UNIVERSIDAD DE COSTA RICA FACULTAD DE FARMACIA TESIS DE LICENCIATURA Evaluación in vitro de la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos de Impatiens hawkeri e Impatiens walleriana (Balsaminaceae) Fabián Delgado Rodríguez Carné: B12207 Comité asesor: Dra. Arlene Loría Gutiérrez (Directora) Dr. Nien Tzu Weng Huang (Asesor) Dr. Olman Hidalgo Muñoz (Asesor) 2017 i ii iii Agradecimientos a: Dirección del INIFAR (Facultad de Farmacia, Universidad de Costa Rica), por su apoyo mediante la habilitación de sus laboratorios de investigación, permiso de uso de equipos y facilitación de materiales y reactivos. Personal del LAFITEC, Laboratorio de Bioanálisis de LAYAFA y del Laboratorio de Farmacognosia (Facultad de Farmacia, Universidad de Costa Rica) por las facilidades en preparación de materiales y equipos. Dr. Carlos Morales Sánchez, botánico de la Escuela de Biología de la Universidad de Costa Rica, por su colaboración en la identificación botánica de los especímenes empleados para la preparación de los extractos. Dra. Cristina Herrera Arias, docente de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Costa Rica, por su ayuda en la adquisición de materiales y reactivos. Personal del Laboratorio de Bacteriología Médica, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, por facilitar cepas bacterianas empleadas en la presente investigación. Miembros del Comité Asesor, por su apoyo técnico a lo largo de la fase experimental y por la aceptación del tema de investigación. iv Delgado Rodríguez, Fabián. Evaluación in vitro de la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos hidroalcohólicos de Impatiens hawkeri e Impatiens walleriana (Balsaminaceae). [San José, Costa Rica], 2017. Comité Asesor: Dra. Arlene Loría Gutiérrez (Directora). Dr. Nien Tzu Weng Huang (Asesor). Dr. Olman Hidalgo Muñoz (Asesor). Resumen: El género Impatiens constituye un grupo de plantas de creciente interés farmacológico. Pese a ello, no se reporta el estudio de extractos o metabolitos de las especies Impatiens hawkeri (IH) e Impatiens walleriana (IW), las cuales tienen alta relevancia debido a su uso como plantas ornamentales. En este trabajo se presenta el primer estudio de la actividad antioxidante y antimicrobiana in vitro de los extractos hidroalcohólicos de planta entera de IH e IW obtenidos a partir de especímenes recolectados en Costa Rica. Así, mismo se comparan dichas actividades con las presentadas por el extracto hidroalcohólico de planta entera de Impatiens balsamina (IB). Especie reconocida por presentar metabolitos antimicrobianos relevantes, así como ser fuente de extractos con actividad antioxidante in vitro. Los resultados indican que el extracto de IH es el que presenta mejor actividad antioxidante in vitro, siendo el mejor candidato para el estudio de dicha actividad en modelos in vivo. Mientras que el extracto de IB es el que presenta mayor actividad antimicrobiana. El análisis de los resultados también indica que el extracto de IH es prometedor para proceder a un fraccionamiento guiado por ensayo biológico con la finalidad de aislar sus metabolitos activos dada la actividad bactericida demostrada y la escasa información disponible acerca de los metabolitos secundarios producidos por esta especie. Además, el presente trabajo constituye el primer reporte de determinación de actividad antimicrobiana para extractos de las plantas IB, IH e IW obtenidos a partir de especímenes recolectados en Costa Rica. Palabras clave: Impatiens balsamina (IB), Impatiens hawkeri (IH), Impatiens walleriana (IW), extractos, antioxidante, antimicrobiano, in vitro v Índice de contenidos: Sección Página 1.Justificación y planteamiento del problema …...………………………….…..... 1 2.Objetivo general …………………………………………………..…….…........... 6 3.Objetivos específicos …………………………………………………….……..… 6 4.Hipótesis ………..………………………………………………………………….. 6 5. Marco teórico y antecedentes ………………………………………………....... 7 5.1. Actividad antioxidante y antimicrobiana de los compuestos fenólicos de origen vegetal ..……………………………………………………………….. 7 5.1.1 Aspectos estructurales de los compuestos fenólicos de origen vegetal …………………………………………………………………….… 7 5.1.2 Métodos para la extracción de compuestos fenólicos a partir de material vegetal ……………………………………………………..……... 10 5.1.3 Métodos colorimétricos para la cuantificación de compuestos fenólicos en extractos de origen vegetal ………………………….…….. 12 5.1.4 Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos de origen vegetal ……………………………………………………………….……… 14 5.1.5 Actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos de origen vegetal ……...…………………………………………………….….……... 16 5.2. Valor antioxidante de los extractos vegetales ………………..………….. 19 5.2.1 Radicales libres y estrés oxidativo ………………………....……... 19 5.2.2 Técnicas in vitro para la determinación de la capacidad antioxidante de extractos vegetales ……………………………..…….... 23 5.3 Investigación de las plantas como fuente de nuevos agentes antimicrobianos (antibacterianos y antifúngicos) ……………….………...….. 29 5.3.1 Investigación de plantas y la necesidad de nuevos antimicrobianos …………………………………………..……….……….. 29 5.3.2 Técnicas para la determinación de la actividad antimicrobiana de extractos de origen vegetal ………….………………………..…….… 38 5.4. Clasificación taxonómica y características botánicas de las especies sujetas a estudio …………………………….…………………......................... 41 5.4.1. Clasificación taxonómica del género Impatiens ……..….…….… 41 5.4.2 Descripción botánica de las especies estudiadas …………...….. 43 5.4.2.1 Impatiens walleriana Hook. f……………………………... 43 5.4.2.2 Impatiens hawkeri Bull ………………………………….... 45 6. Metodología ………………………………………………………….……….…... 46 6.1 Recolección del material vegetal ………………………………………...… 46 6.2 Preparación de los extractos hidroalcohólicos ………………….…….….. 47 6.3 Cuantificación colorimétrica de compuestos fenólicos (fenoles totales y flavonoides totales) y determinación de actividad antioxidante in vitro ……. 48 vi 6.3.1 Determinación de compuestos fenólicos totales por el método colorimétrico de Folin–Ciocalteu ………………………………..……..… 48 6.3.2 Cuantificación colorimétrica de flavonoides…………………….... 50 6.3.3 Determinación de la capacidad secuestrante de radicales libres por el método de reducción del radical difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) 52 6.3.4 Determinación del potencial antioxidante reductor sobre ferricianuro potásico (PFRAP) ……………………………………..…….. 53 6.3.5 Determinación de la capacidad de absorción de radicales de oxigeno (ORAC) ……………………………………...………………..…... 55 6.4 Determinación de la actividad antimicrobiana in vitro ……………….…... 57 6.4.1 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) mediante el método de microdilución ……………………………………. 57 6.4.2 Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) y la concentración mínima funguicida (CMF) mediante el método de recuento en placa …………………………………………….….………… 62 6.5 Tamizaje fitoquímico ………………………………………………………… 63 6.6 Análisis estadístico de resultados …………………....………………….… 64 7. Resultados y discusión ………………………………………………………….. 65 7.1 Recolección del material vegetal ……………………………………….…. 65 7.2 Cuantificación colorimétrica de compuestos fenólicos (fenoles totales y flavonoides totales) y determinación de actividad antioxidante in vitro ….… 67 7.3 Determinación de la actividad antimicrobiana in vitro …………….…….. 82 7.4 Tamizaje fitoquímico ………………………………………………………… 98 8. Conclusiones …………………………………………………...………………… 103 9. Recomendaciones …………………………………………………………….…. 105 10. Referencias …………………………………………………..…..……………..... 106 11. Anexos …………………………………………………………….……..……...… 129 11.1 Fotos y descripción de los especímenes recolectados ………………..... 129 11.2 Precisión del procedimiento de estandarización de los inóculos ............ 137 11.3 Curvas de dosis respuesta para los controles positivos utilizados en las pruebas de microdilución …………………………………………………..…….. 140 11.4 Valores de CI50 determinados para los extractos y controles positivos sobre los microorganismos de prueba en la prueba de microdilución ………. 141 vii Índice de figuras Titulo Página Figura 1. Estructura básica y ejemplos de compuestos fenólicos de origen vegetal ………………………………………………………………….…………… 8 Figura 2. Reacción de estabilización de radicales libres (R•) por parte de compuestos fenólicos (PhOH) en la cual se da la formación de una especie reducida estable (RH) derivada del radical libre y del radical fenoxi (PhO•) ... 15 Figura 3. Generación de radical hidroxilo (OH•) a partir del peróxido de hidrógeno (H2O2) mediante reacciones de Fenton …………………………..... 15 Figura 4. Rectas estándar para la cuantificación de compuestos fenólicos ... 67 Figura 5. Gráficos del Porcentaje de secuestro o estabilización del radical DPPH (PSR) en función de la concentración de los extractos y trolox con su respectiva conversión a curvas de dosis respuesta …………………………… 68 Figura 6. Recta estándar de trolox empleada para la determinación del valor PFRAP de los extractos ……………………………………………………. 69 Figura 7. Recta de mejor ajuste para el ABCN de las soluciones estándar de trolox en función de la concentración determinada para el ensayo ORAC … 69 Figura 8. Curvas de dosis respuesta del porcentaje de inhibición del crecimiento de S. aureus en función del logaritmo decimal de la concentración de los extractos y la ceftriaxona disódica ……………………… 83 Figura 9. Curvas de dosis respuesta para el porcentaje de inhibición del crecimiento de S. epidermidis en función del logaritmo decimal de la concentración de EIB, EIHC y ceftriaxona disódica ..…………………….……. 84 Figura 10. Curvas de dosis respuesta para el porcentaje de inhibición del crecimiento de S. pyogenes en función del logaritmo decimal de la concentración de EIB, EIHC y ceftriaxona disódica …………………..….……. 85 Figura 11. Curvas de dosis respuesta para el porcentaje de inhibición del crecimiento de S. pneumoniae en función del logaritmo decimal de la concentración de EIHC, EIHN y ceftriaxona disódica …………..…….……….. 86 Figura 12. Fotografía de espécimen de Impatiens balsamina ……………….. 130 Figura 13. Fotografía de espécimen de Impatiens hawkeri (planta cultivada) 132 Figura 14. Fotografía de espécimen de Impatiens hawkeri (planta naturalizada) ………………………………………………………………………. 134 Figura 15. Fotografía de espécimen de Impatiens walleriana …………………… 136 viii Figura 16. Curvas de dosis respuesta de la ceftriaxona disódica sobre las bacterias de prueba ….……………………………………………………….……….. 140 Figura 17. Curvas de dosis respuesta de la anfotericina B sobre los microorganismos fúngicos de prueba …………………………………….…………. 140 ix Índice de tablas: Titulo Página Tabla I. Compuestos fenólicos identificados como antibacterianos o antifúngicos bajo el método de difusión en agar cilindro-placa en una cantidad de 500 µg por cilindro ……………………………………….………….. 16 Tabla II. Espectro y mecanismos de acción descritos en la literatura para los tipos de compuestos fenólicos más comunes entre las plantas ……………… 18 Tabla III. ROS y RNS relevantes en los sistemas biológicos …………………. 20 Tabla IV. Mecanismo, principales ventajas y desventajas de los métodos in vitro para la determinación de la capacidad antioxidante de extractos vegetales ……………………………..……………………………….……………. 24 Tabla V. Metabolitos secundarios aislados de especies de plantas del género Impatiens con actividad antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica) 36 Tabla VI. Niveles taxonómicos desde reino hasta género para las plantas del género Impatiens ………………………………………………………..…….. 41 Tabla VII. Cantidad de microorganismo por inóculo de prueba y condiciones de incubación para el ensayo de microdilución ………………………….…….. 59 Tabla VIII. Rango de concentraciones finales de prueba para los controles positivos según el microrganismo empleado en el ensayo de microdilución .. 