BOLTEC 28(2): 13-27. 1995
CULTIVO in vitro DE YEMAS AXlIARES DE PAPAYA (Carica
papaya L.). ll. DETERMINACION DE LAS CONDICIONES
PARA LA REGENERACION y MULTIPLICACION in vitro DE
TALLOS1
Griselda Arrieta2, Eric Guevara3, Guillermo Sancho4
RESUMEN ABSTRACT
Cultivo in vitro de yemas axi1ares de papaya In vitro culture of axillary buds of papaya
(Cariea papaya L). ll. Determinación de las condicio- (Carica papaya L.).II. Determination of conditions for
nes para la regeneración y multiplicación in vitro de in vitro stalk regenerating and multiplying. The
tallos. Se detenninaron las condiciones para la multipli- conditions for in vitro axillary bud multiplication from 4
cación in vitro de yemas axilares provenientes de plantas to 6 months old and fruit bearing papaya plants were
de papaya de 4 a 6 meses de edad y de plantas en produc-
ción. Se estudió inicialmente la respuesta de los explan- determined. The explants' response in a MS medium
tes en un medio MS bajo dos tipos de citoquininas: BAP under two types of cytoquinines: BAP (0.3 mg/l and
(0,3 mg/l) y quinetina (1 mg/l). Posterionnente en la fase kinetin (1 mg/l) was initially studied. Posteriorly,
de multiplicación se estudió la combinación de estas sus- combinations of these substances with GA3 (1 mg!l) and
tancias con AG3 (1 mg/l) y ANA (0,05 y 0,10 mg!l). En NAA (0.05 and 0.1 mg/l) were tested. A larger formation
presencia de BAP se observó una mayor formación y and proliferation of buds was observed in the presence of
proliferación de yemas, que fue menor con kinetina. El BAP, but it was lower with kinetin. The sub-culture of
subcultivo de los explantes en presencia únicamente de explants, in the presence of BAP only, promoted the
BAP promovió el desarrollo de tallos muy cortos, poco growth of very short stalks, not suited for rooting.
aptos para su enraizamiento. Tanto el AG3 como la kine- Neither GA3 or kinetin had an elongating effect on them.
tina no tuvieron efecto sobre la elongación de éstos. La The combination of BAP and NAA (0.1 mg/l) was the
combinación de BAP y de ANA (0,1 mg/l) fue el mejor
medio para la multiplicación, al promover una mejor best multiplication medium, promoting the best stalk
elongación de los tallos, con hojas de menor tamaño. Se elongation with smaller sized leaves. The results are
analizan y discuten los resultados con relación a lo infor- analyzed and discussed in relation to other authors'
mado por otros autores. reports.
Abreviaciones: BAP = 6-bencilaminopurina, AG3 = áci-
do giberélico, ANA- ácido naftalenacético. Keywords: vegetative propagation, in vitro culture,
buds, explants, Carica papaya, plant growth substances,
Palabras clave: propagación vegetativa, cultivo in vitro, ba, kinetin, ga, naa.
yema (planta), explantes, Carica papaya, sustancias de
crecimiento vegetal, 6-benziladenina, quinetina, ácido
giberélico, ácido naftilacético.
1 Esta investigación contó para su realización con recursos de la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica.
(Proyecto VI-736-89-032).
2 CIGRAS, Universidad de Costa Rica.
3 Miembro del Programa de Apoyo Financiero a Investigadores del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas
(CONICIT) de Costa Rica.
4 Ing. Agr. Estación Experimental Fabio Baudrit M., Facultad de Agronomía, Universidad de Costa Rica.
14 BOLETIN TECNICO ESTACION EXPERIMENTAL FABIO BAUDRIT M.
INTRODUCCION MATERIALES Y METODOS
La propagación de la papaya se realiza por me- Dadas las dificultades encontradas por Sancho
dio de semillas, lo cual, sumado al alto grado de po- y Guevara (1991) con material vegetal adulto, se
linización cruzada que caracteriza a esta especie, estudiaron dos tipos de material vegetal. El prime-
produce una gran variabilidad del material genético, ro consistió de plantas con 3-4 meses de edad, para
que incide directamente en la susceptibilidad a en- definir mejor los requerimientos de los explantes de
fermedades, la calidad del fruto y en la producción. papaya. La información obtenida fue utilizada co-
mo base para el estudio con el segundo material,
El establecimiento de un programa de propaga- que consistió de yemas de plantas adultas en pro-
ción clonal in vitro para papaya sería la vía más fac- ducción. 
tible para disminuir esta variabilidad genética.
