Revista del Colegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de Costa Rica ISSN: 2215-3713Revista del Colegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de Costa Rica ISSN: 2215-3713 como responsable de casos tanto en individuos inmunosupresos como inmunocompetentes(12) y el único caso de encefalitis por Sappinia en un hombre inmunocompetente(10). Además de su importancia como agentes productores de enfermedad, las AVL recientemente han sido relacionadas con bacterias potencialmente patógenas(1). Al respecto, se ha sugerido que éstas han podido funcionar como “incubadores evolucionarios” para la adaptación de las bacterias a la vida intracelular dentro de macrófagos. Los primeros estudios sugieren una relación de endosimbiosis, pero actualmente “bacterias resistentes a las amebas”(1) para referirse a aquellos organismos capaces de sobrevivir una vez que fueron fagocitados. Legionella pneumophila, Vibro cholerae, Francisella tularensis, Chlamydia pneumoniae y Mycobacterium avium son algunas de las bacterias aisladas de especies de Acanthamoeba y Balamuthia. La ubicuidad de las amebas, la resistencia de sus quistes, así como la capacidad demostrada de crecimiento en ambientes donde el ser humano realiza actividades recreativas y laborales ha motivado la hipótesis de que estos organismos pueden servir como “reservorios” y “Caballos de Troya”, facilitando la transmisión de las bacterias potencialmente patógenas al ser humano(1). Por la agresividad de los cuadros, principalmente aquellos que afectan el SNC, un diagnóstico rápido y certero es indispensable para el paciente. Según Rocha- Azebedo et al(13) infecciones humanas por AVL depende de dos factores: 1) el conocimiento y familiaridad del clínico con los síntomas y 2) la calidad y tipo de muestra enviada al laboratorio clínico(12). En este último punto, el papel del profesional en Microbiología resulta fundamental, pues es a quien corresponde la búsqueda del agente en las primeras muestras que llegan al laboratorio. Las afecciones a nivel de SNC producidas por los géneros Acanthamoeba y Balamuthia resultan muy similares en sus manifestaciones clínicas. Ambos son cuadros de encefalitis de curso crónico, en al hablar, cambio de conducta, convulsiones, etc. El diagnóstico diferencial incluye meningitis tuberculosa, encefalitis viral, toxoplasmosis, infecciones por hongos, cisticercosis, tumores cerebrales, entre otros. Es importante recordar que las infecciones por Acanthamoeba se asocian a individuos inmunosupresos, mientras que Balamuthia se Las amebas de vida libre (AVL) son protozoarios con distribución cosmopolita que habitan diferentes tipos de suelo, así como fuentes de agua presentan dos estadios evolutivos: trofozoíto y quiste; este último constituye la forma de resistencia que asegura la supervivencia de las amebas bajo las condiciones adversas del medio ambiente. La abundancia y diversidad de estos organismos depende del clima, pH y disponibilidad de nutrientes(1). Los trofozoítos se alimentan por fagocitosis y la digestión de bacterias, hongos y algas ingeridas ocurre dentro del fagolisosoma. Acanthamoeba, Balamuthia, Naegleria y Sappinia son término acuñado para describir la capacidad de algunos organismos de comportarse como endoparásitos bajo condiciones aún desconocidas. El potencial patógeno de las AVL fue propuesto en 1958 por Culbertson(2) quien logró, a nivel experimental, inducir en monos un cuadro de meningoencefalitis al inocular, de forma intranasal, quistes de una ameba aislada del ambiente. Fowler y Carter(3) en 1965 reportaron en Australia el primer caso en humanos producido por amebas del género Naegleria y, a principios de los años 70, se inició el reporte de los primeros casos de afección al sistema nervioso central (SNC) relacionados con amebas del género Acanthamoeba(4). A la fecha han sido reportados más de 230 casos de meningoencefalitis amebiana primaria por Naegleria fowleri (PAM, por sus siglas en