ARTÍCULO DE REVISIÓN Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae) Factors affecting in vitro somatic embryogenesis of palms (Arecaceae) María Viñas*, Víctor M. Jiménez** Resumen La embriogénesis somática (ES) es una vía de desarrollo in vitro que presenta una serie de ventajas sobre otras técnicas utilizadas para la regeneración de palmas. Esta técnica tiene gran potencial para superar las limitaciones observadas al tratar de propagar clonalmente estas plantas utilizando yemas basales. A pesar de la conocida recalcitrancia que presentan las palmas al cultivo in vitro, si se utilizan los reguladores de crecimiento apropiados, el tipo y el estado de desarrollo del explante adecuados, así como genotipos con buena respuesta, es muy probable que se obtengan buenos resultados. Esto ha sido demostrado parcialmente en Phoenix dactylifera (palma dátil), Elaeis guineensis (palma aceitera), Bactris gasipaes (pejibaye) y Cocos nucifera (coco). También se ha logrado generar protocolos eficientes en otras palmas menos estudiadas, como Geonoma gamiova (una palma ornamental), Euterpe edulis (palmito dulce) y Areca catechu (palma de betel). La in- ducción de ES se ha conseguido principalmente con el uso de auxinas. De ellas, la que se ha utilizado con más frecuencia es el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), aunque en algunos casos (como en pejibaye y palma aceitera) se ha usado picloram y dicamba, también con buenos resultados. Los explantes más utilizados han sido inflorescencias, ápices y seg- mentos basales de hojas, todos con un estado de desarrollo incipiente. También se ha visto que el tamaño del explante y el medio de cultivo juegan un papel importante en la respuesta. En este trabajo se presenta una recopilación de los trabajos más importantes sobre ES en esta familia de plantas y del efecto de varios factores sobre su establecimiento y desarrollo. Palabras clave: Explante, genotipo, medio de cultivo, regeneración, reguladores de crecimiento Abstract Somatic embryogenesis (SE) is an in vitro developmental pathway that exhibits a number of advantages over other tech- niques for regeneration of palms. This technique has great potential to overcome the limitations observed when trying to propagate these plants clonally using basal buds. Despite the known recalcitrance of palms for in vitro culture, good results can be obtained by using the appropriate growth regulators, explant type and developmental stage, as well as responsive genotypes. This has been partially observed in Phoenix dactylifera (date palm), Elaeis guineensis (African oil palm), Bactris gasipaes (peach palm) and Cocos nucifera (coconut). Efficient protocols have been also generated in less-studied palms, such as Geonoma gamiova (an ornamental palm), Euterpe edulis (Assai palm) and Areca catechu (areca palm). Induction of SE has been achieved mainly through the use of auxins. Of these, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) has been used most frequently, although in some cases (such as in peach palm and African oil palm) picloram and dicamba have been employed also with good results. The most commonly used explants are young inflorescences, apical buds and leaf-basal segments. Explant size and culture medium also play an important role in obtaining good results. This review presents a compilation of the most important publications on SE in this plant family and the effect of various factors on induction and development of this pathway. Key words: Culture medium, explant, genotype, plant growth regulators, regeneration Recibido: abril 13 de 2011 Aprobado: noviembre 24 de 2011 * M.Sc., CIGRAS, Universidad de Costa Rica e-mail: maria.vinas@ucr.ac.cr ** Ph.D., CIGRAS, Universidad de Costa Rica e-mail: victor.jimenez@ucr.ac.cr RFaevc.t oCroelso qmube. iBnifloutyeecn oeln. Vlao el.m XbIIrIi oNgoé.n 2e sDisi csioemábtriec a2 0in1 v1i t r2o2 d9e- 2p4a2lm a s (Arecaceae) 229 Introducción resultantes presentan cierto grado de variación soma- La embriogénesis somática (ES) es un proceso que clonal. Según Jaligot et al., (2000) y Lucia et al., (2011), implica la formación de embriones a partir de células esa variación es ocasionada por factores epigenéticos somáticas vegetales (Von Arnold et al., 2002). Estos en palma aceitera y se manifiesta principalmente como embriones poseen, al igual que los embriones cigóti- deformaciones durante el desarrollo floral. En esta es- cos, una estructura bipolar con ápices de tallo y de pecie, sin embargo, Sanputawong and Te-chato (2011) raíz (Lelu et al., 1993). Algunos autores indican que los no observaron variación somaclonal en las plantas pro- embriones somáticos tienen un origen unicelular (Car- pagadas mediante ES indirecta, utilizando marcadores man, 1990; Terzi and Lo Schiavo, 1990), mientras que moleculares SSR (Repeticiones de Secuencia Simple). otros proponen orígenes tanto unicelular como multi- Al igual que en muchas otras especies, en palmas el celular (Perera et al., 2007, Gahan and George, 2008). proceso de regeneración de plantas mediante ES se di- Para que ocurra la reprogramación en una célula so- vide en varias etapas. En cada una existen variaciones mática y esta comience a diferenciar un embrión, su en cuanto a las condiciones de cultivo, los reguladores patrón de expresión génica debe cambiar (Dodeman de crecimiento, los medios de cultivo utilizados, entre et al., 1997; Low et al., 2008). Es probable que esta re- otras (Von Arnold et al., 2002). Las cuatro etapas ge- gulación génica se deba a factores epigenéticos como nerales de la ES indirecta (la más común en palmas, la metilación del ADN (Von Arnold, 2008) y compac- como se mencionó anteriormente) son: taciones o descompactaciones en la disposición de la cromatina (Fehér et al., 2003). Según Von Arnold et al. • Callo proembriogénico (CP): donde se establece (2002), los reguladores de crecimiento, principalmen- el estímulo celular para que inicie la ES y se forme te las auxinas, juegan un papel muy importante en la la masa de células proembriogénicas. La etapa de transducción de señales para desencadenar un patrón CP implica una división asimétrica de las células en de expresión génica determinado. De todas las auxinas, respuesta a reguladores de crecimiento, usualmen- el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), utilizado en la te auxinas. Además, se caracteriza por una acidifi- mayoría de los casos para la inducción de ES, es el que cación del citoplasma y de la pared celular en las promueve la hipermetilación del ADN con mayor facili- células con capacidad embriogénica. dad (Terzi and Lo Shiavo, 1990; Causevic et al., 2005). • Desarrollo