Regeneración de yemas de papaya de
En la literatura se citan varios protocolos de plantas de 3-4 meses de edad.
propagación clonal de plantas de papaya in vitro a
partir de yemas axilares y apicales (Drew y Smith 1. Fase de establecimiento.
1986, Drew 1988, Litz y Connover 1978, DeWi-
naar 1988, Rajeevan y Pandey, 1986). Esta prolife- Origen del material vegetal: se tomaron 3 plan-
ración de sistemas, algunos de los cuales presentan tas de papaya del tipo "Criollo" de 3-4 meses de
diferencias importantes en cuanto a la metodología, edad y se colocaron en el invernadero del Centro
responde a la dificultad de los investigadores en re- para Investigaciones en Granos y Semillas (CI-
producir los resultados obtenidos por otros autores. GRAS) de la Universidad de Costa Rica, con el fin
Rajeevan y pandey (1986), DeWinaar (1988) y, de controlar el estado sanitario y nutricional de las
Sancho y Guevara (1991) no lograron regenerar plantas y disminuir los posibles contaminantes in
plantas utilizando el procedimiento descrito por vitro. Para la obtención de una mayor cantidad de
Litz y Connover (978). Sancho y Guevara (991) yemas se siguió el procedimiento descrito por Reu-
también evaluaron además los protocolos sugeridos veni et al. (1990), que consistió en la aplicación en
por DeWinaar (988) y por Guevara (981), obtenien- el tallo de las plantas de una pasta compuesta por
do una mejor respuesta con ambos medios, aunque lanolina, 500 ppm de BAP y 1000 ppm de ácido gi-
no lograron una multiplicación continua ni la for- berélico (AG3). Tres semanas después, cuando bro-
mación de raíces. Estos autores determinaron que, a taron las yemas de plantas tratadas, se procedió a la
pesar de emplear material vegetal de un mismo cul- inoculación de las mismas in vitro.
tivar (por ejemplo el cultivar Solo) , existen varia-
ciones locales que pueden influir seriamente sobre Desinfección y disección: En el momento de
la respuesta al cultivo in vitro. Conclusiones simi- cortar las yemas, éstas se dividieron en dos grupos:
lares han sido expresadas, en cuanto al cultivo in vi- uno se sumergió en alcohol de 95% durante unos
tro de otras especies, por Debergh (987) y por Ban- segundos y el otro no. A todas las yemas se les cor-
gerth (Institut für Obst-, Gemüse und Weinbau. taron los ,segmentos de pecíolo y hojas, de manera
Universidad de Hohenheim, Stuttgart, Alemania. que quedara la menor cantidad de tejido. Posterior-
Comunicación personal 1995). mente, se colocaron en bolsitas de malín y se lava-
ron bajo un flujo continuo de agua durante 45 mi-
Es por esta razón que el objetivo de este traba- nutos. Después de este tiempo se desinfectaron con
jo fue estudiar los requerimientos necesarios para hipoclorito de sodio 0,75% adicionado con tres go-
obtener y establecer en la papaya una multiplica- tas de Tween 80 durante 20 minutos. Por último, se
ción de tallos in vitro de manera satisfactoria y con- lavaron 5 veces con agua destilada estéril en la cá-
tinua. mara de transferencia.
ARRIETA, et al.: REGENERACION Y MULTIPLICACION in vitro DE LA PAPAYA 15
La disección de las yemas se hizo con ayuda de B- Yemas provenientes del medio MS + 1,0 mg/l
un estereoscopio y dos jeringas con agujas a mane- kinetina
ra de pinza y bisturí. Se procuró en todos los casos * MS + 0,5 mg/l kinetina. + 1,0 mg/l de AG3 (6
dejar únicamente dos primordios, el meristema y explantes)
una base. * MS + 1,0 mg/l de AG3 (6 explantes)
* MS + 0,3 mg/l de BAP C7 explantes)
Medios de cultivo: Se utilizaron dos medios de
cultivo in vitro, que en una investigación preliminar El material fue subcultivado dos veces en estos
produjeron los mejores resultados en yemas obteni- medios. Posteriormente, con base en la respuesta
das a partir de plántulas germinadas in vitro (resul- observada en los medios anteriores, se procedió a
tados no publicados): 1- MS + 0,5 mg/l de BAP y realizar diferentes adaptaciones del medio de culti-
2- MS + 1 mg/l de kinetina (kin). Con excepción de vo, las cuales serán descritas conforme se presenten.
la concentración de los reguladores y el uso de un
gelificante, Gel-Rite (2 gr/l), el medio se preparó
según lo descrito por Murashige y Skoog (962). Regeneración y multiplicación in vitro
a partir de yemas de planta adultas en
Se colocó una yema por frasco, para un total de producción.
