UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO ESTRATEGIAS PROFILÁCTICAS Y TERAPÉUTICAS, CON RESPECTO A LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS, QUE SE HAN INVESTIGADO PARA EL MANEJO Y PREVENCIÓN DE LAS INFECCIONES SISTÉMICAS CAUSADAS POR ASPERGILLUS SPP, CANDIDA SPP Y CRYPTOCCOCUS SPP. Trabajo Final de Investigación Aplicada sometido a consideración de la Comisión de Especialidades en Microbiología para optar por el título de Especialista en Inmunología Clínica PAMELA SERRANO VALERÍN Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2021 II DEDICATORIA Quiero agradecer a Dios por todas sus bendiciones, a mis Padres que han sabido darme su ejemplo de trabajo, honradez y perseverancia, y a mi esposo Diego por su apoyo y paciencia en este proyecto de estudio. III AGRADECIMIENTOS A la Dra. Daniela Jaickel por su paciencia y entrega, por apoyarme en este proyecto en más de dos años. IV SISTEMA DE ESTUDIOS EN POSGRADO PROGRAMA DE POSGRADO EN ESPECIALIDADES EN MICROBIOLOGÍA ACTA-71-2021 Acta presentación de Requisito Final de Graduación Trabajo de Investigación Sesión del Tribunal Examinador celebrada el miércoles 22 de setiembre de 2021 con el objeto de recibir el informe oral de la estudiante Pamela de los Ángeles Serrano Valerín carné # A86110, quien se acoge al Reglamento General del Sistema de Estudios de Posgrado para presentar el Trabajo Final de Graduación, para optar por el grado académico de Especialista en Inmunología Clínica. Están presentes los siguientes miembros del Tribunal Examinador: Clas Une, PhD., quien preside y lector, Ericka Silesky Jiménez, MSc., lectora y Daniela Jaikel Víquez, MSc. tutora. ARTICULO 1 Quien preside solicita a la postulante realizar la presentación oral de su Trabajo de Investigación titulado: “Estrategias profilácticas y terapéuticas, con respecto a la producción de vacunas, que se han investigado para el manejo y prevención de las infecciones sistémicas causadas por Aspergillus spp, Candida sppy Cryptoccocus spp.” ARTICULO 2 Terminada la disertación, los miembros del Tribunal Examinador interrogan a la postulante durante el tiempo reglamentario y, una vez concluido el interrogatorio, el Tribunal se retira a deliberar. V ARTICULO 3 El Tribunal Examinador declara el Trabajo Final de Graduación: Aprobado Reprobado ARTICULO 4 Se da lectura al acta que firman los miembros del Tribunal Examinador y el Postulante, a las 18:27 horas. Nombre Firma No. Cédula Clas Une, PhD. 175200001011 Quien preside Daniela Jaikel Víquez, MSc. 1-1183-0673 Ericka Silesky Jiménez, MSc. 3-0328-0372 Pamela de los Ángeles Serrano Valerín 1-1432-0940 Estudiante Observaciones: Se otorga mención de honor Nota: Solamente firmarán el acta los responsables de la actividad descrita Si el trabajo es merecedor de mención de honor anotar en observaciones X VI Autorización para digitalización y comunicación pública de Trabajos Finales de Graduación del Sistema de Estudios de Posgrado en el Repositorio Institucional de la Universidad de Costa Rica. Yo, Pamela Serrano Valerín, con cédula de identidad 114320940, en mi condición de autor del TFG titulado: ESTRATEGIAS PROFILÁCTICAS Y TERAPÉUTICAS, CON RESPECTO A LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS, QUE SE HAN INVESTIGADO PARA EL MANEJO Y PREVENCIÓN DE LAS INFECCIONES SISTÉMICAS CAUSADAS POR ASPERGILLUS SPP, CANDIDA SPP Y CRYPTOCCOCUS SPP. Autorizo a la Universidad de Costa Rica para digitalizar y hacer divulgación pública de forma gratuita de dicho TFG a través del Repositorio Institucional u otro medio electrónico, para ser puesto a disposición del público según lo que establezca el Sistema de Estudios de Posgrado. SI X NO * *En caso de la negativa favor indicar el tiempo de restricción: año (s). Este Trabajo Final de Graduación será publicado en formato PDF, o en el formato que en el momento se establezca, de tal forma que el acceso al mismo sea libre, con el fin de permitir la consulta e impresión, pero no su modificación. Manifiesto que mi Trabajo Final de Graduación fue debidamente subido al sistema digital Kerwá y su contenido corresponde al documento original que sirvió para la obtención de mi título, y que su información no infringe ni violenta ningún derecho a terceros. El TFG además cuenta con el visto bueno de mi Director (a) de Tesis o Tutor (a) y cumplió con lo establecido en la revisión del Formato por parte del Sistema de Estudios de Posgrado. FIRMA ESTUDIANTE Nota: El presente documento constituye una declaración jurada, cuyos alcances aseguran a la Universidad, que su contenido sea tomado como cierto. Su importancia radica en que permite abreviar procedimientos administrativos, y al mismo tiempo genera una responsabilidad legal para que quien declare contrario a la verdad de lo que manifiesta, puede como consecuencia, enfrentar un proceso penal por delito de perjurio, tipificado en el artículo 318 de nuestro Código Penal. Lo anterior implica que el estudiante se vea forzado a realizar su mayor esfuerzo para que no sólo incluya información veraz en la Licencia de Publicación, sino que también realice diligentemente la gestión de subir el documento correcto en la plataforma digital Kerwá. https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio VII TABLA DE CONTENIDOS CONTENIDO PÁGINA Portada ………………………………………………………………………………… I Dedicatoria ………………………………………………………………………….... II Agradecimientos …………………………………………………………………….... III Hoja de firmas ………………………………………………………………………… IV Licencia de publicación ……………………………………………………………… VI Tabla de contenidos ………………………………………………………………...… VII Resumen ……………………………………………………………………………... VIII Lista de figuras ……………………………………………………………………….. IX Lista de abreviaciones ……………………………………………………………….. X Justificación……………………………………………………………………………. 1 Objetivo General ………………………………………………………………………. 4 Objetivos Específicos…………………………………………………………………... 4 Metodología…….……………………………………………………………..……...... 5 Marco de Referencia…………………………………………………………………… 7 Capítulo I………………………………………………………………………………. 15 Capítulo II……………………………………………………………………………….29 Capítulo III ..……………………………………………………………………………41 Conclusiones y recomendaciones ……………………………………………………… 53 Bibliografía…………………………………………………………………………….. 54 VIII RESUMEN Las infecciones por hongos representan un gran problema a nivel mundial tanto en pacientes inmunocompetentes como con algún grado de inmunosupresión, en estos últimos, su sistema inmunológico es un determinante para combatir todo tipo de infecciones por hongos, y lo cual representa una alta tasa de morbi-mortalidad. Los costos de intervención en hospitales representan grandes inversiones económicas tanto en manejo clínico como en tratamiento. Candida spp, Aspergillus spp y Cryptococcus spp, son tres grandes géneros de hongos que provocan infecciones en todo el mundo y para las cuales, el desarrollo de una vacuna representa un gran avance en torno al manejo de los pacientes. De los tres géneros mencionados, Candida representa el más estudiado en producción de vacunas, sin embargo, para ninguno de ellos existe alguna aprobada para uso en seres humanos, y muchos de los estudios realizados hasta el mometo, se encuentran todavía en fase de investigación. IX LISTA DE FIGURAS Figura 1. Principales RRP localizados en la célula huésped, así como los componentes integrales de las paredes celulares de patógenos fúngicos …………………………... 09 Figura 2. Esquema de la arquitectura de la pared en las especies de Aspergillus …… 17 Figura. 3. Esquema de la pared celular de A. fumigatus …………………………….. 18 Figura 4. Mecanismos de patogénesis en C. albicans ……………………………….. 22 Figura 5. Vías de señalización en el reconocimiento inmune por Aspergillus spp …. 30 Figura 6. Reconocimiento de Candida spp, por PRR en fagocitos mieloides ……….. 34 X LISTA DE ABREBIATURAS RRP: Receptores de reconocimiento patrón PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos TNF: Factor de necrosis tumoral INF: Interferón IL: Interleuquina GAG: Galactosaminogalactano ECM: Matriz extracelular CVC: Cateter venoso central HLA: Antígeno Leucocitario Humano TLR: Receptor tipo Toll CTL: Receptor tipo lectina C UCI: Unidad de cuidados intensivos SNC: Sistema nervioso central LCR: Líquido cefalorraquideo GPI: Proteínas de anclaje SAP: Aspartil proteasa secretora Als: Secuencia similar a la aglutinina GM-CSF: Factor estimulante de colonias granulocitos-macrófagos PLC: Fosfolipasa C TFG: Factor de crecimiento transformante MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad ROS/NOS: Especies reactivas de oxigeno/nitrógeno MEL: Lectina de unión a manosa CPA: Célula presentadora de antígenos BTK: Tirosin kinasa de Bruton GXM: Glucoronoxilomanano GalXM: Galactoxilomanano MP: Manoproteínas - 1 - JUSTIFICACIÓN El desarrollo de vacunas seguras es uno de los mayores logros en salud pública a nivel mundial. Hoy en día muchas de las enfermedades causadas por agentes infecciosos, incluidos virus y bacterias tienen una vacuna. En este ámbito, los hongos juegan un papel muy importante en las enfermedades cutáneas, subcutáneas y pulmonares de pacientes aparentemente inmunocompetentes; sin embargo, el impacto más relevante se encuentra en los pacientes que tienen algún grado de inmunosupresión como lo son los receptores de trasplante de médula ósea, trasplantes sólidos, pacientes que reciben quimioterapia, pacientes infectados con el Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o algún tipo de enfermedad autoinmune (Tesfahuneygn & Gebreegziabher, 2018). Independientemente de los cientos de miles de especies fúngicas que existen, solo unas pocas pueden causar enfermedades en los seres humanos. Los géneros más comunes, causantes de infecciones sistémicas son: Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Peumocysitis, Histoplasma, Blastomyces, Coccidiodes, Talaromyces y Paracoccidiodes (Arenas, 2014). Para muchos de los patógenos fúngicos, incluyendo Aspergillus spp., Candida spp. y Cryptoccocus spp., el desarrollo de una vacuna es prioridad, pues causan micosis sistémicas oportunistas en pacientes inmunocomprometidos con una alta tasa de mortalidad (Tesfahuneygn & Gebreegziabher, 2018). Dentro de los cuadros clínicos asociados a Aspergillus spp. pueden encontrarse la aspergilosis invasiva, la aspergilosis crónica pulmonar y la aspergilosis broncopulmonar; éstos en pacientes con neutropenia. El principal agente etiológico es Aspergillus fumigatus. La primera línea de tratamiento se basa en el empleo de voriconazol y anfotericina B liposomal, pero también se han utilizado posaconazol, itraconazol, caspofungina y otras equinocandinas. Sin embargo, inmunosupresores como los - 2 - corticoides también son muy utilizados en pacientes con aspergilosis obstructiva crónica pulmonar (Fortún et al, 2012). Muchos de estos medicamentos presentan limitaciones debido a su toxicidad (hepática y renal), disponibilidad, espectro de actividad e interacciones con otras sustancias, provocando con esto desarrollo de resistencia (Medinini & Del Poeta, 2015). Con respecto a Candida spp., la forma sistémica o candidemia es la más común, pero puede ocurrir en cualquier sitio anatómico, como por ejemplo infecciones endovasculares u osteomielitis y su tratamiento comprende fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol, anidulafungina, caspofungina y micafungina (McCarty & Pappas, 2016). En cuanto a Cryptococcus spp., la criptococosis comienza como una enfermedad pulmonar aguda, subaguda o crónica que puede culminar en una meningitis no purulenta, gracias al tropismo el sistema nervioso central (SNC) que presenta la levadura. El tratamiento de elección es la anfotericina B con fluconazol (Negroni, 2012). Las estimaciones globales sugieren que la candidemia tiene una tasa de mortalidad de (40- 50) %; para Cryptococcus spp se sugiere que de un millón de casos de meningitis que ocurren cada año, la cantidad de muertes resultantes es de aproximadamente 620 000 (Kalkum & Semies, 2017). Por otro lado, en el caso de