proembriogénico (DP): se fomenta el Los embriones somáticos in vitro pueden provenir de crecimiento de la masa proembriogénica formada células que pasaron por un proceso de desdiferencia- anteriormente. ción, como en callos o suspensiones celulares, en lo • Maduración de proembriones (MP): se estimula la que se conoce como ES indirecta o, sin pasar por ese conversión de proembriones a embriones. Durante proceso de desdiferenciación, en lo que se denomina esta etapa los embriones somáticos comienzan a ES directa (Von Arnold, 2008). acumular productos de reserva. En muchos casos la Las palmas, con cerca de 3500 especies, constitu- maduración del embrión requiere la deshidratación yen un grupo particular de plantas tropicales y sub- previa. tropicales, con crecimiento exclusivamente primario • Desarrollo de embriones (DE): se estimula el creci- (Tomlinson, 2006). Su importancia económica las si- miento de los embriones, que pasan por las etapas túa únicamente detrás de las gramíneas entre todos características de su desarrollo (globular, escutelar los grupos de plantas. Se utilizan como fuente de ali- y coleoptilar) hasta que se convierten en pequeñas mento, abrigo, tejidos y combustible, principalmente plantas completas (germinación de embriones). en los trópicos (Glimn-Lacy and Kaufman, 2006). En palmas, la mayoría de los estudios mencionan la ocu- La capacidad para producir embriones somáticos está rrencia de ES indirecta, que permite la producción de genéticamente predeterminada (Von Arnold et al., una progenie más numerosa, tal y como se ha observa- 2002), por lo que la respuesta ante tratamientos varía do en palma dátil (Phoenix dactylifera), palma aceitera según la especie con la cual se esté trabajando. En pal- (Elaeis guineensis), palma de betel (Areca catechu) y mas la inducción de embriones es difícil mientras que coco (Cocos nucifera) (Rajesh et al., 2003; Konan et al., en otras especies, como Daucus carota, la ES ocurre 2006; Pérez-Núñez et al., 2006; Te-chato and Hilae, fácilmente cuando los tejidos se colocan en el medio 2007; Wang et al., 2010). Según Gueye et al. (2009), de cultivo adecuado (Von Arnold, 2008). la formación de callo es un prerrequisito indispensable en palma dátil para la inducción de ES. Sin embargo, La multiplicación de palmas por medio de ES puede debido a este paso previo, muchas veces las plantas ser importante, ya que muchas de estas monocotile- 230 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIII No. 2 Diciembre 2011 229-242 dóneas perennes producen muy pocos hijos basales de crecimiento exógenos y hormonas endógenas ha y estos son difíciles de enraizar (Eke et al., 2005; Ase- sido estudiada previamente en varias especies (Jimé- mota et al., 2007; Othmani et al., 2009). Asemota et nez, 2005). al. (2007) afirman que incluso algunos genotipos de palma dátil nunca producen hijos basales. Tanto en palmas como en otras familias de plantas, las auxinas son los reguladores de crecimiento más am- La recalcitrancia que presentan las palmas al cultivo in pliamente utilizados para inducir callo con potencial vitro es ampliamente conocida. Aun así, muchos auto- embriogénico. De las auxinas disponibles, la más uti- res mencionan haber desarrollado protocolos eficien- lizada es el 2,4-D (Fehér et al., 2003; Phillips, 2004). tes para la inducción de ES in vitro en palmas, como A continuación se detallarán los reguladores de creci- en el caso de palma dátil (Eke et al., 2005; Al-Khayri, miento más utilizados en palmas durante cada una de 2005; Asemota et al., 2007), palma aceitera (Rajesh et las etapas de la ES descritas anteriormente: al., 2003; Konan et al., 2006; Konan et al., 2007), Bac- tris gasipaes-pejibaye (De Almeida and Vieira, 2006; Etapa CP: en palmas, la auxina utilizada con más fre- Steinmacher, 2007abc) y coco (Verdeil et al., 1994; cuencia para esta etapa es el 2,4-D (Verdeil et al., Chan et al., 1998). Otras palmas menos estudiadas 1994; Ledo et al., 2002; Eke et al., 2005; Saldanha et son: Geonoma gamiova (una palma ornamental) (Dias al., 2006; Gueye et al., 2009), aunque picloram (ácido et al., 1994), Euterpe edulis (palmito dulce) (Guerra 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico) y/o dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) se han utilizado tam- and Handro, 1988; Guerra and Handro, 1998) y palma bién en pejibaye (Steinmacher et al., 2007abc, Maciel de betel (Wang et al., 2003; Karun et al., 2004; Wang et al., 2010, Steinmacher et al., 2011), Areca catechu et al., 2006). (Karun et al., 2004; Wang et al., 2010) y palma aceitera Los aspectos que más influyen sobre la ES en palmas, (Kramut and Te-chato, 2010; Scherwinski-Pereira et al., así como en otras especies vegetales, en orden de im- 2010; Thuzar et al., 2011; Sanputawong and Te-chato, portancia, son: los reguladores de crecimiento, el tipo 2011) con buenos resultados. Recientemente se ha de explante, el genotipo, el estado de desarrollo del observado la expresión diferencial de transcritos en explante, el medio de cultivo y el tamaño del explante suspensiones celulares de palma aceitera de acuerdo (Badawy et al., 2005; Asemota et al., 2007; Steinma- con el tipo y concentración de auxina utilizada en esta cher et al., 2007a; Gueye et al., 2009; Perera et al., etapa (Roowi et al., 2010). Aunque en la mayoría de 2009). A continuación se presentará un resumen de los casos se han utilizado concentraciones altas de 2,4- los principales estudios en palmas realizados hasta el D durante esta etapa (>100 µM), Thi-Lan et al. (1999) momento para determinar la influencia que ejercen observaron que concentraciones mayores a 90,5 µM cada uno de estos factores sobre la ES. de este regulador de crecimiento inhibieron por com- pleto la inducción de callo embriogénico en Phoenix canariensis “Canary Island”. En palma aceitera el uso Factores que influyen sobre la ES en palmas de bajas concentraciones de 2,4-D (5 µM), junto con Picloram (1 µM), produjo la mejor respuesta en cuan- Reguladores de crecimiento to a inducción de callo embriogénico utilizando hojas inmaduras como explante (Yusnita, 2011). En todas las familias de plantas, incluyendo la Areca- ceae, el aspecto más importante para combatir la re- Algunos autores han utilizado, además de auxina, ci- calcitrancia durante el cultivo in vitro es la selección toquininas como la BAP (6-bencilaminopurina) (22,2 adecuada de los reguladores de crecimiento que se µM) (Zouine and El Hadrami, 2007) y la 2ip (N6-(2-iso- incorporan en el medio de cultivo (Benson, 2000). Al penteniladenina)) en bajas concentraciones (15 µM) respecto, es muy importante tener en cuenta que los (Veramendi and Navarro, 1997; Al-Khayri, 2001; Ba- explantes se encuentran bajo el control de regulado- dawy et al., 2005; Eke et al., 2005; Eshraghi et al., 2005) res de crecimiento tanto endógenos como exógenos o bien tidiazurón (9 - 90 µM), también con buenos y que el balance de estos es el que determina el resul- resultados (Perera et al., 2009; Sidky and Zaid, 2011). tado final (Jiménez, 2005). Por ejemplo, Jiménez et al. El uso solo de esta última citoquinina en altas concen- (2005) mostraron la participación de las hormonas en- traciones provocó la inducción de embriogénesis di- dógenas en la respuesta embriogénica en zanahoria, recta sin previa producción de callo en palma aceitera mientras que, en palma dátil, Othmani et al. (2009) de- (Sidky and Zaid, 2011). Es importante tener en cuenta terminaron que la aplicación exógena de reguladores que el uso de citoquininas en altas concentraciones de crecimiento es indispensable para la producción de podría aumentar la acumulación de compuestos fenó- callo embriogénico. Esa interacción entre reguladores licos y por tanto, afectar negativamente la inducción y Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae) 231 el crecimiento de los embriones somáticos en palmas Etapa DE: en el caso de las palmas, como se mencio- (Abohatem et al., 2011) nó anteriormente, la maduración del embrión, es decir, su conversión hacia plantas completas, requiere, en la Azpeitia et al. (2003), con la utilización de explantes de mayoría de los casos, del uso de reguladores de cre- plúmula de coco, mostraron que el uso del brasinoes- cimiento. No existe ningún regulador de crecimiento teroide brassinolide antes de la etapa CP (3 a 7 días), utilizado con mayor frecuencia, aunque el ABA (1 mg/L) ayuda a aumentar la respuesta ante el 2,4-D, actuando ha mostrado ser efectivo en coco (Fernando and Ga- de forma sinergística con otras auxinas, como se ha ob- mage, 2000; Perera et al., 2007), palma dátil (Zouine servado en diversas plantas (Nakamura et al., 2003). et al., 2005; Othmani et al., 2009; Sghaier et al., 2009) Etapa DP: en esta etapa generalmente se elimina por y Phoenix canariensis (Huong et al., 1999; Thi-Lan et al., completo del medio de cultivo la auxina utilizada du- 1999). Sghaier-Hammami et al. (2010) mostraron que rante la etapa CP, o bien se reduce su concentración la adición de ABA en el medio de cultivo incrementa (Thomas and Rao, 1985; Valverde et al., 1989; Ver- significativamente el contenido de proteína dentro de deil et al., 1994; Fki et al., 2003; Othmani et al., 2009; los tejidos, principalmente proteínas abundantes duran- te la embriogénesis tardía (LEA) implicadas en la protec- Perera et al., 2009). Al respecto, es importante des- ción del embrión a la desecación. Thi Lan et al. (1999) tacar que subcultivos sucesivos en medio de cultivo mostraron, además, que el medio de cultivo adicionado con altas concentraciones de auxinas durante la eta- solamente con BAP, kinetina o 2ip inhibió por comple- pa DP pueden provocar que, posteriormente durante to el desarrollo de los embriones, mientras que Yusnita la etapa DE, se inhiba el desarrollo de los embriones. (2011) utilizó BAP durante esta etapa en palma aceitera Esto fue observado por Aberlenc-Bertossi et al. (1999) logrando un buen desarrollo de los embriones y Guerra y Handro (1998) en palma aceitera y Euterpe edulis, respectivamente. Por otro lado, en Areca ca- Perera et al. (2009) utilizaron BAP (5 µM), en conjunto techu, subcultivos sucesivos en medio suplementado con 2ip (5 µM), en el medio de cultivo durante esta con dicamba llevaron a la formación de embriones so- etapa y lograron aproximadamente un 85% de conver- máticos anormales (Wang et al., 2010). sión de embriones de coco. Estos autores mostraron, además, que la inclusión de ácido giberélico (AG3) Al-Khayri (2001) utilizó altas concentraciones de 2ip (0,45 µM) al medio de cultivo fomentó considerable- (148 µM) y bajas concentraciones de ANA (ácido naf- mente la maduración de embriones de esta planta, talenacético) (54 µM) en palma dátil, mientras que mientras que la adición de ABA no favoreció la ma- Pérez-Núñez et al. (2006) redujeron la concentración duración. El efecto positivo del AG3 en la formación de 2,4-D de 600 µM a 6 µM y adicionaron 300 µM y germinación de embriones somáticos también fue de BAP en coco. Con este último procedimiento, los observado por Montero-Córtes et al. (2010) en esta autores generaron altas cantidades de embriones (9,8 misma especie. millones de embriones/100 plúmulas). En Phoenix ca- nariensis la mejor combinación de reguladores de cre- Además, otros autores han utilizado auxinas en esta cimiento para esta etapa fue 2,26 µM de 2,4-D, 0,83 etapa con buenos resultados (Al-Khayri, 2003; Othma- µM de kinetina (6-furfurilaminopurina) y 2 µM de ABA ni et al., 2009). Al-Khayri (2003) utilizó ácido indol- (ácido abscísico) (Thi-Lan et al., 1999). 3-butírico (AIB) (0,98-1,97 µM) y obtuvo entre un 80 y un 90% de germinación de embriones somáticos de Etapa MP: A diferencia lo que se realiza comúnmente palma dátil, comparado con la misma concentración con otras especies, en las cuales durante esta etapa de ANA, con la cual se lograron apenas entre un 40 y se eliminan completamente los reguladores de cre- 60% en la germinación de los embriones. cimiento del medio de cultivo (Dudits et al., 1991; Komamine et al., 1992; Von Arnold et al., 2002), en Una excepción a lo anterior es el caso de palma acei- palmas, luego de su formación, los proembriones se tera, en la cual Scherwinski-Pereira et al. (2010) logra- subcultivan directamente en un medio de cultivo con ron la conversión a plantas completas eliminando en los reguladores de crecimiento utilizados para la etapa su totalidad los reguladores de crecimiento del medio DE (Eshraghi et al., 2005; Steinmacher et al., 2007c; de cultivo. Othmani et al., 2009). Sin embargo, en contraste con lo anterior, Konan et al. (2010) lograron conservar em- briones somáticos de palma aceitera por al menos 20 Tipo de explante años en medio desprovisto de reguladores de creci- Existen algunos tejidos que responden mejor a los tra- miento. También obtuvieron porcentajes de regenera- tamientos para inducción de ES que otros. Para lograr ción de alrededor de 30% en varios genotipos. la regeneración de embriones somáticos en plantas 232 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIII No. 2 Diciembre 2011 229-242 monocotiledóneas es muy importante la selección por lo que las plantas obtenidas fueron diploides. El de explantes que contengan regiones meristemáticas uso de plántulas de Hyophorbe lagenicaulis, palma en (Benson, 2000). Es