16 yemas en el medio con BAP y 15 en el medio
con kinetina para el tratamiento con alcohol y, 8 Y 1. Experimento I.
12 yemas para el tratamiento sin alcohol, respecti-
vamente. Origen del material vegetal: Se tomaron 31
yemas provenientes de tallos laterales de plantas
adultas de una plantación de papaya criolla situada
2. Multiplicación del material cerca de la Estación Experimental Fabio Baudrit en
Alajuela. Estas se sumergieron en alcohol de 95%
Los explantes procedentes de la fase de esta- en el momento de cortarlas.
blecimiento fueron colocados en tratamientos kine-
tina o BAP, en combinación o no con 1 mg/l de áci- Desinfección: el procedimiento fue idéntico al
do giberélico (AG3). Estas pruebas se basan en los utilizado con las plantas de 3-4 meses de edad.
resultados de elongación obtenidos por DeWinaar
(988) con este último regulador. Además, una in- Medio de cultivo: se utilizó inicialmente el me-
vestigación preliminar con material proveniente de dio MS + 0,3 mg/l de BAP. Después de cuatro sub-
semilla y yemas de plántulas cultivadas in vitro re- cultivos todos los explantes se transfirieron a un
cién germinadas produjo una buena respuesta en medio MS + 0,3 mg/l de BAP + 0,1 mg/l de ANA.
cuanto a multiplicación (resultados no publicados). El pH se ajustó a 5,8 y se añadió agar como gelifi-
Los medios utilizados se presentan a continuación: cante (10 g/l). El medio (aproximadamente 20 cc)
fue vertido inicialmente en frascos pequeños (130
A- Yemas provenientes del medio MS + 0,5 mg/l cc de contenido) del tipo de comida para bebés de
de BAP tamaño y posteriormente autoclavado. Cuando la
* MS + 0,3 mg/l de BAP + 1,0 mg/l de AG3 (7 multiplicación de los explantes empezó a ser
explantes) importante, se utilizaron frascos grandes (275 cc de
* MS + 1,0 mg/l de AG3 (8 explantes) contenido).
* MS + 0,3 mg/l de BAP (7 explantes)
16 BOLETIN TECNICO ESTACION EXPERIMENTAL FABIO BAUDRIT M.
2. Experimento 2 RESULTADOS
Se procedió a realizar un segundo experimen- Experimentos con plantas de 3-4 me-
to, utilizando yemas de la misma plantación que en ses de edad.
la prueba anterior.
Fase de establecimiento
La desinfección fue similar a la del experimen-
to anterior, con la excepción que se evaluaron dos En primera instancia, se evaluó la decoloración
concentraciones de NaOCl: 0,75% y 0,5%. A ambas (pérdida de color de la hoja que puede considerarse
se les añadió una gota de Tween 80 por cada 100 cc. como degradación de la clorofila y del contenido
celular) de los explantes después de los tratamien-
En el tratamiento de 0,75% de NaOCl se colo- tos de desinfección. Estos resultados se describen
caron 26 yemas y en el de 0,5% de NaOC1,16. en el Cuadro 1.
Los medios de cultivo fueron los mismos que Puede notarse que el proceso de degradación
en el experimento anterior. A partir del segundo de los explantes fue mayor en presencia de alcohol
subcultivo las yemas del tratamiento de 0,5% de y cuando el medio de cultivo contenía BAP.
NaOCl se inocularon en un medio MS + 0,3 mg/l de
BAP y las de 0,75% de NaOCl en un medio MS + En cuanto a la contaminación ésta fue muy ba-
0,3 mg/l de BAP + 0,1 mg/l de ANA. ja y únicamente de procedencia fungosa, la cual só-
lo se observó en una yema cultivada en el trata-
miento conteniendo Kinetina y sin alcohol.
ARRIETA, et al.: REGENERACION Y MULTIPLICACION in vitro DE LA PAPAYA 17
En cuanto al desarrollo de las yemas, se dio Fase de multiplicación
inicialmente un engrosamiento leve en la base y en
los primordios foliares de las mismas. Sin embargo, La transferencia del material anterior a los me-
éste fue distinto en los dos medios de cultivo utili- dios de mutiplicación se ilustra en el Cuadro 3.
zados. En el medio con 0,5 mg/l de BAP, el volu-
men de las yemas aumentó con el tiempo hasta lle- Se observa que el porcentaje de formación de
gar a la formación de un callo en la base de algunos callo es bajo en todos los tratamientos, aunque es
explantes (Cuadro 2). En la parte superior se obser- mayor cuando se utilizó BAP previamente. En con-
varon puntos de neoformación que le dieron a las traposición, se da una c1orosis muy generalizada y
yemas el aspecto de una "roseta". Dos meses des- considerable en las yemas, independientemente del
pués de inoculadas, el aumento en el tamaño de és- tratamiento. Esta disminuyó después del segundo
tas era tal que podían observarse a simple vista. subcultivo. Con respecto a la necrosis y la contami-
nación se obtuvieron porcentajes muy bajos, siendo
la segunda causada por hongos.