60 Tabla IX. Datos de recolección del material vegetal de las especies sujetas a estudio …………………………………………………………………………… 65 Tabla X. Resultados de la determinación de compuestos fenólicos (CFT y FT) y de los ensayos in vitro empleados para evaluar la actividad antioxidante de los liofilizados …………………………………………………… 70 Tabla XI. Resultados de los ensayos in vitro para la determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos ……………………………………… 88 Tabla XII. Resultados del tamizaje fitoquímico aplicado a los extractos …... 98 Tabla XIII. Determinación de la cantidad de unidades formadoras de colonias en inóculos independientes de las cepas bacterianas de prueba …. 137 x Tabla XIV. Determinación de la cantidad de unidades formadoras de colonias en inóculos independientes de las cepas fúngicas de prueba …….. 139 Tabla XV. Valores de CI50 calculados por interpolación en curvas de dosis respuesta para los extractos y los controles positivos ………………………… 141 xi Índice de ecuaciones o fórmulas de cálculo: Titulo Página Ecuación 1. Fórmula para la determinación de la cantidad de compuestos fenólicos totales en los extractos liofilizados en términos de AG ……………. 50 Ecuación 2. Fórmula para la determinación de la cantidad de flavonoides totales en los extractos liofilizados en términos de QA ……………………..… 52 Ecuación 3. Fórmula para la determinación del porcentaje de actividad secuestrante del radical DPPH de los extractos liofilizados …………………. 53 Ecuación 4. Fórmula para la determinación del valor PFRAP de los liofilizados en términos de trolox ………………………………………………… 55 Ecuación 5. Fórmula para el cálculo del área bajo la curva neta de los gráficos de decaimiento de la fluorescencia relativa ………………………….. 56 Ecuación 6. Fórmula para la determinación del valor ORAC de los liofilizados ………………………………………………………………………….. 57 Ecuación 7. Fórmula de cálculo del porcentaje de inhibición del crecimiento de los microrganismos …………………………………………………………… 61 xii Lista de abreviaturas A: Absorbancia AB: Absorbancia del blanco ABC: Absorbancia del blanco de color o de la muestra control de la absorbancia ABCB: Área bajo la curva del blanco (metanol) ABCM: Área bajo la curva de la muestra ABCN: Área bajo la curva neta ABCNE: Área bajo la curva neta del extracto ABTS: Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) Ac: Absorbancia del control ACCC: Agricultural Culture Collection of China ACCVC: Área de Conservación Cordillera Volcánica Central ACLAP: Área de Conservación La Amistad Pacífico AG: Ácido gálico APPH: Diclorhidrato de 2,2'-Azobis(2-amidinopropano) ATCC: American Type Culture Collection ATP: Trifosfato de adenosina b: Intercepto con eje de las abscisas BHA: Butilhidróxianisol CE50 DPPH: Concentración a la que se alcanza el secuestro o estabilización del 50% del radical DPPH CFT: Compuestos fenólicos totales CI50: Concentración de sustancia que produce una inhibición del 50% del crecimiento del microorganismo de prueba CLSI: Clinical & Laboratory Standards Institute CMB: Concentración mínima bactericida CMF: Concentración mínima fungicida CMI: Concentración mínima inhibitoria Cn: Concentración Cp: Concentración de prueba de extracto CT: Concentración de trolox CUPRAC: Capacidad reductiva antioxidante cúprica (Cupric Reducing Antioxidant Capacity). DOC: Densidad óptica del control DOM: Densidad óptica de la muestra DOB: Densidad óptica del blanco DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo. DMSO: Dimetilsulfóxido DER: Porcentaje de desviación estándar relativa xiii ECL: Ensayo de quimioluminiscencia aumentada EIB: Extracto liofilizado de Impatiens balsamina EIHC: Extracto liofilizado de Impatiens hawkeri (planta cultivada) EIHN: Extracto liofilizado de Impatiens hawkeri (planta naturalizada) EIW Extracto liofilizado de Impatiens walleriana ES: Error estándar ET: Electron transfer EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FR: Fluorescencia relativa FT: Flavonoides totales. HAT: Hydrogen atom transfer HORAC: Capacidad antioxidante sobre el radical hidroxilo (Hydroxyl Radical Antioxidant Capacity). IB: Impatiens balsamina IC95%: Intervalo al 95% de confianza IH: Impatiens hawkeri IHC: Impatiens hawkeri planta cultivada IHN: Impatiens hawkeri planta naturalizada IW: Impatiens walleriana. m: Pendiente de recta de mejor ajuste MFC: Método de Folin-Ciocalteu MOPS: Ácido 4-morfolinopropanosulfónico mTOR: Mechanistic target of rapamycin MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazolio ORAC: Capacidad de absorción de radicales de oxígeno (Oxygen Radical Absorbance Capacity) PFRAP: Poder reductor antioxidante sobre ferricianuro potásico (Potassium Ferricyanide Reducing Antioxidant Power) PSR: Porcentaje de secuestro o estabilización del radical DPPH QA: Quercetina anhidra RFC: Reactivo de Folin-Ciocalteu. RNS: Especies reactivas de nitrógeno (Reactive Nitrogen Species) ROS: Especies reactivas de oxigeno (Reactive Oxygen Species) r: Coeficiente de correlación r2: Coeficiente de determinación SINAC: Sistema Nacional de Áreas de Conservación. TEAC: Actividad antioxidante equivalente a trolox (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). TPTZ: 2,4,6-Tri(2-piridil)-S-triazina TRAP: Parámetro de capacidad captadora total del radical peroxilo (Total xiv Peroxyl Radical Trapping Antioxidant Parameter). TRL: Trolox UFC: Unidades formadoras de colonias UV-vis: Ultravioleta-visible. VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 1. Justificación y planteamiento del problema El género de plantas Impatiens constituye uno de los más extensos en lo que a número de especies se refiere (1). Dentro de la literatura existen diversos reportes de plantas de dicho género que se caracterizan porque sus extractos o algunos de sus metabolitos secundarios han demostrado actividades biológicas que incluyen efecto antipruriginoso, antiinflamatorio, antianafiláctico, antinociceptivo, hipoglicemiante, citotóxico, antimicrobiano, antioxidante, entre otros; esto ya sea mediante estudios in vitro o in vivo (2-23). Dentro de dichos efectos biológicos, resulta de especial interés la actividad antimicrobiana, dado que el descubrir nuevas fuentes de agentes con dicha actividad biológica constituye un aspecto de alta relevancia, considerando que la salud pública se enfrenta a un acelerado proceso de desarrollo de infecciones bacterianas y fúngicas de difícil manejo con los recursos farmacológicos disponibles en la actualidad (24-26). Esta situación ha creado la necesidad de proceder a la investigación para el descubrimiento de nuevos agentes antimicrobianos que sean útiles para el tratamiento de este tipo de patologías (27-31). La Organización Mundial de la Salud ha reconocido su preocupación por la diseminación de microorganismos patógenos capaces de generar infecciones contagiosas y persistentes mientras el descubrimiento de nuevos antimicrobianos sigue siendo un proceso lento y reducido (32). Es por estos antecedentes, que el descubrimiento de nuevos antimicrobianos es considerado como uno de los principales retos en lo que respecta a la investigación para el descubrimiento de nuevos medicamentos (31). Cabe mencionar que las especies bacterianas Escherichia coli y Staphylococcus aureus se encuentran dentro de la lista de agentes patógenos que más preocupación generan dentro de la Organización Mundial de la Salud (33). También destaca la bacteria Pseudomonas aeruginosa, la cual puede ser responsable de infecciones del tracto respiratorio, del torrente sanguíneo, del tracto 2 urinario y de heridas quirúrgicas a nivel intrahospitalario. Las infecciones por estas bacterias han sido consideradas como una amenaza seria para la salud de pacientes hospitalizados por parte de Centers for Disease Control and Prevention de los Estados Unidos (34). En lo que corresponde a patógenos fúngicos, tanto Candida albicans como Aspergillus spp. forman parte del grupo de microorganismos de este tipo que mayor relevancia poseen por su carácter patógeno para la salud humana, debido a la diseminación mundial de cepas capaces de producir infecciones de difícil manejo con los antifúngicos que se emplean actualmente para su tratamiento (35- 36). Ante estas circunstancias, resulta de interés que extractos y metabolitos de especies del género Impatiens hayan demostrado actividad antimicrobiana. Un ejemplo de ello son los extractos de partes áreas de I. balsamina para los cuales se encuentra reportada una significativa actividad antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica) (13-14), resultados que son análogos a los que se reportan para los extractos de partes áreas y planta entera de I. bicolor (19,21). El principal metabolito secundario responsable de la actividad antimicrobiana de I. balsamina es el compuesto fenólico 2-metoxi-1,4-naftoquinona (11,15,37-39). El compuesto 2-metoxi-1,4-naftoquinona se caracteriza por su actividad contra a C. albicans, reportándose incluso su uso en un ensayo clínico como el principio activo de un enjuague bucal para el tratamiento profiláctico de la candidiasis oral en pacientes infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) o que utilizan prótesis dentales (40). Los resultados de dicho ensayo clínico indican que el enjuague bucal con 2-metoxi-1,4-naftoquinona promueve una reducción significativa de las células viables de C. albicans presentes en la cavidad oral de los pacientes tratados (40). Estos antecedentes dejan claro que las plantas del género Impatiens representan una fuente potencial de componentes activos contra microorganismos patógenos, lo cual es una necesidad en la actualidad y un aspecto de relevancia en 3 materia de investigación para el descubrimiento de nuevos medicamentos. Por lo tanto, es justificable el continuar investigando para definir qué otras especies del género Impatiens pueden ser una probable fuente de agentes antimicrobianos. Como se detalla más adelante, existen otras especies del género Impatiens capaces de producir metabolitos antimicrobianos que incluyen la 2-metoxi-1,4- naftoquinona, siendo importante el destacar que la mayor parte de estos metabolitos corresponden a compuestos fenólicos (3,6,15,41-46), lo que confiere relevancia a la cuantificación de este tipo de metabolito en los extractos de las plantas del género Impatiens. Dentro de los compuestos fenólicos con actividad antimicrobiana hallados en las plantas del género Impatiens, destacan la quercetina y el kaempferol, los cuales son flavonoides (41-44). Por lo tanto, también resulta de interés el cuantificar este tipo de metabolito en los extractos de las plantas del género Impatiens que se vayan a emplear para la determinación de su actividad antimicrobiana. Otra actividad relevante reportada para extractos de plantas del género Impatiens, la constituye la capacidad antioxidante determinada in vitro mediante los métodos de reducción del radical difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) y la determinación del potencial reductor sobre ferricianuro potásico, esto específicamente para las plantas I. balsamina, I. textori e I. bicolor, las cuales han sido empleadas en la medicina tradicional de China, para los dos primeros casos, y de Pakistán en el caso de la última especie mencionada (10,13-14,22,41,47). La capacidad antioxidante atribuible a productos de origen vegetal se encuentra normalmente relacionada con la cantidad de compuestos fenólicos presentes en ellos, incluyendo dentro de este grupo a los flavonoides (48-51). En plantas del género Impatiens se ha encontrado una correlación entre la concentración de compuestos fenólicos (fenoles totales y flavonoides), determinada bajo los métodos colorimétricos de Folin-Ciocalteu y de formación de complejos de flavonoides con cloruro de aluminio, y la capacidad antioxidante demostrada in vitro 4 (13-14). Esto constituye otra justificante para proceder a la cuantificación de los compuestos fenólicos de los extractos