por ello que en palmas común- peligro de extinción, con tres semanas de edad, sec- mente se utiliza tejido somático inmaduro, como es cionadas de forma longitudinal y cultivadas en medio el caso de inflorescencias, ápices y secciones basales MS (Murashige and Skoog, 1962), con 3 mg/l 2,4-D de hojas. En algunos casos también se ha reportado el indujo la formación de embriones somáticos de forma uso de raíces, como por ejemplo las provenientes de directa; sin embargo, no fue posible aclimatarlos en el plantas de Areca catechu en cultivo in vitro (Wang et suelo (Sarasan et al., 2002). al., 2006). Estos autores encontraron mayor formación de callo embriogénico en raíces que en hojas y tallos. Badawy et al. (2005) utilizaron ápices, yemas axilares y hojas de palma dátil, aplicaron los mismos tratamien- Se ha observado que la respuesta embriogénica puede tos en todos los tipos de explante, y encontraron que variar, aun en una misma especie de palma, según el el explante que mejor respondió ante los tratamientos tipo de tejido utilizado. Por ejemplo, en algunas es- fue el ápice, seguido de la yema axilar. En esta especie pecies la mejor respuesta se logra con inflorescencias no es común el uso de inflorescencias como explan- mientras que en otras, se logra con el uso de hojas. te para la inducción de ES. También en palma dátil, Thuc et al. (2011) encontraron, en palma aceitera, un Veramendi and Navarro (1997) utilizaron diferentes posible marcador molecular (el transcripto Eg707) que explantes para la inducción de callo embriogénico (te- permite identificar estadios tempranos de ES en los ex- jido subapical, ápices y yemas de la planta, además de plantes, ya que se expresa mayoritariamente en tejido ápices, bases y fragmentos de las hojas) y observaron con potencial embriogénico. Esto permitiría descartar que los ápices y las yemas de la planta así como las explantes sin esperar hasta que ocurra una respuesta bases de las hojas produjeron la mayor cantidad de visible, ahorrando de esta forma tiempo y recursos. callo, donde los dos primeros tuvieron rendimientos de entre 96 y 100% en la formación de callo. Los embriones cigóticos responden muy bien a varios tratamientos para inducir ES, tal y como lo mostraron Teixeira et al. (1994) utilizaron inflorescencias inma- Huong et al. (1999) y Thi-Lan et al. (1999) en Phoenix duras de palma aceitera y lograron la inducción de canariensis y Teixeira et al. (1993) en palma aceitera. callo embriogénico luego de 81 semanas de cultivo. Al comparar la respuesta entre embriones cigóticos Sin embargo, la mayoría de los explantes se oxidaron. y ápices, los primeros presentaron significativamente Es probable que por ello los tejidos más utilizados en mayor potencial para la formación de callo embriogé- esta especie sean las hojas jóvenes provenientes de nico. Sin embargo, en muchos casos la aplicación de plantas adultas (Schwendiman et al., 1988; De Tou- la metodología desarrollada para un explante, en este chet et al., 1991; Lucia et al., 2011; Thuc et al., 2011). caso embriones cigóticos, no lleva a los mismos resul- Guerra y Handro (1998) utilizaron embriones, inflo- tados en otros tejidos (Chan et al., 1998). rescencias y hojas para la producción de embriones somáticos en Euterpe edulis; sin embargo, solamente Chan et al. (1998) y Azpeitia et al. (2003) utilizaron con los dos primeros lograron producción de plantas plúmulas provenientes de embriones en frutos de completas. También se han utilizado anteras de coco coco y obtuvieron buenos rendimientos (>50%) en la para inducir callo embriogénico, embriones somáti- formación de embriones. Los cambios morfológicos e cos y, posteriormente, regeneración de plantas, aun- histológicos que ocurren durante este proceso fueron que con una frecuencia de únicamente 7% (Perera descritos y caracterizados posteriormente (Sáenz et et al., 2008). al., 2006). En palma aceitera, Thomas and Rao (1985) utilizaron solamente la sección basal de la hoja para la El cuadro 1 resume la composición de reguladores inducción de ES, logrando que un 50% de los explan- de crecimiento en algunos de los casos más exito- tes produjeran callo embriogénico. sos reportados hasta el momento en palmas durante cada etapa, excepto la MP, en la cual, como se de- En pejibaye y coco se ha reportado el uso de inflores- talló anteriormente, no hay variaciones en el medio cencias, ya que en estas dos especies la ES a partir de de cultivo ya que los explantes son subcultivados ápices y hojas no es sencilla (Valverde et al., 1989; Ver- directamente a medio de cultivo suplementado con deil et al., 1994; Steinmacher et al., 2007a). En coco, los reguladores de crecimiento característicos de la además se han utilizado ovarios no fertilizados para la etapa DE. Además, se indica el tipo de explante utili- inducción de ES con buenos resultados (Perera et al., zado, ya que, como se mencionó anteriormente, es 2007; Perera et al., 2009). En este último caso, el callo el segundo factor más importante para la inducción embriogénico se formó a partir del carpelo del ovario, de ES en palmas. Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae) 233 Cuadro 1. Tipo de explante y reguladores de crecimiento utilizados en las diferentes etapas durante la ES en varias especies de palma ETAPA DE LA ES** CP DP DE Especie Explante* Referencia Concentración Concentración Concentración Nombre Nombre Nombre (µM) (µM) (µM) Bactris 2,4-D 40 Steinmacher et I Picloram 300 Picloram 300 gasipaes 2-ip 10 al. (2007a) I 2,4-D 200-300 2,4-D 150-200 BAP 10 Verdeil et al. (1994) 2,4-D 1 2,4-D 1 P 2,4-D 100 Chan et al. (1998) BAP 50 BAP 50 2,4-D 550 2,4-D 6 2,4-D 6 P Azpeitia et al. (2003) Cocos HBr* 0,01-0,1 BAP 300 BAP 300 nucifera 2,4-D 6 Pérez-Núñez P 2,4-D 600 2,4-D 600 BAP 300 et al. (2006) O 2,4-D 100 ABA 5 NO Perera et al. (2007) 2,4-D 100 BAP 5 O 2,4-D 66 Perera et al. (2009) TDZ 9 2ip 5 2,4-D 362-905 2,4-D 113,1-905 2,4-D 362-452,5 de Touchet H BAP 4,4 BAP 4,4 BAP 4,4 et al. (1991) Elaeis ANA 15 I 2,4-D 475 2,4-D 500 Teixeira et al. (1994) guineensis ABA 2 2,4-D 113,12 2,4-D 0,045 2,4-D 0,045 EC Rajesh et al. (2003) 2ip 14,76 Putrescina 1000 Putrescina 1000 2,4-D 453 ANA 54 A Al-Khayri (2001) 2ip 15 2ip 7 I 2,4-D 45,2 2,4-D 4,5 No Fki et al. (2003) H 2,4-D 2,3 2,4-D 4,5 2,4-D 452,5 ANA 53,7 Phoenix A Al-Khayri (2005, 2007) 2ip 14,8 2ip 29,5 dactylifera 2,4-D 452,5 ANA 0,54 ANA 0,54 A, PF, YA Badawy et al. (2005) 2ip 14,8 2ip 9,8 2ip 14,8 2,4-D 453 ANA 0,54 ANA 0,27-0,54 A Eke et al. (2005) 2ip 15 2ip 24,6 2ip 4,9 H 2,4-D 45,2 2,4-D 0,45 ABA 3,8 Othmani et al. (2009) * PF = Primordio foliar; H= hojas; YA= yema axilar; A= ápice; EC= embrión