UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMAS DE ESTUDIOS DE POSGRADO Importancia del laboratorio clínico en el éxito de los trasplantes de células madre hematopoyéticas Trabajo final de investigación aplicada sometido a la consideración de la comisión de Estudios de Posgrado en Microbiología para optar por el grado y título de Especialidad en Hematología Daniela Villalobos Zúñiga Carné: A96811 Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa rica ii iii Tabla de contenido Portada i Hoja de aprobación ii Tabla de contenido iii Resumen v Lista de cuadros vi Lista de figuras vii Lista de abreviaturas viii Autorización para digitalización x Introducción 1 Objetivos 3 Objetivo general 3 Objetivos específicos Contenido 1. Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas 6 1.1 Generalidade de Trasplantes 6 1.2 Tipos de trasplantes 7 1.3 Uso de trasplantes en diferentes enfermedades 9 1.4 Enfermedades hematológicas adquiridas 14 1.5 Enfermedades hematológicas hereditarias 14 2. Procedimientos de preparación del paciente previo al trasplante 16 2.1 Sistema de evaluación de riego EBMT 16 2.2 Preparación del paciente 20 2.3 Quimioterapia y/o radioterapia previo al trasplante 22 3. Recolección de células CD34+ en trasplantes autólogos y alogénicos 24 3.1 Movilización de células madre 24 3.2 Procedimiento de recolección 26 iv 3.2.1 Leucoaféresis 27 3.2.2 Aspiraciones repetidas a partir de la cresta ilíaca 28 3.3 Recuento de células CD34+ 32 4. Sistema MHC, evaluación pre-trasplante y su manejo para evitar complicaciones 36 4.1 Herencia y generalidades del Sistema de Histocompatibilidad 37 4.1.1 Generalidades del Sistema de Histocompatibilidad 37 4.1.2 Herencia y expresión de los genes MHC 39 4.2 Pruebas de laboratorio-emparejamiento 40 4.2.1 Determinación de HLA por métodos serológicos 41 4.2.2 Determinación de HLA por métodos moleculares 41 4.3 Evaluación del injerto mediante estudio de quimeras 44 4.3.1 Métodos para analizar el quimerismo 44 Conclusiones 48 Referencias bibliográficas 49 v Resumen El trasplante de células madre hematopoyéticas es la única terapia curativa tanto para desordenes hereditarios que afectan la médula ósea como para enfermedades adquiridas, el procedimiento consiste en reponer células madre con capacidad regenerativa y proliferativa y así lograr la regeneración., En los últimos años, se ha logrado mucho éxito en el uso de esta terapia. Por lo tanto, cada vez se realizan más de estos tratamientos alrededor del mundo, tanto en países desarrollados como subdesarrollados Sin embargo, es una terapia que requiere de muchos puntos de control para lograr su éxito. En la presente revisión se mencionan las principales generalidades de este procedimiento, así como pruebas especializadas laboratorio que se consideran puntos de control en el proceso de trasplante de células madre hematopoyéticas; como lo son la tipificación del HLA del paciente y sus posibles donadores para evitar la enfermedad de injerto versus huésped, la recolección de células madre y su consecuente recuente previo al trasplante así como el control de la quimera del paciente posterior al procedimiento. vi Lista de cuadros Cuadro 1. Definición de riesgo según EBMT 19 Cuadro 2. Probabilidad (%) de TRM (mortalidad relacionada al trasplante) a los 5 20 años utilizando la definición de riesgo según EBMT Cuadro 3. Probabilidad (%) de sobrevida global (OS) a los 5 años aplicando el risk 20 score según EBMT Cuadro 4. Evaluaciones recomendadas previas al trasplante 22 Cuadro 5.Principales tipos de acondicionamiento y sus características principales 24 Cuadro 6. Protocolo recomendado por la EMBT para realizar el recuento de células 34 CD34+ vii Lista de figuras Figura 1. Esquema de división según densidades que utilizan los procedimientos 29 de aféresis para realizar la separación de los diferentes componentes sanguíneos Figura 2. Centrífuga encargada de realizar la separación de los diferentes 30 componentes sanguíneos Figura 3. Representación esquemática del proceso de separación de componentes 31 sanguíneos realizado por el equipo “Spectra Opthia Apheresis” Figura 4. Descripción del área de detritos celulares que debe ser eliminada para 35 realizar el análisis por citometría de flujo de las células CD34+ Figura 5. Representación de la selección de áreas CD45 y CD34 por citometría 36 de flujo Figura 6. Organización del Complejo Mayor de Histocompatibilidad en humanos 38 Figura 7. Posibilidades de herencia de haplotipo HLA en familia humana típica 39 Figura 8. Representación de la electroforesis a la que se someten los productos de 45 PCR con el fin de determinar la quimera en el paciente trasplantado y el cálculo realizado para estimar la cantidad relativa de ADN presente Figura 9. Puntos de control del laboratorio clínico, durante y posterior a un trasplante 47 células madre hematopoyéticas viii Lista de abreviaturas ADN Ácido Desoxirribonucleíco AIM Interfase de Manejo Automatizado CFU-GM Unidad Formadora de Colonias de granulocitos y Macrógafos CO Opción Clínica CMNC Colector Mononuclear Continúo CT Tomografías Computarizadas D En desarrollo EBMT Sociedad Europea para el Trasplante de Médula Ósea FAB Asociación Francoamericana-británica FITC Isotiocianato de Fluoresceína FSC Forward Scatter G-CSF Factor Estimulante de Colonias Granulocíticas GNR Generalmente No Recomendado HLA Complejo Antigénico Leucocitario Humano IMC Índice de Masa Corporal LLA Leucemia Linfoide Aguda LLC Leucemia Linfoide Crónica LMA Leucemia Mieloide Aguda LMC Leucemia Mieloide Crínica LNH Linfoma No Hodgkin MHC Sistema de Histocompatibilidad Mayor MM Mieloma Múltiple MO Médula Ósea OS Sobrevida Global PCR Reacción en cadena de Polimerasa PE Ficoeritrina PET Tomografía por Emisión de Positrones RC Remisión Completa ix S Estándar de Cuidado SMD Síndrome Mielodisplásico SP Sangre Periférica SSC Side Scatter TRM Mortalidad relacionada al Trasplante x xi 1 Introducción El trasplante de células madre hematopoyéticas es la única terapia curativa tanto para desordenes hereditarios que afectan la médula ósea como para enfermedades adquiridas, el desarrollo de la técnica empezó a ser utilizada con el fin de regenerar la médula ósea, posterior a la depleción accidental con altas dosis de radiación(Chabannon et al., 2018) El procedimiento consiste en reponer células madre con capacidad regenerativa y proliferativa y así lograr la regeneración. El trasplante puede ser autólogo o alogénico, y la elección va a depender tanto de la patología del paciente, así como de las condiciones del sistema de salud del país donde se realice, ya que no es solo necesario cumplir con las bases de un sistema de salud, sino que se debe contar con el apoyo económico, legal y ético para poder realizar estos procedimientos, más si el trasplante a realizar es alogénico. (Chaudhri et al., 2017) En los últimos años, se ha logrado mucho éxito en el uso de esta terapia. Por lo tanto, cada vez se realizan más de estos tratamientos al año alrededor del mundo, tanto en países desarrollados como subdesarrollados(Chabannon et al., 2018). Sin embargo, es una terapia que requiere de muchos puntos de control para lograr su éxito. Con respecto a las malignidades hematológicas, estas corresponden al 6.5% de los tipos de cáncer alrededor del mundo, en Estados Unidos y Europa, se calcula que corresponde a un 9%, mientras que en Latinoamérica es menos conocida su incidencia.