de las plantas del género Impatiens. Debe tomarse en cuenta que el uso de productos con una significativa actividad antioxidante puede constituir un factor de protección contra los efectos nocivos para la salud que tiene el estrés oxidativo, resultado de la generación de altos niveles de radicales libres (51). El estrés oxidativo se encuentra relacionado con el desarrollo de patologías tales como: cáncer, envejecimiento, cataratas, artritis reumatoide, enfermedades autoinmunes, neurodegenerativas, cardiovasculares y preeclamsia, entre otras (48-51). Ante estos antecedentes, se ha planteado que el uso de antioxidantes exógenos, como los compuestos fenólicos de origen vegetal, constituyen un factor protector ante la posibilidad de desarrollar estrés oxidativo, esto al ser capaces de estabilizar a los radicales libres (51). Considerando la necesidad de nuevos agentes antimicrobianos y la relevancia de los agentes antioxidantes, así como los antecedentes que reportan dichas actividades para plantas del género Impatiens, puede resultar de interés el establecer si dichos efectos pueden ser evidenciados de manera significativa por extractos de las especies del mismo género de mayor difusión a nivel mundial (52-53). En Costa Rica se da el cultivo de las dos especies del género Impatiens de más importancia en cuanto a la extensión de cultivo como plantas de uso ornamental. Estas corresponden a I. hawkeri e I. walleriana. En el caso de la última, esta se encuentra dentro de las primeras tres plantas de mayor producción a nivel mundial para su uso como ornamento (52), existiendo además de su forma para explotación agrícola otra naturalizada que se encuentra extendida ampliamente dentro del territorio costarricense (53). A pesar de la importancia de I. walleriana e I. hawkeri como plantas ornamentales, son escazas las publicaciones relacionadas con actividades biológicas atribuibles a estas dos especies. Ante esta situación, considerando además lo anteriormente expuesto sobre la necesidad de agentes antimicrobianos y la relevancia de los antioxidantes, surge como un aspecto de interés el evaluar si los 5 extractos de ambas plantas presentes en Costa Rica son capaces de ejercer efectos antimicrobianos y antioxidantes in vitro análogos a los descritos para otras especies de su género. Esto con la finalidad de establecer un precedente que defina la viabilidad de que en investigaciones posteriores se proceda al aislamiento de los componentes responsables de ambas actividades biológicas, o bien, si vale la pena proceder a estudios in vivo. En el caso de la presente investigación, se procede a la selección del material vegetal sujeto de estudio con un enfoque quimiotaxónomico, el cual consiste en la selección de plantas considerando la existencia de otras de su género o familia cuyos extractos o metabolitos poseen una actividad biológica de particular interés (54). Por lo tanto, la selección de las especies I. walleriana e I. hawkeri para su estudio se justifica considerando la existencia de otras de su género cuyos extractos o metabolitos secundarios han evidenciado efectos antimicrobianos y antioxidantes in vitro. También debe considerarse la importancia agrícola de estas plantas, lo que podría significar la posibilidad de uso no solo como ornamento, sino también como plantas fuente de extractos o metabolitos con actividad antimicrobiana y antioxidante. En síntesis, con la investigación del presente trabajo se busca definir si los extractos de las plantas I. walleriana e I. hawkeri son capaces de evidenciar efectos antimicrobianos y antioxidantes tomando como fundamento los resultados de ensayos in vitro descritos para otras plantas del género Impatiens. Esta investigación constituye un acercamiento a las especies I. walleriana e I. hawkeri, con la finalidad de estudiar los potenciales efectos antimicrobianos y antioxidantes de extractos hidroalcohólicos obtenidos a partir de estas plantas. Además, la selección para el estudio de ambas actividades biológicas se basa en la necesidad expuesta en la literatura consultada de hallar nuevas fuentes de sustancias con propiedades antimicrobianas, así como la relevancia de contar con fuentes de antioxidantes exógenos. 6 2. Objetivo general: Evaluar mediante ensayos in vitro la actividad antioxidante y antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica) de los extractos hidroalcohólicos de planta entera de las especies Impatiens hawkeri (IH) e Impatiens walleriana (IW) a partir de especímenes recolectados en Costa Rica. 3. Objetivos específicos: 3.1 Determinar la cantidad de compuestos fenólicos (fenoles totales y flavonoides totales) presentes en los extractos hidroalcohólicos de planta entera de IH e IW mediante los métodos colorimétricos de Folin–Ciocalteu y formación de complejos en solución con cloruro de aluminio. 3.2 Determinar la actividad antioxidante in vitro de los extractos hidroalcohólicos de planta entera de IH e IW mediante los ensayos de reducción del radical difenil-2- picrilhidrazil (DPPH), la determinación del poder reductor antioxidante sobre ferricianuro potásico (PFRAP) y la capacidad absorbente de radicales de oxígeno (ORAC). 3.3 Evaluar la actividad antimicrobiana in vitro de los extractos hidroalcohólicos de planta entera de IH e IW sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans y Aspergillus niger por medio del ensayo de microdilución. 4. Hipótesis: Los extractos hidroalcohólicos obtenidos por maceración de la planta entera de las especies I. walleriana e I. hawkeri poseen actividad antioxidante y antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica) in vitro considerando que extractos o diversos tipos de metabolitos secundarios de otras especies de su género, (I. balsamina, I. bicolor, I. glandulifera, I. noli-tangere, I. textori e I. parviflora) poseen dichas actividades biológicas. 7 5. Marco teórico y antecedentes: 5.1. Actividad antioxidante y antimicrobiana de los compuestos fenólicos de origen vegetal 5.1.1 Aspectos estructurales de los compuestos fenólicos de origen vegetal Los compuestos fenólicos corresponden a los metabolitos secundarios más abundantes entre las plantas (55). Estructuralmente, estos compuestos se caracterizan por presentar uno o más anillos aromáticos con uno o más grupos hidroxilo, siendo posible encontrar en la naturaleza, compuestos fenólicos que varían desde moléculas simples, como los ácidos fenólicos, hasta estructuras poliméricas, como los taninos (55). Este tipo de compuesto generalmente constituye un mecanismo de defensa para las plantas ante la exposición a la radiación ultravioleta o el ataque por organismos patógenos, parásitos o predadores. Dada su amplia extensión entre los miembros del reino Plantae, los compuestos fenólicos se encuentran como un componente común entre los alimentos de origen vegetal (55). Los compuestos fenólicos corresponden a moléculas generadas a través de la ruta biosintética del ácido shikímico. En el caso particular de los flavonoides, estirilpironas, estilbenos, flavolignanos e isoflavonoides, también existe participación de la ruta del acetato en su biosíntesis; mientras que para el caso de las quinonas terpenoides, hay un involucramiento tanto de las rutas del isopreno como la del ácido shikímico en su proceso de biosíntesis (56). En la figura 1 se presenta el núcleo básico de los compuestos fenólicos hallados entre las plantas. Cabe mencionar que los ácidos fenólicos, flavonoides y taninos, son los que se encuentran con mayor frecuencia, mientras que lignanos, estilbenos, cumarinas, curcuminoides, quinonas y otros se encuentran con menor frecuencia entre las plantas (55,57). Los flavonoides constituyen los compuestos fenólicos más comunes entre las plantas. Se caracterizan por presentar el núcleo básico de flavano, el cual posee 15 átomos de carbono dispuestos en tres anillos (A, B y C) (55). Los flavonoides se clasifican en seis grupos, los cuales corresponden a flavonas, flavonoles, flavanoles, flavanonas, isoflavonas y antocianinas, lo cual depende del grado de oxidación del 8 anillo C. Otras diferencias estructurales dependen de sus patrones de hidroxilación, metoxilación, prenilación y glicosilación (55). Por otra parte, los ácidos fenólicos se clasifican en dos clases las cuales corresponden a derivados del ácido benzoico (como el ácido gálico) y los derivados del ácido cinámico (como los ácidos cumárico, cafeico y ferúlico) (55). Los taninos se dividen en dos tipos, hidrolizables y condensados. En el caso de los primeros, son moléculas con una unidad central de glucosa u otro poliol esterificado con múltiples unidades de ácido gálico (galotaninos) o ácido elágico (elagitaninos). Además, este tipo de compuestos pueden sufrir reacciones intermoleculares, lo que puede dar origen a compuestos oligómeros de pesos moleculares de entre 2000 a 5000 Dalton (55,58). Por su parte, los taninos condensados o protoantocianinas corresponden a oligómeros o polímeros de unidades de flavan-3-ol unidas entre sí por enlaces carbono-carbono conocidos como enlace interflavano (55). Figura 1. Estructura básica y ejemplos de compuestos fenólicos de origen vegetal. 9 Figura 1. Estructura básica y ejemplos de compuestos fenólicos de origen vegetal. (Continuación). 10 5.1.2 Métodos para la extracción de compuestos fenólicos a partir de material vegetal Los compuestos fenólicos pueden ser extraídos de material vegetal fresco, congelado o seco, antes de proceder a ello, pueden aplicarse procesos de molienda y tamizaje para homogenizar el tamaño de partícula del material vegetal con la finalidad de aumentar la eficiencia del proceso de extracción (55,59). La extracción de los compuestos fenólicos suele basarse en el uso de solventes, debido a su facilidad de acceso, eficiencia y amplia aplicabilidad, siendo determinantes para la eficiencia del proceso factores tales como la polaridad del disolvente, el tiempo y la temperatura de extracción, la relación muestra-disolvente y la naturaleza química de los compuestos a extraer (55). Dada la diversidad estructural de los compuestos fenólicos, no existe en la actualidad un método universal para su extracción, es así como dependiendo del disolvente elegido, se obtendrá un extracto que cuenta con una mezcla de aquellos compuestos fenólicos solubles en él, pudiendo estar presentes en su composición otras sustancias como carbohidratos, proteínas y ácidos grasos también solubles en el disolvente de extracción elegido (55). Solventes como el metanol, etanol, acetona y acetato de etilo, así como sus combinaciones entre sí o con agua, son los que normalmente se emplean para la extracción de los compuestos fenólicos más comunes (55). El uso de metanol como solvente se asocia una mayor eficiencia en el proceso de extracción de compuestos fenólicos de bajo peso molecular a partir de material vegetal, mientras que la acetona constituye un solvente útil para la extracción eficiente de compuestos fenólicos de mayores pesos moleculares. Debe indicarse que el etanol constituye un solvente adecuado, no solo por servir para una extracción eficiente de los compuestos fenólicos, sino también por su mayor seguridad para la salud humana (55,60-65). Un aumento de la temperatura del solvente durante el proceso de extracción puede favorecer un aumento de la solubilidad del tipo de compuesto a extraer. Además, se puede reducir la viscosidad y tensión superficial del solvente, lo que favorece su ingreso a la matriz vegetal con los compuestos a extraer, resultando de 11 todo ello un aumento de la eficiencia del proceso de extracción (55). Sin embargo, debe tomarse en cuenta que altas temperaturas en el proceso de extracción pueden favorecer la hidrólisis y oxidación de los compuestos termolábiles, lo cual reduce la eficiencia del proceso de extracción de los compuestos fenólicos, un caso