inglés)(5), y un número similar de casos de encefalitis granulomatosa amebiana (GAE, por sus siglas en inglés) por Acanthamoeba(6), especie que también es la responsable de más de 5000 casos de queratitis amebiana solamente en los Estados Unidos(7). Balamuthia mandrillaris es responsable de cerca de 200 casos con afección a SNC y piel, la mayoría en América Latina y los Estados Unidos(8,9), mientras que Sappinia diploidea se ha aislado de un único caso clínico de encefalitis(10). La invasión de las AVL al ser humano puede producirse vía respiratoria, con llegada al cerebro a través del nervio olfatorio o bien, a través de mucosa nasofaríngea. En otros casos, la afección a SNC se produce a partir de un foco primario en pulmón o cutáneo, con diseminación vía hematógena. En el caso de las queratitis por Acanthamoeba, la infección ocurre cuando la ameba, aprovechando lesiones previas en ojo, logra invadir y afectar la córnea. Dentro de los grupos de riesgo para Acanthamoeba están individuos inmunosupresos, usuarios de lentes de contacto y personas con afecciones de sistema respiratorio. En el caso de Naegleria, los cuadros clínicos se presentan en individuos inmunocompetentes, donde niños y jóvenes con historia previa de actividad acuática son los grupos más afectados(11). Para los géneros Balamuthia y Sappinia más propensas a la infección, reportándose Balamuthia Valores de referencia PAM Aspecto Claro Turbio, amarillento, con o sin sangre Proteínas 15 a 60 mg/100 mL 100 mg/100mL a 1000 mg/100mL Glucosa 50 a 80 mg/100 mL (o mayor a dos tercios del nivel de azúcar en la sangre) 10 mg/100mL o menor Celularidad < 5 leucocitos mononucleares, 0 glóbulos rojos, 0 PMN Predominio de PMN: 300 céls/ mm3 a 26000 céls/mm3 Tabla 1. Características del líquido cefalorraquídeo en un cuadro de meningoencefalitis amebiana primaria (PAM)(12) Naegleria fowleri Acanthamoeba sp.* Tipo de núcleo Vesiculoso tipo limax Vesiculoso tipo limax Trofozoíto 13-25 µm, seudópodo ancho, eruptivo 20-60 µm, acantopodios y algunos lobópodos Quiste Dos membranas delgadas lisas, Con tapones mucoides planos Dos membranas, con endocisto liso o de formas geométricas (estrellas, polihedros) No existe Termotolerancia Crecimiento 42-45°C Crecimiento 37-40°C Tabla 2. Características morfológicas de las AVL asociados con mayor frecuencia a cuadros a nivel de SNC(28) (*) Existen varias especies de Acanthamoeba asociadas a cuadros en SNC: A. castellanii, A. culbertsoni, A. polyphaga, entre otros. También, estas especies suelen agruparse en genotipos actualmente. Revista del Colegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de Costa Rica ISSN: 2215-3713Revista del Colegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de Costa Rica ISSN: 2215-3713 puede presentar también en pacientes inmunocompetentes en donde, en la mayoría de los casos, va precedido por un cuadro a nivel cutáneo(1). Como sucede con todos los cuadros de encefalitis, la primera muestra que se envía al laboratorio es el líquido cefalorraquídeo (LCR). El análisis incluye la bioquímica y celularidad de la muestra, así como la búsqueda de formas ameboides. Los valores del LCR asociado a casos de GAE son similares a los encontrados para una meningitis viral: proteínas elevadas y glucosa disminuida, con altos recuentos de linfocitos. Para la búsqueda de las formas amiboides, se debe centrifugar la muestra durante 5 a 8 minutos a 1000 rpm y tomar el sedimento para la observación directa las formas. Una tinción de Giemsa o de Wright también puede ser empleada para el diagnóstico (Tabla 2). De forma paralela a la observación directa se recomienda el cultivo del sedimento sobre agar no nutritivo al 1,5%, suplementado con Escherichia coli. Algunos autores sugieren suplementar el agar con peptona 0,05%, extracto de levadura 0,05% y glucosa (15). Las placas de agar deben ser incubadas a 37°C durante siete días, con observación diaria a partir del tercer día. En el caso de Balamuthia es