Aspergillus spp. la mortalidad de las formas invasivas depende de la presentación clínica y el tipo de huésped, pero suele ser superior al 50 % (Fortún et al, 2012), incluso puede llegar a un 80 % (Medinini & Del Poeta, 2015). En Estados Unidos la principal micosis sistémica es la candidemia, con un 75 % de los casos (Wilson et al, 2002). En términos económicos es más costosa que otras infecciones debido a los largos periodos de tratamiento e internamiento (Medinini & Del Poeta, 2015). En el 2017 las enfermedades fúngicas tuvieron un costo de $ 7.2 mil millones, incluidos $ 4.5 mil millones por 75 055 hospitalizaciones y $ 2.6 mil millones por 8 993 230 visitas ambulatorias. Entre estas hospitalizaciones Candida (n = 26 735, costo total $1.4 mil millones) y Aspergillus (n = 14 820, costo total $1.2 mil millones) representaron los costos - 3 - totales de hospitalización más altos que cualquier enfermedad, incluidos los tratamientos antifúngicos (Benedict et al, 2019). Por todo lo mencionado anteriormente, la prevención de este tipo de micosis debe dirigirse a pacientes de alto riesgo de infección y enfocarse en infecciones de alta morbi-mortalidad que aún hoy en día se encuentran inadecuadamente cubiertas por las terapias existentes. Además, a pesar de los medicamentos antimicóticos disponibles, muchas micosis tienen una tasa de éxito muy baja, la utilización de los mismos puede producir una toxicidad que disminuye por mucho la relación costo / beneficio de su uso; o en muchos casos su costo económico también juega un papel importante en el resultado final (Tesfahuneygn & Gebreegziabher, 2018). Es por esto, que este trabajo pretende llenar un vacío de conocimiento sobre los avances en el campo de la vacunación fúngica, recopilando información precisa sobre la posibilidad de crear vacunas para diferentes géneros fúngicos incluyendo Aspergillus, Candida y Cryptoccocus, tres agentes etiológicos muy comunes causantes de micosis sistémicas (Kalkum & Semies, 2017), con el fin de dar a conocer al lector el estado actual de estos estudios científicos y contribuir al mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes inmunosupresos como los pacientes con cáncer, VIH/SIDA y aquellos que se encuentran internados en el hospital por largos periodos de tiempo. - 4 - OBJETIVO GENERAL Describir las estrategias profilácticas y terapéuticas, con respecto a la producción de vacunas, que se han investigado para el manejo y prevención de las infecciones sistémicas causadas por Aspergillus spp, Candida spp y Cryptoccocus spp. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Describir la ultraestructura fúngica, patogénesis y los cuadros clínicos sistémicos causados por los géneros fúngicos Aspergillus, Candida y Cryptoccocus. • Definir los mecanismos de respuesta inmune contra Aspergillus spp, Candida spp y Cryptoccocus spp que se produce durante sus infecciones sistémicas. • Mencionar y ejemplificar los mecanismos de acción de las vacunas fúngicas contra Aspergillus spp, Candida spp y Cryptoccocus spp. - 5 - METODOLOGÍA El estudio se llevó a cabo mediante una recolección y análisis de datos en el año 2020 (Moreno, et al 2018). Se concluye con la presentación oral en setiembre 2021. Al tratarse de un estudio de tipo revisión bibliográfica narrativo, la población meta que se tomará en cuenta serán los artículos de las bases de datos PubMed, Science Direct, Annual Reviews y Google Académico; incluyendo como muestra todos aquellos artículos que cumplen los siguientes criterios de inclusión: (Moreno, et al 2018) • Fecha de publicación entre 2010 – 2020 • Idiomas inglés y español • Palabras clave: vacunas micóticas, respuesta inmunológica y patología, infecciones micóticas sistémicas, Aspergillus spp., Candida spp., Cryptococcus spp. Posterior a la recopilación de todos los artículos se procede al escrutinio de los títulos, los resúmenes y resultados de éstos, para verificar si son tomados en cuenta para la revisión bibliográfica. Posterior a la revisión inicial, se realizará la lectura de los artículos, recopilando la información más relevante y digitalizando en el programa de Excel los datos a tomar en cuenta de los artículos, con el fin de guardar en el programa los diferentes títulos, temas que se van a ir desarrollando según los capítulos y así sistematizar la información. Lo anterior permite realizar una síntesis de los aspectos más relevantes, organizar, y discutir la información, con el fin de obtener conclusiones y recomendaciones al final del trabajo (Moreno, et al 2018). - 6 - Cronograma de trabajo Fecha Actividad Julio 2020 Búsqueda de artículos Agosto y Setiembre 2020 Lectura y análisis de artículos Octubre 2020 – junio 2021 Escritura del trabajo Julio – agosto 2021 Correcciones del trabajo Setiembre 2021 Presentación del trabajo final - 7 - MARCO DE REFERENCIA Los hongos son organismos heterótrofos, con una membrana celular conformada por ergosterol, así como una pared celular formada por polisacáridos como la quitina (N- acetilglucosamina), glucanas, mananas y derivados celuloides que le dan gran rigidez; así como glucopéptidos y manoproteínas que le confiere algún grado de flexibilidad y que son importantes por su antigenicidad (Bonifaz, 2012). En función de las características morfológicas, se clasifican como levaduras o mohos, además, algunos de ellos presentan el fenómeno biológico de dimorfismo, gracias al cual pueden pasar reversiblemente de una forma micelial a levadura o esférula, esto en función de nutrientes y/o temperatura (Otárola, et al 2018). Las infecciones causadas por hongos en el ser humano se llaman micosis. Las personas sanas tienen inmunidad natural a las infecciones micóticas. Esta resistencia es inespecífica y depende de factores genéticos, hormonales, nutricionales, así como de la edad y el género. Según su localización, las micosis se clasifican en cuatro grandes grupos: superficiales, subcutáneas, sistémicas y oportunistas. Las micosis subcutáneas y sistémicas también pueden agruparse en las micosis profundas (Arenas, 2014). En sujetos inmunocompetentes, las infecciones fúngicas se limitan en su mayoría a la piel y mucosas, sin embargo, existen especies que tienen la capacidad de originar infecciones clínicas en personas que no presentan condiciones que favorezcan su desarrollo (llamadas micosis primarias) (Cutler, Deepe & Klein, 2007; Otárola, et al 2018). Mayor Los pacientes inmunocomprometidos son aquellos que presentan disfunción de mecanismos de defensa básicos en el sistema inmunológico, presentando por lo tanto mayor posibilidad de infecciones de tipo oportunistas como candidiasis, aspergilosis, criptococosis y pneumocistosis (Cutler, Deepe & Klein, 2007; Valderrama, et al 2018). Ejemplo de este tipo de pacientes son los que presentan HIV, o que toman ganciclovir que - 8 - aumenta el riesgo de aspergilosis o las quinolonas que en pacientes con cáncer favorecen las micosis (Vasquez-del Mercado & Arenas, 2008). En cuanto al desarrollo de las patologías causadas por hongos, es importante tener en cuenta que los daños causados son muchas veces resultado de los factores de virulencia fúngica o alternativamente causados también por la inflamación a causa de la presencia del hongo en el huésped (Brown et al, 2012). Respuesta inmunológica El reconocimiento inmunológico se da principalmente por componentes de la pared, constituida por una parte interna conservada principalmente por β-1,3-glucano y quitina. La pared exterior presenta variaciones según las diferentes especies, por ejemplo: manano en Candida spp, hidrofobinas, melanina y α-glucano en unas especies de Aspergillus spp, galactomanano y galactosaminoglicano en otras especies de este género; galactoxilomanano en Cryptococcus spp, y en el caso de la cápsula el glucoronoxilomanano (Gow & Netea, 2016). La capa externa activa levemente el sistema inmunológico, por lo que es necesario un daño a esta capa para desenmascarar la capa interna de β-1,3 glucano y quitina. Esto se logra por medio de las enzimas líticas liberadas por las células fagocíticas o por medio de medicamentos antimicóticos; logrando activar los verdaderos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) fúngicos y con esto, una amplificación de la respuesta inmune (Brown et al, 2012). La respuesta celular antifúngica inicia con el reconocimiento de esos PAMPs, censados por receptores de la célula huésped localizados en la superficie o citoplasma celular y que son conocidos como RRPs (receptores de reconocimiento patrón) (Figura 1); que pueden ser de tipo toll (TLR), tipo lectina C (CTL) o tipo NOD (NDR) (Erwig & Gow, 2016). - 9 - Figura 1. Principales RRP localizados en la célula huésped, así como los componentes integrales de las paredes celulares de patógenos fúngicos. Tomado de Erwig and Gow, 2016. Esta serie de eventos conllevan a la absorción de la célula fúngica, la liberación de citoquinas y otras moléculas encargados del reclutamiento de células fagocíticas y células presentadoras de antígeno al sitio de infección. Todo lo anterior a su vez es necesario para la activación de las células T vírgenes y la producción de anticuerpos por las células B (Gow & Netea, 2016). Las células epiteliales juegan un papel muy importante, por ejemplo, la superficie epitelial es el sitio de entrada de C. albicans, por medio del cual se da el inicio de la respuesta inmune y una subsecuente reparación del daño causado en el tejido (Jiang, 2016) Como primera línea de defensa, los macrófagos y neutrófilos se encargan por medio de la liberación de enzimas, compuestos tóxicos oxidantes y nitrosativos, de eliminar los microorganismos fúngicos (Gow & Netea, 2016). Los neutrófilos son esenciales en la defensa del huésped ante hongos como Candida spp., Fusarium spp. y Aspergillus spp. La principal contribución reside en sus funciones - 10 - fagocíticas y microbicidas, la producción de citoquinas y quimioquinas que pueden modular la respuesta inmune protectora. Su ausencia es un factor de riesgo importante para la adquisición de infecciones y desarrollo de la enfermedad (Cutler, Deepe & Klein, 2007). Uno de los mayores descubrimientos es el mecanismo en el cual el neutrófilo libera una trampa extracelular “tipo net” que junto con una explosión oxidativa y liberación de antimicrobianos constituye una potente respuesta antifúngica (Jiang, 2016). Los macrófagos no solo pueden ingerir organismos que han sido opsonizados con anticuerpos, complemento o colectinas, también pueden fagocitar elementos fúngicos sin opsonizar mediante receptores de reconocimiento como las integrinas. Además, pueden presentar antígenos a las células T CD4+ y CD8+ en el caso de patógenos intracelulares como Histoplasma capsulatum o Cryptococcus neoformans (Cutler, Deepe & Klein, 2007). Por su parte, las células dendríticas dirigen la maduración de las células Th CD4+ y Th reguladoras que conducen a la protección, o muchas veces a reacciones inflamatorias responsables de la patología (Gow & Netea, 2016). Capturan y procesan antígenos, expresan moléculas coestimuladoras en los linfocitos y migran a órganos linfoides y secretan citoquinas incluyendo IL-10 e IL-12 para iniciar respuestas inmunes (Jiang, 2016). Las células dendríticas son particularmente potentes en la respuesta inmune innata y adaptativa a varios hogos incluyendo C. neoformans, A. fumigatus y Candida albicans (Ramirez & Means, 2012). Un aspecto importante en la respuesta inmunológica antifúngica son los inflamasomas, una familia de proteínas que activados por los RRPs promueven la inducción y ensamblaje de la enzima proteolítica caspasa-1, responsable de dar origen a citoquinas proinflamatorias como la IL-1, TNFα e INF. Los más estudiados son los NLRP3, (expresado en macrófagos, monocitos, células dendríticas y epiteliales) y NLRP4. Mutaciones o polimorfismos en estas proteínas conllevan a una susceptibilidad a enfermedades causadas por Candida spp. (Miro, et al 2016; Nami, et al 2019). - 11 - En