típico son las antocianinas, las cuales son degradadas a temperaturas superiores a los 70 °C (55). En general suelen emplearse temperaturas entre los 20 °C y 50 °C en la extracción de compuestos fenólicos para reducir la probabilidad de descomposición de los mismos (55,66-67). Las técnicas convencionales de extracción, como la maceración y la extracción mediante aparato Soxhlet son generalmente considerados como de baja eficiencia y procesos que favorecen la contaminación ambiental debido a los grandes volúmenes de solvente que deben ser empleados y al tiempo prolongado de extracción (55). En años recientes se han desarrollado técnicas más eficientes que requieren el tener a disposición equipos específicos, tal y como la extracción asistida con microondas, extracción asistida con ultrasonido, extracción con agua subcritica, extracción con fluidos supercríticos y la extracción con fluidos presurizados. Estos métodos han sido aplicados con éxito para la extracción de compuestos fenólicos (55). Cabe mencionar, que en el caso de los reportes de investigaciones en las cuales se determina la concentración de compuestos fenólicos de extractos de plantas del género Impatiens, y en las que además se define su capacidad antioxidante o antimicrobiana, los solventes de extracción empleados corresponden a metanol, etanol, éter de petróleo, n-hexano, cloroformo y acetato de etilo (13-14,21- 22,68). A pesar de lo indicado en el párrafo anterior, en relación a las técnicas de extracción de compuestos fenólicos, debe indicarse que las técnicas que han sido empleadas para la obtención de extractos con cantidades representativas de compuestos fenólicos así como con actividades antioxidantes y antimicrobianas significativas, a partir de plantas del género Impatiens, corresponden a la extracción asistida por ultrasonido, maceración, agitación a temperatura ambiente y extracción con aparato Soxhlet (13-14,21-22,68). 12 5.1.3 Métodos colorimétricos para la cuantificación de compuestos fenólicos en extractos de origen vegetal Con respecto a los métodos de cuantificación de compuestos fenólicos, estos suelen clasificarse en los que permiten una cuantificación del contenido total de compuestos fenólicos y los que permiten cuantificar un tipo particular de compuesto fenólico. En ambos casos, la cuantificación es influenciada por la naturaleza del extracto, la presencia de sustancias interferentes y el estándar de cuantificación seleccionado (55,65). Es importante indicar que los métodos actuales para la estimación total de compuestos fenólicos no son perfectos debido a la posibilidad de interferencia de otras sustancias distintas a los compuestos fenólicos. Sin embargo, estos siguen siendo ampliamente utilizados (55,69). Para la cuantificación colorimétrica de compuestos fenólicos totales suele recurrirse al método de Folin-Ciocalteu (MFC). Para este se emplea el reactivo de Folin-Ciocalteu (RFC), el cual es una disolución de los ácidos fosfomolíbdico y fosfowolfrámico, los cuales consisten en complejos metálicos hexavalentes cuya coloración en medio acuoso es amarilla (70-71). La cuantificación de fenoles totales bajo este método está basada en la reacción de reducción-oxidación en la cual se da la reducción de los iones metálicos Mo+6 y W+6 mediante la captación de uno o dos electrones de los compuestos fenólicos (especies sujetas a oxidación). Como resultado de la reacción en medio alcalino, se da la formación de complejos entre los iones metálicos reducidos y los compuestos fenólicos, los cuales se caracterizan por su coloración azul, pudiendo ser determinados espectrofotométricamente a una longitud de onda de máxima absorbancia cercana a los 760 nm, siendo la intensidad de la absorbancia de la solución proporcional a la cantidad de compuestos fenólicos presentes en el medio (69,60). Para la determinación cuantitativa de compuestos fenólicos se debe utilizar un patrón de referencia (compuesto fenólico) que suele ser catequina, ácido gálico (el más utilizado), ácido tánico o pirogalol con base al cual se expresa la concentración de compuestos fenólicos presentes en el extracto sujeto a prueba (69,72). Para ello se procede a la construcción de una recta estándar graficando la 13 absorbancia en función de la concentración del patrón de referencia elegido. Con la ecuación obtenida por regresión lineal, se establece por interpolación la concentración de compuestos fenólicos del extracto sujeto a análisis (74). Dentro de los métodos de cuantificación de un tipo específico de compuestos fenólicos, se encuentra el método de determinación de flavonoides totales mediante el método colorimétrico basado en la formación de complejos entre los flavonoides y el ión Al3+ presente en disoluciones cloruro de aluminio. El método está basado en la formación de complejos por la interacción entre el ión Al3+ y los electrones deslocalizados de los flavonoides. Estos complejos son estables en disolución acuosa a pH básico, dotando a las mismas de una coloración rosácea cuya intensidad puede determinarse espectrofotométricamente a una longitud de onda de 410 nm o 510 nm en el caso de que se emplee quercetina como estándar (13-14,73- 76). El método de análisis es similar al descrito para la determinación de compuesto fenólicos totales, puesto que se establece una curva de calibración estándar usando un flavonoide patrón (generalmente quercetina) en términos del cual se reporta la concentración de compuestos fenólicos en el extracto. La misma se establece por interpolación en la curva de calibración (13-14,73-75). Los métodos colorimétricos tienen como ventaja su facilidad, rapidez y bajo costo, lo cual explica su amplia aplicación, siendo los más utilizados para la determinación de compuestos fenólicos. Sin embargo, en todos ellos hay riesgo de presencia de interferencias en el extracto sujeto a análisis que pueden favorecer la sobre o subcuantificación del tipo de metabolito valorado, lo que puede limitar el resultado a una estimación (55). Vale la pena mencionar, que en el caso de los extractos de plantas del género Impatiens cuya actividad antioxidante y antimicrobiana han sido determinadas, la cuantificación de compuestos fenólicos se ha limitado a la determinación de compuestos fenólicos totales, mediante MFC, y de flavonoides totales mediante el método de formación de complejos en solución con cloruro de aluminio (13-14,21-22). 14 5.1.4 Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos de origen vegetal La importancia de determinar los compuestos fenólicos en extractos de plantas para las cuales se quiere establecer propiedades medicinales, radica en el hecho de que este tipo de compuesto puede ser capaz de evidenciar, en estudios in vitro e in vivo, distintas actividades biológicas que incluyen los efectos antipruriginoso, antianafiláctico, antiarteriosclerótico, antiinflamatorio, depresor del sistema nervioso central, antioxidante, antimicrobiano, hipoglicemiante, entre otros (2-3,6-9,55,77-80). A pesar de la diversidad de actividades biológicas atribuibles a los compuestos fenólicos, su efecto antioxidante constituye la principal atribución benéfica asignada a los mismos, gracias a la capacidad que tienen de interactuar químicamente con los radicales libres que pueden estar implicados en el desarrollo del estrés oxidativo (49-50,55). El estrés oxidativo es una condición en la cual en el organismo se presentan niveles nocivos de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno debido a que los mecanismos antioxidantes endógenos no son capaces de compensar la alta generación de estos productos con propiedades oxidantes. Dentro de estas especies se encuentran radicales libres como el radical hidroxilo, hidroxiperoxilo, anión superóxido, entre otros (49,55). Los radicales libres presentan una alta reactividad debido al electrón desapareado que presentan en su estructura electrónica. Debido a ello es posible que se dé la reacción con proteínas, lípidos y ácidos nucleicos de las células que componen el organismo, lo cual puede tener efectos nocivos para la salud, como el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, cáncer, arteriosclerosis, accidentes cerebrovasculares isquémicos, procesos neurodegenerativos, diabetes, entre otros (81-82) (para más detalle sobre el estrés oxidativo ver la sección 5.2.1). Los compuestos fenólicos actúan como un agente antioxidante exógeno al estabilizar los radicales libres mediante la donación de un átomo de hidrógeno proveniente de uno de sus grupos hidroxilo (Hydrogen Atom Transfer (HAT)), o bien mediante la donación de un electrón (Electron Transfer (ET)) (49,55,83). Por ambos mecanismos los compuestos fenólicos son sometidos a oxidación, generándose 15 radicales fenoxi, los cuales son más estables que el radical libre al cual se le dona el átomo de hidrógeno o el electrón debido a la deslocalización electrónica presente en su estructura. La menor reactividad del radical fenoxi hace menos probable el ataque oxidativo sobre biomoléculas como los ácidos nucleicos, lípidos y proteínas, esenciales para la sobrevivencia celular, en comparación con el radical libre sujeto a estabilización (49,55). R• + PhOH → RH + PhO• (HAT) R• + PhOH → R- + PhO• + H+ (ET) Figura 2. Reacciones de estabilización de radicales libre (R•) por parte de compuestos fenólicos (PhOH) en la cual se da la formación de una especie reducida estable derivada del radical libre (RH o R-) y del radical fenoxi (PhO•). La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos no se debe únicamente a su efecto estabilizador sobre los radicales libres. Los compuestos fenólicos dihidroxilados pueden interrumpir las reacciones de Fenton que permiten la generación del radical hidroxilo a partir de peróxido de hidrógeno a nivel celular, al formar complejos con los iones Fe2+ o Cu2+ que pueden estar involucrados en dicho tipo de reacción (55,84). En la figura 3 se ilustran las reacciones de Fenton en las cuales pueden participar los iones mencionados anteriormente. H2O2 + Cu+ ó Fe2+ → Cu2+ ó Fe3+ + OH- + OH• H Figura 3. Generación de radical hidroxilo (OH•) a partir del peróxido de hidrógeno (H2O2) mediante reacciones de Fenton Los flavonoides presentan otros mecanismos antioxidantes. Por ejemplo, poseen efecto inhibitorio sobre enzimas involucradas en la oxidación de ácidos grasos de la membrana celular para formar metabolitos proinflamatorios, como lo es el caso de la enzima ciclooxigenasa (78). Además, los flavonoides han demostrado la capacidad de promover la síntesis de glutatión, lo que se ha asociado a la activación de diversos factores de transcripción que incluyen a AP-I, NF-κβ y AREs/EpREs, dando como resultado un aumento de la producción de la enzima ɣ-glutamilcistein sintetasa, la cual cataliza el paso limitante de la síntesis del glutatión, el antioxidante endógeno más importante de las células (85). 