Cuatro semanas después del segundo subculti-
vo, se dio en los explantes del tratamiento BAP
0,3mg/l + AG31,0 mg/l unengrosamiento a nivel de
la base de las yemas, pero la proliferación de las
mismas continuó siendo baja. En el tratamiento
AG3 1,0 mg/l, se observó una tendencia similar a la
del tratamiento anterior, mientras que con BAP 0,3
mg/l se dio una alta proliferación de las yemas en
comparación con los otros tratamientos. En presen-
cia de kinetina, el resultado obtenido fue similar,
pero con un menor engrosamiento de la base.
En el medio de cultivo con 1,0 mg/l de Kineti-
na se dio también un aumento de volumen en las La combinación de esta citoquinina con AG3
yemas pero menor que en presencia de BAP. En es- produjo el mismo efecto que con el uso de BAP 0,3
te caso se observó primeramente una expansión de mg/l, aunque la proliferación obtenida fue menor
los primordios foliares, hasta el punto que formaron cuando fue utilizada como tratamiento previo. Los
hojas completamente desarrolladas, que inhibieron resultados obtenidos muestran que la mayor proli-
en algunos casos la actividad meristemática de la feración fue obtenida al utilizar BAP 0,3 mg/l como
yema. La presencia de callos en la base de las ye- único regulador en el medio.
mas se cuantificó hasta 3 meses después de la ino-
culación, momento en el que era más evidente su La brotación de las yemas fue baja en todos los
presencia. En el Cuadro 2 se presentan las evalua- tratamientos, aún después del segundo subcultivo.
ciones en cuanto a la formación de callo en las ba- Sin embargo, se notó un aumento de volumen en las
ses de las yemas. El uso de BAP promueve una ma- yemas de los tratamientos procedentes de un trata-
yor formación de callo. Cinco meses después de la miento inicial con BAP. Cuando el tratamiento pre-
inoculación de las yemas, éstas no se encontraban vio se hizo con kinetina, no se observó esta carac-
aún en una fase de multiplicación semejante a la del terística.
material procedente de semillas (resultados no pu-
blicados). Aunque las yemas presentaban brota- La baja respuesta en cuanto a brotación en los
ción, su proliferación fue baja. resultados obtenidos en la prueba anterior, eviden-
18 BOLETIN TECNICO ESTACION EXPERIMENTAL FABIO BAUDRIT M.
ció que las combinaciones utilizadas de reguladores y del B (yemas previamente cultivadas bajo un me-
no estimulaba el crecimiento y el desarrollo de los dio con Kinetina) 20 explantes, para un total de 43
explantes, por lo que se discontinuó y se prosiguió explantes. 
con una segunda prueba de multiplicación, con el
fin de determinar las condiciones más favorables Dos meses después del último subcultivo se
para el establecimiento de esta fase en material pro- transfirió el material a un medio MS + 0,3 mg/l de
veniente de yemas. Para ello se evaluó el efecto de BAP + 0,05 mg/l de ANA. Los medios de cultivo se
la aplicación de ANA en el medio de cultivo como gelificaron en un principio con Gel-Rite a razón de
factor de establecimiento de la dominancia apical 2 g/l; pero luego se utilizó Agar a 10 g/l.
en los tallos, con el fin de permitir el desarrollo de
tallos elongados y reducir el número de rosetas. En el medio de cultivo MS + 0,3 de BAP,
46,5% de los explantes presentaron en forma consi-
Respuesta de los explantes al medio derable el proceso de vitrificación (desorden fisio-
MS + 0,3 mg/l BAP + 0,05 mg/l ANA. lógico caracterizado por una excesiva acumulación
de agua, alteración de la formación de conexiones
Se transfirieron todos los explantes de la prue- vasculares y ausencia de rigidez en las paredes ce-
ba anterior a un medio MS + 0,3 mg/l de BAP que lulares), además de clorosis y necrosis. Ante esta si-
fue con el que se obtuvo una mejor proliferación. tuación se desecharon aquellos explantes que mani-
Del tratamiento A (yemas previamente cultivadas festaron este síntoma, quedando una población de
en un medio con BAP) se obtuvieron 23 explantes 20 explantes (53,5%).