(Tietsche de Moraes Hungria et al., 2019). Según el padecimiento del paciente y el transcurso de la enfermedad el personal médico puede tomar la decisión de realizar un trasplante como medida curativa. La decisión más importante es cuanto más curable es la enfermedad con trasplante de células madre, en comparación con el uso de terapias menos intensas o estándar. Con respecto al tipo de trasplante (autólogo o alogénico), según la literatura corresponde a una de las decisiones más importantes y va a depender del diagnóstico; usualmente esta preestablecido para cada patología.(Duarte, et al. 2019). En caso de ser alogénico, en el 2 caso de Costa Rica que no se cuenta con banco de células madre se debe buscar un donador HLA compatible (haplo o HLAidéntico) y posteriormente evaluar que el procedimiento haya sido exitoso por medio de control con quimerismos.(Kropshofer et al., 2016). En el caso que el trasplante a realizar sea autólogo la recolección de la cantidad necesaria de células CD34+ es vital para garantizar el éxito del tratamiento (Zumbado, et al, 2014). Por otro lado debido a que muchos de los trasplantes que se complican a pesar de ser exitosos es a causa de infecciones bacterianas, así como virales, el control microbiológico de estos pacientes es vital.(Espinoza et al., 2018) En Costa Rica, a partir del 8 de noviembre de 1986, por decreto ejecutivo se autorizan las terapias regenerativas con células madre adultas, por lo tanto, es fundamental que a nivel país se cuente con el control de los parámetros necesarios para garantizar el éxito del procedimiento. (Decreto Ejecutivo No39986-S, 2016) 3 Objetivo general Estudiar los diferentes puntos de control en los que el laboratorio clínico ejerce su función a la hora de evaluar diferentes variables del proceso de trasplante de células madre hematopoyéticas. Objetivos específicos  Especificar el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas en pacientes con enfermedades hematológicas adquiridas como hereditarias.  Compilar las diferentes variables del paciente que se deben cumplir para que este sea seleccionado para realizar el trasplante y que este responda con éxito.  Estudiar como la movilización y conteo de células CD34 impactan el éxito o no de trasplante de células madre hematopoyéticas.  Evaluar la importancia del quimerismo para evitar la enfermedad de injerto versus huésped en pacientes trasplantados. 4 1. Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas 1.1 Generalidades de trasplantes Los trasplantes de células madre se empezaron a utilizar para regenerar la médula ósea (MO) posterior a la irradiación accidental y debido al efecto beneficioso que se observó tuvieron un gran auge (Chabannon et al., 2018). El procedimiento consiste en utilizar la capacidad regenerativa y de diferenciación que tienen las células madre hematopoyéticas para restaurar el tejido depletado. Majhail et al, define el trasplante de células madres como un proceso que inicia con el régimen de preparación y continua con la infusión de células madre y la posterior recuperación.(Majhail et al., 2015). Más de 60 años de estudios han permitido que esta técnica se convirtiera en la única donde hay un trasplante celular que es utilizado a gran escala (Chabannon et al., 2018). Además, el procedimiento se ha perfeccionado y diversificado; permitiendo el uso de diferentes recursos de células madre como lo es la MO, sangre periférica (SP) e incluso células provenientes del cordón umbilical, así como, el uso de unidades provenientes tanto de donadores emparentados como no emparentados(Chabannon et al., 2018). Con respecto a las células madres provenientes de sangre de cordón umbilical pueden ser utilizadas si son debidamente almacenadas y cumplen con “screening” de agentes potencialmente infecciosos como lo son los virus, este tipo de trasplante se utiliza principalmente en niños.(Fruchtman, 2003). Entre las ventajas que se mencionan en la literatura de esta fuente es que inmunológicamente los linfocitos T son “naive”, algo a favor a la hora de realizar el emparejamiento entre donador y receptor(Fraint et al., 2020). Entre las limitaciones que se mencionan en la literatura con respecto a las células provenientes de cordón umbilical se encuentran que su uso se limita principalmente a niños por la cantidad de células que logra ser recolectada, solo pueden ser utilizadas para enfermedades de la sangre hasta el momento y no pueden utilizarse en trasplantes autólogos en enfermedades hereditarias (Lamm, 2014). Además se reporta una lenta reconstitución hematopoyética lo que aumenta el riesgo de infecciones y sangrados en 5 el paciente trasplantado(Fraint et al., 2020). Estas características y las ventajas que se mencionan más adelante de otras fuentes de células madre han llevado a que el uso de este tipo de trasplante haya perdido popularidad en los últimos años (Passweg et al., 2016) Las otras dos fuentes que pueden ser utilizadas como recurso de células madre y hoy en día son las más empleadas son la sangre periférica y la médula ósea. Según Passeweg et al; cerca de un 95% de los autotrasplantes y un 75% de los alotrasplantes realizados en Europa en el 2016 provenían de sangre periférica. (Passweg et al., 2016) siendo esta fuente la más elegida debido al menor costo y tiempo requerido para la recolección. Entre otras ventajas que se han reportado a las células madre provenientes de SP se mencionan un tiempo de injerto más corto, menor necesidad de transfusiones, menor estancia hospitalaria, facilidad a la hora de realizar la recolección y además el sistema inmunológico se restaura de forma más rápida.