16 5.1.5 Actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos de origen vegetal Si bien es posible realizar una extensa revisión de compuestos fenólicos responsables de la actividad antimicrobiana en extractos de diversas plantas, vale la pena hacer énfasis en los descubiertos en plantas del género Impatiens. A partir de I. balsamina han sido aislados los compuestos fenólicos kaempferol, quercetina, escopoletina, 2-metoxi-1,4-naftoquinona, lawsona y metilen-3,3'-bilawsona, los cuales poseen actividad antibacteriana o antifúngica in vitro (3,11,15,37-39,42,88-90). Cabe mencionar que la 2-metoxi-1,4-naftoquinona, la lawsona y la metilen-3,3'- bilawsona son compuestos fenólicos del tipo naftoquinona, mientras que el kampferol y la quercetina, son flavonoides; por otra parte, la escopoletina es una cumarina. Los compuestos 2-metoxi-1,4-naftoquinona y kampferol han sido identificados también en I. glandulifera (89-90), mientras la lawsona o 2-hidroxi-1,4-naftoquinona, ha sido identificada también en I. noli-tangere (89). Para mayor detalle sobre el espectro de actividad antimicrobiana de los extractos de plantas del género Impatiens, así como de sus metabolitos secundarios aislados con dicha actividad, conviene revisar la sección 5.3. Rauha et al (46), ha determinado la actividad antibacteriana y antifúngica de diversos compuestos fenólicos puros bajo la técnica de difusión en agar cilindro- placa, sobre cepas bacterianas de Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, S. aureus, P. aeruginosa, E. coli y fúngicas de Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans. En la tabla I se resumen los compuestos fenólicos capaces de mostrar actividad antimicrobiana en una cantidad de 500 µg por cilindro de acuerdo con los resultados de Rauha et al. (46). Tabla I. Compuestos fenólicos identificados como antibacterianos o antifúngicos bajo el método de difusión en agar cilindro-placa en una cantidad de 500 µg por cilindro. Compuesto fenólico Microorganismos cuyo crecimiento es inhibido Ácido cafeico Pseudomonas aeruginosa Ácido gálico P. aeruginosa, Micrococcus luteus Ácido protocatéquico P. aeruginosa, M. luteus Flavona Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, M. luteus, Escherichia coli, P. aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans 17 Tabla I. Compuestos fenólicos identificados como antibacterianos o antifúngicos bajo el método de difusión en agar cilindro-placa en una cantidad de 500 µg por cilindro (Continuación). Compuesto fenólico Microorganismos cuyo crecimiento es inhibido Naringenina S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, M. luteus, E. coli, P. aeruginosa, S. cerevisiae Naringina P. aeruginosa, M. luteus (+)-catequina S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa (+)-catequina S. aureus, Aspergillus niger Metilgalato M. luteus, E. coli, A. niger Morina S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, M. luteus, E. coli, P. aeruginosa Kaempferol S. aureus, B. subtilis Basado en: Rauha JP, Remes S, Heinonen M, Hopia A, Kähkönen M, Kujala T, Pihlaja K, Vuorela H, Vuorela P. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compounds. Int J Food Microbiol. 2000 May; 56(1):3-12. Debe indicarse que existen compuestos fenólicos que presentan una actividad antibacteriana y antifúngica superior a la de los agentes antibióticos o antifúngicos disponibles actualmente en la práctica clínica. Ejemplo de ello son las catequinas del té verde, las cuales han demostrado mayor potencia que la tetraciclina y la vancomicina frente a Bacillus cereus (91), mientras el compuesto 2- metoxi-1,4-naftoquinona aislado de I. balsamina, ha evidenciado mayor potencia que la anfotericina B frente a Candida albicans y Aspergillus fumigatus (15). A pesar de ello, la literatura es enfática al indicar que la aplicación más probable que se le podría dar a los compuestos fenólicos de origen vegetal radica en su uso como agentes sinérgicos de los antibióticos actualmente utilizados, aumentando su eficacia y reduciendo la dosis normalmente requerida, lo que puede disminuir la posibilidad de efectos adversos (79,92-94). Finalmente, debe indicarse que el espectro antimicrobiano general por tipo de compuesto fenólico ha sido sujeto a revisión junto con su mecanismo de acción. En la tabla II se resume el espectro de los compuestos fenólicos por tipo y por mecanismo de acción descrito en la literatura. Como se puede ver, los flavonoides son el tipo de compuesto fenólico con mayor espectro antimicrobiano. 18 Tabla II. Espectro y mecanismos de acción descritos en la literatura para los tipos de compuestos fenólicos comunes entre las plantas. Tipo de compuesto fenólico Espectro Mecanismos de acción descritos Referencias Flavonoides Bacterias: Vibrio cholera, Streptococcus mutans, Clostridium jejuni, Clostridium perfringes, E.coli, B. cereus, H.pylori, S.aureus, Lactobacillus acidophilus, Actinimyces naeslundii, Provetella oralis, Porphyromonas gingivalis, Provetella melaninogenica, Fusobacterium, Chlamydophila pneumonia. Microorganismos fúngicos: C. albicans, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum Inhibición de la formación de biopelículas y de la movilidad de colonias, desestabilización de la membrana externa en bacterias Gram negativas, efecto agregativo sobre bacterias. 79,95-97 Taninos Bacterias: Salmonella spp. Staphylococcus spp., Helicobacter spp., E. coli, Bacillus spp., Clostridium spp., Campylobacter spp., Listeria spp. Microorganismos fúngicos: Candida parapsilosis Desestabilización de la membrana plasmática, aumento de la permeabilidad de membrana, inhibición de enzimas extracelulares, acción quelante sobre iones empleados como micronutrientes, precipitación de proteínas de membrana. 79,98-99 Ácidos fenólicos Bacterias: S.aureus, Listeria monocytogenes, E.coli, P. aeruginosa. En bacterias Gram negativas evidencian inducción de muerte celular por rotura de la membrana externa. 79,100-101 Lignanos Bacterias: Mycobacterium tuberculosis Inhibición de la síntesis de ácido micólico (desestabilización de la pared celular) 79,102 19 5.2 Valor antioxidante de los extractos vegetales. 5.2.1 Radicales libres y estrés oxidativo El organismo es capaz de producir una serie de sustancias conocidas como especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS) las cuales se caracterizan por ser sustancias químicamente inestables y ser radicales libres o bien precursores de estos (82). Los radicales libres, por su parte, son especies químicas altamente reactivas e inestables que se caracterizan por tener un electrón desapareado en su estructura electrónica. Sin embargo, debe indicarse que en la literatura suele emplearse el término radical libre para referirse a las especies radicalarias propiamente dichas o bien a sus precursores (82,103). Los radicales libres suelen ser producidos de forma regulada a nivel celular con la finalidad de mantener la homeostasis. Estas sustancias son producidas en distintos procesos celulares normales o bien pueden ser generadas como respuesta a estímulos ambientales que incluyen la exposición a radiaciones ionizantes, el consumo de cigarrillo y exposición a sustancias químicas promotoras de la producción de radicales libres, caracterizándose por poseer una vida media del orden de milisegundos a nanosegundos (82,104). Son diversos los procesos por los que en el organismo se pueden formar ROS y RNS, en la tabla III se enlistan los ROS y RNS más relevantes en los sistemas biológicos. Los radicales libres y sus precursores son agentes oxidantes que tienen funciones importantes en los procesos de fosforilación oxidativa responsables de la generación de energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) al actuar como transportadores de electrones. Por otra parte, son empleados por los citocromos 450 para proceder al metabolismo de xenobióticos, mientras las isoformas de la enzima ciclooxigenasa emplean radicales libres para inducir la oxidación de ácidos grasos de membrana y proceder a la síntesis de prostaglandinas y leucotrienos necesarios para la homeostasis, dada su injerencia en diversos procesos fisiológicos (50,82). Estas sustancias también son producidas por los macrófagos y linfocitos citotóxicos como mecanismos para inducir la muerte celular en microorganismos patógenos y células cancerosas (82). 20 Tabla III. ROS y RNS relevantes en los sistemas biológicos Especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) Representación química Observaciones Radical superóxido (ROS) O2 • ¯ Generado por el metabolismo mitocondrial. Radical hidroxilo (ROS) OH• Altamente reactivo, producido en condiciones de sobrecarga de hierro o similares. Peróxido de hidrogeno (ROS) H2O2 Producido en una amplia cantidad de procesos celulares, precursor del radical hidroxilo. Peróxido orgánico o radical peroxilo (ROS) ROOH Reacciona con iones de metales de transición para formar otras especies reactivas. Oxígeno singlete (ROS) 1O2 Especie altamente reactiva formada durante la fotosensibilización (exposición a luz ultravioleta). Ozono (ROS) O3 Presente como contaminante ambiental, es un precursor del oxígeno singlete. Radical óxido nítrico (RNS) NO• Neurotransmisor y potente regulador de la presión arterial, bajo condiciones patológicas es un fuerte agente oxidante. Ácido peroxinitroso (RNS) ONOOH Forma protonada del peroxinitrito Dióxido de nitrógeno (RNS) NO2 Captado como contaminante ambiental por el organismo. Adaptado de: Devasagayam TP, Tilak JC, Boloor KK, Sane KS, Ghaskadbi SS, Lele RD. Free radicals and antioxidants in human health: current status and future prospects. J Assoc Physicians India. 2004 Oct; 52: 794-804. Como es evidente en la tabla III, diversos son los procesos que pueden favorecer la generación de radicales libres. Entre ellos se tienen los procesos metabólicos llevados a cabo a nivel mitocondrial, a través de enzimas como la xantina oxidasa, procesos metabólicos en peroxisomas, procesos inflamatorios, la fagocitosis, liberación de ácido hipocloroso por neutrófilos, el metabolismo del ácido araquidónico, el metabolismo de azucares, la producción de óxido nítrico a partir de L-arginina, la isquemia y el ejercicio físico, los cuales constituyen factores endógenos que promueven la producción de ROS y RNS (49,105-107). Por otra parte, factores como la contaminación ambiental, la exposición a agentes químicos 21 (pesticidas, disolventes, fármacos y ozono) y la energía ionizante constituyen promotores externos de la producción de ROS y RNS (49). En el cuerpo humano saludable, la generación de ROS y RNS se mantiene controlada por distintos mecanismos antioxidantes, de modo que la misma no llegue a niveles que resulten nocivos y puedan desencadenar estados patológicos (49,82,105). Dichos mecanismos incluyen la presencia de antioxidantes producidos por el organismo como es caso del glutatión, o bien aquellos obtenidos en la dieta como las vitaminas E y C, los compuestos fenólicos de origen vegetal y el mismo glutatión obtenido de fuentes exógenas (49,82,105,108). La presencia de sustancias antioxidantes en los sistemas biológicos es acompañada de la acción de enzimas que convierten a los ROS y RNS en especies más estables (49,82,105). El peroxinitrito puede reaccionar con el glutatión para producir nitrito que posteriormente es convertido en nitrato por interacción con la oxihemoglobina de los eritrocitos tal y como sucede con el radical óxido nítrico (106,109-110). El nitrato obtenido es químicamente estable, mientras el glutatión es oxidado a glutatión disulfuro, el cual es convertido nuevamente a glutatión por la enzima glutatión reductasa, de modo que se puede repetir el ciclo y conservar la actividad antioxidante del glutatión (105,109). El citocromo C y la enzima superóxido dismutasa convierten al radical superóxido en oxígeno molecular, siendo un producto secundario del proceso el peróxido de hidrógeno, el cual es convertido en agua por las enzimas catalasa y glutatión peroxidasa (105). En el caso de las vitaminas C y E y los compuestos fenólicos obtenidos por fuentes exógenas, estas actúan como reductores de los radicales libres convirtiéndose en radicales de baja reactividad en comparación con los que estabilizan, esto debido a la deslocalización electrónica presente en su estructura (55,111). Cuando los mecanismos antioxidantes anteriormente mencionados son insuficientes para compensar la generación de ROS y RNS por alguno de los procesos anteriormente descritos, estos pueden llegar a niveles nocivos para las células y ser la causa de cuadros patológicos. Esta condición es la que se conoce 22 como estrés oxidativo (49,82,105). Bajo estas condiciones, los ROS y RNS son capaces de reaccionar con distintas moléculas fundamentales para la sobrevivencia celular, que incluyen lípidos (peroxidación lipídica y perdida de integridad de membrana), proteínas (modificación de aminoácidos, rotura de estructura primaria mediada por radicales libres, entrecruzamientos por reacciones con productos de peroxidación lipídica), ADN y ARN (modificación de bases nitrogenadas, delecciones, roturas de cadenas, entrecruzamiento del ADN) y carbohidratos (producción de α y β dicarbonilos los cuales son agentes mutagénicos) (49). Por los mecanismos descritos, no es extraño que el estrés oxidativo se asocie a procesos patológicos. Esta condición ha sido asociada a más de 100 enfermedades, así como al aceleramiento de los procesos de envejecimiento (49). Ejemplos de enfermedades cuya etiología puede radicar en el estrés oxidativo corresponden a la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, aterogénesis, enfermedad arterial coronaria, remodelamiento cardiaco, artritis reumatoide, accidente cerebro vascular isquémico, diabetes y cáncer (82,112-113). Ante las implicaciones que puede tener para la salud el estrés oxidativo, ha existido particular interés en investigar fuentes de antioxidantes. Dentro de esta línea de investigación destaca el estudio de los alimentos de origen vegetal, así como de los extractos de plantas empleadas en la medicina tradicional de distintas regiones con la finalidad de encontrar nuevas fuentes ricas en antioxidantes (81,114-117), más aun considerando los reconocidos efectos benéficos demostrados por el uso de antioxidantes en la salud humana, en especial a nivel cardiovascular (118). El descubrimiento del importante valor que pueden tener las plantas como fuente de moléculas o extractos con alta actividad antioxidante ha planteado la posibilidad de desarrollar nuevos productos fitoterapéuticos que incluyen el desarrollo de productos farmacéuticos derivados de plantas (“plant-derived pharmaceuticals”) con multicomponentes de origen vegetal (mezcla de extractos) y suplementos dietéticos (82). 23 5.2.2 Técnicas para la determinación de la capacidad antioxidante in vitro de extractos vegetales Es importante destacar que existen diversos métodos para la determinación de la actividad antioxidante de extractos de origen vegetal, existiendo diferencias entre el mecanismo del ensayo (efecto quelante sobre iones de metales de transición, actividad reductora, actividad secuestrante de radicales libres) y la complejidad de la prueba (número de pasos en el procedimiento, tipo de reactivos, rapidez de la prueba) (119-121). Por lo anterior, el uso de un solo método suele ser insuficiente para valorar la actividad antioxidante de los extractos, por lo que se suele obtener información de mayor valor al emplear más de un método (119,122). Los métodos para la determinación de la actividad antioxidante pueden clasificarse según el tipo de técnica en tres categorías a saber: espectrofotométricos, cromatográficos y electroquímicos (120). Los métodos espectrofotométricos se basan en cambios de absorbancia o de la intensidad de la fluorescencia de soluciones con radicales libres o con sustratos que sufren ataques radicalarios por ROS presentes en el medio. Estos cambios son debidos a la adición de sustancias con actividad antioxidante que estabilizan los radicales presentes en solución (120). Los métodos cromatográficos suelen emplearse previamente a los espectrofotométricos, siendo utilizados para detectar y cuantificar un componente con actividad antioxidante de interés (120). En el caso de los métodos electroquímicos o voltamétricos estos pueden ser aplicados de distintas maneras, siendo los mismos agrupados en tres tipos: voltametria cíclica, biamperometría y amperometría (120). Dentro los tres tipos de métodos mencionados, los más utilizados por su sencillez, rapidez y fácil disponibilidad de equipos son los espectrofotométricos (120). Entre los métodos espectrofotométricos, los más empleados son los basados en cambios de absorbancia que pueden ser detectados por espectroscopia ultravioleta- visible (UV-vis), debido a la mayor factibilidad de contar con detectores UV-vis que, con otros más especializados, como es el caso de los detectores de fluorescencia (120). En la tabla IV se resumen las ventajas y desventajas de los principales 24 métodos espectrofotométricos para la determinación de actividad antioxidante in vitro. Tabla IV. Mecanismo, principales ventajas y desventajas de los métodos in vitro para la determinación de la capacidad antioxidante de extractos vegetales. Método Mecanismo Ventajas Desventajas Referencias ORAC Inhibición de la reacción de oxidación de un marcador fluorescente por un radical peroxilo. Puede adaptarse a agentes antioxidantes hidrófilos o lipófilos. Automatizable Reproducibilidad sensible a la temperatura. Requiere de detectores de fluorescencia. 120,123-127 TRAP Inhibición de la reacción de oxidación de un marcador fluorescente o que presenta un pico de absorbancia a una longitud de onda detectable Posibilidad de uso de agentes iniciadores del proceso oxidativo de carácter lipídico. Permite valorar la actividad antioxidante en muestras de plasma. Alta variabilidad en el punto final entre laboratorios. Es un método lento que demanda experiencia y pericia. Solo para antioxidantes que prolongan el periodo de iniciación del proceso oxidativo. Requiere de detector de fluorescencia. 120,123,128- 130 FRAP Generación de un complejo colorido entre el Fe2+ y TPTZ por reducción del Fe3+ por el agente antioxidante de prueba Simple, rápido y robusto. Bajo costo. Automatizable. No considera el efecto antioxidante del glutatión en extractos. Existe riesgo de asumir punto final antes de tiempo. La reducción del Fe3+ no es un mecanismo antioxidante fisiológicamente relevante. 120,123 CUPRAC Variante de FRAP en la que se sustituye Fe3+ por Cu2+ y TPTZ por batocuproina o neocuproina Considera el efecto antioxidante del glutatión en extractos. Simple, rápido y robusto. Automatizable. Existe riesgo de asumir punto final antes de tiempo. La reducción del Cu2+ no es un mecanismo antioxidante fisiológicamente relevante. 120,123 25 Tabla IV. Mecanismo, principales ventajas y desventajas de los métodos in vitro para la determinación de la capacidad antioxidante de extractos vegetales. (Continuación). Método Mecanismo Ventajas Desventajas Referencias ABTS o TEAC Decoloración de soluciones de ABTS•+ por adición de agente antioxidante donador de un átomo de hidrógeno Simple y rápido. Puede llevarse a cabo con la mayoría de solventes orgánicos y en medio acuoso. Automatizable El radical ABTS•+ no está presente en sistemas fisiológicos. En algunos casos el punto final se alcanza lentamente. Existe riesgo de asumir el punto final antes de tiempo 120,123,131- 133 HORAC Inhibición de la generación del radical hidroxilo por quelación del ión Co2+ que participa en reacciones de Fenton. Consecuente inhibición de la oxidación de fluoresceína. Robusto, buena reproducibilidad y linealidad. Automatizable. Se limita a evaluar de manera preponderante la actividad antioxidante debida a la acción quelante sobre iones de metales de transición. Requiere de detector de fluorescencia 119-120,134 ECL Atenuación de la luminiscencia debido a la estabilización de radicales libres que producen dicho fenómeno al reaccionar con un marcador como el luminol Automatizable. No apto para mezclas e antioxidantes (solo para moléculas puras). Requiere de detector de luminiscencia. 121-123 Método de β-caroteno ácido linoleico/die no conjugado Reducción de la tasa de decoloración de soluciones de β-caroteno inducida por oxidación por reacción con un radical peroxilo Automatizable La decoloración del β-caroteno puede darse por temperatura, exposición a la luz y radicales libres. Se prefiere crocina por su mayor especificidad de reacción con radicales libres. 123,135-137 26 Tabla IV. Mecanismo, principales ventajas y desventajas de los métodos in vitro para la determinación de la capacidad antioxidante de extractos vegetales. (Continuación). Método Mecanismo Ventajas Desventajas Referencias PFRAP Reducción del ferricianuro potásico a ferrocianato de potasio que reacciona con cloruro de hierro III para formar el complejo ferrocianuro férrico de coloración azul. Método sencillo en cuanto equipo analítico. El método ha sido optimizado para evitar pasos de calentamiento y centrifugación presentes en el método convencional. Requiere control del pH. Pretratamiento de la muestra puede requerir calentamiento y centrifugación (método convencional). La reducción del Fe3+ no es un mecanismo antioxidante fisiológicamente relevante. 120,138-139 DPPH Decoloración de las disoluciones del radical DPPH por su reducción por un agente antioxidante. Simple y rápido. Automatizable. No requiere pretratamiento de la muestra. Efectivo para determinar el perfil antioxidante de extractos de origen vegetal. No requiere fuente externa de radicales libres. Riesgo de presencia de componentes del extracto que absorban a la longitud de onda de máxima absorbancia del radical DPPH. El radical DPPH no está presente en sistemas bilógicos y por su estabilidad no se comporta como los que están presentes en ellos. El radical DPPH presenta impedimento estérico por lo que solo puede reaccionar con moléculas relativamente pequeñas. 120-121,123 27 Es evidente que son múltiples los métodos existentes para la determinación de la actividad antioxidante de extractos de origen vegetal. Existen diversas revisiones que discuten cual es el mejor método. Sin embargo, no existe un consenso claro entre los autores, lo que puede introducir confusión a la hora de seleccionar un método (121). En el caso de los extractos de plantas del género Impatiens, se tienen que los liofilizados, obtenidos a partir del extracto por maceración con etanol al 70% v/v de hojas y tallos de I. balsamina, poseen una significativa actividad antioxidante in vitro, inclusive superando al butildihidroxianisol (BHA), empleando el método de DPPH (13). La fracción obtenida con n-hexano a partir del extracto metanólico de planta entera de I. bicolor Royle ha evidenciado una importante capacidad antioxidante mediante el método DPPH, que en parte se debe a la presencia del compuesto 2-(1-naftil)acetofenona (140). Resultados análogos son reportados para las partes áreas de I. bicolor (21), los cuales se caracterizan por tener dentro de sus componentes, glucósidos de flavonoides derivados de la naringenina, kaempferol y quercetina (41). Por otra parte, el extracto metanólico obtenido a partir de la planta entera de I. textori Miq, especialmente la fracción generada por la partición con éter etílico demuestra una significativa actividad antioxidante de acuerdo con los resultados del ensayo de reducción de DPPH y la determinación del potencial reductor mediante el ensayo de reducción de ferricianuro potásico (PFRAP) (22). Ante estos antecedentes es claro que los métodos de DPPH y PFRAP son los más empleados para la determinación de la actividad antioxidante de extractos de plantas del género Impatiens. Por lo tanto, dichos métodos pueden ser seleccionados para evaluar la actividad antioxidante de extractos de plantas del mismo género cuya actividad antioxidante aún no ha sido determinada. Así las cosas, vale la pena hacer un breve repaso sobre el mecanismo de ambos métodos. En el caso del método de DPPH, las disoluciones metanólicas y etanólicas de dicho radical libre se caracterizan por presentar un pico de absorbancia cercana a los 515 nm y 520 nm de longitud de onda respectivamente (141-142), además 28 exhiben una coloración violeta intensa que se reduce estequiométricamente con la cantidad de electrones transferidos a los radicales DPPH del medio, lo cual es proporcional a la cantidad de antioxidantes presente en el medio de reacción (142). Esto permite la estimación de la capacidad secuestrante de radicales del agente antioxidante evaluado por medio de espectrofotometría UV-Vis usando además un estándar de referencia como el butilhidroxianisol (BHA), ácido ascórbico o trolox cuya actividad antioxidante será comparada con la sustancia antioxidante sujeta a prueba (13, 141-142). En el ensayo PFRAP, la actividad antioxidante es determinada mediante la reducción del ferricianuro potásico a ferrocianuro potásico. Este último entra en coordinación con el ión Fe+3 libre para formar un complejo que produce disoluciones de color azul con un pico de absorbancia máxima a los 700 nm (138). La magnitud de la densidad óptica de las soluciones del complejo ferrocianuro férrico formado es proporcional a la actividad reductora de la sustancia evaluada (14). Con la finalidad de ampliar la información que se puede obtener sobre la actividad antioxidante de los extractos de las plantas del género Impatiens analizados en el presente estudio, se llevó a cabo el ensayo ORAC. En este método, un radical libre del tipo peroxilo, obtenido a partir de AAPH (diclorhidrato de 2,2-azobis-2- amidinopropano), reacciona con un marcador fluorescente, como la fluoresceína o la β-ficoeritrina, atenuando la intensidad de la fluorescencia emitida por el mismo (119,123). En presencia de un antioxidante que estabilice al radical libre, la tasa de decaimiento de la fluorescencia es disminuida. El efecto antioxidante es medido como la integral entre las curvas obtenidas al graficar la intensidad de la fluorescencia emitida por las disoluciones de prueba en función del tiempo. Una de las curvas se obtiene con el agente antioxidante de prueba y la otra con una solución blanco sin el agente antioxidante (124-126). 