ARRIETA, et al.: REGENERACION Y MULTIPLICACION in vitro DE LA PAPAYA 19
Debido a los problemas anteriores y a la baja Después del cuarto subcultivo en el medio con
proliferación observados, todos los explantes fue- 0,3 mg/l BAP + 0,05 mg/l ANA solidificado con
ron transferidos al medio MS + 0,3 mg/l de BAP + agar, la clorosis disminuyó a 51,8% y se eliminó la
0,05 mg/l de ANA (ácido naftalen-acético). vitrificación. Todos los explantes formaron callos
con un diámetro promedio de 1- 1,5 cm. En forma vi-
Dos meses después de cultivo en este medio se sual los tallos presentaron mejor apariencia, con ho-
explantes, que empezaron a formar un importante jas de menor tamaño (mejor proporcionadas con re-
número de brotes. Con el fin de caracterizar este lación a la dimension del tallo) y menos suculentas.
material vegetal, se evaluaron los siguientes pará-
metros: la formación del callo y su diámetro, y la Los resultados anteriormente obtenidos lleva-
tasa de proliferación de tallos, clasificada en: alta ron a caracterizar mejor el efecto del ANA. Para
(15 brotes o más); media (5-10 brotes) y baja (me- ello, los explantes se cultivaron en un medio MS +
nos de 5 brotes). Los resultados obtenidos se pre- 0,3 mg/l BAP conteniendo o no 0,1 mg/l de ANA.
sentan en el Cuadro 4. Los explantes de la prueba anterior fueron dividi-
dos en dos grupos y se transfirieron a cada uno de
Se puede observar que muy pocos explantes estos tratamientos. Los subcultivos se realizaron
formaron callo, aún después de dos meses de culti- cada tres a cuatro semanas. Se evaluó la tasa de
vo en presencia de BAP. La multiplicación fue so- multiplicación de los explantes en cada tratamiento
bre todo media y la extensión de las hojas neofor- y el tipo de explantes producidos. Para ello, se es-
madas fue leve. Se observó un aumento en la tableció una clasificación basada en los tipos de ta-
proliferación de hojas y brotes en todos los explan- llos que se generan en la fase de multiplicación (Fi-
tes. Sin embargo solo en dos de ellos (14,2%) se gura 1):
formaron tallos definidos. Un fenómeno interesan-
te fue observar que en todas las "macollas o arbus- - Tipo A: ejes únicos, dominantes sobre la masa
tos" (explantes que formaron muchos tallos y hojas, de proliferación. Hojas bien desarrolladas, ta-
simulando un arbusto en miniatura), varios tallos maño aproximado: 2,1 o más cm.
presentaron fenómenos de vitrificación y clorosis, - Tipo B: tallos únicos o en grupos de 2-3 con
aunque el fenómeno nunca fue generalizado a todo una base de callo. Brotación media a alta, ta-
el explante, por lo que éstos continuaron su cre- maño entre 1,1 - 2,0 cm.
cimiento. Sin embargo, debido a la aparición de es- - Tipo C: masa de proliferación con una gran
te fenómeno, se procedió a cambiar el gelificante cantidad de brotes y tallitos, alta proporción de
Gel-Rite, empleado hasta el momento, por Agar pa- hojas de mediano desarrollo, tamaño aproxi-
ra determinar si esta era la causa de la anomalía. mado de 0,25 a 1,0 cm.
20 BOLETIN TECNICO ESTACION EXPERIMENTAL FABIO BAUDRIT M.
Fig. l. Tipos morfológicos observados durante la ultiplicación in vitro de tallos de papaya. Tipo A: eje único, do-
minante. Hojas bien desarrolladas; Tipo B: tallos únicos o en grupos de 2-3, con callo en la base; dimensio-
nes medianas; Tipo C: tallos con abundante proliferación axilar, de dimensiones reducidas.
Los resultados obtenidos en esta prueba se re- Propagación mediante el uso de yemas
sumen en los Cuadros 5 y 6. El uso de únicamente de plantas adultas en producción
BAP (Cuadro 5) promovió inicialmente una mayor
formación de tallos de tipo B en comparación con Inicialmente, se evaluó el porcentaje de conta-
la presencia en el medio de ANA (Cuadro 6). Sin minación y de necrosis de las yemas después de la
embargo, en este último medio se observa un incre- desinfección. Los resultados obtenidos se presentan
mento constante de la totalidad de explantes, y en en el Cuadro 7. Estos evidencian una alta contami-
particular de tallos tipo A, mientras que con el uso nación del material proveniente de condiciones de
de únicamente BAP se aprecia a partir del mes de campo y una mayor sensibilidad de los tejidos al
febrero una disminución en la proliferación de ta- tratamiento de desinfección, en comparación con
llos tipo C. En presencia de auxina, se puede notar los tratamientos de plantas jóvenes en invernadero.