muy raro el hallazgo de trofozoítos y quistes en muestras de LCR y, al ser ésta una ameba fastidiosa, solo se ha podido crecer en cultivos celulares. Otras muestras empleadas para el diagnóstico incluyen suero y tejido cerebral. La serología en los casos de una infección por Acanthamoeba ha demostrado que en sangre puede ser indicativo de una infección activa. Resultados de IgG de 1:256 hasta 1:1024 en individuos infectados contrastan con el título máximo 1:80 determinado en individuos sanos(16, 17). La detección de estos anticuerpos se puede hacer a través de un ELISA o Actualmente están disponibles métodos moleculares que permiten el diagnóstico de género y que pueden ser empleados tanto en clínica como a nivel ambiental. Para el caso de Acanthamoeba se utiliza una reacción (18) y en el caso de Balamuthia, ADNr(19). Ambas técnicas están disponibles en la Sección de Protozoología Médica, Facultad de Microbiología (Universidad de Costa Rica) y están siendo empleadas para la determinación de estos organismos en el ambiente, principalmente en sitios considerados de riesgo para la infección del ser humano, por ejemplo piscinas, duchas de emergencia, aires acondicionados, unidades dentales, entre otros. La PAM es el cuadro a nivel de SNC producido por Naegleria fowleri. Con un curso agudo y fulminante, la enfermedad progresa rápidamente, produciendo la muerte del paciente dentro de los próximos 5 a 10 días post infección. Son escasos los reportes de sobrevivientes, calculándose la mortalidad en más del 95%(5). Los primeros síntomas inician de manera abrupta con nucal, seguido por náuseas, vómito, irritabilidad y cansancio. A nivel mundial se han descrito alrededor de 235 casos, la mayoría de ellos en niños y jóvenes inmunocompetentes(5,11). La epidemiología de los casos indica que existe una asociación entre actividad acuática y posibilidad de adquisición del agente, incluyéndose el buceo desnudo, la inmersión y la zambullida, entre otras, como actividades relacionadas con la posible adquisición de esta especie. La infección con N. fowleri se produce vía nasal, con penetración del trofozoíto a través del nervio olfatorio y migración a lo largo del mismo, hasta atravesar la placa criboide y alcanzar el bulbo olfatorio del SNC(12). La porosidad de la lámina cribosa en individuos jóvenes podría explicar por qué estas poblaciones son las más afectadas. Debido a lo agresivo del cuadro, el diagnóstico de una PAM los síntomas, así como la poca experticia del clínico y el analista, pueden ser los factores que expliquen el diagnóstico tardío. A diferencia de los cuadros producidos por Acanthamoeba y Balamuthia, el diagnóstico temprano de la PAM recae casi exclusivamente en la observación de la ameba en LCR. Cuando el nivel de presión intracraneana del paciente lo permite, debe enviarse al laboratorio una muestra de LCR. El líquido no debe refrigerarse y el procesamiento debe ser el mismo que se indicó para las otras amebas. La observación macroscópica revela por lo general un líquido de color grisáceo-amarillento, con o sin la presencia de sangre(13). En la Tabla 1 se pueden observar los valores de proteínas, glucosa y celularidad que se determinan en un caso sospechoso de PAM. Al igual que se describió anteriormente, la tinción de Giemsa o de Wright pueden ayudar a la visualización del agente (Tabla 2). Es importante mencionar que la presencia de formas en LCR no es una constante en todos los casos de PAM, por lo que la sensibilidad de la técnica es baja. El cultivo de material biológico, por ejemplo tejido sa de muerte, pero no debe ser la primera opción para el diagnóstico temprano. La aplicación de pruebas como termotolerancia (crecimiento a 42°C-44°C) y (20) a las formas aisladas pueden ayudar al diagnóstico diferencial del agente. Actualmente se encuentra disponible una PCR para la determinación de N. fowleri(21), sin embargo, su uso se limita a los laboratorios de investigación y son pocos los laboratorios