29 La actividad antioxidante determinada mediante ORAC para un extracto de prueba puede ser expresada como equivalentes de trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílio) (119,127). Para lo anterior se establece una regresión lineal o cuadrática, en la cual se grafica la concentración de trolox en función de la integral entre las curvas obtenidas con disoluciones de distinta concentración de trolox y la de la solución blanco sin trolox (123). Con el valor de la integral obtenida con el extracto, se establece por interpolación su actividad antioxidante equivalente a trolox (123). 5.3 Investigación de las plantas como fuente de nuevos agentes antimicrobianos (antibacterianos y antifúngicos) 5.3.1 Investigación de plantas y la necesidad de nuevos antimicrobianos Los fármacos antimicrobianos han constituido una herramienta de trascendental importancia en el desarrollo de la medicina moderna, permitiendo avances en el tratamiento de cuadros infecciosos, traumas, cirugías y pacientes inmunosuprimidos (143), así como un incremento en la expectativa de sobrevivencia infantil (144); sin embargo actualmente existe un acelerado proceso de resistencia a los antimicrobianos por parte de bacterias y microorganismos fúngicos (24,25), debido en parte a su uso excesivo e inapropiado (24), a la generación de biopelículas por parte de los microorganismos (145-146) y al desarrollo de mutaciones en los genes que codifican para las dianas de los fármacos antimicrobianos (147). Todo esto ha provocado preocupación hasta el punto de ser considerado un serio problema de salud pública en la actualidad (26), constituyendo un riesgo en especial para los pacientes con algún grado de inmunosupresión, así como para aquellos que se encuentran bajo tratamiento contra el cáncer o para la prevención del rechazo de trasplantes de órganos (24). Además, en el caso de las infecciones producidas por bacterias con multirresistencia a los antibióticos, se tiene que estas no se limitan al ser del tipo nosocomial, siendo posible su propagación a nivel comunitario con una alta tasa de mortalidad en ambos casos (28). 30 Los antecedentes señalan que es imperativo el desarrollo de nuevos medicamentos antibióticos para el tratamiento de infecciones producidas por microorganismo resistentes a los recursos farmacológicos actualmente disponibles (26-31). Sin embargo, la velocidad con la que se descubren nuevos fármacos de este tipo resulta inadecuada considerando lo acelerado del proceso de desarrollo de resistencia a los antibióticos (27,148). No debe dejarse de lado que el desarrollo de un antimicrobiano seguro y eficaz es un proceso lento por sí mismo, considerando la necesidad de que este demuestre un amplio espectro sobre microorganismos patógenos con un efecto mínimo sobre dianas moleculares humanas, lo cual a su vez constituye un factor para la alta probabilidad de fracaso en el proceso de desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos (24). El declive de la eficiencia de las terapias actuales contra las bacterias patógenas, impulsado por el desarrollo de resistencia a los antibióticos, así como la escasez de nuevos tipos de moléculas capaces de sustituirlos o complementarlos, han constituido elementos de presión para un mayor impulso de la investigación en lo que respecta al descubrimiento de mejores agentes antibacterianos (31). Estos antecedentes han promovido que esta línea de investigación sea considerada como uno de los principales retos en el siglo XXI para las disciplinas involucradas en el desarrollo de nuevos medicamentos (31). No es extraño que en la literatura se señalen a especies bacterianas contra los cuales es preciso el desarrollo de más y mejores antibióticos de manera expedita. Dentro de ellas se pueden mencionar a Clostridium difficile (149-150), Staphylococcus aureus meticilina resistente (144-145,151), Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae (5,155-157), Mycobacterium tuberculosis (144,154), Neisseria gonorrhoeae, bacterias Gram negativas portadores de enzimas metalo betalactamasas (144) y Helicobacter pylori (155). La Organización Mundial de la Salud ha definido las especies bacterianas que mayor preocupación generan a nivel mundial debido a la resistencia a los antibióticos que presentan, así como al aumento de su prevalencia tanto a nivel intrahospitalario como comunitario. Dichas especies 31 corresponden a Escherichia coli, Klebsiella penumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Salmonella no typhi, Shigella spp. y Neisseria gonorrhoeae (33). Por otro lado, existen reportes relacionados con cepas de microorganismos fúngicos, incluidos Candida spp. y Aspergillus spp., que han desarrollado resistencia a los agentes antifúngicos y cuya prevalencia ha aumentado en los últimos años a escala global (35). Inclusive existe un estudio en el que se señala a Candida spp. como uno de los principales agentes etiológicos de infecciones del torrente sanguíneo en pacientes hospitalizados de los Estados Unidos (36). Ante este panorama debe tomarse en cuenta que los medicamentos antifúngicos disponibles para su uso clínico son reducidos por lo que se ha planteado la necesidad de fortalecer la investigación para el descubrimiento de este tipo de agentes terapéuticos (78), más aun considerando el desarrollo de resistencia por parte de cepas de Candida spp. y Aspergillus spp. contra los fármacos azólicos, equinocandinas y en menor grado frente a los políenos (35,156-158). Dentro de las estrategias utilizadas para el descubrimiento de nuevos antimicrobianos también se encuentra la síntesis de moléculas derivadas de fármacos actualmente utilizados en la práctica clínica (29). Sin embargo, los productos naturales constituyen la principal fuente de agentes antimicrobianos, inclusive superando en número a los de origen totalmente sintético (159), siendo especialmente importantes los metabolitos secundarios de molécula pequeña sintetizados por bacterias y microorganismos fúngicos (29,160-161). Esto puede deberse a que las moléculas de origen sintético pueden tener obstáculos de permeabilidad sobre las membranas de los microorganismos, mientras las moléculas de origen natural corresponden comúnmente a productos evolutivamente seleccionados para permear las membranas de los microorganismos blanco (159). La investigación para el aislamiento de productos naturales activos contra microorganismos puede enfrentar barreras como una baja tasa de síntesis por parte de los organismos que los producen, la posibilidad de que estos pierdan la habilidad de sintetizarlos, inestabilidad dada la complejidad de sus estructuras químicas e 32 incluso el no ser efectivos clínicamente una vez que han sido purificados (29). Sin embargo, este último punto puede eventualmente resolverse a través de la modificación de su estructura para obtener moléculas con un mejor perfil farmacológico y mayor espectro antimicrobiano (162). Por otra parte, las plantas aún constituyen un elemento de investigación como potenciales agentes en la lucha contra los microorganismos patógenos resistentes a los antibióticos, al punto de despertar el interés de las autoridades en salud humana y animal para su potencial uso terapéutico (163). Son múltiples los reportes de investigaciones publicados en los últimos diez años en los cuales se estudian plantas de diversas regiones con la finalidad de buscar nuevas fuentes de antimicrobianos. Un ejemplo es el descubrimiento de la actividad antibacteriana y antifúngica de extractos de plantas de: Finlandia (46), Yemen (164-165), India (166), Sudáfrica (167), islas del Caribe (168), Camerún (169), Amazonas (170) y otras empleadas en la medicina tradicional china (171-172). Este tipo de investigación es útil en cuanto a que orientan la selección de plantas para proceder al estudio posterior del aislamiento y elucidación estructural de sus moléculas activas, mismas que posteriormente pueden ser sometidas al análisis de su relación estructura- actividad para permitir el desarrollo de nuevos antimicrobianos seguros y eficaces (171). Ejemplo de lo expuesto en el párrafo anterior lo constituye el descubrimiento de la actividad bactericida frente a H. pilory demostrada por los extractos etanólicos de las plantas Curcuma amada Roxb., Mallotus phillipinesis (Lam) Muell., Myrisctica fragrans Houtt. y Psoralea corylifolia L., empleadas tradicionalmente en Pakistán para el tratamiento de malestares gastrointestinales (155). Además, se ha determinado que la combinación de los aceites esenciales de las plantas Eucalyptus globulus, Dianthus caryophyllus, Mentha piperita y Thymus vulgaris permite la obtención de fórmulas con un significativo efecto bactericida frente a Escherichia coli O157:H7, las que pueden ser potencialmente empleadas para el tratamiento de la colibacilosis en aves de corral (163). 