un mejor desarrollo de las hojas, mientras que una
presencia continua de BAP produce plantas con ho- Las cuatro yemas que no se contaminaron se
jas más pequeñas y suculentas. mantuvieron en el medio de cultivo inicial MS +
0,3 mg/l de BAP durante 3 semanas, después de las
ARRIETA, et al.: REGENERACION Y MULTIPLICACION in vitro DE LA PAPAYA 21
22 BOLETIN TECNICO ESTACION EXPERIMENTAL FABIO BAUDRIT M.
cuales se realizó el primer subcultivo a medio fres- viamente en la sección anterior. Además, se inició
co. Al cabo de tres subcultivos las yemas no proli- la cuantificación de la tasa de multiplicación de los
feraron, observándose únicamente un aumento de explantes. Los resultados obtenidos se resumen en
volumen en la base. el Cuadro 8.
Cuatro meses después de iniciada la prueba, las Los resultados anteriores mostraron una im-
yemas mostraron cierta proliferación. En este mo- portante formación de tallos pequeños (tipo C),
mento se transfirieron dos yemas a un medio MS + aunque se puede observar con el tiempo un aumen-
0,3 mg/l de BAP + 0,1 ANA y las otras dos se man- to en la formación de tallos tipo A y un aumento
tuvieron en el medio con 0,3 mg/l de BAP. constante en la tasa de multiplicación, que se evi-
dencia en el número de tallos totales formados.
En estos medios de cultivo se dieron diferen-
cias en la proliferación, dependiendo de los regula- Ante los resultados obtenidos, se realizó un se-
dores aplicados. Las yemas que se mantuvieron en gundo experimento con el fin de comprobar los re-
0,3 mg/l de BAP mostraron una multiplicación muy sultados anteriores. El material vegetal adulto utili-
baja en comparación a las cultivadas en 0,3 mg/l de zado proviene de la misma plantación que el
BAP + 0,1 mg/l de ANA. Las yemas con estos re- experimento 1. 
guladores formaron callos y brotes más definidos,
con ejes únicos de 1,0 cm. Nuevamente, se evaluó la contaminación en
cada uno de los tratamientos de desinfección. En
A los seis meses de iniciada la prueba, dado la presencia de NaOCI 0,5% se contaminaron 15 ex-
mejor apariencia y crecimiento de los tallos en el plantes (57,6%), en comparación con 5 (31,3%) en
medio con 0,3 mg/l de BAP + 0,1 mg/l de ANA, to- con 0,75% de NaOCl. Por su parte la decoloración
dos los explantes se subcultivaron en este medio. fue de 3,8% y de 6,3%, respectivamente.
Las yemas se seccionaron y se obtuvieron 19 ex-
plantes, que se clasificaron según las características Después de esta fecha no se dio más contami-
de los tallos ilustrada en la Figura 1 y descrita pre- nación en las yemas. En general se observa que el
ARRIETA, et al.: REGENERACION Y MULTIPLICACION in vitro DE LA PAPAYA 23
uso de NaOCl a 0,75% produce resultados satisfac- con material proveniente de otras zonas del país,
torios, en particular respecto a la contaminación. con el fin de estudiar su comportamiento in vitro.
Un mes después de iniciada la prueba, se observó Para ello, se realizaron dos pruebas adicionales con
un aumento en el tamaño de los primordios foliares yemas de plantas adultas procedentes de las regio-
de las yemas, las cuales son visibles a simple vista nes de Paquera y de Orotina, pero a los 12 días de
(Figura 2A) pero no hubo proliferación. Durante el iniciadas, la totalidad del material se perdió debido
primer subcultivo se eliminaron los primordios fo- a la contaminación por bacterias, aún siguiendo el
liares. mismo procedimiento de desinfección que en las
pruebas 1 y 2.
A las seis semanas se observaron pequeños
brotes en el centro de las yemas así como un engro-
samiento de las bases. No hubo formación de ca- DISCUSION
llos.
El efecto del alcohol en el proceso de desinfec-
A partir del segundo subcultivo las yemas se ción es muy evidente en los resultados obtenidos y
dividieron en dos tratamientos con reguladores. muestra la necesidad de estudiar tiempos de expo-
Una parte se inoculó en un medio MS + 0,3 mg/l de sición menores a esta sustancia o la necesidad real
BAP y la otra en MS + 0,3 mg/l de BAP + 0,1 mg/l de su aplicación, ya que afecta considerablemente
de ANA. la integridad del explante, disminuyendo en mu-
chos casos desarrollo posterior.