cuanto a la respuesta inmune adaptativa, las células Th tienen la capacidad de categorizar la respuesta de acuerdo con cualquiera de los cinco grupos: Th1, Th2, Th9, Th17 o Threg. La respuesta Th1 puede activarse por medio de la señalización de las células dendríticas mediante los TLR, ayudando a optimizar la activación de los fagocitos en el sitio de infección y liberando citoquinas proinflamatorias como INFγ y TNFα (Jiang, 2016). Por otro lado, las células Th2 activadas por las IL-4 e IL-13, generan citoquinas incluyendo IL-5 que puede limitar la respuesta Th1, además de activar macrófagos dañinos tipo M2, relacionados con infecciones fúngicas graves y de tipo alérgicas (Jiang, 2016). Se ha visto, que la respuesta Th17, promueve la liberación de citoquinas que estimulan las células fagocíticas que remueven patógenos fúngicos. En su mayoría, las células linfoides innatas tipo 3 (ILC3) son las encargadas de producir grandes concentraciones de IL-17. Las ILC3 se han evaluado como contribuyentes en la defensa ante Aspergillus spp. y Candida spp., de hecho, pacientes con defectos genéticos en la respuesta Th17, presentan mayor frecuencia de candidiasis mucocutánea, ya que se ve inhibido el reclutamiento de polimorfonucleares con actividad fungicida; y en mucosas no se estimula a los queratinocitos y células epiteliales a liberar péptidos antimicrobianos (Miró, et al 2016; Nami, et al 2019). Es importante tomar en cuenta que los hongos cuentan con mecanismos de evasión inmune, logrando llevar a cabo su ciclo celular, dando como resultado muchas veces una patología en el ser humano. Los hongos poseen la capacidad de evitar la inflamación contribuyendo a su adaptación y oportunismo (Levitz, 2010). La pared fúngica es dinámica y cambia durante el ciclo celular logrando, por ejemplo, en C. albicans enmascarar los β-1,3 glucanos en su forma de hifa, favoreciendo el escape por la dectina 1 (Miro, et al 2016). A. fumigatus, presenta conididas cubiertas de hidrofobinas y melanina que evitan el reconocimiento inmune. A su vez muchos hongos poseen la capacidad de disminuir el CR3 para amortiguar la respuesta inflamatoria y de esta manera permitir el parasitismo - 12 - fúngico intracelular. (Romani, 2011) Otro ejemplo es C. neoformans que cubre completamente su pared fúngica con una cápsula de polisacáridos y evita ser reconocido por los RRP, o logra escapar una vez detectado por los macrófagos, por medio de un mecanismo expulsivo que no mata la célula por lo que evita la inflamación (Levitz, 2010). Sin embargo, con el uso de medicamentos antimicóticos se ha solventado de alguna manera las patologías asociadas a estos microorganismos (Arenas, 2014) En los últimos años, el desarrollo de vacunas antimicóticas ha tomado gran relevancia. Se han estudiado muchos enfoques moleculares para iniciar con vacunas seguras y efectivas por medio de extractos citoplasmáticos o de la pared celular, proteínas recombinantes o ingeniería genética (Hamad, 2011; Nami, et al 2019). Sin embargo, se debe tomar en cuenta, y que es posiblemente uno de los fracasos en la producción de vacunas antifúngicas, la compleja composición genética que poseen los hongos, ya que pueden cambiar fácilmente su morfotipo (modificación del talo), cambiar su perfil antigénico (modificación de β-glucanas por α-glucanas en los hongos dimórficos, por ejemplo) y expresar diversos factores de virulencia como melanina y proteasas (Cassone & Rappuoli, 2010). Además, los hongos tienen una variedad de mecanismos complejos por medio de los cuales logran regular la inmunidad del huesped, lo que aumenta el fracaso de las vacunas (Hamad, 2012). La idea de una vacuna universal antifúngica, con la capacidad de inducir protección contra múltiples cepas o especies patógenas, y tomando en cuenta la presencia de antígenos comunes estrechamente relacionados entre cepas o especies, se ha descrito como mecanismo conveniente y rentable en la producción de vacunas (Cassone & Rappuoli, 2010; Hamad, 2012; Nami, et al 2019). Por ejemplo, varios componentes de la pared de C. albicans, C. neoformans, A. fumigatus y Paracoccidioides brasiliensis se han estudiado como protectores en modelos animales (Hamad, 2011). - 13 - Basado en el análisis de diferentes tipos de vacunas contra agentes infecciosos, se describen principalmente tres grupos de vacunas antifúngicas: vivas atenuadas, conjugadas y de subunidades recombinantes (Nami, et al 2019). Las vacunas vivas atenuadas se caracterizan por presentar similitudes con los agentes infecciosos, por lo que las respuestas inmunes son fuertes y a largo plazo eficientes. Este tipo de vacunas se recomienda para pacientes inmunocompetentes, ya que en pacientes inmunosupresos se corre el riesgo de una posible infección. Las ventajas de este tipo de vacuna es que el patógeno se replica en el sitio de infección e induce respuestas fuertes y amplias que implica múltiples vías de la respuesta inmune, siendo más representativo de una inmunidad natural a la enfermedad (Cutler, Deepe & Klein, 2007). Las vacunas de subunidades recombinantes son los tipos de vacunas antifúngicas más estudiadas. Consisten en purificar de forma recombinante una o varias proteínas o polisacáridos del hongo mediante ingeniería genética, logrando activar una respuesta inmune deseada (Oslafsdottir et al, 2015). En este tipo de vacunas, el gen que se transmite codifica por una secuencia relacionada con virulencia y patogenicidad. A menudo, se combinan con coadyuvantes o proteínas, en su mayoría toxoides bacterianos para establecer una respuesta eficiente (Santos & Levitz, 2014). Este tipo de vacunas son más seguras sobre todo en pacientes inmunocomprometidos, pues el patógeno completo está ausente, además, al ser producidas por medio de ingeniería de ADN, han sido creadas y purificadas cuidadosamente, por lo que los antígenos son altamente especializados (Santos & Levitz, 2014). La mayoría de este tipo de vacunas están diseñadas contra Candida spp (Nami, et al 2019). El último tipo de vacunas son las conjugadas, producidas por la unión covalente de un antígeno débil (comúnmente un polisacárido) a un antígeno fuerte (comúnmente una proteína). Una ventaja de este tipo de vacunas es que se basan en atacar los epítopos de polisacáridos, que son comúnmente encontrados en los hongos, especialmente los β- - 14 - glucanos. Ejemplos de este tipo de vacunas se han desarrollado para C. neoformans, Candida spp y Aspergillus spp (Karch & Burkhard, 2016). Existen nuevas estrategias de vacunas que consisten en la inserción de antígenos fúngicos en plásmidos, un ejemplo de esto es la vacuna de ADN que combate la tiña causada por Trichophyton verrucosum (Nami, et al 2019). - 15 - CAPÍTULO I Estructura, patogénesis y cuadros clínicos sistémicos causados por los géneros fúngicos Aspergillus, Candida y Cryptoccocus Aspergillus spp. Existen más de 200 especies de Aspegillus spp. en el planeta, y aunque solo unas pocas están asociados con enfermedad en seres humanos, A. fumigatus es el agente etiológico más común de la aspegilosis invasiva (Fortún et al, 2012). Los aspergilos liberan esporas asexuales al aire llamadas conidias que son inhaladas a diario por los seres humanos, y que por su pequeño tamaño ((2-3) µm) pueden evitar el aclaramiento mucociliar y alojarse en tracto respiratorio inferior. En pacientes inmunocompetentes la acción del epitelio respiratorio, los macrófagos residentes en los pulmones y los neutrófilos eliminan las conidias de forma eficiente (Fortún et al, 2012), sin embargo, en una inmunosupresión como la neutropenia prolongada y monocitopenia, característicos de los regímenes de quimioterapia o trasplantes de células hematopoyécticas, son factores de riesgo para el desarrollo de las aspergilosis invasivas (Segal 2009). Dentro de las aspergilosis invasivas, se encuentran la aspergilosis pulmonar invasiva subaguda, que puede denominarse también aspergilosis pulmonar crónica necrotizante, aspergilosis pulmonar crónica cavitaria o aspergilosis pulmonar crónica fibrótica (Muldoon, et al 2016; Segal 2009). El sello distintivo de la aspergilosis invasiva es la germinación de las conidias inhaladas, con el consecuente crecimiento de las hifas filamentosas que pueden diseminarse hematógenamente a sitios remotos, aunque el árbol respiratorio es el sitio más común de la infección (Segal, 2009). Los nódulos pulmonares son una manifestación poco frecuente de la aspergilosis pulmonar en pacientes inmunocompetetentes, son difíciles de detectar y esto lo diferencia de otras patologías pulmonares (Muldoon, et al 2016). - 16 - Una estrategia utilizada por A. fumigatus para lograr establecer una infección pulmonar, es la producción de biopelículas durante la infección invasiva en pacientes inmunocomprometidos o en las vías respiratorias de pacientes con enfermedad pulmonar crónica (Loussert, et al 2010), (Speth, et al 2019). Distintos estudios han demostrado el papel del exopolisacarido galactosaminogalactano (GAG) tanto en la formación de las biopelículas de A. fumigatus como en la modulación de la respuesta inmune. El GAG se une a las hifas y cubre al microorganismo en crecimiento, formando una matriz extracelular entre las hifas, correlacionando al exopolisacarido con la virulencia intrínseca de las especies de Aspergillus (Lee, et al 2015). Las cepas deficientes en GAG no forman biopelículas y son menos virulentas en modelos Balb/C de ratón experimental con aspergilosis invasiva (Speth, et al 2019). En general, durante los ciclos de vida, las células de los hongos filamentosos necesitan adaptarse a los cambios de temperatura, pH oxidativos, estrés osmótico y otros cambios en cultivos que son necesarios para producir enzimas y compuestos. En este proceso la pared del hongo juega un papel muy importante ya que detecta cambios en el ambiente extracelular, que son transmitidos al citoplasma y provocan una respuesta celular apropiada. Estas respuestas al estrés son las más sofisticadas y de los mecanismos más importantes que afectan la supervivencia de los hongos filamentosos (Yoshimi, et al 2016). El contacto con la célula huésped es el primer paso para infectar a su hospedero, la estructura superficial de A. fumigatus, incluida la capa superficial de la pared celular, juega un papel crítico en la expresión de la aspegilosis invasiva, sin embargo, es importante mencionar el papel que juega la matriz extracelular que produce el hongo, compuesta por polisacáridos principalmente α-1,3-glucano y el GAG, que recubren las paredes celulares del hongo creando una estructura de superficie celular crucial para la expresión patogénica (Beauvais, et al 2014). Las paredes de los hongos son estructuras complejas compuestas principalmente de polisacáridos, que incluye principalmente α-1,3-glucano pero también pequeñas - 17 - cantidades de α-1,4-glucano, β-1,3-glucano con ramas de β -1,6-galactomanano y quitina (Figura 2) (Latgé, 2010). El núcleo central de la pared celular está compuesto principalmente por ramificaciones β-1,6 y β-1,3-glucano, unidas a quitina. α-1,3- glucano amorfo en la capa externa de la pared celular, además, polisacáridos como galactosaminogalactano, galactomanano, y proteínas de superficie (Yoshimi, et al 2016). Figura 2. Esquema de la arquitectura de la pared en las especies de Aspergillus. Tomado de (Yoshimi, et al 2016). Abreviaturas: AGS, α-1,3-glucano sintasa; BGS, β-1,3-glucano sintasa; CHS, quitina sintasa y ECM, matriz extracelular Por otro lado, la pared celular de la conidia está cubierta por una capa proteica, altamente hidrofóbica (hidrofobinas), que oculta un subyacente pigmento fúngico, llamado melanina. La vía 1,8-dihidroxinaftaleno (DHN) produce el pigmento conidial en A. fumigatus y A. terreus, mientras que la vía 3,4-dihidroxi de fenilalanina produce el pigmento en A. niger y A. flavus (Anuradha, et al 2014). Estas capas externas se desprenden durante la germinación de las conidias, exponiendo una capa central de - 18 - enlaces β-1,3 polisacáridos de glucano, manoproteínas y galactomanano, lo cual activa los receptores de reconocimiento patrón del sistema inmune innato (Anuradha, et al 2014; Tishler & Hohl, 2019). En las conidias, la capa interna de la pared celular está formada por polisacáridos tipo quitina y polímeros de N-acetilglucosamina; la cual reside inmediatamente encima de la membrana plasmática (Gow, et al 2017). Una diferencia de las conidias con el micelio, es que este último carece de la capa externa de hidrofobinas y melanina; por su parte sintetizan una capa externa de galactosaminogalactano, que a su vez, está ausente de las conidias (Figura 3) (Tishler & Hohl, 2019). Figura. 