cigótico; O= óvulos; I= inflorescencias; P= plúmula. HBr = 22(S),23(S)-homobrassinolide ** CP = callo proembriogénico, DP= desarrollo proembriogénico, DE= desarrollo de embriones 234 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIII No. 2 Diciembre 2011 229-242 Genotipo se ve acentuada por el hecho de que la propagación En la familia Arecaceae se ha observado la influencia por semilla, producto muchas veces de un proceso de del genotipo sobre la respuesta embriogénica en las polinización abierta, predomina sobre la propagación especies más estudiadas: pejibaye, coco, palma dátil vegetativa (Elshibli and Korpelainen, 2008). Solo se co- y palma aceitera. En pejibaye, por ejemplo, inflores- nocen protocolos para la embriogénesis somática de cencias de varios genotipos presentaron respuestas variedades específicas en el caso de palma dátil (Fki et significativamente diferentes a los mismos tratamien- al., 2003; Eke et al., 2005; Eshraghi et al., 2005). tos durante la inducción de ES (Steinmacher et al., 2007a). En palma dátil el número de embriones so- Estado de desarrollo del explante máticos formados fue significativamente diferente en dos cultivares expuestos a los mismos tratamientos de La capacidad que posee una célula o grupo de células concentraciones y tipos de reguladores de crecimien- para convertirse en embriogénica también depende to (Zouine and El Hadrami, 2007). En coco, Verdeil et de su estado fisiológico y de diferenciación (Gueye et al. (1994) encontraron respuesta diferencial al 2,4-D al., 2009). Los tejidos maduros, por ejemplo, presentan durante la etapa CP en los tres genotipos utilizados. un mayor grado de metilación del ADN, lo que provo- ca una baja capacidad de desdiferenciación (Terzi and En palma dátil la etapa CP depende en gran medida Lo Schiavo, 1990). del genotipo (Gueye et al. 2009). Esta sería la principal limitante para la propagación de genotipos importan- En el caso de palma dátil, Gueye et al. (2009) realiza- tes de esta especie. Eshraghi et al., (2005) demostraron ron un estudio histológico de diferentes secciones de que dos cultivares iraníes de palma dátil respondie- hoja y determinaron que en el segmento basal existe ron de diferente manera en todas las etapas. En ese una zona de división celular, seguida de una zona de caso solamente uno de los cultivares (Khanizi) logró elongación celular (segmento intermedio), para termi- alcanzar la etapa MP. Sumado a esto, Al-Khayri and Al- nar en una zona de maduración (segmento distal). De Bahrany (2004) reportaron diferencias en la respuesta esa forma los autores encontraron que únicamente los ante diferentes concentraciones de AgNO3 durante la segmentos intermedios de las hojas, donde se ubica la etapa DP en diferentes genotipos de palma dátil. El zona de elongación celular, fueron los que respondie- AgNO3 se ha utilizado para favorecer la ES en especies ron ante el tratamiento con 2,4-D para lograr la induc- como maíz (Songstad et al., 1991) gracias a su acción ción de callo embriogénico. como inhibidor de la actividad del etileno (Kumar et al., 1998). Se ha reportado que el etileno también pue- En el caso de las inflorescencias, los resultados obteni- de inhibir la respuesta morfogénica in vitro en Passiflo- dos al utilizar diferentes estados de desarrollo varían de ra edulis (Kumar et al., 2009) y zanahoria (Tisserat and acuerdo con la especie. En el caso de coco, Verdeil et Murashige, 1977). Por otro lado, Zouine and El Hadra- al. (1994) mostraron que las inflorescencias con mayor mi (2004) mostraron que dos genotipos de palma dá- respuesta embriogénica fueron aquellas con un mayor til respondieron de forma significativamente diferente desarrollo (tamaño de espata = 45 cm); mientras que ante distintas dosis de sacarosa durante la etapa DP. en pejibaye fueron las inflorescencias con menor desa- Mientras que Aslam et al. (2011) y Al-Khayri (2011a) rrollo (tamaño de espata = 5-8 cm) (Steinmacher et al., mostraron que la respuesta durante todas las etapas 2007a), lo cual refuerza lo dicho anteriormente sobre de la ES fue diferente entre los genotipos de palma el papel del genotipo en la respuesta embriogénica. dátil evaluados. Perera et al. (2007) utilizaron ovarios sin fertilizar de En palma aceitera también se ha reportado influencia coco en diferentes estados de desarrollo para inducir del genotipo en la maduración de los embriones du- ES. Estos fueron numerados desde 0 a -6, donde 0 co- rante la etapa MP con el uso de BAP. En este caso, rrespondió al estado de desarrollo maduro (inflores- solamente algunos clones respondieron positivamente cencia que abrió primero) y -6 al estado de desarrollo al tratamiento con diferentes concentraciones de esta más inmaduro (inflorescencia que abrió aproximada- citoquinina (Aberlenc-Bertossi et al., 1999). mente seis meses después). Sin embargo, no encon- traron resultados consistentes en cuanto a la influencia El efecto tan determinante del genotipo en la respues- del estado de desarrollo del ovario sobre la inducción ta embriogénica ha impedido definir un protocolo par- de callo embriogénico en los diferentes tratamientos ticular que se pueda aplicar en forma general para una utilizados. Los ovarios con estado de desarrollo más misma especie de palmas. Lo anterior probablemente avanzado respondieron mejor cuando las concentra- está relacionado con la alta diversidad genética pre- ciones de auxina fueron mayores (100-200 µM de sente en los miembros de esta familia de plantas, que 2,4-D), mientras que los estados con menor desarrollo Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae) 235 respondieron mejor ante concentraciones menores de En el caso de palma dátil, el medio de cultivo más uti- auxina (50 µM de 2,4-D). lizado incluye las sales y vitaminas de MS (Al-Khayri, 2001; Fki et al., 2003; Eke et al., 2005; Othmani et al., Samosir et al. (1998) encontraron que la mayor canti- 2009; Eshraghi et al., 2005). Sin embargo, en algunos dad de embriones cigóticos de coco que produjeron casos se ha utilizado el MS adicionado con las vitami- callo embriogénico fueron los inmaduros (> 40%) con nas de Morel y Wetmore (1951) (Sané et al., 2006). 