la muestra hay una concentración de 63,32 µg de azúcares reductores/mL, obteniendo 0,63 U/mg de proteína. Para la proteína extraída del cultivo de la fase II se obtuvo una densidad óptica de 0,0341 a 540 nm, correspondiente a 63,15 µg de azúcares reductores/mL, lo que resulta en 0,63 U/mg de proteína. Niveles bajos de actividad quitinolítica fueron también encontrados por Mahmood et al (2018), quienes encontraron niveles de 0,41 U/mg cuando estudió la actividad quitobiosidasa de la quitinasa producida por X. nematophila. y = 0,0059x - 0,3385 R² = 0,9972 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 100 200 300 400 500 600 A b so rb an ci a 5 4 0 n m Concentración (µg/ml) 39 Determinación de la actividad biológica del extracto de proteínas Ensayo de inhibición de extensión de las hifas No se encontró inhibición del crecimiento del micelio de los hongos y los oomycetes a los que se adicionó el extracto de proteína obtenido a partir del cultivo de la fase I de las bacterias (Figura 15). El tratamiento correspondiente a la suspensión de S. marcescens y el tratamiento de la mezcla de Xenorhabdus sp Sc-CR9 + S. marcescens presentaron una inhibición del crecimiento del micelio de Botrytis sp (Figura 16). Figura 15. Prueba de actividad biológica del extracto de proteína obtenido a partir del cultivo de la fase I de Xenorhabdus sp Sc-CR9 contra dos cepas de Fusarium sp. P: proteína EX: sobrenadante X: Xenorhabdus S: S. marscesens X+S: Xenorhabdus + S. marscesens 40 Figura 16. Prueba de actividad biológica del extracto de la proteína contra Botrytis sp. En las pruebas con el extracto de la proteína obtenido a partir del cultivo de la fase II de la bacteria no se observó inhibición del crecimiento del micelio de los hongos y los oomycetes. Los otros tratamientos tampoco presentaron ningún tipo de inhibición del crecimiento del micelio (Figura 17). Figura 17. Prueba de actividad biológica del extracto de proteína obtenido a partir del cultivo de la fase II de Xenorhabdus sp Sc-CR9 contra Botrytis sp (A) y Fusarium sp (B). Zona de inhibición Zona de inhibición S Inhibición del micelio Inhibición del micelio S+X P EX X S S+X A A P EX X S S+X A B P: proteína EX: sobrenadante X: Xenorhabdus S: S. marscesens X+S: Xenorhabdus + S. marscesens 41 Estos resultados indican que para que haya algún efecto inhibitorio en este tipo de bioensayo se requiere la bacteria viva. Adicionalmente, cuando se evaluó como control una quitinasa comercial de Streptomyces griseus (Sigma-Aldrich), no se observó efecto de esta sobre el crecimiento de los hongos y oomycetes evaluados. Prueba de inhibición de germinación de esporas de hongos Al realizar las pruebas de inhibición de germinación de esporas de Fusarium sp, se observó que las muestras del control negativo, en el cual se utilizó agua tuvieron un crecimiento normal del hongo, mientras que las muestras de los tratamientos con proteína y con Xenorhabdus sp Sc-CR9, el desarrollo del hongo fue inhibido (Figura 18 A, B y C). Indicando que la proteína y la bacteria afectan de forma negativa el crecimiento del hongo. Figura 18. Prueba de crecimiento en plato de Fusarium sp. A: Control con agua, B: Tratamiento con extracto de proteína, C: Tratamiento con suspensión de Xenorhabdus sp Sc-CR9. Se ha reportado la capacidad de las quitinasas de Xenorhabdus para producir efectos negativos en el crecimiento de hongos patógenos, tal es el caso de Liu et al (2019) que observaron la inhibición de extensión de las hifas y distorsión del micelio en hongos como Alternaria. Mahmood et al (2018) reportan la inhibición del crecimiento de hifas de Fusarium oxysporum y Alternaria alternate producto de la actividad endo y exoquitinasa de la enzima aislada a partir del cultivo de X. nematophilus. Esto hace pensar que tanto el extracto proteico como el sobrenadante obtenido a partir del cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9 tiene compuestos generados por esta bacteria que A B C 42 afecta el crecimiento del hongo Fusarium sp, entre las cuales se encuentran las enzimas quitinolíticas. Efecto del extracto proteico sobre larvas de Galleria mellonella Cuando se evaluó el efecto de la proteína y el sobrenadante de las bacterias en fase I y II añadidas a la dieta de las larvas de Galleria mellonella (Figura 19), se utilizó en el primer caso una población de larvas con un peso promedio de 0,2211 g (cuadro 3), y en el segundo 0,1914 g. Ambas poblaciones presentaron una distribución normal (p>0,05) según la prueba de Shapiro-Wilks. Cuadro 3. Peso de las larvas antes de la exposición durante tres días a alimento suplementado con 100 µL de proteína y sobrenadante de Xenorhabdus sp Sc-CR9 fase I y II. Xenorhabdus sp Sc-CR9 Peso inicial de las larvas (g) Fase I 0,2211 ± 0,0390 Fase II 0,1914 ± 0,0322 Los resultados indican, según la prueba de Kruskal Wallis que hubo diferencias (p=0,0238) en el peso en las larvas sometidas al sobrenadante con respecto al control, pero no a la proteína obtenida de la bacteria en la fase I, lo que indica que otros compuestos del sobrenadante podrían tener un efecto sobre el peso de las larvas de Galleria mellonella (Cuadro 4, Anexo 1). Se ha reportado que bacterias del género Xenorhabdus tienen la capacidad de producir metabolitos con efectos insecticidas si se aplican de manera oral, por ejemplo, las proteínas del complejo Xpt, la subunidad citotóxica pilin, XnGroEl y también la producción de XeGroEL por X. ehlersii, han demostrado un efecto letal en larvas de Galleria mellonella (Shi et al, 2012). Este tipo de compuesto podrían producir un efecto negativo en el peso de las larvas, pero en este caso al ser concentraciones bajas no produjeron la muerte. Al analizar el efecto del sobrenadante y la proteína obtenidas a partir de la bacteria en fase II, no se encontraron diferencias en el peso de las larvas con respecto al control (p= 0,3796). 43 Cuadro 4. Peso de larvas de Galleria mellonella antes y después de la exposición a alimento suplementado con 100 µL de proteína, y de sobrenadante de Xenorhabdus sp Sc-CR9 fase I y II. Fase Aditivo Peso Inicial (g) Peso Final (g) Fase I Proteína 0,21 ± 0,05 0,33 ab Sobrenadante 0,24 ± 0,04 0,33 b Control 0,21 ± 0,03 0,28 a p 0,0238 Fase II Proteína 0,20 ± 0,02 0,23 a Sobrenadante 0,18 ± 0,04 0,23 a Control 0,21 ± 0,03 0,25 a p 0,3796 Figura 19. Larvas de Galleria mellonella expuesta a la proteína obtenida del cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9. A: Día cero, B: Día tres. Aly et al (2019) reportaron al evaluar el uso de quitinasas contra larvas de G. mellonella, que la enzima influyó en los procesos metabólicos de estos insectos. Los autores observaron efectos negativos en el desarrollo y alimentación además de alteraciones en parámetros bioquímicos (concentración de proteínas, carbohidratos y lípidos). Sin embargo, la actividad de la proteína utilizada en estos ensayos es de 135 U/mg de proteína, cantidad considerablemente mayor a la obtenida a partir del cultivo de Xenorhabdus sp Sc-CR9. A B