3. Esquema de la pared celular de A. fumigatus (Tishler & Hohl, 2019). Candida spp. El género Candida es representado por un conjunto de especies importantes que son fuente de infecciones sistémicas en todo el mundo, incluidas C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis y C. parapsilosis (Whaley, et al 2017). C. albicans es la principal especie causante de mayores complejidades, tanto en adultos como en poblaciones pediátricas (Pappas, et al 2018). Por lo que el estudio se centrará mayormente en esta especie. C. albicans es miembro de la microbiota humana, es en gran medida asexual, y morfológica y fisiológicamente muy variable. Es una levadura polimórfica dimórfica en superficies mucosas y se encuentra comúnmente en tejido gastrointestinal, respiratorio y - 19 - genitourinario (Dadar, et al 2018). Esta especie exhibe lo que se conoce como conmutación fenotípica, una variación no sexual que puede generar colonias con propiedades distintas, además se caracteriza por ser un microorganismo comensal que puede convertirse en patógeno oportunista, sobretodo en pacientes inmunocomprometidos o inmunológicamente deficientes (Natea, et al 2015) Las infecciones por C. albicans conducen a una tasa de mortalidad de aproximadamente del 40 % y es considerada por algunos autores la especie responsable de la mayor cantidad de casos de candidiasis invasiva con un 46,3 %, seguida de C. glabrata con 24,4 % y C. parapsilosis con 8,1 % (Andes, et al 2016; Dadar, et al 2018). Sin embargo, en Costa Rica las especies de Candida distintas de C. albicans constituyeron el 62 % de las causas de candidemia en el Hospital México, y curiosamente C. parapsilosis fue la causa más frecuente asociada a catéter venoso central (CVC) (Villalobos, et al 2016, Villalobos, et al 2016). Este fenómeno difiere de lo descrito en la mayoría de los reportes de la bibliografía, incluida Latinoamérica. C. albicans es un hongo polimórfico, la morfología predominante es la levadura o blastospora, de forma redonda u ovalada, y que bajo determinados estímulos se induce la formación de tubos germinativos y el crecimiento en forma de micelio. Las pseudohifas y las hifas completas son consideradas las formas filamentosas de este hongo (Huertas, 2017). En el estrato córneo de la piel existe como levadura, pero en su forma patógena en dermis y órganos sistémicos existe predominantemente como pseudomicelio. De hecho, se ha reportado que las mutantes de C. albicans que no pueden formar filamentos no logran establecer una infección robusta, lo que sugiere que la transición de levadura a hifa es requerida para la virulencia (Kashem, et al 2015). La candidiasis es un término muy amplio, que se refiere a infecciones cutáneas, de las mucosas y de órganos profundos causados por hongos del género Candida; éstas pueden ocurrir en cualquier edad y generalmente se producen en un entorno de fácil identificación por algún factor de riesgo. La candidiasis invasiva se refiere a las infecciones del torrente - 20 - sanguíneo con Candida spp. (candidemia), e infecciones profundas como absceso intraabdominal, peritonitis u osteomielitis (McCarty & Pappas, 2016). Durante el curso de una infección, C. albicans coloniza varios nichos con diferencias en cuanto a disponibilidad de nutrientes, pH, hipoxia y niveles de CO2. Esta capacidad de adaptabilidad a las diferentes condiciones es la clave del éxito como patógeno, logrando adaptarse debido a cambios en la composición de los polisacáridos de la pared celular, lo que modifica la sensibilidad al estrés ambiental y también a los antifúngicos. De hecho, el cambio en los polisacáridos de la pared también afecta la inmunogenicidad ya que altera la expresión y presentación de PAMPs en los diferentes escenarios (Brown, et al 2014). La célula huésped retiene la disponibilidad de micronutrientes, como Fe, Zn, Cu y Mn para el patógeno en un proceso denominado “inmunidad nutricional”, sin embargo, C. albicans supera este problema mediante la expresión de transportadores de micronutrientes como Rbt5/Als para hierro; Zrt1/Zrt2/Pra1 para Zn y además expresa enzimas que utilizan micronutrientes alternativos como cofactores (Li, et al 2015). Dos mecanismos complementarios están involucrados en la invasión de C. albicans a la célula huésped a través de las células epiteliales, ambos desencadenados por factores asociados con hifas; una endocitosis inducida por el hongo producido por pseudópodos que rodean al hongo para atraerlo a la célula, y por el contrario una penetración activa ocurre cuando las hifas invaden entre o a través de las células epiteliales (Naglik, et al 2011). La diseminación sistémica, que no depende de la transición morfológica, ocurre en la forma de levadura desde el tracto gastrointestinal, por medio del trasporte transepitelial mediado por mecanismos indirectos como por células dendríticas del lumen intestinal o por transcitosis de células M (Vautier, et al 2014). - 21 - Dentro de los mecanismos de patogenia de las infecciones por C. albicans se encuentran los factores de virulencia que se detallan, a continuación (Figura 4) (Da Silva et al 2016) (Pappas, et al 2018). • Flexibilidad metabólica: eficiente uso alternativo de fuentes de carbono, resistencia al estrés, cambio en componentes de la pared • Evasión del sistema inmune: cambios en la estructura y composición de la pared celular, enmascarando PAMPs • Contrarrestar inmunidad nutricional: toma micronutrientes por medio de transportadores, uso alternativo de nutrientes como cofactores • Morfogénesis: cambio de levadura a hifa en respuesta a temperatura, pH alcalino, nutrientes, CO2 • Adhesión a superficies del huésped: por medio de la expresión de adhesinas • Formación de biopelícula: resistencia a antifúngicos y al sistema inmune del hospedero • Cambio fenotípico: células resistentes a la envoltura de los neutrófilos • Candidalisina: péptido secretor citolítico que daña las células del hospedero y activa señales de peligro durante la infección de mucosas • Enzimas hidrolíticas: Saps, Lip, Pip; que degradan el tejido conectivo del huésped, escisión de factores inmunes, adquisición de nutrientes - 22 - Figura 4. Mecanismos de patogénesis en C. albicans. Tomado de Pappas, et al 2018. Aproximadamente el 50 % de los casos de candidemia ocurren en pacientes internados en cuidados intensivos, con factores de riesgo intrínsecos al huésped o al estado de su enfermedad, mientras que otros son el resultado de intervenciones iatrogénicas. Dentro de los factores de riesgo individuales se encuentran la presencia de un CVC permanente, exposición a agentes antibacterianos de amplio espectro, estancia en Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) a largo plazo con o sin ventilación, cirugías recientes, pancreatitis necrotizante, diálisis de cualquier tipo, nutrición parenteral e inmunosupresión (Pappas, et al 2018). De hecho hay tres condiciones principales que predisponen la infección invasiva por C. albicans, el primero es el uso a la largo plazo de antibióticos que permiten el aumento en la colonización del intestino, lo que le confiere una ventaja selectiva sobre las bacterias comensales que tienen efectos protectores sobre la mucosa; otro factor es la ruptura de las barreras gastrointestinales y cutáneas dada por quimioterapia, cirugía gastrointestinal o perforación por catéteres venosos que permiten a candida traslocarse al torrente sanguíneo. El tercer factor es la inmunosupresión iatrogénica inducida por una - 23 - neutropenia dada por tratamientos como corticosteroides que perjudica las defensas inmunes (Da Silva et al 2016). Cryptococcus spp. El género Cryptococcus, está conformado por levaduras saprófitas ambientales encapsuladas. Se han descrito más de 70 especies dentro del género, sin embargo, muy pocas causan infección en seres humanos (Zavala, et al 2020). Los complejos de especies asociados con enfermedad son el complejo de especies C. gatti y el complejo de especies C. neoformans El primero ha sido considerado como un patógeno de pacientes aparentemente inmunocompetentes, sin embargo, se han descrito afecciones preexistentes y estados de inmunosupresión como factores de riesgo, dentro de los cuales se encuentran, la infección por VIH, los tratamientos prolongados con corticosteroides y enfermedades autoinmunes (De Oliveira, et al 2019), mientras que C. neoformans es el principal causante de meningitis en pacientes con VIH en África subsahariana y en países de bajos y medios ingresos (Srikanta, et al 2014; Rajasingham, et al 2017). El órgano blanco de estos hongos es el sistema nervioso central (SNC), causando meningitis y meningoencefalitis criptocócica, la manifestación más común y grave (Maziarz & Perfect, 2016).A pesar de que tienen una gran predilección por SNC y pulmones, también producen enfermedad en otros sitios anatómicos menos frecuentes como sangre, piel, sistema óseo, articulaciones y próstata. Sin embargo, esta levadura puede diseminarse e infectar a cualquier órgano en pacientes severamente inmunosuprimidos, por lo que puede entonces aparecer en cualquier sitio del cuerpo humano (Maziarz & Perfect, 2016). La infección ocurre, en la mayoría de casos, por la inhalación de la blastospora o la basidiospora de una fuente ambiental, y por lo general, la enfermedad pulmonar se da por una reactivación y no por inhalación aguda de las blastosporas. En raras ocasiones la https://www.ecured.cu/Corticosteroides - 24 - infección de la piel se da por inoculación local, y la transmisión de persona a persona por inhalación de aerosoles, todavía no se ha documentado (Zavala, et al 2020). En el SNC los síntomas pueden aparecer en varias semanas, incluyendo dolor de cabeza, fiebre, neuropatías craneales, letargo, alteración mental, pérdida de memoria y otros, en pacientes con inmunodeficiencias la carga de blastosporas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) puede alcanzar hasta 1 millón por mL, por lo que las manifestaciones pueden iniciar mucho más rápido (Maziarz & Perfect, 2016). La pared celular de C. neoformans presenta una estructura dinámica, con remodelaciones constantes para modular los componentes necesarios para el crecimiento y división celular (Agustinho, et al 2018). Está constituida por una estructura de dos capas, α-1,3-glucano, β-1,3 y β-1,6-glucano, quitina, quitosano, manoproteinas y otras proteínas de anclaje (GPI). El componente en mayor cantidad es el β-1,6-glucano y el que se encuentra en menor cantidad es el β-1,3-glucano (Wang, et al 2018). La capa interna está compuesta principalmente de β-glucanos y quitina, dispuestos en fibras paralelas a la membrana plasmática y la capa externa contiene α-glucanos y β-glucanos, a esta última capa está anclada la cápsula de exopolisacárido. (García-Rubio, et al 2020). El α-1,3-glucano es un componente fundamental de la pared celular, si se ve interrumpida su síntesis las levaduras están vivas pero la unión a la cápsula no se realiza, ya que se ha demostrado que el α-1,3-glucano es importante para la correcta fijación de la pared a la cápsula, y que además está involucrado en la protección contra el sistema inmune, ocultando los β-glucanos inmunogénicos y moléculas de quitina (Wang, et al 2018). Finalmente, entre los componentes que conforman la pared