Después de la segunda transferencia se dio una
mayor proliferación en todas las yemas y se obser- Es interesante notar una diferencia importante
vó la formación de callo en la base (Figura 2B). En dependiendo de la citoquinina evaluada, ya que los
cada subcultivo se subdividieron los explantes. resultados obtenidos en la fase de establecimiento
Aunque en forma general se observó una menor indican la existencia de diferencias morfológicas en
proliferación en el tratamiento con ANA y BAP, la el explante. La kinetina refuerza el desarrollo de es-
formación de ejes únicos es muy baja en ambos tra- tructuras ya existentes, lo cual no ocurre con la
tamientos. Se puede decir que 4 meses después del BAP, sustancia mucho más activa que la kinetina
inicio de la prueba todos los explantes se clasifica- (Moore, 1989), que induce con facilidad la forma-
ron como tallos de tipo C. Sin embargo, se observa ción de nuevas yemas así como el rápido creci-
que conforme se incrementan los subcultivos el nú- miento de callo. En general, la kinetina refuerza el
mero de tallos de mayor tamaño y apariencia se in- desarrollo de hojas, que predominan en el explante,
crementan (Figura 2C). En general, la mayor proli- inclusive sobre el meristema de la yema, por lo que
feración se obtiene utilizando solamente BAP en el al final se observa una hoja de grandes proporcio-
medio. Pero nuevamente, es en presencia de ANA nes, debido a su dominancia en lo que respecta a
que se obtienen explantes con un desarrollo y apa- crecimiento y mobilización de nutrientes. Esta con-
riencia morfológica muy similar a las plantas obser- dición se da a expensas de la yema, que se mantie-
vadas en condicionesde campo, particularmente en ne inhibida y no crece. Este mismo fenómeno fue
el caso de las hojas (Figura 2D). observado por Guevara (1981) en un estudio previo
con yemas de plantas de 6 meses de edad en presen-
En el Cuadro 9 se presentan los resultados de cia de kinetina.
la tasa de multiplicación de los explantes desde el
inicio de la prueba. Los resultados en la fase inicial de multiplica-
ción indican que la combinación del BAP y de la
Ante la buena tasa de multiplicación observada Kinetina con la giberelina, contrariamentea lo espe-
en el cuadro anterior, se decidió iniciar el estudio rado, detiene considerablemente la regeneración de
24 BOLETIN TECNICO ESTACION EXPERIMENTAL FABIO BAUDRIT M.
ARRIETA, et al.: REGENERACION Y MULTIPLICACION in vitro DE LA PAPAYA 25
las yemas. De Winnaar (1988) considera que existe ción, añadiendo al medio ANA. Este proceso difie-
un antagonismo entre la multiplicación y la elonga- re de lo observado por Litz y Connover (1978)
ción de los tallos. La autora afirma que este podría quienes emplearon continuamente la combinación
disminuirse subcultivando las macollas en un me- de ambos reguladores (y en mayores concentracio-
dio de proliferación con 1,0 mg/l de AG3, por va- nes) para realizar todo el proceso de obtención de
rios ciclos. Sin embargo, en nuestras condiciones el tallos.
empleo de AG3 en la fase de multiplicación mues-
tra una situación completamente contraria, ya que Los resultados obtenidos con yemas pro-
los tallos no mostraron ni proliferación ni elonga- venientes de plantas adultas muestran que es posi-
ción. Además, la aplicación de ácido giberélico co- ble realizar una multiplicación masiva de este tipo
mo único regulador no fue suficiente para contra- de material. La metodología empleada, derivada de
rrestar el efecto antagónico mencionado por De los resultados obtenidos a partir del uso de plantas
Winnaar (1988), lo cual sí se logró con la combina- jóvenes de 3-4 meses cultivadas in vitro concuerda
ción BAP y ANA. bastante bien, lo que permitió ahorrar tiempo en es-
te paso. Uno de los mayores problemas lo constitu-
Estas diferencias en las respuestas de los ex- ye sin embargo, la ausencia de elongación de los ta-
plantes puede deberse a diferencias genéticas entre llos en el medio de multiplicación, que en su
las variedades utilizadas en nuestras condiciones mayoría pertenecen al tipo C (Cuadro 9), y que por
(criollas) y las del experimento de De Winnaar su tamaño no logran el desarrollo de raíces (Reuve-
("Sunrise" y "Solo"). De igual forma De Winnaar ob- ni et al, 1990). Este proceso sugiere que estos tallos
servó diferencias entre clones de un mismo cultivar. no tienen una fuerte dominancia apical, ya que en
general, tallos con esta característica logran elon-
De los resultados obtenidos se concluye que garse satisfactoriamente. Es conocido que el BAP
para la propagación clonal de las variedades crio- promueve una alta proliferación meristemática,
llas de papaya, las yemas deben establecerse prime- muchas veces en detrimento de la elongación. Las
ro en una fase de multiplicación, con utilización citoquininas antagonizan en general a la dominan-
únicamente de BAP y luego proceder a la elonga- cia apical (Moore 1989). Es posible entonces que el