(Zumbado Salas et al., 2014). Por otro lado las células madre obtenidas a partir de médula ósea se consideran las favoritas sí la principal necesidad es reducir la toxicidad (Dufour, 2019), y estos trasplantes se han asociado con un menor riesgo de desarrollar enfermedad de injerto versus huésped (Holtick et al., 2014). Sin embargo, no se han reportado diferencias significativas con respecto a la sobrevida libre de enfermedad y la global entre ambas fuentes de células progenitoras hematopoyéticas (Holtick et al., 2014) La elección del paciente a quien se va a trasplantar es un proceso complejo que no solo depende del diagnóstico del paciente, diferentes variables como la edad, comorbilidades, apoyo familiar, condición socioeconómica e incluso la motivación del paciente por someterse a este procedimiento juegan un papel muy importante a la hora de seleccionar los candidatos(Hamadani et al., 2010). En el caso de realizar alotrasplante, previo al procedimiento se utilizan altas dosis de quimio o radio-terapia con el fin de prevenir rechazo al injerto(Jagannath et al., 2016). Se administra terapia inmunosupresora para prevenir la enfermedad de injerto versus 6 huésped, la cual consiste en una respuesta de las células que provienen del donador contra las células del nuevo hospedero que se encuentra inmunocomprometido(Hernández Cancino et al., 2017) . A este pre-condicionamiento se le conoce como mieloablación e inmunoablación y se ajusta la intensidad según las necesidades del paciente (Fraint et al., 2020). La función de la irradiación a la que se somete el paciente a trasplantar es depletar las células vasculares como perivasculares de la médula ósea gracias a la activación de la vía de p53. Esto a su vez lleva a que las células madre restante o residual migren a sangre periférica. (Fraint et al., 2020). Posterior a esta preparación se realiza el trasplante por vía intravenosa (IV), las células madre viajan a sangre periférica y entre dos y cuatro semanas después inicia la producción nuevas células sanguíneas. (Jagannath et al., 2016) La quimioterapia principalmente se basa en agentes alquilantes, y es necesaria tanto en trasplantes autólogos como alogénicos (Dufour, 2019). Es definida como la combinación de agentes que llevan a pancitopenia profunda entre 1-3 semanas a partir de su administración, la pancitopenia va a ser prolongada y por lo general irreversible hasta lograr la restauración de la hematopoyesis posterior al injerto de céñulas hematopoyéticas (Bacigalupo et al., 2010) 1.2 Tipos de trasplantes En el caso de los trasplantes alogénicos como se sabe el donador debe ser HLA compatible con el paciente a trasplantar, y la disponibilidad de este donador corresponde al principal factor limitante en este tipo de trasplante(Fruchtman, 2003). En países donde se cuenta con donadores registrados se ha observado mayor morbilidad y mortalidad (Fruchtman, 2003), sin embargo, los avances han permitido ir sobrepasando este tipo de limitaciones. 7 Se considera, que si el donador no está relacionado con el receptor, pero hay un buen emparejamiento entre estos, lo que quiere decir que se obtiene lo que se ha definido como un 10/10 o 8/8 de identidad con respecto a la tipificación del HLA se puede utilizar sin ningún problema. Al hablar de trasplantes alogénicos, la mejor opción es el hermano HLA-idéntico, sin embargo, se ha estudiado que la sobrevida pos-trasplante es similar a la que se obtiene con donadores no relacionados en algunas enfermedades (Chaudhri et al., 2017). Debido a que hay mayor facilidad de conseguir donadores familiares haploidénticos, lo que quiere decir que el donador y el receptor solo son compatibles en un haplotipo del HLA, este tipo de trasplante es muy utilizado y para controlar la fuerte respuesta de aloreactividad entre donador y receptor se utilizan altas dosis de ciclofosfamida posterior a realizar el trasplante (Duarte et al., 2019). Es importante mencionar, que también se puede utilizar para prevenir la enfermedad de injerto versus huésped la globulina antitimocito, este tratamiento se ha asociado con mejoras importantes en la expectativa de vida en pacientes trasplantados pero aún no se tiene claro la dosis óptima, y altas dosis se han asociado con aumento de infecciones fatales, recaídas e injertos tardíos (Kawamura, 2019). En cuanto a los trasplantes autólogos, utilizan células madre obtenidas mediante aféresis a partir de SP, estas células son criopreservadas para ser posteriormente re-infundidas en el paciente posterior a altas dosis de quimio y radioterapia. En este tipo de trasplante el efecto anti tumor es debido al tratamiento utilizado (quimio y radioterapia)(Bazinet & Popradi, 2019). 1.3 Usos en diferentes enfermedades Aunque el trasplante de médula ósea se ha visto como una buena opción para muchas enfermedades, durante el paso de los años se ha logrado estratificar según sus beneficios e inconvenientes para las diferentes patologías. Además se debe tener en cuenta el riesgo asociado tanto a la enfermedad como al procedimiento en sí, sin dejar de lado la estrategia a seguir sí el trasplante no se realiza (Duarte et al., 2019) 8 Según la sociedad europea de trasplante (EBMT) el realizar un trasplante o no lo clasifican en cuatro categorías según el grado de evidencia que se tenga para el padecimiento en particular, por lo tanto el grado I corresponde a enfermedades donde al menos se tiene un ensayo al azar bien ejecutado, para el grado II se cuenta con evidencia de al menos un ensayo que no sea al azar, casos clínicos controlados (preferiblemente de diferentes centros) o hay resultados muy importantes a partir de experimentos no controlados. Y por último el grado III en donde ya se tiene evidencia y experiencia clínica e incluso hay estudios y reportes de comités expertos (Duarte et al., 2019). Las categorías que utiliza EBMT son las siguientes: - Estándar de cuidado (S): el uso de trasplante está bien definido y se han obtenido resultados favorables o mejores con respecto a los pacientes que no son trasplantados. - Opción clínica (CO): estudios en cohortes pequeñas de pacientes han demostrado eficacia y toxicidad aceptable, pero se ha utilizado en pocos pacientes. Por lo tanto la decisión de realizar el trasplante es individual según el paciente. - En desarrollo (D): en esta categoría la experiencia es limitada y es necesario realizar más estudios. Por lo general, cuando se realizan estos protocolos debe haber aprobación por parte del comité de ética y se debe cumplir con diferentes estándares. - Generalmente no recomendado(GNR): en este caso los trasplantes no han probado ser beneficiosos para el paciente, podría ser por la edad del paciente o el estado de avance en la enfermedad en la que este se encuentre, donde se considere que puede traer más riesgos que beneficios (Duarte et al., 2019). 9 En la literatura se menciona que debido a que existen muchas técnicas, incluyendo el recurso del cual se obtiene las células a trasplantar, así como los diferentes variaciones entre pacientes es difícil la interpretación de los datos para llegar a una conclusión de cuando es conveniente o no trasplantar (Duarte et al., 2019). 1.4 Enfermedades hematológicas adquiridas En pacientes con malignidades hematológicas aunque el trasplante es mucho más tóxico que la quimioterapia y la terapia inmunosupresora, representa la cura y por lo tanto solo está indicado en casos donde el paciente va a tener un mayor tiempo de sobrevida así como una mejor calidad de esta. Sin embargo la decisión de realizar un trasplante o no es paciente específico; por lo tanto el médico debe tener en cuenta las últimas recomendaciones que se encuentren en la literatura con cada caso.