celular, se encuentran proteínas que están embebidas entre los carbohidratos de la pared, cerca de 29 proteínas GPI ancladas entre las que se encuentran proteasas, carbohidrato-activas y fosfolipasas como la PIb1, que se une covalentemente a β-1,6-glucano y participa en la homeostasis de la membrana, remodelación e integridad de la pared (García-Rubio, et al 2020). - 25 - Dentro de los factores de virulencia más importantes se encuentra el polisacárido de la cápsula, que, aunque es un proceso metabólico costoso, le confiere ventajas patogénicas (Alspaugh, 2015): • Actúa como barrera para la fagocitosis • Agota el complemento • Desregula la secreción de citoquinas • Interfiere en la presentación de antígenos • Produce edema cerebral • Crea selectina y pérdida del receptor para TNF • Permite una carga altamente negativa alrededor de la levadura • Se extruye del ambiente intracelular con el potencial de toxicidad local en orgánulos celulares • Confiere resistencia al estrés oxidativo lo que puede mejorar su supervivencia Defectos en la constitución o funcionamiento de la cápsula, genera cepas avirulentas, con blastosporas de tamaño mayor, debido a una pared celular más grande lo que las hace más susceptible a los antifúngicos (Alspaugh, 2015; Perfect & Bicanic, 2015). La cápsula es un polisacárido compuesto en un 90 % por el polisacárido glucuronoxilomanano (GXM) formado por una columna de unidades α-1,3 manosa sustituidas con grupos β-1,4 y β-1,2 xilosilo y β-1,2glucuronilo; y al menos dos carbohidratos antigénicos menores como el galactoxilomanano (GalXM) y manoproteínas (MP) que representan el restante 10 % (Perfect & Bicanic, 2015; De Oliveira, et al 2019). El serotipo parece estar relacionado con las diferencias estructurales en el GXM relacionado con el número de residuos de xilosa o el grado de O-acetilacion de los grupos hidroxilo (Perfect & Bicanic, 2015). El espesor de la cápsula está regulado por señales ambientales como la presión de CO2, ensuero, urea y bajas concentraciones de hierro que aumentan el tamaño capsular en muchas cepas (Alspaugh, 2015). - 26 - Otro factor de virulencia es la capacidad de producir melanina, gracias a la enzima lacasa, que cataliza la conversión de compuestos fenólicos en eumelanina, propiamente, que utiliza como agente antioxidante (Camacho, et al 2019). De hecho, no se sabe aún si el tropismo de este hongo a cerebro está relacionado con la cantidad de catecolaminas encontradas en el tejido y que son fuente necesaria para la producción de melanina. (De Oliveira, et al 2019). Además, se ha estudiado que la melanina tiene la capacidad de dar soporte o integridad a la pared celular, alterar la carga de la misma, interferir con la respuesta de células T, anular la respuesta inmune por fagocitosis y por anticuerpos, y proteger contra cambios de temperatura y agentes antifúngicos (Nosanchuk, et al 2000; De Oliveira, et al 2019). La capacidad de crecer a altas temperaturas es considerada también otro factor de virulencia, ya que el crecimiento a 37 ̊ C es determinante para la infección, y tanto C. gatti como C. neoformans logran un crecimiento consistente a esta temperatura. Se considera que incluso cuando poseen la capacidad de hacer una cápsula y producir melanina, si no logran crecer a 37 ˚C son avirulentos (Perfect & Bicanic, 2015). Recientemente, se ha estudiado una proteína de unión a ADN (Usv101), que es considerada como un factor de virulencia, esta proteína reguladora de la transcripción y traducción es capaz de controlar la producción de melanina, así como el crecimiento de la cápsula (Zavala, et al 2020). Por último, factores de virulencia, como la expresión de enzimas tipo fosfolipasas y más estudiadas como la ureasa, que utiliza para tomar urea del ambiente externo, utilizada para diseminar al SNC y promoviendo una Th2 con lo que evita su eliminación; han sido asociadas con la sobrevivencia, mantenimiento y replicación intracelular de Cryptococcus spp. (De Oliveira, et al 2019). La patogénesis de la criptococosis está determinada por tres factores generales: el estado inmunológico del paciente, la virulencia de la cepa de Cryptococcus, y el tamaño del inóculo. Sin embargo, la importancia de cada uno de los factores en la severidad de la - 27 - enfermedad es incierta, pero está claro que las complejidades de las interacciones pueden producir una mejor presentación (Perfect & Bicanic, 2015). Durante la fisiopatología de la criptococosis, un huésped susceptible entra en contacto, vía inhalatoria, con las esporas o propágulos infecciosos. En los alveolos las blastosporas entran en contacto con macrófagos alveolares que reclutan agentes inflamatorios a través de quimiocinas o citoquinas que conducen a una respuesta Th1 adecuada, se produce una reacción inflamatoria granulomatosa que puede tomar una de las siguientes tres vías: 1. Puede proliferar y diseminar causando enfermedad clínica si el paciente es inmunosupreso. 2. Se elimina completamente la blastospora si el paciente es inmunocompetente y logra realizar una respuesta inmune efectiva. 3. Las blastosporas permanecen inadvertidas en los ganglios linfáticos pulmonares y permanecen latentes. En este último escenario, las blastosporas permaneces inactivas, por lo que el paciente es asintomático, hasta que se produce pérdida de inmunidad por alguna situación como el uso de corticosteroides, VIH u otro que favorece la replicación de la blastospora, logrando la diseminación a otros órganos fuera del pulmón (similar a la teoría propuesta para tuberculosis o histoplasmosis) (Perfect & Bicanic, 2015). A diferencia de otros hongos, Cryptococcus spp. no es dimórfico, solamente cambia de tamaño. El aumento de tamaño se puede dar de dos maneras: aumentando solamente el tamaño de la cápsula o aumentando el tamaño de la cápsula y de la célula; produciendo una población de blastosporas en los pulmones que contribuyen a evadir la respuesta inmune (De Oliveira, et al 2019). Al fenómeno de aumentar de tamaño la pared celular y la cápsula se le conoce como células Titán, resultando en células con paredes celulares más gruesas en comparación con las células normales, compuestas con más glucosamina y menos glucosa; además, menos β-glucanos y más α-glucanos en su capa interna, así como mananos estructurales. La pared de las células Titán, también tiene más quitina que - 28 - las blastosporas normales, resultando en un aumento de citocinas tipo Th2 perjudicial para el huésped (Mukaremera, et al 2018). Las limitaciones en CO2 y también en hierro inducen el crecimiento de la cápsula, sin embargo, se han descrito factores que inducen este proceso como el suero de mamíferos, medios con baja concentración de nutrientes a pH neutro o manitol (Zaragoza, et al 2004). Por el contrario, factores como la presión osmótica o altas concentraciones de glucosa recuden el tamaño de la cápsula (O’Meara & Alspaugh, 2012). En la criptococosis existe lo que se conoce como el síndrome inflamatorio de reconstitución inmune (IRIS), una restauración de la inmunidad específica contra el patógeno. Se presenta mucho en pacientes VIH positivos, pero puede darse también en otras condiciones (Dellière, et al 2018). Se cree que es el IRIS criptocócico representa una reversión desregulada de un Th2 antiinflamatorio a una fuerte respuesta inmune por células Th pro- inflamatorias en el restablecimiento de la recuperación inmune. Los síntomas ocurren durante la recepción de tratamiento antimicótico apropiado que no puede ser explicado por una infección reciente u otro proceso (Perfect & Bicanic, 2015). Las características clínicas del IRIS criptocócico son similares a las de la infección criptocócica activa en sí, pero la enfermedad meníngea es más severa, un hallazgo distintivo es la inflamación granulomatosa o necrótica con blastosporas en histopatología y con cultivo negativos. A pesar de los cambios en los marcadores inflamatorios no hay pruebas de diagnóstico específicas y confiables para diagnósticas IRIS (Dellière, et al 2018). Se cree que múltiples factores están asociados con episodios IRIS, e incluyen una alta carga de levadura al inicio de la infección, inmunidad del huésped ineficaz durante respuesta a la infección inicial y restauración rápida de la inmunidad (Perfect & Bicanic, 2015). - 29 - CAPÍTULO II Mecanismos de respuesta inmune contra Aspergillus spp., Candida spp. y Cryptoccocus spp. que se producen durante las infecciones sistémicas Aspergillus spp. La infección por Aspergillus spp. inicia con la inhalación de las conidias compuestas principalmente por β-glucano, quitina, galactomanano y α-glucano, de los cuales, el β- glucano es inicialmente reconocido por los PRR, entre ellos el receptor de lectina tipo C (CLR) (Amarsaikhan & Templeton, 2015). La familia de receptores CLR son reconocidos como un punto crítico en el reconocimiento de los hongos, específicamente contra A. fumigatus (Tishler & Hohl, 2019). La germinación de las conidias desencadena la activación de la respuesta innata (Figura 5), principalmente por medio de la señalización en las células mieloides del dominio de unión a carbohidratos de Dectina-1, que reconoce las partículas de β-1,3-glucanos desencadenando la fosforilación dependiente de la quinasa Src en su motivo intracelular ITAM y la activación de la tirosin kinasa esplénica (Syk) (Brown, et al 2018). La activación de Syk es transducido a través de la protein kinasa Cδ (PKCδ) y al miembro de la familia de dominio de reclutamiento de caspasa 9 (CARD9) para el ensamblaje del complejo ternario CARD9 / BCL10 / MALT1, esencial para la producción de citoquinas dependientes del factor de transcripción NK-κB como IL-12, TNF, IL-23, IL-6, CXCL1/2 y pro IL-1β (Tishler & Hohl, 2019). - 30 - Figura 5. Vías de señalización en el reconocimiento inmune por Aspergillus spp. Tomado de Tishler and Hohl, 2019. La activación de la fosfolipasa C (PLCγ2) está vinculada al ensamblaje de la NADPH oxidasa, la producción de especies reactivas de oxígeno y activación del factor de transcripción NFAT dependiente de calcineurina.que regulan receptores adicionales como Pentraxin-3 y CD23 (Tishler & Hohl, 2019). Adicionalmente, la vía Dectina-1/Syk conduce al ensamblaje de inflamasomas que incluyen a la familia de receptores tipo NOD (NLRP3 o AIM2), un componente estructural común como ASC y una pro caspasa como la pro caspasa 1; resulando en el procesamiento proteolítico de pro IL-1β en IL-1β bioactivo (Tomalka & Hise, 2015). El reclutamiento de la caspasa-8 en el complejo CAD9 / BCL10 / MALT1 da lugar a una vía - 31 - alternativa para el procesamiento proteolítico de la caspasa-8 activa e IL-1β bioactiva (Gringhuis, et al 2012). A. fumigatus alternativamente puede activar los receptores Dectina-2 y Dectina-3 acoplados a FcRγ a través de restos de manano, y el receptor MelLec a través de exposición a DHN-melanina (Tishler & Hohl, 2019). Dectina-1 puede interactuar con VAV1 y la tirosina quinasa de Bruton (BTK) para facilitar la fagocitosis fúngica de macrófagos. BTK también puede promover la activación y la producción de calcineurina de citocinas reguladas por NFAT (Tishler & Hohl, 2019). Es importante señalar el papel fundamental que juega BTK en la transducción de señales corriente abajo del receptor Dectina-1 en las células mieloides durante las infecciones por hongos; por ejemplo, en A. fumigatus, los macrófagos activan la señalización de calcineurina por medio del TLR9 endosómico, a través de MyD88 y BTK para regular NFAT y con esto la producción de TNF (Herbst, et al 2015). Un estudio del 2018 apoya el concepto de que la señalización de BTK se ve inhibida en pacientes que toman Ibrutinib, un medicamento quimioterapeutico recetado para diferentes linfomas. Este agente bloquea el BTK, por lo que causa un defecto en la vigilancia inmune contra hongos, especialmente contra A. fumigatus (Ghez, et al 2018). En cuanto a las células innatas del sistema inmune, los neutrófilos y los monocitos son componentes