10 meses de edad, mientras que solamente un 10% de Recientemente, en esta especie Al-Khayri (2011b) indi- los embriones maduros con 12 meses de edad produ- có que es importante realizar variaciones en el medio jeron callo embriogénico. de cultivo según la etapa de ES, ya que se observó que un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de Medios de cultivo callo embriogénico no necesariamente coincide con el medio de cultivo óptimo para la regeneración de Tipos de medios de cultivo los embriones. En el caso de coco (Gupta et al., 1984; Verdeil et al., En la mayoría de los casos se ha utilizado medio de 1994, Adkins et al., 1998) y Acrocomia aculeata (Fe- cultivo sólido durante todas las etapas descritas ante- rreira et al., 2009), se ha utilizado preferencialmente riormente; sin embargo, el uso de suspensiones celula- el medio de cultivo Y3. En pejibaye se ha preferido el res durante la etapa DE ha fomentado la obtención de MS adicionado con las vitaminas de Morel y Wetmore embriones somáticos, tanto en palma aceitera (De Tou- (1951) (Steinmacher et al., 2007ab). El medio de cul- chet et al., 1991, Aberlenc-Bertossi et al., 1999) como tivo CRI 72 (Karunaratne y Periyapperuma, 1989) fue en palma dátil (Bhaskaran and Smith, 1992; Veramendi utilizado con éxito en embriones inmaduros y ovarios and Navarro, 1996; Fki et al., 2003; Zouine et al., 2005; de coco (Karunaratne y Periyapperuma, 1989; Perera Badawy et al., 2009). El cultivo de células de palma et al., 2009). aceitera en biorreactor también ha sido reportado con anterioridad; sin embargo, sin indicar si estas eran em- Sin embargo, también existen informes de que cam- briogénicas (Gorret et al., 2004). Recientemente, Stein- biar el medio de cultivo a lo largo del desarrollo del macher et al. (2011) observaron mayor formación de proceso embriogénico puede ser beneficioso. Así, Ver- embriones somáticos de pejibaye y mayor crecimiento deil et al. (1994) utilizaron inflorescencias de coco cul- de las plántulas formadas al utilizar un sistema de in- tivadas en el medio de cultivo Y3 adicionado con las mersión temporal que cuando se utilizó medio sólido. vitaminas de Morel y Wetmore (1951) durante la eta- Sin embargo, la sobrevivencia al momento de realizar pa CP. Posteriormente, para las siguientes tres etapas la aclimatación fue mayor en las plantas cultivadas en (DP, MP y DE), utilizaron la sales y vitaminas del medio medio sólido. Khawnium y Te-chato (2011) mostraron de cultivo MS pero con las concentraciones aumenta- que es posible la criopreservación por medio de vitri- das al doble. Para una aproximación más precisa, Dus- ficación de tejido embriogénico friable proveniente de sert et al. (1995) analizaron la absorción de nutrientes hojas jóvenes de palma aceitera, logrando más de 65% específicos durante el inicio de la ES en coco, y encon- de formación de embriones somáticos. traron que nitrato, calcio, magnesio y sacarosa fueron los requeridos en mayor cantidad. Para una misma especie, la literatura reporta general- mente el uso de un mismo medio de cultivo basal para Debido a que la maduración del embrión (etapa MP) todo el proceso, en algunos casos con ciertas varia- requiere la deshidratación previa, en algunas ocasio- ciones. Paranjothy y Othman (1982) afirman que en nes es posible utilizar medios de cultivo con mayor palma aceitera el uso de un medio de cultivo con una concentración de solutos, utilizando diversos agentes formulación estándar de nutrientes como el MS es su- osmóticos, como azúcares y polietilenglicol (Von Ar- ficiente para la inducción de callo. Además, en esta nold et al., 2002). misma especie, Da Silva Guedes et al. (2011) obser- varon una mayor formación de callo embriogénico en Uso de antioxidantes los explantes cultivados en medio de cultivo MS que en los cultivados en medio de cultivo Y3 (Eeuwens En palmas, la oxidación de los tejidos en cultivo in vi- 1976). También Thuzar et al. (2011) mostraron que, en tro es un problema recurrente (Sugimura and Salvaña, comparación con el MS, una mayor cantidad de los ex- 1989; Teixeira et al., 1994; Al-Khayri, 2005; Steinma- plantes de esta misma especie, cultivados en el medio cher et al., 2007c; Sáenz et al., 2010). Este podría ser N6 (Chu et al., 1975), produjeron callo embriogénico. uno de los motivos más determinantes para la reduci- 236 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIII No. 2 Diciembre 2011 229-242 da regeneración vegetativa in vitro de esta familia de cencias de palma aceitera, lo cual sí sucedió cuando se plantas. utilizó carbón activado. El carbón activado es utilizado comúnmente para dis- minuir los problemas de oxidación durante el proceso Otros aditivos de ES en palmas. Sin embargo, este compuesto puede adsorber ciertos componentes importantes del me- Algunos autores mencionan los beneficios del uso de dio de cultivo, como los reguladores de crecimiento otros componentes en el medio de cultivo durante las diferentes etapas de la ES en palma, tales como vitami- y otros compuestos orgánicos, lo que podría afectar nas, aminoácidos, diferentes concentraciones y tipos la respuesta morfogénica (Pan and van Staden, 1998). de fuentes de carbono, entre otros. La adición de bio- La adsorción de reguladores de crecimiento por par- tina y tiamina durante la etapa DP ayudó a aumentar te del carbón activado fue demostrada por Ebert and significativamente el peso de los callos embriogénicos Taylor (1990). Estos autores encontraron que el 2,4-D y el tamaño y número de embriones obtenidos en pal- es adsorbido por el carbón activado en forma depen- ma dátil (Al-Khayri, 2001). También en esta especie, la diente de la consistencia del medio de cultivo. Cuando adición de glutamina (0,67 mM) favoreció significativa- se agregó una concentración intermedia de 2,4-D (100 mente el número de embriones somáticos producidos µM) y 2,5 g/l de carbón activado, un día después de (Zouine and El Hadrami, 2007), mientras que el uso de preparado el medio de cultivo, la cantidad de 2,4-D AgNO3, junto con 2ip, ha resultado favorable para el disponible en el medio de cultivo líquido fue de 3,6%, crecimiento de los callos embriogénicos, pero también mientras que en medio de cultivo semisólido, la canti- para la elongación de los embriones durante la etapa dad disponible de 2,4-D fue de 5-6%. DE (Al-Khayri and Al-Bahrany, 2001). Huong et al. (1999) y Thi-Lan et al. (1999) reportaron En coco, Adkins et al. (1998) mostraron que la adición que la adición de carbón activado durante la etapa CP de poliaminas (espermidina-0,5 µM y putrescina-7,5 inhibió completamente la formación de callo embrio- µM) en el medio de cultivo redujo la producción de génico en Phoenix canariensis. Por el contrario, Sáenz etileno y, con ello, lograron un aumento significativo et al. (2010) afirman que el carbón activado también en la producción de embriones somáticos. Mientras actúa positivamente sobre la ES en coco por razones que en palma dátil, Al-Khayri (2010) mostró que la adi- que aún se desconocen y Samosir et al. (1998) en- ción de 10-15% de agua de coco al medio de cultivo contraron que la presencia de carbón