(Takami, 2018). En la presente revisión se van a tomar algunos ejemplos de enfermedades donde el trasplante es utilizado como opción curativa, basados en las principales malignidades hematológicas trasplantadas en Costa Rica. Leucemias agudas Leucemia mieloide aguda (LMA) Las leucemias mieloides agudas son una malignidad de células hematológicas precursoras (mieloblastos) que se acumulan en la médula ósea a expensas de sus contrapartes normales, su diagnóstico se puede hacer mediante citomorfología en médula ósea o sangre periférica y el inmunofenotipo, y las caracterizaciones citogenéticas y moleculares se realizan para clasificar estas malignidades en los diferentes subtipos(Dufour, 2019). En el caso de las leucemias mieloides agudas se considera como pacientes con un mal pronóstico y por lo tanto mayor posibilidad de ser candidato a trasplante aquel que presente un recuento leucocitario ≥20 000/µL en el momento de realizar el diagnóstico. Además que sea clasificada como M0, 6 o 7 según la clasificación franco-americana 10 británica (FAB), que falle la inducción inicial, que presente un riesgo citogenético intermedio lo que quiere decir que presente alguno de los siguientes cariotipos: normal, +8, +6, +21, -Y, del [12p ], un riesgo pobre como lo son las anormalidades del cromosoma 5 o 7, 11q23 o un cariotipo complejo con más de 3 anormalidades, t(6;9), t(9;22), etc.(Takami, 2018) . Pacientes que presenten una remisión completa (RC) pero que sin embargo su enfermedad mínima residual (EMR) es positiva, van a ser considerados como candidatos a trasplante alogénico, el autólogo se va a considerar en aquellos s que presenten un cariotipo favorable o que tengan un riesgo intermedio(Takami, 2018). En el caso de la población que tenga más de 65 años se debe evaluar las morbilidades que esté presente, así como el estado de sus órganos (Takami, 2018). Se debe tener en cuenta que en la literatura no se recomienda el trasplante alogénico en sujetos que se encuentren en su primera remisión y además presenten subtipos citogenéticos favorables como la t(8;21); inv(16). Sin embargo, en aquellos que son diagnosticados con LMA M3 en donde persista la mutación PML/RARA posterior a la consolidación o al uso de tratamiento agresivo se recomienda realizar el trasplante con un hermano HLA idéntico e incluso con donador no emparentado que sea HLA- compatible(Ljungman et al., 2006). Leucemia linfoide aguda (LLA) La leucemia linfoide aguda es una transformación maligna de células progenitoras linfoides en la médula ósea, sangre y sitios extramedulares, su incidencia es bimodal, el primer pico se da en la infancia y en la edad adulta es común después de los 50 años. (Carreras et al., 2018). En los últimos años se ha observado que no se obtienen los mismo resultados en cuanto a sobrevida en pacientes pediátricos y en adultos que cursan con leucemia linfoide aguda, según la literatura la sobrevida es de 80-90% en niños mientras que en adultos esta apenas alcanza aproximadamente un 60% (Bassan et al., 2018); es por esto que se han empezado a utilizar los regímenes quimioterapéuticos de la población pediátrica en adultos, principalmente en adolescentes y adultos jóvenes (≤40 años) logrando aumentar la sobrevida general hasta 80% (Bassan et al., 2018). 11 Además existen nuevas terapias prometedoras como son el uso de anticuerpos monoclonales, inmunomoduladores, receptores de células T quiméricos; así como drogas dirigidas a moléculas específicas involucradas en la proliferación de células leucémica (Bassan et al., 2018). La LLA es una enfermedad muy heterogénea, y debido a esto se ha tenido que subclasificar para determinar en cuales pacientes es necesario un tratamiento más intenso, tomando en cuenta incluso el trasplante de células hematopoyéticas (Bassan et al., 2018). Entre los factores de riesgo se incluyen la hiperleucocitosis, fenotipo, la citogenética y genética adversos, ejemplos de estos serían las translocaciones t(9;22)/BCR-ABL, t(4;11)/KMT2A-AFF1, hipodiploidía, TP53 mutado, etc. (Bassan et al., 2018). Debido a esta heterogeneidad el trasplante no se propone de forma sistemática en personas con riesgo moderado, principalmente si la enfermedad mínima residual es negativa. Sin embargo, se considera como opción terapéutica en pacientes de alto riesgo, tales como, resistentes a esteroides o quimioterapia y que ha recaído después de completar su primera remisión. (Duarte et al., 2019). También se considera como opción terapéutica en aquellos que recaigan posterior a su segunda remisión completa. El trasplante autólogo es opción tanto aquellos casos Ph+ como Ph-negativo siempre y cuando la enfermedad mínima residual esté negativa y no se recomienda en población de riesgo alto (Duarte et al., 2019). Leucemias agudas en población pediátrica En el caso de los niños diagnosticados con leucemia mieloide aguda, según la literatura entre un 50-60% van a lograr una sobrevida prolongada al utilizar la quimioterapia, incluso si están clasificados como pacientes de alto riesgo, por lo tanto no es común que en estos casos se realicen trasplantes (Takami, 2018). Sin embargo, existen casos donde no se obtienen los resultados esperados con la quimioterapia por sí sola y en estos casos que por lo general son de muy alto riesgo, o ya han tenido recaídas anteriores el 12 trasplante alogénico junto con la quimioterapia como medida para eliminar cualquier rasgo de malignidad van a tener un papel curativo (Merli et al., 2019). Leucemia linfoide y mieloide crónica En el caso de la leucemia mieloide crónica desde que se cuenta con inhibidores de tirosin-kinasa el trasplante no se considera como tratamiento de primera línea al momento del diagnóstico de LMC. Según las guías europeas, cuando hay fallo de dos líneas de tratamiento es cuando se debe considerar el trasplante (Duarte et al., 2019). En el caso de la leucemia linfoide crónica el uso de inhibidores en la vía de señalización como lo es el Ibrutinib han hecho que la EBMT proponga como LLC de alto riesgo los pacientes que tengan anormalidades en TP53 y en la respuesta a inhibidores, lo que quiere decir que estos serán los candidatos a ser trasplantados (Cwynarski et al., 2012). Linfoma de Hodgkin En los pacientes que cursan con esta malignidad el trasplante de células madre autólogo es la primera opción en aquellos casos que recaigan posterior a la quimioterapia, esto corresponde entre un 20-30% de los sujetos; (Broccoli & Zinzani, 2019) este procedimiento es efectivo en un 50% de los casos (Broccoli & Zinzani, 2019). Las personas que recaen, por lo general lo hacen a los 2-3 años post-trasplante y la primera evidencia clínica que presentan por lo general es la presencia de síntomas B y avance en el estadio Ann Arbor. Cuando hay recaída posterior al autoinjerto se puede considerar el realizar el trasplante alogénico, sin embargo en