esenciales en una infección por Aspergillus spp., estudios en ratones (a los que se les suprimió el receptor de quimiocina 2 (CCR2) y el receptor Ly6C-expresado en monocitos inflamatorios (CCR2+Mo)) han demostrado el papel tan importante que juegan los macrófagos en la eliminación de conidias y del hongo en general; sin embargo, los monocitos y las células dendríticas derivadas de monocitos también ejercen propiedades inmunes al eliminar conidias y mejorar la capacidad fungicida de los neutrófilos (Espinosa, et al 2014). - 32 - La señalización por parte del interferón tipo I y III participa también en el proceso, los monocitos inflamatorios regulan la producción local rápida de INF-α que a su vez estimula la producción de INF-λ, los neutrófilos expresan receptores para INF I y III, activando la vía de señalización que promueve el estallido respiratorio fungicida (Espinosa, et al 2017) El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) también desempeña un papel en la comunicación celular y activación de neutrófilos durante una infección por Aspegillus spp., ya que se ha demostrado que los neutrófilos que no logran sensar GM-CSF presentan una discapacidad para realizar la explosión oxidativa ante una respuesta anti-fúngica (Kasahara, et al 2016). Las células NK por su parte, desempeñan un papel beneficioso en la eliminación de hongos, pues en ratones neutropénicos se ha reportado que pueden desempeñar una buena respuesta ante una aspergilosis invasiva (Morrison, et al 2003). La expresión de la molécula de adhesión CD56, en células NK, parece interactuar con A. fumigatus disminuyendo su expresión en la superficie, y con esto una secreción adecuada de citoquinas; lo que lleva a la idea de que CD56 es un receptor de reconocimiento patrón fúngico para células NK, observado también en en C. neoformans y C. albicans (Ziegler, et al 2017). En cuanto a las plaquetas en la respuesta inmune contra Aspergillus spp., éstas se unen a conidias e hifas, o compuestos fúngicos solubles aumentando la expresión de CD26P y CD63, que son marcadores para liberación de gránulos α y gránulos densos respectivamente; con esto, se activan las plaquetas y produce daños como pérdida de integridad y disminución de la viabilidad. De igual manera es mediador en la activación del complemento y atrayente de fagocitos por medio de la quimiotaxis (Speth, et al 2014). Sin embargo, aunque el papel in vivo de las plaquetas no está del todo claro, la trombocitopenia si se encuentra documentada como un factor de riesgo para la aspergilosis invasiva en pacientes trasplantados de hígado (Snarr, et al 2017). - 33 - Con respecto a la respuesta adaptativa, la clave es la producción de citocinas proinflamatorias tipo Th1 por parte de las células mononucleares (INFγ, TNFα, IL-12, IL- 1, IL-18 y GM-CSF), que regulan negativamente la producción de citocinas tipo Th2 como IL-4 e IL-10 que favorece la exacerbación de la enfermedad (Stevens, 2006). Se ha evidenciado que, entre los componentes de la pared, la quitina y el β-glucano pueden estimular respuestas protectoras o perjudiciales, según el nivel de expresión y reconocimiento, incluso el reconocimiento de ambos por su unión covalente inicia respuestas Th1/Th17 o Th2 que pueden alterar el equilibrio inmunológico. Muchos de estos subconjuntos pueden depender de la dosis, frecuencia de aspiraciones y características de las cepas de conidias (Amarsaikhan & Templeton, 2015). La inmunidad adaptativa tiene un papel redundante en la protección contra la aspergilosis invasiva, las células presentadoras de antígeno dan forma al desarrollo de respuestas de células T específicas y tanto las células T CD4+ como las T CD8+ son importantes en la mediación de la inmunidad protectora (Amarsaikhan & Templeton, 2015). La generación de inmunidad anti-Aspergillus Th1 y Th17 está regulada por la señalización de TLR / MyD88 y Dectina-1, respectivamente. La señalización de calcineurina-NFAT en las CD CD103 + configura la inducción óptima de respuestas Th17 en el pulmón a través de la producción de IL-2 (Amarsaikhan & Templeton, 2015). En el caso de la desregulación de Treg, la respuesta de las células T a los alérgenos de Aspergillus se desplaza hacia una respuesta de las células Th2 CD4+. Además, las células T, las células B, las células NK y los eosinófilos pueden ser hiperreactivos a la IL-4, lo que conduce a un bucle de amplificación por retroalimentación positiva de las células Th2 CD4+, síntesis de IL-4 y activación policlonal de las células B productoras de IgE (Latgé & Chamilos, 2019). - 34 - Candida spp. La respuesta inmunológica anti-Candida inicia con el reconocimiento de PAMPs por medio de los PRR expresados predominantemente por fagocitos mieloides que incluyen TLR, CLR, NOD, RIG1 y receptores componentes del complemento (Erwig & Gow, 2016). La transición entre blastospora e hifa es necesaria para las respuestas anti Candida , lo que permite diferenciar entre C. albicans comensal e invasiva (Gow, et al 2012). Como se ejemplifica en la figura 6, los receptores de superficie TLR4, TLR2, TLR6 y el receptor intracelular TLR9 realizan la señalización a través de la proteína de diferenciación adaptadora mieloide MYD88 para la producción de interferones, citoquinas y quimiocinas que promueven el reclutamiento fagocitos y la generación de ROS y dan forma a la activación de respuestas Th (Natea, et al 2015). Figura 6. Reconocimiento de Candida spp, por PRR en fagocitos mieloides. Tomado de Erwig and Gow, 2016. - 35 - El receptor de la familia de las lectinas tipo C reconoce carbohidratos fúngicos y da como resultado la activación de la tirosina quinasa del bazo (syk) para la activación de factor nuclear κB (NF-κB); los receptores asociados a células dendríticas (dectina 2 y dectina 3) y los receptores de macrófagos (mincle) requieren la cooperación del receptor Fc de la inmunoglobulina γ (FcγR) para la señalización (Lionakis & Netea, 2013). La señal del receptor tipo NOD forma el complejo inflamosoma para la producción de IL- 1β por medio de la caspasa 1, mientras que la dectina 1 activa el complejo CARD9- BCL10-MALT1 para la promoción del inflamasoma no canónico que también resulta en la producción de IL-1β pero por medio de la caspasa 8 (Pappas, et al 2018). Las células NK pueden ser activadas por C. albicans debido a sus receptores como TLR, FCγ y manosa; sin embargo, se ha demostrado que el principal receptor es NKp30, resultando en la señalización a través del fosfatidil inositol 3 kinasa (PI3K), manejando directamente efectos citotóxicos anti fúngicos mediados por perforina (Li, et al 2013). Además, las células NK ayudan en la modulación de otras células inmunes, mediante la liberación de citoquinas liberadas como GM-CSF e INFγ ayudando en la eliminación eventual del hongo (Duggan, et al 2015). Las células dendríticas son cruciales para determinar la respuesta adaptativa al detectar y procesar microorganismos, dirigiendo la diferenciación de los linfocitos vírgenes a células efectoras contra una infección (Gil, et al 2016). En la piel hay, al menos, tres subconjuntos de células dendríticas: células dendríticas (CD) de Langerhans, CD 103+ dérmica y CD 11b+, todas migran a ganglios linfáticos donde presentan antígeno a células T vírgenes, secretan citoquinas y determinan diferenciación de células Th. Durante la infección cutánea con C. albicans, las CD 103+ generan IL-12 necesaria para la diferenciación a Th1, sin embargo, se requiere de CD de Langerhans para inducir una Th17, que a altas concentraciones inducen IL-1b, TGF-B e IL-6. CD11b+ impulsa la diferenciación de células a Th2 (Kashem, et al 2015). - 36 - Los macrófagos residentes en tejidos y los monocitos sanguíneos también juegan un papel muy importante en la respuesta anti Candida, produciendo citoquinas pro inflamatorias y quimioquinas que reclutan y activan otras células inmunes (Ngo, et al 2014). La importancia de la respuesta Th1 y la producción de INFγ para las actividades fungicidas en neutrófilos y macrófagos está bien establecida, en estudios donde se utilizan ratones deficientes en INFγ o defectuosos en la producción de citoquinas que inducen Th1 como la IL-18 se han visto más susceptibles a la candidiasis diseminada (Kullberg, et al 1993; Stuyt, et al 2004). La producción de células Th17 por medio de las IL-17 e IL-22 también es muy importante para la defensa contras especies de Candida, ya que reclutan y activan neutrófilos y son responsables de la activación del epitelio y liberación de β-defensinas antifúngicas, sin embargo, las respuestas Th17 son principalmente necesarias en respuestas de candidiasis en mucosas no tanto en candidiasis invasiva (Duggan, et al 2015). En contraste con la Th1 y Th17, una respuesta Th2 se ha demostrado que tiene roles conflictivos, sin embargo, se requiere para el mantenimiento de un equilibrio no perjudicial de las respuestas inflamatorias (Gil, et al 2016). Las células inmunes innatas (ILC) tienen la capacidad de producir citoquinas que promueven la eliminación de Candida spp., la ILC 1 expresa T-bet y produce INFγ, ILC 2 expresa proteína de unión a GATA 3 y produce las citocinas IL-5 e IL-13, y ILC 3 que expresa el receptor RORγt y produce IL-17 e IL-22, otras ILC como las células Tγδ liberan citoquinas protectoras como IL-17 (Spits, et al 2013). En cuanto al complemento, C. albicans es un potente inductor de las tres vías de activación, resultando en la formación rápida de la convertasa C3, fragmentos de escisión quimiotácticos y una posterior opsonización fúngica por C3b que favorece la fagocitosis, - 37 - además de la formación de C3a y C5a que actúan como anafilotoxinas (Duggan, et al 2015). Los neutrófilos son considerados los precursores de la respuesta innata debido a su eficaz reconocimiento para la eliminación del hongo, de hecho los receptores de complemento CR3 y FCγR son los principales receptores de neutrófilos capaces de reconocer C. albicans, generando mecanismos efectores como fagocitosis, explosión oxidativa y formación de la trampa extracelular de neutrófilos (NET), que contienen grandes cantidades de ADN con estructuras fibrilares que se unen y neutralizan las hifas que son demasiado grandes para ser fagocitadas, liberando también sustancias antimicrobianas de los gránulos de los neutrófilos (Menegazzi, et al 2011). Los neutrófilos utilizan tanto mecanismos oxidantes como ROS así como no oxidantes para eliminar a Candida spp., factores anti microbianos como lisozima, lactoferrina, β- defensinas, gelatinasas, catepsina G y elastasa, esta última contribuye a la liberación de las NETs (McCormick, et al 2010). El impacto de las células B y los anticuerpos en la defensa contra Candida spp no esta tan claro, se ha visto que pacientes con hipogamaglobulinemia no sufren mayor suceptibilidad a la infección por este hongo (Netea, et al 2015). Cryptoccocus spp. La primera línea de defensa ante C. neoformans lo constituyen las barreras superficiales pertenecientes al sistema inmune innato, como la piel y las mucosas, principalmente la mucosa nasal, sin embargo, la saliva y el suero humano juegan un papel en la actividad anticriptocócica (Rohatgi, & Pirofski, 2015). La fagocitosis mediada por las células fagocíticas, incluidas las células dendríticas, macrófagos y neutrófilos encuentran las blastosporas inhaladas que viajan a los pulmones, y una vez internalizadas se produce una fusión entre el fagosoma y lisosoma que resulta - 38 - en la activación del inflamasoma, la acidificación del mismo y la posterior degradación de la blastospora (Campuzano & Wormley, 2018). La fagocitosis mediada por complemento ocurre a través del reconocimiento de la blastospora opsonizada por receptores CR como CR1, CR3 y CR4, además, los receptores en macrófagos, neutrófilos y células dendríticas mediante los receptores Fc de anticuerpos opsonizando a Cryptococcus. También los receptores de manosa en macrófagos y células dendríticas pueden unirse a manoproteínas