activado en el durante todas las etapas, hasta la germinación de los medio de cultivo es necesaria para promover la ES en embriones, influyó positivamente en el crecimiento coco. del callo embriogénico y en el número de embriones somáticos obtenidos. La caseína hidrolizada también Según Sáenz et al. (2010), la capacidad de adsorción favoreció el crecimiento de los callos embriogénicos y del carbón activado depende también de la marca la producción de embriones somáticos en palma dátil comercial. Ellos observaron que la formación de callo (Al-Khayri, 2011a). embriogénico en coco varió significativamente depen- diendo de la marca de carbón activado que se utilizó. Badawy et al. (2009), por su parte, evaluaron el uso de diferentes concentraciones de varias vitaminas para En la mayoría de los trabajos publicados en palmas, el aumentar el grado de globuralización de los embrio- carbón activado es eliminado durante las etapas fina- nes somáticos durante la etapa DE en palma dátil. Ellos les de la ES (Verdeil et al., 1994; Fki et al., 2003; Stein- mostraron que este parámetro se favorece cuando se macher et al., 2007c). En otros casos se utiliza durante agrega tiamina-HCl, piridoxina y ácido nicotínico al todas las etapas de la ES (Eshraghi et al., 2005; Stein- medio de cultivo, mientras que la adición de biotina macher et al., 2007a) y en pocos casos, no se usa del no mostró ser efectiva. De ellas, la vitamina que más todo (Badawy et al., 2005; Wang et al., 2006). Sugimu- influyó positivamente sobre el número de embriones ra y Salvaña (1989) y Samosir et al. (1998) reportaron somáticos obtenidos fue la tiamina (7,4 µM). que, en los casos en los cuales no se agregó carbón activado al medio de cultivo, se observó oxidación en Veramendi and Navarro (1996) y Badawy et al. (2005) todos los explantes de inflorescencias de coco. encontraron que la concentración óptima de sacarosa para la formación de embriones somáticos en palma El uso de PVP (polivinilpirrolidona) no es comúnmente dátil fue de 30 g/l. Cuando se redujo la concentración reportado en la literatura sobre ES en palmas. Da Silva a 15-20 g/l o se aumentó a 40-60 g/l, el número de em- Guedes et al. (2011) observaron que este compuesto briones obtenidos se redujo considerablemente. De la no influyó sobre la respuesta embriogénica en inflores- misma forma y también en palma dátil, Zoudine and El Factores que influyen en la embriogénesis somática in vitro de palmas (Arecaceae) 237 Hadrami (2004) mostraron que existe un aumento sig- tes muy pequeños (0,7-1,0 mm) obtenidos a partir de nificativo de la masa proembrionaria durante la etapa diferentes partes de la planta (Silva, 2003). DP cuando se utiliza una concentración de sacarosa de 30 g/l, comparado con concentraciones de 15 y Conclusiones 60 g/l. También en esa especie y similar a los resulta- dos anteriores, Asemota et al. (2007) mostraron que La ES in vitro representa una alternativa para la pro- una concentración de sacarosa de 30 g/l era suficiente pagación clonal de palmas con gran potencial para para una inducción adecuada de callo embriogénico. superar los problemas de propagación vegetativa que Además de la sacarosa como fuente de carbono, Kra- presenta esta familia de plantas. Aunque son muchos mut y Te-chato (2010) utilizaron 0,2 M de sorbitol du- los factores que influyen sobre la ES en este grupo rante la etapa DE en palma aceitera. Ellos observaron vegetal, su manejo adecuado ha permitido la obten- un aumento significativo en la cantidad de embriones ción de buenos resultados en varias especies, como somáticos obtenidos. Mientras que Te-chato and Hilae en el caso de palma dátil, coco y palma aceitera. Al (2007), en esa misma especie, reportaron que la mejor respecto, es muy importante tener en cuenta que los fuente de carbono para la inducción de ES secundaria tres factores que más han influido sobre la respuesta fue el sorbitol (0,2 M), comparado con las mismas con- embriogénica en palmas son: los reguladores de cre- centraciones de manitol, sacarosa, fructuosa y glucosa. cimiento, el tipo de explante y el genotipo. Una vez evaluado y definido el efecto de estos tres factores El tipo de gelificante agregado al medio de cultivo tam- para una determinada especie y variedad, el correcto bién puede influir en las etapas finales de la ES, como manejo de factores adicionales (estado de desarrollo, lo mostraron Wong et al. (1997) en palma aceitera. tamaño del explante y medio de cultivo) permite au- Según estos autores, el Gelrite favoreció el desarrollo mentar la eficiencia del proceso. de los embriones (etapa DE) ya que con este gelifican- te se obtuvo mayor cantidad de embriones que con el uso de agar. Referencias bibliográficas Aberlenc-Bertossi, F., Noirot, M. and Duval, Y. 1999. BA enhances Tamaño del explante the germination of oil palm somatic embryos derived from embryogenic suspension cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 56: 53-57. El tamaño del explante es otro de los factores que pue- de afectar la respuesta embriogénica en palmas. En Abohatem, M., Zouine, J. and El Hadrami, I. 2011. Low concentra- general, los tamaños más pequeños responden mejor tions of BAP and high rate of subcultures improve the esta- ante los diferentes tratamientos, probablemente por- blishment and multiplication of somatic embryos in date palm suspension cultures by limiting oxidative browning associated que existe una mayor cantidad de células expuestas al with high levels of total phenols and peroxidase activities. Scien- medio de cultivo, lo cual provoca un mayor estrés que tia Horticulturae 130: 344-348. fomenta el metabolismo celular (Fehér et al. 2003). Gueye et al. (2009) afirman que, en hojas de palmas, Adkins, S. W., Samosir, Y. M., Ernawati, A., Godwin I.D., and Drew, el callo emerge a partir de las células perivasculares. El R.A. 1998. Control of ethylene and use of polyamines can op- timize the conditions for somatic embryogenesis in coconut seccionamiento de los explantes hasta alcanzar tama- (Cocos nucifera L.) and papaya (Carica papaya L.). Acta Horti- ños pequeños, permitiría que una mayor cantidad de culturae 461: 459-466. células perivasculares se encuentren en contacto con los componentes del medio de cultivo y, por tanto, Al-Khayri, J. M. 2001. Optimization of biotin and thiamine require- ments for somatic embryogenesis of date palm (Phoenix dac- respondan con mayor facilidad. tylifera L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 37: 453-456. Existen pocos estudios en palmas en los que se ha evaluado el efecto del tamaño del explante sobre su Al-Khayri, J. M. 2003. In vitro germination of somatic embryos in respuesta. En estos se han utilizado hojas como fuente date palm: effect of auxin concentration and strength of MS de material vegetal. En palma aceitera, Othmani et al. salts. Current Science 84: 680-683. (2009) mostraron que la mayor cantidad de callo em- Al-Khayri, J. M. 2005. Date palm Phoenix dactylifera L. In: Jain, S. M.; briogénico se obtuvo con los explantes más pequeños Gupta, P. K. (eds.). Protocol for somatic embryogenesis in woo- (5-10 mm) de hoja. Mientras que en pejibaye (Steinma- dy plants. The Netherlands: Springer. pp. 309-319. cher et al., 2007c) y palma aceitera (Scherwinski-Perei- Al-Khayri, J. M. 2007. Date palm Phoenix dactylifera L. micropro- ra et al., 2010) se ha utilizado exitosamente la técnica pagation. In: Jain, S. M.; Häggman, H. (eds.). Protocols for conocida como TCL (capas delgadas de células, por micropropagation of woody trees and fruits. The Netherlands: sus siglas en inglés), la cual consiste en utilizar explan- Springer. pp. 509-526. 