la literatura se reporta que los datos históricos muestran mal pronóstico en el 80% de estos pacientes con posibilidad de morir en los 5 años próximos (Alois Gratwohl et al., 2019)(Broccoli & Zinzani, 2019). Linfoma Difuso de Células B grandes EL linfoma difuso de células B grandes es el subtipo de linfomas no Hodgkin más común, comprende cerca del 30% de los casos nuevos. (González-Barca et al., 2020). El tratamiento de primera línea es el rituximab junto con antraciclinas como quimioterapéutico. (González-Barca et al., 2020). En estos sujetos, el trasplante 13 autólogo es tratamiento de elección cuando recaen posterior a la primera línea, sin embargo entre el 30-40% de los pacientes recaen, teniendo una sobrevida muy pobre que va de los 3 a los 9 meses. La principal opción de tratamiento posterior a la recaída consiste en una terapia salvaje, que consiste en combinaciones de diferentes quimioterapéuticos. Los últimos estudios recomiendan para estos pacientes la necesidad de tratamientos efectivos, donde se considera entre estos la terapia celular con CAR T .(Duarte et al., 2019) (González-Barca et al., 2020) Linfoma Folicular La recomendación en este tipo de tumor es realizar el trasplante posterior a la primera remisión completa como consolidación(Alois Gratwohl et al., 2019). Estudios comparativos entre trasplantes autólogos y alogénicos han demostrado que los alotrasplantes presentan mortalidad mucho mayor asociada con la intensidad del tratamiento acondicionador pero la posibilidad de recaer es mucho menor; se cree que la recaída es alta al realizar el trasplante autólogo debido a la infusión de células de linfoma ocultas.(van Besien, 2015). Linfomas de células T Este linfoma es de muy mal pronóstico y por tanto, altas dosis terapéuticas seguidas de trasplante autólogo es ampliamente recomendado para la consolidación del tratamiento posterior a completar la remisión completa, aunque esta indicación aún es controversial debido a que no se han obtenido los resultados esperados (Schmitz et al., 2018)(Duarte et al., 2019). El trasplante alogénico es una opción a considerar ya que se ha logrado prolongar la expectativa de vida en un 30-50% de quienes reciben el injerto y la sobrevida general de 5 años en un 30-40%.(Dufour, 2019) (Schmitz et al., 2018). Mieloma Múltiple (MM) Con respecto al MM en los últimos años se han dado muchos cambios en la terapia utilizada, como lo ha sido la introducción de drogas inmunomoduladoras, los inhibidores de proteasomas, así como el uso de anticuerpos monoclonales(Kazandjian 14 et al., 2020); sin embargo, en la literatura se reporta una mejor sobrevida en pacientes que han recibido ya sea una dosis alta de quimioterapia o un trasplante de células madre alogénico (Shah et al., 2015), pero esto podría ser por la falta de estudios y de experiencia con las nuevas drogas. La terapia con altas dosis de melfalán junto con el trasplante de células madre se considera la mejor opción de tratamiento en pacientes que califiquen para esta terapia, sin embargo, los estudios continúan debido a la alta toxicidad y a los riesgos que existen a futuro como lo es la posibilidad aumentada a desarrollar síndrome mielodisplásico (SMD) y leucemia aguda con respecto a quienes no reciben este tratamiento. (Kazandjian et al., 2020) Actualmente el trasplante autólogo como primera línea se considera un tratamiento adecuado en pacientes que son recién diagnosticados. Sin embargo, se han observado mejores resultados en quienes han sido tratados previo al trasplante (Duarte et al., 2019). Se han realizado dobles autotrasplantes en aquellos casos que tienen mal pronóstico, que no logran la remisión completa o presentan una remisión parcial muy buena, presentando mejores resultados que en la población a la que se le realizó un único trasplante(Duarte et al., 2019). El trasplante alogénico junto con el uso de ciclofosfamida posterior al procedimiento, ha demostrado ser una muy buena opción; sin embargo, la recaída sigue siendo un problema (Duarte et al., 2019). Según la literatura, entre lo más significativo que se ha logrado al realizar trasplantes es el aumentar la sobrevida de los pacientes de riesgo moderado de 36 meses a más de 5 años(Shah et al., 2015). Además, no se ha encontrado una diferencia significativa con respecto a sí el trasplante se hace tempranamente o ya de una forma tardía, y la edad no se considera un factor limitante para obtener resultados exitosos (Shah et al., 2015). 1.5 Enfermedades hematológicas hereditarias Las enfermedades hematológicas hereditarias, en donde la médula ósea falla en alguna parte del proceso de generación de células sanguíneas, como lo son por ejemplo la β- 15 talasemia y la drepanocitosis, las cuales son de las enfermedades genéticas más comunes a nivel mundial (Gaziev & Lucarelli, 2003) y además, se ha logrado controlar sus manifestaciones clínicas con terapias como las transfusiones sanguíneas, la hidroxiurea, etc; a lo largo de la vida estos pacientes van desarrollando diferentes complicaciones, tales como, múltiples disfunciones endocrinas, fibrosis en el hígado, enfermedades cardíacas, así como infecciones virales postransfusionales. (Gaziev & Lucarelli, 2003). En estos pacientes la única forma de lograr la cura es realizando trasplante de células madre hematológicas o con terapia génica.(Gaziev & Lucarelli, 2003) En pacientes con β-talasemia se evalúa el realzar trasplante según tres factores: hepatomegalia de más de 2 cm, fibrosis hepática y terapia de quelación de hierro irregular. (Gaziev & Lucarelli, 2003). Y es importante tomar en cuenta que a pesar que el paciente se cura de la enfermedad igual en los órganos de este va a haber un exceso de hierro el cual debe tratar de ser depletado pos trasplante, e incluso se recomienda el realizar flebotomías con el fin de eliminar el exceso de hierro del cuerpo (Gaziev & Lucarelli, 2003). Entre los obstáculos que se encuentran al realizar este procedimiento se encuentran la ausencia de hermanos HLA idénticos, la gran variabilidad que se puede encontrar dentro de estas enfermedades entre pacientes y además no hay criterios aceptados para clasificar a los pacientes con alto riesgo a morir(Gaziev & Lucarelli, 2003). Con respecto a la falta de pacientes que tengan un donador HLA idéntico se propone utilizar donadores no emparentados. (Gaziev & Lucarelli, 2003). En el caso de la drepanocitosis, debido al tamizaje que se les realiza a los recién nacidos, así como el buen manejo para prevenir las crisis de dolor con la hidroxiurea, el screening transcraneal mediante la prueba de Doppler y las transfusiones crónicas de glóbulos rojos se ha logrado prevenir complicaciones en la niñez y mejorar la sobrevida en adultos (Krishnamurti et al., 2019). .El trasplante de médula ósea proveniente de un hermano HLA-idéntico es una potencial cura; sin embargo no ha sido utilizado ampliamente, se considera como opción terapéutica en adultos que presenten 16 drepanocitosis severa. En Estados Unidos se considera una traba el que solo el 18% de estos pacientes cuenta con potencial donador que sea hermano HLA-idéntico y la probabilidad de encontrar donador no relacionado HLA-idéntico apenas aumenta en 1 punto porcentual (Krishnamurti et al., 2019). 