criptocócicas y mediar la fagocitosis (Gibson and Johnston, 2015). En cuanto a complemento, el cual es vital para la respuesta inmune, además de mediar la fagocitosis, se ha estudiado que Cryptococcus activa el complemento a través de la vía alternativa depositando C3 en la cápsula, sin embargo, los anticuerpos anti capsulares activan la vía clásica y la lectina de unión a manosa (MBL) pueden unirse a la pared celular y activar también la vía de la lectina (Mershon, et al 2011). En pulmón, los macrófagos alveolares son el puente para unir la respuesta inmune adaptativa, sin embargo, algunas blastosporas pueden también sobrevivir y proliferar intracelularmente y otras logran escapar mediante exocitosis no lítica. Estos macrófagos pueden promover una respuesta tipo Th1 que inducen la eliminación del hongo sirviendo como célula presentadora de antígenos (CPA) a linfocitos T secretando citoquinas que favorecen una vía Th1 o Th2/Th17 (Davis, et al 2013). Así mismo, C. neoformans, en pulmones, puede polarizar la respuesta de los macrófagos a M1 (activados de forma clásica) conduciendo principalmente a una Th1 mediante la producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS – RNS, respectivamente) y con INFγ como citoquina principal o, a un M2 (activado alternativamente) orientando una respuesta Th2. Para el huésped es considerablemente más eficiente como célula fungicida un M1 que un M2 (Leopoldo & Wormley, 2014). - 39 - La producción de INF en respuestas Th1 mediante linfocitos T CD4 y las células NK, estimulan la activación de macrófagos M1 a través del transductor de señales y activador de la transcripción (STAT1), necesario para una respuesta protectora, independiente de IL-17 (Leopoldo, et al 2015). Las células dendríticas experimentan una estimulación en la producción de moléculas coestimuladoras CD40, CD80 y CD86, maduran y presentan antígenos a linfocitos vírgenes a través de MCH II. Esta maduración en presencia de INF resulta en células dendríticas productoras de IL-12 que está relacionada a una Th1, mientras que la expresión de CD86 con OX40L induce Th2 (Campuzano & Wormley, 2018) Los polimorfonuleares forman granulomas para contener y tratar de eliminar al hongo en los pulmones mediante mecanismos oxidativos y no oxidativos, también secretan péptidos antimicrobianos tipo defensinas que son tóxicos para C. neoformans (Rohatgi, & Pirofski, 2015). Las células linfoides NK son capaces de eliminar a C. neoformans mediante muerte directa por medio de gránulos como perforinas, y al igual que las células CD8 expresan también granulisina de forma constitutiva para el contacto directo con células criptocócicas y granulomas criptocócicos (Gibson & Johnston, 2015). Al llegar al cerebro, las células microgliares que expresan TLR2, TLR4 y TLR9 reconocen el zymosan (β-glucanos), GXM y ADN fúngico respectivamente, actuando como células fagocíticas primarias (Redlich, et al 2013). En cuanto a inmunidad adaptativa, las células T CD4 juegan un papel importante en la inmunidad celular para C. neoformans ya que reclutan macrófagos y granulocitos a los pulmones, por lo que recuentos bajos predisponen a criptococosis como en pacientes HIV (Campuzano & Wormley, 2018). - 40 - Las células B también ayudan a combatir la criptococosis, secretando IgM, IgG e IgA que han sido identificados en niños y adultos en el mismo orden de prevalancia, sin embargo, su papel va más relacionado con la fagocitosis desempeñando efectividad como opsonina para C. neoformans (Gibson & Johnton, 2015). Un estudio realizado por Szymczak y colaboradores (2013) mostró que los ratones deficientes en células B, presentan mayor carga fúngica, y una disminución en la captación de macrófagos alveolares, lo que indica la relación entre la respuesta de células B y la función efectora de los fagocitos utilizando los anticuerpos para la fagocitosis (Szymczak, et al 2013). Las células T CD8 limitan el crecimiento y supervivencia de C. neoformans mediante la producción de INF-γ independiente de células T CD4, se ha visto que ratones deficientes en CD4 aumentan la proliferación de CD8, con aumento de TCR (Gibson & Johnton, 2015). La activación de la respuesta inmune protectora asociada a Th1 está asociada a la producción de INF e IL-2 e IL-12, así mismo la respuesta tipo Th17 que está asociada con la producción de Il-6, IL-17, IL-21, Il-22 y factor de crecimiento transformante (TGF) también se asocian a respuesta anti-criptocócicas, sin embargo, aunque la IL-17 contribuye con la protección, no es requerida para una eventual erradicación de Cryptococcus spp. (Campuzano & Wormley, 2018). Por su parte, las respuestas de tipo Th2, están asociadas con la producción de IL-4, IL-5 e IL-13, que reclutan eosinófilos y con esto una exacerbación de la enfermedad. La ureasa y la lacasa, están involucrados en la modulación de una respuesta tipo Th2 no protectora (Campuzano & Wormley, 2018). - 41 - CAPÍTULO III Mecanismos de acción de las vacunas fúngicas contra Aspergillus spp., Candida spp. y Cryptoccocus spp. Como se mencionó anteriormente, existen diversos desafíos que conllevan a un retraso en la producción de vacunas; entre ellos, la necesidad de determinar la población diana a la cual será aplicada, ya que muchas micosis invasivas son causadas en pacientes inmunosupresos (Da Silva et al 2020). Además, se requiere conocimiento sobre el tipo de respuesta protectora necesaria para combatir un tipo de hongo en específico, realizar una formulación que sea segura y eficaz. Por otro lado, la complejidad de la célula fúngica, que al ser eucariota presenta similitudes marcadas con las células humanas, como en la membrana lipídica (bicapa de fosfolípidos) en la que el ergosterol presenta similitudes al colesterol, importante para la fluidez (Da Silva et al 2020). Existen aparentemente dos mecanismos inmunológicos para lograr protección, basados en una respuesta Th1 y/o Th17 y una inmunidad mediada por anticuerpos. La primera media protección indirectamente, promoviendo una respuesta inflamatoria con reclutamiento d e factores solubles como péptidos antimicrobianos, citoquinas, quimioquinas, y factores celulares como macrófagos o neutrófilos responsables del control y eliminación de las células fúngicas (Romani, 2011). Los anticuerpos pueden mediar la protección no solo por opsonización y activación de complemento, sino también por neutralización directa (Da Silva et al 2020). Apergillus spp. Candidatos a vacunas proteicas recombiantes como Aspf3, basadas en la modificación de alergenos fúngicos inmunodominantes con propiedades inmunoprotectoras, han sido utilizados en ratones hembra CF-1 de manera subcutánea, logrando animales sobrevivientes libres de hifas en pulmones con solo una baja densidad de infitrado - 42 - irregular de células mononucleares, en comparación con los ratones hembra CF-1 no inmunizados que murieron con elementos hifales invasivos (Ito, et al 2006). Otros mecanismos para vacunas contra las aspergilosis sistémicas involucran al manano de la pared de C. albicans conjugado con albúmina de suero bovino, un estudio realizado en ratones C57BL/6 y BALB/c comprende la vacunación vía subcutánea del conjugado tres veces por semana, infectado dos semanas antes de la finalización con las conidias de A. fumigatus, logrando disminución en las cargas del hongo en el cerebro y en el riñon (Liu, et al 2012). Se ha demostrado que las células dendríticas son esenciales en la activación de respuestas tipo Th1 en hongos, por lo que es importante que los antígenos activen dichas células para lograr respuestas determinantes en una infección (Grazziutti, et al 2001). Los oligodesoxinucleótidos CpG no metilados (ODN) son PAMPs que al ser reconocidos por TLR9, activan las CDp para el cebado Th1, actuando como adyuvantes para la vacunación específica contra Th1 en roedores, además potencia la actividad antifungica de los fagocitos efectores, beneficiando la activación de los sistemas inmunes innato y adaptativo (Bauer, et al 2001). Se ha evaluado la capacidad de diferentes alérgenos recombinantes de Aspergillus como Asp f16, ya sea solos o en presencia de ODN, para inducir respuestas protectoras Th1 y oponerse a la patología inflamatoria en ratones con aspergilosis pulmonar invasiva (Bozza, et al 2002) Un estudio del 2011 determinó que otro alergeno recombinante de A. fumigatus puede ser candidato a vacuna, el epítopo Crf1/p41 de una glucanasa de la pared celular al parecer es presentado por al menos tres alelos diferentes de MHC clase II y tiene reactividad cruzada para C. albicans. En este estudio los ratones hembra C57BL/6 y BALB/c fueron vacunados intranasalmente con la proteína Crf1 purificada y CpG murino antes de la - 43 - infección con conidias de A. fumigatus, reduciendo el crecimiento fúngico y el reclutamiento de células inflamatorias (Stuehler, et al 2011). También se ha estudiado el efecto vacuna, administrando conidias de A. fumigatus en aves de corral, inmunizándolas previamente con dosis bajas de las mismas esporas, antes de ser expuestas al hongo, sin embargo en un estudio del 2012 solo se logró demostrar un 40 % de efectividad en los pollos de engorde (Kwanashie, et al 2012). Al igual que con Candida spp y Cryptococcus spp la vacunación con Saccharomyces cerevisiae atenuada por calor protege contra una infección experimental contra Aspergillus spp. (Liu, 2011; Clemons, et al 2014). En el 2011, Liu y colaboradores realizaron un estudio en el que utilizaron alumbre como adyuvante junto con la levadura atenuada por calor de S. cerevisiae, administrando la levadura y el alumbre tres veces por semana antes de realizar un inoculo que provoque la infección por Aspergillus, este estudio mostró protección, sobrevivencia y reducción de infección en los órganos de los ratones (Liu, 2011). Otro estudio en el 2014, logró purificar el β-glucano de la pared celular de S. cerevisiae administrandolo vía subcutánea a ratones tres veces por semana, posteriormente se inoculó vía intravenosa con A. fumigatus. Los investigadores midieron la concentración de citocinas y anticuerpos anti- β -glucano, logrando un perfil inmune innato y adaptativo (INFα, quimiocinas como MCP-1, MIP-1a, citocinas activadoras de Th17 como IL-6, IL-1β, IL-17), sin embargo no hubo respuesta protectora medida por células B, ya que no se logró determinar anticuerpos anti- β-glucano en suero (Clemons, et al 2014). Candida spp. Los estudios realizados, a la fecha, han demostrado que las vacunas de péptidos modificados generalmente pueden considerarse como seguras y rentables, en comparación con las vacunas convencionales (Da Silva et al 2020), sin embargo, al ser de un pequeño tamaño son débiles inmunológicamente, por lo que requieren moléculas de transporte que ayuden con la estabilidad química y sirvan como adyuvantes (Aguilar & Rodríguez 2007). - 44 - Por ejemplo, se han estudiado anticuerpos específicos contra péptidos de la pared celular de C. albicans como Fba (fructuosa-bifosfato aldolasa) o Mt6 (metil tetrahidro pteroiltri glutamato), que conjugados a -1,2-manotriosa (Man 3) se obtienen glicopéptidos con la capacidad de crear protección a través del carbohidrato y el péptido unidos luego de ser presentadas a células dendríticas, un enfoque basado en inmunógenos químicamente definidos completamente sintéticos que generalmente son útiles en el desarrollo de vacunas, una ventaja es que el péptido portador se deriva del agente infeccioso de interés, proporcionando la posibilidad de una doble respuesta de protección inmunitaria tanto contra el epítopo del glucano como contra el péptido portador (Xin, et al 2008). Un estudio más reciente, confirma que la inmunización activa y pasiva de los mismos conjugados contra la candidiasis diseminada en ratones neutropénicos también es posible, mejorando significativamente la supervivencia y la carga fúngica de candidiasis (Xin, 2016) Dada la complejidad de la síntesis de oligosacáridos, se han estudiado nuevas