33 Por otra parte, los extractos acuosos de frutos (como: arándanos, uvas y frambuesas), y de hierbas (como: albahaca, tomillo, col rizada, romero, jengibre y cúrcuma), son capaces de inhibir el sistema Quorum sensing de la bacteria Chromobacterium violaceum en ensayos in vitro (173). Los investigadores responsables de estos resultados señalan que este descubrimiento plantea la posibilidad de establecer nuevas estrategias en el combate de bacterias resistentes a antibióticos a través de la inhibición de sus sistemas Quorum sensing (173). Resultados análogos se reportan para el extracto etanólico al 70% v/v de la planta Phyllanthus amarus (174), tradicionalmente empleada para el tratamiento de enfermedades como disentería, diarrea, fiebre entre otras (175). Los productos naturales provenientes de plantas también pueden funcionar como coadyuvantes en la terapia con los antibióticos disponibles en la práctica clínica gracias a que favorecen un incremento del efecto antimicrobiano por medio del desarrollo de un efecto sinérgico (79,176-177). Un ejemplo de esto es el aumento de la actividad antibacteriana de la penicilina frente a S. aureus en combinaciones con epigalocatequin galato, una molécula de origen vegetal (176). En general, los productos naturales obtenidos de plantas, capaces de funcionar de manera sinérgica con los antimicrobianos convencionales, actúan a través de mecanismos que incluyen su efecto sobre blancos conocidos para los fármacos utilizados en la práctica clínica que han sido modificados por mutaciones, inhibición de las enzimas que desactivan los antibióticos, incremento de la permeabilidad bacteriana e inhibición de bombas de eflujo (177-178). Cabe indicar que anteriormente se hizo referencia a los compuestos fenólicos de origen vegetal que han evidenciado actividad antimicrobiana. Sin embargo, deben tomarse en cuenta otros tipos de metabolitos, como alcaloides, compuestos terpénicos y péptidos de origen vegetal que también pueden ser capaces de evidenciar actividad antimicrobiana (179). Cabe hacer énfasis en la actividad antimicrobiana reportada para metabolitos y extractos de plantas del género Impatiens. Las fracciones obtenidas con éter de petróleo, éter dietílico, cloroformo y metanol a partir del extracto producido de tallos 34 secos de I. balsamina usando éter de petróleo (60-90 °C) como solvente de extracción, han demostrado actividad antimicrobiana contra Penicillium italicum (ACCC 30399), Penicillium digitatum (ACCC 30389), Escherichia coli (ACCC 01630), Shigella boydii (ACCC 04121), Bacillus subtilis (ACCC 10618), Staphyloccocus aureus Rosenbach (ACCC 01338), Saccharomyces cerevisiae Hansen (ACCC 21135), Candida utilis (ACCC 20059), Aspergillus niger (ACCC 30391), Aspergillus oryzae (ACCC 30789) de acuerdo al método de difusión en agar cilindro-placa para la determinación de actividad antimicrobiana (14). En el caso de los extractos etanólicos al 70 % v/v de hojas y tallos de I. balsamina, estos han sido capaces de evidenciar actividad antimicrobiana bajo el método de difusión en agar cilindro-placa. Dichos resultados demuestran que el extracto obtenido a partir de las hojas de I. balsamina posee mayor potencia antimicrobiana, así como efecto sobre un mayor número de microorganismos patógenos en comparación con el obtenido con el extracto de tallos, siendo microorganismos de prueba Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Candida albicans, Clostridium perfringens (13). Sin embargo, los resultados de la investigación a la que se hace referencia señalan que solo sobre Escherichia coli es posible observar mayor potencia antimicrobiana por parte del extracto obtenido con tallos en comparación al obtenido con hojas de Impatiens balsamina. Los investigadores atribuyen la tendencia observada en los resultados a la mayor concentración de compuestos fenólicos y flavonoides totales determinada en el extracto de hojas en comparación con la concentración de dichas sustancias presente en el extracto de tallos (13). También se han determinado los valores de CMI (concentración mínima inhibitoria) y CMB (concentración mínima bactericida) bajo el método de dilución en caldo de cultivo, esto para los extractos obtenidos con diversas secciones anatómicas de I. balsamina, así como con diferentes disolventes de extracción, sobre cepas de H. pylori (39). Los resultados obtenidos con extractos hidroalcohólicos al 95% v/v de diversas partes anatómicas de I. balsamina, señalan, que en general, el 35 extracto de frutos es el de menores valores de CMI y CMB sobre H. pylori, mientras el de planta entera es el que mayor valor tiene para esos parámetros (39). El extracto metanólico de planta entera I. bicolor no ha evidenciado actividad antibacteriana contra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Shigella flexenari, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa o Salmonella typhi (20). Sin embargo, este extracto exhibe actividad antifúngica contra Microsporum canis y Fusarium solani al igual que su fracción acuosa. En el caso de las fracciones obtenidas con n-hexano y diclorometano, presentan actividad solo contra M. canis, mientras que las obtenidas con acetato de etilo y n-butanol evidencian efecto antifúngico sobre Aspergillus flavus y M. canis, a través del ensayo de difusión en agar (20). Sin embargo, en otro estudio se indica que los extractos de partes áreas de I. bicolor obtenidos con hexano, cloroformo, acetato de etilo y metanol poseen actividad antimicrobiana frente Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis y Escherichia coli bajo el método de difusión en agar (21). Distintos metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana han sido aislados de las plantas del género Impatiens, siendo estos los responsables de la actividad antimicrobiana evidenciada por sus extractos. En la tabla V se hace indicación de los metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica) identificados en diferentes especies de plantas del género Impatiens. Es evidente que las plantas de dicho género pueden constituir una fuente de nuevos antifúngicos y antibióticos más aun considerando el reporte de un ensayo clínico para uno de sus metabolitos. Específicamente, el compuesto 2- metoxi-1,4-naftoquinona ha demostrado eficacia para el tratamiento profiláctico de la candidiasis oral en pacientes con VIH y con prótesis dentales (40), lo cual demuestra la relevancia que pueden tener las plantas del género Impatiens para la investigación en la búsqueda de nuevos antimicrobianos. 36 Tabla V. Metabolitos secundarios aislados de especies de plantas del género Impatiens con actividad antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica). Metabolito Especie (sección anatómica†) Espectro Referencias 2-metoxi-1,4- naftoquinona I. balsamina (TP) I. glandulifera (H, R) Bacterias: Escherichia coli, Staphyloco- ccus aureus, Helicobacter pylori, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis. Microorganismos fúngicos: Rhodotorula glutinis, Aspergillus niger, Candida albicans 15,37-40,88- 89 Lawsona I. balsamina (F, CR) I. noli-tangere (H) Bacterias: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus 3,38,88-89 Metilen-3,3′- bilawsona I. balsamina (H) Bacterias: Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis. 38 Kaempferol I. balsamina (F) I. bicolor (H) I. parviflora (H) I. glandulifera (F) I. textori (F) Bacterias: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Propionibacterium acnes 6,42- 44,46,180 Quercetina I. balsamina (F) I. bicolor (H) I. textori (F) I. parviflora (H) Bacterias: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Propionibacterium acnes 6,41-43,46 180 Ácido cafeico I. parviflora (H) Bacterias: Pseudomonas aeruginosa 43,46 37 Tabla V. Metabolitos secundarios aislados de especies de plantas del género Impatiens con actividad antimicrobiana (antibacteriana y antifúngica). (Continuación). Metabolito Especie (sección anatómica†) Espectro Referencias Escopoletina I. balsamina (CR) Bacterias: Mycobacterium tuberculosis, Salmonella typhi. 86,181 Péptido Ib- AMP-1 I. balsamina (S) Bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium, Streptococcus faecalis, Micrococcus luteus, Proteus vulgaris. Microorganismos fúngicos: Candida albicans 182-185 Péptido Ib- AMP-3 I. balsamina (S) Microorganismos fúngicos: Aspergillus flavus 186 Péptido Ib-AMP-4 I. balsamina (S) Bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis, Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae 182,187-188 †TP: toda la planta; H: hojas; R: Raíz; CR: Cultivo de raíces in vitro; S: Semilla; F: Flor. Como se puede ver en la tabla V, los metabolitos antimicrobianos reportados en distintas especies de plantas del género Impatiens no se limitan a una porción anatómica específica. Destaca además el hecho de que los siete primeros metabolitos enlistados en la tabla V, corresponden a compuestos fenólicos, siendo el kaempferol y la quercetina flavonoides. Es importante indicar que existe otro péptido, además de los mencionados en la tabla V, con actividad antimicrobiana. Este corresponde a Ib-AMP-2, sin embargo, la actividad demostrada in vitro se ha limitado 38 a microorganismos fúngicos que son patógenos de plantas de interés para la agricultura y no de seres humanos (182). 5.3.2 Técnicas para la determinación de la actividad antimicrobiana de extractos de origen vegetales Los métodos disponibles para el estudio de la actividad antimicrobiana de extractos de plantas suelen limitarse al ensayo de dilución o su variante de microdilución (diluciones en microplacas) y al ensayo de difusión en agar (189). En el caso del último, este se fundamenta en la difusión de las sustancias de prueba a través del medio de cultivo sólido en el cual crece un microrganismo de interés. Si las sustancias de prueba tienen actividad antimicrobiana se observará una zona en la cual no hay crecimiento del microorganismo alrededor del sito de aplicación de la sustancia de prueba. El diámetro de dicha área es proporcional a la actividad antimicrobiana de la sustancia evaluada (13-14). Como desventajas, se tiene que el ensayo de difusión en agar es útil solo para aquellas sustancias capaces de difundir a través del agar solidificado, por lo que no es apto para determinar la actividad antimicrobiana de sustancias lipofílicas (189). Con respecto a la técnica de dilución, esta consiste en la mezcla de un medio de cultivo inoculado con el microorganismo, con la sustancia de prueba a una concentración conocida de la misma. Dicho medio puede ser liquido (caldo de cultivo) o puede solidificarse posteriormente (189). Para este ensayo deben prepararse una serie diluciones de distinta concentración de la sustancia de prueba que se mezclaran con el medio inoculado de la manera descrita anteriormente, una vez que la mezcla es incubada se procede de determinar la turbidez, absorbancia o fluorescencia (en caso de usar un marcador de metabolismo celular como MTT, resazurina o fluoresceína) para cada recipiente con sustancia de prueba a distinta concentración. Con dichos datos es posible construir una curva de dosis respuesta para determinar el valor de CI50, o bien, se puede determinar la CMI. Esta última también puede determinarse visualmente, siendo aquella concentración del antimicrobiano evaluado para la cual no es visible el crecimiento del microorganismo de prueba (189). 39 El método de dilución presenta la ventaja de brindar datos de CMI, CMB, CMF e CI50 que usualmente no se obtienen con la prueba de difusión en agar, también puede ser empleado para determinar dichos parámetros tanto para sustancias lipofílicas e hidrofílicas (189). Sin embargo, el método de dilución presenta desventajas como la posibilidad de errores en la preparación de las distintas diluciones de las sustancias de prueba, se requieren cantidades considerablemente mayores de las sustancias de prueba y de los estándares usados como control positivo. Además, se requiere de mayor espacio (no aplican para la técnica de microdilución), además es más costoso que el método de difusión en agar (189-190). A pesar de las desventajas mencionadas para el método de dilución, es fundamental considerar que muchas pueden ser subsanadas por medio de su adaptación a micrométodo (prueba de microdilución) (190). Para este método se emplean microplacas estériles de poliestireno de 96 pozos. En cada uno de ellos se colocan las diluciones de las sustancias de prueba en medio de cultivo líquido inoculado con una cantidad estandarizada de microorganismo de prueba, pudiéndose evaluar la disminución del crecimiento microbiano con una sola lectura de turbidez, absorbancia o fluorescencia, esto posteriormente a la incubación de la microplaca bajo condiciones adecuadas para el crecimiento microbiano (189-190). Dadas estas ventajas, no es extraño que en la literatura se reporte el uso creciente de este método para evaluar la actividad antimicrobiana de distintos tipos de sustancias, incluyendo extractos de origen vegetal (189), siendo un aspecto a tomar en cuenta la posibilidad de evaluar simultáneamente la actividad antimicrobiana de hasta 12 sustancias de prueba (190). El método de microdiluci