2. Procedimiento para preparar al paciente posterior al proceso de selección y antes de realizar el trasplante A la hora de elegir el donador, es necesario tomar en consideración algunos factores clínicos del paciente como lo son la enfermedad de fondo y el estadio en que se encuentra; así como la urgencia de realizar el trasplante (Majhail et al., 2015), esto con el fin de evaluar el riesgo-beneficio del paciente al realizar el procedimiento. Además, antes de realizar el procedimiento existen diferentes variables que son deseables o necesarias para poder iniciar el trasplante. 2.1 Sistema de evaluación de riesgo del EBMT El EBMT cuenta con una herramienta que permite evaluar el riesgo asociado al procedimiento que se va a someter. Se consideran cinco factores clave, que son: la edad del paciente, estado de la enfermedad, el tiempo que ha transcurrido a partir del diagnóstico, el tipo de donador y el sexo del receptor (A. Gratwohl, 2012). La puntuación va de 0 a 7 donde 0 corresponde a la mejor puntuación que se puede obtener mientras que 7 a la peor. Este sistema se puede utilizar en todos los desórdenes hematológicos adquiridos tanto para trasplantes autólogos como alogénicos, no se toma en cuenta la tecnología que decida utilizarse ni el condicionamiento al que se someta al paciente (A. Gratwohl, 2012). Se ha asociado el resultado obtenido con esta herramienta con el riesgo a recaída y la sobrevida posterior a realizar el trasplante en LMA, LLA, SMD, SMP, LNH, MM y AA. (A. Gratwohl, 2012). Factores de riesgo Edad del paciente: como se observa en el cuadro 1, entre mayor sea el paciente va a haber más riesgo de sufrir complicaciones, sus periodos de recuperación van a ser más 17 largos y no va a tolerar las drogas de la misma forma que un paciente más joven (A. Gratwohl, 2012). Además una observación que se le realiza a esta clasificación es que probablemente muy pronto se le debe agregar una categoría correspondiente a pacientes mayores de 60 años, debido a que los trasplantes en este grupo etario ha aumentado significativamente (A. Gratwohl, 2012). Estadio de la enfermedad: esta clasificación al inicio se basaba en las etapas de la LMC (fase crónica, acelerada y blástica), pero se ha ido cambiando con el fin de adaptarlo a las otras enfermedades hematológicas adquiridas; hoy en día se utilizan los términos etapa temprana, intermedia y tardía.  Etapa temprana: no otorga puntos e incluye leucemias agudas trasplantadas en su primera remisión completa, SMD no tratados o en la primera remisión, LMC en fase crónica, LNH y MM trasplantados, no tratados o en su primera remisión completa.  Etapa o estadio intermedio: otorga un punto y corresponde a leucemias agudas en segunda remisión completa, LMC en la segunda o tercera fase crónica o la primera fase acelerada, SMD en segunda remisión completa o en respuesta parcial, linfoma y mieloma múltiple en segunda remisión completa, en respuesta parcial o cuando la enfermedad se ha mantenido estable.  Etapa tardía: aquí se otorgan dos puntos y se posicionan las leucemias en cualquier otra fase, los linfomas y mielomas que no sean tempranos e intermedios. (A. Gratwohl, 2012) Tiempo entre el diagnóstico y el trasplante: se ha observado que la mortalidad libre de recaída y el riesgo de recaer aumenta entre mayor sea el tiempo entre el diagnóstico y el trasplante; sin embargo aún no se sabe la causa exacta de esto. El sistema de puntuación del EBMT le otorga 1 punto cuando el tiempo transcurrido es más de un año y si es menos no le suma ningún puntaje (A. Gratwohl, 2012). 18 Tipo de donador: EBMT toma en cuenta hermanos HLA-idénticos a los que no les otorga ninguna puntuación, mientras que a donadores no relacionados les da un punto. Es importante mencionar que no se toma en cuenta trasplantes de donadores gemelos debido a que son muy pocos los casos así, ni los trasplantes donde el donador es haploidéntico(A. Gratwohl, 2012). Combinación de sexos entre receptor y donador: desde los primeros trasplantes en anemias aplásicas se reconoció el riesgo a rechazo aumentado cuando se realizaba el trasplante de un donador masculino (XX) a uno femenino (XY) donde in vitro se podían observar tanto respuestas humorales como celulares (A. Gratwohl, 2012). Mientras que si el receptor era masculino y el trasplante provenía de una donadora femenina lo que se observaba era mayor incidencia de enfermedad de injerto versus huésped, así como menos riesgo de sufrir recaídas (A. Gratwohl, 2012). 19 Cuadro 1. Definición de riesgo según EBMT. Obtenida de (A. Gratwohl, 2012). Este sistema ha permitido predecir la probabilidad de sobrevida aproximada a los 5 años, así como la mortalidad relacionada al trasplante de las principales enfermedades como se observa en los cuadros 2 y 3(Dufour, 2019). Factor de riesgo Puntuación Edad del paciente <20 20 - 40 0 1 >40 2 Estadio de la enfermedad Temprana 0 Intermedia 1 Tardía 2 Intervalo de tiempo entre el diagnóstico y el trasplante (meses) <12 0 >12 1 Tipo de donador Hermano HLA-idéntico 0 Donador no relacionado 1 Combinación de sexos entre donador- receptor Cualquier otro 0 Donador femenino, receptor masculino 1 20 Puntos 0 1 2 3 4 5 6-7 LMA 14 20 25 30 36 40 41 LLA 15 23 24 30 40 47 53 LMC 15 22 30 38 45 52 55 AA 18 26 40 49 52 SMD 25 28 30 35 38 46 50 MM 29 35 40 42 52 LNH 15 24 28 30 34 36 38 Cuadro 2. Probabilidad (%) de TRM (mortalidad relacionada al trasplante) a los 5 años utilizando la definición de riesgo según EBMT. Obtenido de (Dufour, 2019) Puntos 0 1 2 3 4 5 6-7 LMA 68 59 52 38 30 23 18 LLA 66 52 43 38 22 16 14 LMC 76 72 60 51 39 26 14 AA 81 72 60 49 45 SMD 56 52 46 40 35 28 25 MM 48 40 36 22 17 LNH 75 59 50 48 43 40 38 Cuadro 3. Probabilidad (%) de sobrevida global (OS) a los 5 aplicando el puntaje de riesgo según EBMT. Obtenido de (Dufour, 2019) 2.2 Preparación del paciente Una vez que se han evaluado las condiciones del paciente y se toma la decisión de proceder con el trasplante, antes de iniciar el proceso es muy importante que el paciente y su familia se encuentren bien informados con respecto a lo que va a suceder, sus riesgos y beneficios; así como conocer características importantes del proceso al que se va a someter. Posterior a esto es necesario evaluar el estado del paciente, su hemograma, serologías, así como valorar su función, renal, pulmonar y cardíaca (Bompoint et al., 2018). 