estrategias mediante el uso de mimotopos peptídicos que imitan estructuralmente el epítopo protector del glucano β- (Man) 3 como sustituto inmunógeno que sustituyen a la parte glucano en la vacuna glucopéptidica [β- (Man) 3-Fba]. Un estudio seleccionó cinco mimotopos los cuales fueron inmunogénicos en ratones y tres pudieron inducir protección por medio de anticuerpos contra la candidiasis diseminada. Por lo tanto, el uso de un doble epítopo basado en mimotopo-péptido contra la candidiasis es un candidato potencial a vacuna que es económico de producir, altamente eficaz y posiblemente seguro para su uso en humanos (Xin, et al 2019). Asimismo, se han realizado estudios con diferentes glicopéptidos como la combinación del β-1,2 manano y del oligopéptido derivado del Als1 (rAls1p-N); que fueron sintetizados y conjugados covalentemente, resultando en una respuesta que induce altos niveles de anticuerpos IgG en ratones con propiedades auto adyuvantes. Este estudio, además, muestra la reacción de los anticuerpos contra la superficie celular de diferentes especies de Candida como C. albicans, C. tropicalis, C. lustaniae y C. glabrata (Liao, et al 2019). - 45 - Por otro lado, las respuestas protectoras contra los componentes de manano de Candida parecen ser principalmente por inducción de anticuerpos protectores específicos contra los epítopos de péptidos fúngicos y los polisacáridos conjugados, que permiten la producción de anticuerpos IgG anti polisacáridos in vivo. El cambio de IgM a IgG, la activación del sistema del complemento, y la rápida deposición de altas cantidades de factor C3b en la pared celular de la blastospora son mecanismos que contribuyen a inhibir el crecimiento de Candida spp. in vitro (Sampaio & Pais, 2017). Un estudio reciente basado en vacunas de péptidos inmunoterapéuticos utiliza el proteoma de C. albicans para identificar los epítopos que son más inmunodominantes en células B, HLA de clase I y HLA de clase II. El estudio selecciona los 18 epítopos en proteínas de la hifa que ayudan a que el hongo se adhiera e invada las células epiteliales. La selección de estos epítopos radica en la importancia de las células Th para reconocer las proteínas HLA de clase II y, a su vez, activan tanto las células B para secretar anticuerpos como las células Tc para matar las células diana infectadas (Tarang, et al 2020). Los epítopos se unen con el fin crear una proteína recombinante multivalente contra C. albicans (mvPC), utilizando el adyuvante sintético (RS09) para aumentar la inmunogenicidad (Tarang, et al 2020). Los epítopos de mvPC seleccionados son homólogos contra todas las secuencias de referencia anotadas disponibles de 22 cepas de C. albicans, ofreciendo así, una mayor cobertura y respuesta protectora. Una de las principales ventajas del enfoque de vacuna actual es la naturaleza multivalente de mvPC (reconociendo epítopos múltiples), que probablemente proporcione una protección mejorada contra complejos antígenos de Candida (Tarang, et al 2020). La transición morfogenética entre la blastospora y la forma hifal es uno de los más importantes factores de virulencia en C. albicans por eso la incapacidad de no formar la hifa es una característica común de las cepas atenuadas de esta especie, y da origen a una posible vacuna atenuada (Da Silva Dantas, et al 2016; Pappas, et al 2018). - 46 - Varios mutantes de C. albicans asociados con una baja o ninguna virulencia se han estudiado, incluyendo PCA-2, CNC13 (al que le han eliminado la MAP quinasa HOG1), RML2U (en la que han eliminado el gen ECM33 de la proteína de la pared celular CWP), y tet-NRG1 (en el que el represor de filamentación NRG1 puede ser sobreexpresado con doxiciclina); todas estas cepas se han utilizado para inmunizar ratones y se ha demostrado protección incluso posterior a una infeccion sistémica letal con una cepa virulenta (Fernández et al 2004). Se ha reportado que blastosporas de Saccharomyces muertas por calor exhiben protección contra la candidiasis sistémica, esta vacunación mostró respuesta inmune de tipo Th1 y además logró inducir anticuerpos contra los glucanos y citoquinas incluidas la IL-17α (Liu, et al 2012).La eficacia de esta vacuna es baja, probablemente, porque los componentes protectores similares tienden a ser poco abundantes entre Candida y Saccharomyces, incluso los investigadores aumentaron la dosis, no obstante, el resultado fue una toxicidad asociada a la misma (Liu, et al 2011; Capilla et al 2019, Liu, et al 2012). Es importante señalar que, a pesar de tener éxito en la investigación, ninguna de las vacunas atenuadas ha logrado avanzar a ensayos clínicos, posiblemente porque la caracterización de las cepas es compleja, la estabilidad de las mutaciones atenuantes de virulencia no está del todo garantizado y porque su uso actualmente no esta recomendado para pacientes inmunosupresos con la posibilidad de desarrollar la enfermedad (Tso, et al 2018). Las vacunas recombinates de Candida en general se han centrado en proteínas expresadas en su superficie, en proteínas de adhesión para garantizar que sean fácilmente reconocidas por el sistema inmunológico y mas recientemente a proteínas asociads a hifas que conllevan a respuestas inmune adaptativas más fuertes (Hoyer & Cota 2016). La proteína de secuencia similar a la aglutinina (Als) se encuentra en la superficie de C. albicans y es importante en la adhesión a células endoteliales en el desarrollo de candidiasis invasiva por lo que se se han propuesto varias vacunas con proteínas - 47 - recombinantes como Als1 y Als3 formuladas con y sin adyuvantes (Hoyer & Cota 2016). Por ejemplo, en el 2006 se realizó un estudio en ratones BALB/c utilizando el extremo N. terminal de la proteína recombinante Als1 (rAls1p-N) de S. cerevisiae y utilizando el adyuvante completo de Freund, dando como resultado una supervivencia del (50-57) % cuando fueron infectados con C. albicans (Ibrahim, et al 2006). Posteriormente, en el 2009, utilizando el extremo N de Als3 recombinante (rAls3p-N) se indujo una respuesta de anticuerpos y una tasa de supervivencia mayor en comparación con la vacuna rAls1p-N; además, fue más eficaz en el modelo murino de candidiasis en orofaringe y vagina (Lin, et al 2009). Actualmente, la propuesta de vacuna en la fase más avanzada de estudio para combatir una infección por hongos es NDV-3A, que utiliza (rAls3p-N) (Da Silva, et al 2020). En este estudio de fase II aleatorizado, a doble ciego y controlado con placebo, se administró NDV-3A a mujeres con candidiasis vulvovaginales recurrentes y la vacuna resultó ser segura y las mujeres vacunadas desarrollaron rápidamente respuestas de células T y B a rAls3p-N, desarrollando inmunidad por 12 meses (Edwards et al, 2018). El suero de las pacientes que respondieron al NDV-3A contenía anticuerpos que evitaron, in vitro, la adhesión de C. albicans y la formación de biopelículas, así como la invasión en la vagina de las células epiteliales (Uppuluri, et al 2018). Además, en otro estudio ratones machos C57BL/6 vacunados con NDV-3A desarrollaron altos títulos de anticuerpos anti-rAls3-N y la presencia de estos anticuerpos fue suficiente para evitar que C. albicans colonizara catéteres de la vena yugular. El NDV-3A es considerado, por lo tanto, un prometedor prototipo de vacuna para el tratamiento de la candidiasis vaginal y la candidiasis invasiva (Alqarihi et al 2019). A parte de las Als, las aspartil proteasas secretoras (SAP) son otras proteínas candidatas para vacunas en C. albicans; éstas constituyen una familia de diez proteínas que son necesarias para el metabolismo, la adhesión e invasión epitelial y endotelial (Naglik, et al 2003). La proteína SAP2p, se ha estudiado por su mayor expresión en C. albicans, y su - 48 - forma recombinante se ha utilizado para realizar ensayos en ratones Wistar, logrando eliminar infecciones vaginales por este hongo. Por otro lado, se ha logrado desarrollar una versión truncada de la proteína, que incorporada a lisosomas de influenza (PEV7), ha mostrado protección contra candidiasis vaginal (De Bernardis, et al 2002). PEV7 logró avanzar a ensayos clínicos como vacuna terapéutica en el tratamiento de la candidiasis vaginal, en un ensayo aleatorio de fase I en el que los sujetos participantes fueron inmunizados por medio de inyecciones intramusculares o cápsulas vaginales y desarrollaron una fuerte respuesta inmune mediada por células B sin efectos adversos (De Bernardis, et al 2012). La proteína de choque térmico 90 (Hsp90p) es una proteína inducible al estrés, altamente conservada y clave en la viabilidad de la blastospora de C. albicans; está localizada en la pared celular, es considerado un antígeno altamente inmunogénico y varios de sus epítopos se han utilizado en estudios de supervivencia en ratones con candidiasis sistémica (Yang, et al 2005). Por ultimo, no solo las proteínas recombinantes se han estudiado, también se han analizado extractos de la pared celular conocidos como (CWP). Estos extractos parecen ser eficaces para proteger contra la candidiasis invasiva, de hecho, la inmunización de CWP con el adyuvante RAS (Ribi Adjuvant System) seguido de un refuerzo a los 21 días, logró protección en el 75 % de los ratones hembra BALB/c luego de ser expuestos a C. albicans. Sin embargo, estas preparaciones son poco probables que avancen a ensayos clínicos debido a la dificultad estarización las formulaciones (Thomas, et al 2006). Cryptococcus spp. En la actualidad, no existen vacunas aprobadas para uso clínico en la prevención de cualquier enfermedad fúngica, lo que lleva a pensar en el desafío que conlleva la creación de una vacuna criptocócica, sin embargo, se deben tomar en cuenta aspectos como la inducción de una inmunidad protectora, la combinación del adyuvante con el antígeno - 49 - criptocócico, la vía y sistema de administración, con el fin de crear una vacuna segura, viable y eficaz (Caballero & Wormley, 2018). De manera in vitro, las vacunas de cepas mutantes atenuadas o inactivadas por calor son posibles candidatos a una vacuna contra Cryptococcus spp, y algunos estudios han demostrado que por ejemplo, la vacunación de ratones hembra A/J con cepas atenuadas de C. neoformans diseñadas para sobre expresar Znf2, un regulador positivo en el desarrollo de hifas (C. neoformans se presenta principalmente en forma de levadura, pero es capaz de cambiar a la forma hifal, la cual se ha asociado durante mucho tiempo con una virulencia atenuada, pero el mecanismo subyacente sigue siendo difícil de alcanzar), impulsa respuestas inmunes protectoras de tipo Th1 y Th17 (Zhai, et al 2015). Resultados similares fueron obtenidos en otro estudio donde se utilizó la cepa cda 1D2D3D de C. neoformans, deficiente en quitosano e inactivada por calor, utilizada para inmunizar a ratones BALB/c y en los cuales se evidenció una protección robusta contra la cepa virulenta de C. neoformans y además, protección cruzada con C. gatti (Baker, et al 2011). En un estudio más reciente, se examinó el potencial que tienen las cepas muertas por calor y mutantes para la proteína fbp-1 (que promueve la virulencia por medio de las interacciones con el huésped), en crear una inmunidad protectora y eficiente por medio de respuestas Th1 al prolongar el tiempo entre una dosis alta y la exposición al patógeno. Un detalle importante es que la protección de esta vacuna es eficaz incluso en ratones deficientes en linfocitos CD4+, hallazgo particularmente importante en el contexto de la inmunodeficiencia causada por VIH/SIDA. Incluso la protección se logró para diferentes patógenos fúngicos como C. gatti, A. fumigatus y una protección parcial contra C. albicans, por lo que aseguran ser una candidata adecuada para la criptococosis y otras infecciones fúngicas invasivas, tanto en inmunocompetentes como en inmunodeprimidos (Wang, et al 2019). - 50 - Se debe tomar en cuenta que la probabilidad de reversión de cepas atenuadas a cepas completamente virulentas se puede reducir sig