238 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XIII No. 2 Diciembre 2011 229-242 Al-Khayri, J. M. 2010. Somatic embryogenesis of date palm (Phoenix from plumule explants through somatic embryogenesis. Plant dactylifera L.) improved by coconut water. Biotechnology 9: Cell Reports 17: 515-521. 477-484. Chu, C-C., Wang, C-C. and Sun C-S. 1975. Establishment of an effi- Al-Khayri J. M. 2011a. 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The conference this year includes an additional night enabling not only our scientific inquisitiveness to be cultivated, but also to nurture our souls by learning about the Mexican ancient culture that was able to have great achievements both in astronomy and mathematics. - Interestingly, the Mayan Culture also provided the world of its time with a highly sophisticated device for efficient mixing! Come and join us in this most exciting conference. In June 2012 it will be held in the beautiful State of Quintana Roo, Mexico, in the heart of the Riviera Maya! Enrique Galindo Chair of Mixing XXIII galindo@ibt.unam.mx North American Mixing Forum The call for papers for Mixing XXIII is now open In keeping with the tradition of the conference, the acceptance of both oral and poster presentation is based - solely on submitted abstracts (300 – 600 words). Full papers are not required. The deadline for the submission of abstracts is March 15th, 2012. There will be no published proceedings for the conference, which allows for the presentation and discussion of the most recent mixing research in a collegial environment. Sessions will cover mixing related subjects from fundamentals to the application of mixing in a wide range of industrial processes. Topics include, but are not limited to: • Mixing Fundamentals • New modeling and simulation approaches to mixing • Mixing on small scales • Mixing and chemical reaction • Static and Other in-Line Mixers • CFD Modeling of mixers and mixing processes • Mixing of Multi-phase Systems • Mixing aspects of biotechnological processes • Mixing of solids • Industrial Mixing Processes Short course on Mixing: June 17th A special session of Mixing XXIII will be devoted to celebrate the 21st anniversary of NAMF, discussing the 21 most influential contributions to mixing. Please e-mail your abstract submission to marcela.garcia@agronegociosinternacionales.com.mx. You will receive an e-mail confirmation within the next 24 hours. If not, please contact Marcela García at the same e- mail address. For further information visit: www.mixing.net • www.23mixing.net The Iberostar Paraíso Beach lies between Playa del Carmen and the lesser-known city of Puerto Morelos, which is some 15 minutes from Cancun International Airport. The contrast between these two cities is immediately noticeable: Puerto Morelos is a far more relaxed, laid-back destination, popular with artists and craftsmen, fishermen and divers. In contrast, the glamorous Playa del Carmen is far more lively and vibrant, and is packed with tourists who flock to the beaches during the day and in the evening enjoy a drink at one of the many bars. The hotel address is: Carretera Chetumal - Puerto Juarez, km.309 Playa Paraíso, Quintana Roo –Mexico Phone +(52-984) 8772800 Fax: +(52-984) 8772810 Web site: http://www.iberostar.com/EN/Riviera-Maya-hotels/Iberostar-Paraiso-Beach.html For further information visit: www.mixing.net • www.23mixing.net Mayan Riviera Conference site characteristics Hotel: Iberostar Paraiso Beach The Iberostar Paraíso Beach is a family hotel built in traditional Mexican colonial style, with arches and columns throughout. The furniture in this All Inclusive hotel includes authentic works of art that wouldn't look out of place in an exhibition of fine art. Upon arrival at the hotel the superb wooden carvings in the reception area will immediately strike you. This is the perfect spot to escape from the crowds. The hotel is so large that a small train runs every 15 minutes transporting guests around the facilities to the restaurants, lobby, rooms and even the shopping mall and modern spa that form part of the Paraíso complex. Dinner in XCARET is included in the program As night falls on Xcaret, a fiesta awakens with the most famous musical performance in Mexico: Xcaret Mexico Espectacular. More than 300 artists on stage will amaze you with a vibrant musical journey through the history of Mexico, which brings to life colorful traditions and the heritage of the country Xcaret Mexico Espectacular will take you to presence an unforgettable display of Mexican traditional hand-made dresses, dances and musical performances that will stay in your heart forever. This is the most amazing representation of Mexico's national identity and cultural heritage. Dinners are served while guests enjoy Xcaret Mexico Espectacular. Knowing The Heart Of Maya´s Civilization Also included is a day-trip to Chichen Itza. It was the most important regional capital of the Mayan culture from 750 to 1200 B.C. Their structures are well conserved, as well as the Yucatan ancient Mayas tales. Their vestiges show the incredible Mayan civilization and architecture, enriched with other cultural currents of Mesoamerica. The temple of Kukulcán, also called "El Castillo”, is a magnificent construction of 23 meters of height in pyramidal form. It has four faces, in which during the equinox a shade of a serpent can be seen descending by the stairs of the building. You will also visit the Ball Game (the greatest of Mesoamerica), the Observatory, the Temple of the Soldiers with its figure of the Chac- Mool and the sacred cenote. For further information visit: www.mixing.net • www.23mixing.net