21 Los resultados obtenidos van a permitir condicionar el trasplante, lo que quiere decir que con estos se van a tomar las decisiones pertinentes con respecto al régimen de acondicionamiento, el tipo de injerto; así como la estrategia postrasplante (Bompoint et al., 2018). Clínicamente existes muchas herramientas y son las que utilizan los médicos para evaluar los factores de riesgo individuales. Estos al final tienen 4 objetivos principales que son: la primera y más importante es dar la indicación de que el paciente debe recibir un trasplante, informar sobre el procedimiento al que se le va a someter elegir el mejor donador, el acondicionamiento y evaluar la sobrevida postrasplante y por último, evaluar los resultados a larga escala porque en trasplantes como en los demás tratamientos es importante analizar si se están obteniendo los resultados que se esperan(Carreras et al., 2018). En el cuadro 4 se mencionan el panel sugerido de chequeo pretrasplante; sin embargo este va a depender de las condiciones del lugar donde se realice el trasplante. 22 Análisis recomendados pre-trasplante Hemograma completo Urea, electrolitos y función hepática Evaluación serológica: HIV, VHB, VHC, VHE, CMV y EBV Grupo sanguíneo Screening HLA Pruebas de coagulación Pacientes politransfundidos previo al trasplante se les debe realizar ferritina para evaluar la sobrecarga de hierro Evaluación de la función cardíaca Evaluación de la función renal: aclaramiento de creatinina Pruebas de función pulmonar Aspirado de médula ósea, evaluación citogenética CT/PET en pacientes con linfoma Colocar catéter central Electrocardiograma Cuadro 4. Evaluaciones recomendadas previo al trasplante según (Bompoint et al., 2018). 2.3 Quimioterapia y/o radioterapia previa al trasplante Antes de iniciar el trasplante per se, el paciente debe prepararse ya sea con quimio y/o radioterapia con el fin de eliminar la enfermedad subyacente (Bompoint et al., 2018). Con este régimen preparativo al que se somete el candidato receptor se espera: (1) Erradicar la malignidad hematológica (en caso que la haya); (2) Proveer la inmunoablación necesaria con el fin de que se garantice que se dé el injerto y a la vez prevenir el rechazo y la enfermedad de injerto vs huésped y por último pero no menos importante (3) Proveer de nichos en la médula ósea del receptor para las nuevas células madre que serán trasplantadas (Carreras et al., 2018). Este acondicionamiento va a tener como objetivos la mielodepleción que con esto lo que se espera es erradicar las células madre del hospedero y la linfodepleción en donde 23 se tiene como objetivo el sistema linfoide del receptor(Carreras et al., 2018). Entre los medicamentos que se utilizan algunos van a ser más mieloablativos como por ejemplo el melfalán o busulfan los cuales son agentes alquilantes que interfieren en la mitosis normal y en la replicación celular y ambos agentes penetran el sistema nervioso central (Kebriaei et al., 2013). Por otro lado, la ciclofosfamida y la fludarabina son de los medicamentos que se utilizan de forma más común en la linfodepleción y ambos agentes actúan impidiendo la replicación del ADN (Carreras et al., 2018). La irradiación corporal total también forma parte del acondicionamiento, hay condiciones especiales donde lo que se realiza es irradiación linfática total como lo son los trasplantes haploidénticos o también el médico tratante puede tomar la decisión de realizar un acondicionamiento libre de radiación (Carreras et al., 2018). El esquema y las dosis de administración varía según el protocolo que se utilice y además los regímenes varían según el tipo de trasplante. Incluso la intensidad, por ejemplo, va a ser mayor cuando se realizan trasplantes entre donador y receptor no emparentados en comparación con los que el donador es un hermano HLA compatible. (Carreras et al., 2018). Otros factores que se toman en cuenta son la edad, las comorbilidades y el riesgo de toxicidad órgano-específico (Carreras et al., 2018). El protocolo también varía en población pediátrica donde se deben tener presente el desarrollo y la pubertad. En el cuadro 5, se exponen características generales de los principales tipos de acondicionamiento que se realizan: 24 Tipo de acondicionamiento Generalidades Acondicionamiento mieloablativo sin irradiación total del cuerpo Se utiliza tanto en trasplantes autólogos como alogénicos Citopenias prolongadas Acondicionamiento no mieloablativo (intensidad y toxicidad reducida) Busca reducir la toxicidad, se utilizan principalmente en pacientes añosos Citopenias mínimas Acondicionamiento en trasplantes con donadores alternativos (MMUD, cordón umbilical y haploidénticos) Uso de globulinas anti-timocito Cuadro 5. Principales tipos de acondicionamiento y sus características principales. 3. Recolección de células CD34+ en trasplantes autólogos y alogénicos Posterior a la selección del paciente y la preparación de este; tanto si se va a realizar trasplante autólogo o alogénico se debe tener todo un protocolo con respecto a la obtención de las células madre que serán re infundidas en el receptor posteriormente. Según Fraint, et al; el principal desafío es el obtener la cantidad necesaria de células del donador con el fin de lograr la repoblación hematopoyética deseada(Fraint et al., 2020). 3.1 Movilización de células madre El término movilización se utilizó en un inicio para describir el aumento de progenitores mieloides (CFU-GM) circulantes posterior a la administración de endotoxinas en voluntarios sanos en 1977 (To et al., 2011). En 1976 se describieron altos niveles de CFU-GM en pacientes recuperados de quimioterapia mielosupresora; pero hasta la década de 1980 se estableció el uso de movilizadores en trasplantes de células madre hematopoyéticas; una única dosis alta de ciclofosfamida fue la terapia de elección como movilizador (To et al., 2011). 25 Las células madre circulan en muy baja cantidad por sangre periférica, por esta razón es necesario realizar la movilización. Según la literatura, la concentración de células madre en sangre periférica es de 10 a 100 veces menor que en la médula ósea (Bompoint et al., 2018). Para este proceso en la literatura se reportan dos estrategias diferentes una que se conoce en inglés como “steady-state” que se traduciría como estado estable y la movilización mediante quimioterapia (Dufour, 2019). Según estudios, en trasplantes a partir de hermanos, la dosis que se recomienda es 2x106 CD34 cel/kg como mínimo. Se ha observado que entre 4-5x106 CD34 cel/kg es una cantidad más aceptable en el caso de trasplantes de adultos ya que se han asociado con recuperación de neutrófilos y plaquetas más rápidas, así como, hospitalizaciones, transfusiones y terapia antibiótica reducida (Dufour, 2019). A pesar del amplio uso que se le ha dado a las células madre obtenidas a partir de sangre periférica, ha sido difícil llegar a un consenso con respecto a parámetros como el tipo de factor de crecimiento, la dosis óptima, la efectividad de la quimioterapia y su dosis, así como el momento adecuado para iniciar la leucoaféresis (Mohammadi et