clínicos que tienen acceso a la misma. En nuestro país son escasos los trabajos realizados y publicados sobre AVL. El primero de ellos data del año 1979(22) universitarios. Los resultados obtenidos determinaron la presencia de amebas de vida libre en frotis nasales y muestra de heces, y se logró obtener 8 aislamientos de Acanthamoeba con capacidad patogénica. En 1981, Chinchilla et al lograron aislar estos protozoarios de piscinas, así como de frotis nasales y LCR de niños del Hospital San Juan de Dios(23). El último reporte de este tipo en el país corresponde a un trabajo publicado en el año 1994, en el que Echandi y colaboradores(24) realizaron 32 aislamientos de amebas potencialmente patógenas a partir de heces y frotis nasales de 500 pacientes de consulta externa de la Clínica Marcial organismos se basó en las características morfológicas, así como en la demostración de la capacidad patogénica en animales de laboratorio. A nivel clínico sólo se tiene el registro de dos afecciones a SNC por amebas: en el 2006 Morales et al(25) reportaron el primer caso de PAM en un hospedero animal (una vaca) y en el 2011 Wagner et al(26) describen un caso clínico de encefalitis en un paciente venezolano, que se sospecha pudo adquirir el agente en un bosque tropical de nuestro país. Recientemente, se dispararon las alertas en el país por la muerte de un niño de 11 años, de origen norteamericano, quien al regreso de unas vacaciones en la zona de San Carlos, fue remitido a un hospital de la Florida por un cuadro a nivel de SNC. El cuadro resultó fulminante y el niño murió a los 3-4 días posterior a su ingreso. Las pruebas realizadas por el sospechándose que la infección se produjo en Costa Rica (27) Cuando un caso como el anterior es dado a conocer, lo que procede es llevar a cabo las investigaciones necesarias para con las que el paciente pudo tener contacto. Para el estudio epidemiológico en el país, el Ministerio de Salud contactó a la Sección de Protozoología Médica de la Facultad de Microbiología, la cual dispone de la batería de pruebas necesarias para el aislamiento de ésta y otras AVL. El estudio epidemiológico se realizó en la zona de San Carlos y las muestras analizadas procedían de fuentes naturales de agua y piscinas, incluyendo las de presencia de amebas con características morfológicas similares a Naegleria sp. Para evaluar el potencial patogénico de los asilamientos se realizaron ensayos de Naegleria. La prueba de termotolerancia determinó la presencia de una ameba con capacidad de crecimiento a 43-45°C y el ensayo de presencia de N. fowleri; aún está pendiente el resultado El hallazgo de N. fowleri en fuentes de agua natural y de origen natural y con alto contenido orgánico son los sitios que favorecen la proliferación de la ameba. A nivel mundial, países como Australia, Francia, Japón, Estados Unidos, República Checa, Venezuela, Brasil, Cuba, entre otros, registran casos de PAM relacionados con visitas a piscinas y aguas termales(5). La posible presencia de N. fowleri en sitios recreacionales y de uso público en nuestro país, debe servir para ayudar a las autoridades de salud a establecer las medidas de prevención necesarias para evitar nuevos casos de infecciones por esta y otras AVL. En este sentido, debe quedar claro que la eliminación de estos organismos de su hábitat natural se vuelve una tarea casi imposible y lo que impera es: 1) educar a la población para reducir las conductas de riesgo para la adquisición del agente y 2) mantener una vigilancia epidemiológica que permita conocer el comportamiento de esta ameba y otras AVL potencialmente patógenas en el ambiente. 1. Greub G, Raoult D. Microorganisms Resistant to Free-Living Ameoba. Clin Microbiol Rev. 2004; 17(2): 413-433. 2. Culbertson CG, Smith JW, Cohen HK, Minner JP. Experimental infection of mice and monkey by Acanthamaoeba. Am J Pathol. 1950; 35: 185-197. 3. Fowler M, Carter RF. 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