26 BOLETIN TECNICO ESTACION EXPERIMENTAL FABIO BAUDRIT M.
continuo estímulo de inducción de formación de por injerto. Al respecto, Dalsaso y Guevara (1989)
yemas, causado por la presencia de BAP en el me- sólo pudieron obtener regeneración y multiplica-
dio de cultivo, se oponga a la dominancia de un so- ción in vitro de plantas de aguacate adultas del cv.
lo eje dentro de la macolla en el medio de prolife- Fuerte cuando estas cultivaron y mantuvieron en in-
ración. Se sabe en efecto, que una aplicación vernadero. El uso del mismo material (yemas), pe-
continua de BAP a una yema promueve su libera- ro cultivado en las condiciones de campo en la zo-
ción de la dominancia apical (Li y Bangerth 1992). na de Fraijanes, nunca permitió obtener más allá de
Reuveni et al. (1990) han sugerido el uso de kineti- un simple aumento de volumen del material.
na para favorecer la elongación en el medio de cul-
tivo, en sustitución del BAP, por ser menos activa La investigación desarrollada en el presente
en cuanto a proliferación axilar que la segunda. Es- trabajo ha permitido establecer un protocolo satis-
to ha sido observado en tallos originados de semi- factorio para la regeneración y multiplicación de
llas, en dónde aún en presencia de kinetina en el plantas adultas de papaya. Costa Rica se encuentra
medio ha sido observada la elongación y formación ubicada en la zona de origen de las Caricaceas, por
de raíces (Guevara 1981). Sin embargo, en las con- lo que la diversidad genética existente es muy am-
diciones de la investigación realizada en este traba- plia. De hecho, muchos cultivares obtenidos en
jo, la kinetina no ha sido satisfactoria en la elonga- otros países tienen como progenitores material ge-
ción del material, como tampoco el empleo de nético proveniente en primera instancia de Costa
giberelinas. Rica (Dalmo Giacometti, EMBRAP A, Brasil, co-
municación personal, 1988). Esta mayor variabi-
La pérdida total de material proveniente de las lidad sugiere que la respuesta al cultivo del mate-
regiones de Paquera y de Orotina evidencia la difi- rial, tanto in vitro como en el campo pueda ser muy
cultad de establecimiento de material adulto a par- diferente. Así, Carica papaya ha sido descrita como
tir de yemas tomadas directamente a partir de cam- una planta tipo monocaule, sin ramificación lateral
po. Ello confirma lo resultados obtenidos (Hallé y Oldeman 1970). Pero es muy frecuente ob-
previamente (Sancho y Guevara 1991). La disponi- servar en Costa Rica, y en forma natural, la presen-
bilidad de un invernadero de techo alto podría per- cia de múltiples ramificaciones en plantas adultas
mitir disponer de plantas bajo condiciones contro- de papaya. Estas ramificaciones laterales son las
ladas y así disponer de material con alto grado de que han sido utilizadas en el presente trabajo y se
higiene. Sin embargo, es probable que el mejor pro- están estudiando para su utilización en el protocolo
cedimiento consista en estimular el crecimiento de descrito por Reuveni et al. (1990) para enraiza-
brotes laterales de papayas adultas en producción miento de estacas.
en condiciones de campo, mediante la aplicación de
reguladores, y poder posteriormente enraizar/os se- En estos momentos, se ha continuado con los
gún la técnica descrita por Reuveni et al. (1990). Se estudios de multiplicación del material adulto y jo-
dispondría así de material adulto que se puede tras- ven, lo cual ha permitido la obtención de tasas altas
ladar y mantener en condiciones de inver nadero, de multiplicación elevadas con plantas adultas. Al
evitando los problemas de alta contaminación ob- respecto, es importante señalar el hecho de que se
servados con material de campo directamente esta- haya podido mantener en multiplicación material
blecido in vitro. Este material presentaría probable- adulto por un período prolongado de tiempo, supe-
mente ciertas condiciones de juvenilidad que ya rior al límite mencionado por Litz y Connover
han sido observadas en otras especies multiplicadas (981) de 13 subcultivos.
ARRIETA, et al.: REGENERACION Y MULTIPLICACION in vitro DE LA PAPAYA 27
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