al., 2017). La movilización sin quimioterapia consiste en el uso de citoquinas únicamente. El protocolo recomendado debido a su baja toxicidad (Bompoint et al., 2018), incluye 10µg/kg por día de factor estimulante de colonias granulocíticas (G-CSF), el cuál va a inducir hiperplasia mieloide y liberación de células CD34+ a la circulación. Según las guías europeas se recomienda el uso de esta citoquina por 5-7 días consecutivos. (Dufour, 2019). Estas citoquinas van a inducir la activación y migración de leucocitos específicos y van a promover el proceso de “homing” de las células madre hacía la médula. La molécula CXCR4 es la responsable de anclar estas células a la matriz gracias a la interacción de moléculas como el factor 1-alfa derivado de células madre (SDF-1α)(Bompoint et al., 2018). La circulación de progenitores hematopoyéticos se logra con antagonistas de los receptores que bloqueen el sitio de activación como lo es el plerixafor. Esto es muy útil 26 en pacientes que se consideren movilizadores pobres como lo son los pacientes con mieloma múltiple y linfoma (Bompoint et al., 2018). Entre las ventajas de esta técnica de movilización se pueden mencionar la baja toxicidad, tiempo de leucoaféresis predecible, la administración es ambulatoria y los costos son reducidos en comparación con la movilización que utiliza quimioterapia. Según Luo, et al; la movilización utilizando únicamente G-CSF requiere de múltiples dosis, y se debe iniciar por lo menos 4 días antes de la primera aféresis, realizando entre 2-5 procedimientos para obtener la cantidad de células madre circulantes en sangre periférica adecuadas, condición que podría predisponer a efectos adversos (Luo et al., 2021). Además, los resultados de células CD34+ obtenidas son muy variables y más bajos que los que se obtienen cuando se utiliza quimioterapia como movilizador. Esta estrategia no se puede utilizar en quienes necesiten quimioterapia (Dufour, 2019). Con respecto a la movilización utilizando quimioterapia en combinación con el G-CSF, esta técnica es la mejor elección si se necesita disminuir la carga tumoral del paciente o es necesario recolectar un gran número de células madre hematopoyéticas. Sin embargo, es importante tomar en cuenta la toxicidad relacionada a la quimioterapia, los días de internamiento y su alto costo. Por otro lado, es difícil calcular cuando se va a dar el pico de CD34+ en sangre periférica por lo que es necesario estar realizando monitoreo diarios(Dufour, 2019). 3.2 Procedimiento de recolección Una vez que el paciente ha sido seleccionado y se ha determinado el procedimiento se continúa con el proceso de recolección. Existen dos metodologías para realizar la recolección de células madre; se puede lograr realizando aspiraciones repetidas de la médula ósea que se encuentra en la cresta pélvica o mediante leucoaféresis posterior a la movilización de células madre en sangre periférica (Carreras et al., 2018). En los últimos años, la recolección a partir de sangre periférica se ha considerado el estándar debido a que es menos estresante para el paciente y permite que el injerto se dé más rápidamente. (Dufour, 2019). 27 Aún existe el debate de cuando utilizar médula ósea (MO) y cuando sangre periférica (SP) como recurso de células madre. Según un metanálisis consultado donde se incluyeron 1521 pacientes tratados entre 1994-2009. Se ha observado una reducción estadísticamente significativa de enfermedad de injerto versus huésped en aquellos en los que se utilizó médula ósea como fuente de CD34+ con respecto a los que recibieron las células madre de sangre periférica; sin embargo se obtuvieron resultados semejantes con respecto a la supervivencia libre de enfermedad (Holtick et al., 2015). En cuanto a la incidencia de presentar recaídas, él estudió observó mejores resultados en pacientes donde se utilizó SP y donadores emparentados, pero no hubo diferencia significativa en aquellos casos donde su donador no estaba emparentado. (Holtick et al., 2015). En la década de 1990 solo cerca de un 30% de las recolectas se realizaban a partir de SP, mientras que en los años 2000 el Registro Internacional de Trasplante de Médula Ósea reportó un aumento de un 50-60% del total de trasplantes realizados aproximadamente. (Koca & Champlin, 2008). En términos generales, al utilizar SP como fuente de células madre, se ha observado mejores resultados con respecto a recuperación más pronta, o sea injerto celular más rápido, incluso se reporta que el injerto neutrofílico y plaquetario se da 5-6 días antes que utilizando médula ósea(Koca & Champlin, 2008). Pero a largo plazo han demostrado mayor morbi y mortalidad asociada a la enfermedad de injerto versus huésped. (Koca & Champlin, 2008) 3.2.1 Leucoaféresis Una vez que el personal clínico elige el procedimiento para obtener las células que van a ser trasplantadas es muy importante tomar en cuenta que la cantidad de células CD34+ puede variar de forma muy importante, debido a variables como: protocolo de movilización, condición del paciente, el momento en el que se haga la recuperación, el equipo que se utilice; así como la técnica del operador y el volumen sanguíneo procesado (Bompoint et al., 2018). 28 La aféresis por lo general se inicia cuando el conteo leucocitario es mayor a 2x109/L. (To et al., 2011)Según la literatura, el procedimiento de leucoaféresis no debe durar más de 5h, y en la mayoría de los casos es perjudicial realizar más de 4 procedimientos entre el cuarto y sexto día de haber iniciado la movilización para evitar generar estrés en el paciente (Dufour, 2019). Diferentes estudios que han evaluado la eficiencia de la recolección han observado que los factores que afectan la aféresis son: la edad, el género, el peso, el IMC, diagnóstico, Hb pre-colecta, recuento plaquetario, % de granulocitos inmaduros y recuento previo de células mononucleares(Chen et al., 2020) En las personas que se utiliza únicamente citoquinas como movilizador la recolección se debe hacer entre los días 4-5 que es donde se espera haber logrado el pico de CD34+; si el régimen utilizado es con quimioterapia y factor de crecimiento los días donde se espera un mejor rendimiento son entre el 12-15(Bompoint et al., 2018). En Costa Rica, el sistema utilizado para realizar la recolección de células CD34+ es el “Spectra Optia Apheresis”, este cuenta con una interfase automatizada que asiste al operador en la identificación y control durante la colección continúa de células mononucleares. La separación se da mediante centrifugación gracias a las diferentes densidades que presentan los componentes sanguíneos como se puede observar en la figura 1. 29 Figura 1. Esquema de división según densidades que utilizan los procedimientos de aféresis para realizar la separación de los diferentes componentes sanguíneos.(Cousins et al., 2012) De forma general, durante el proceso de aféresis el puerto de colección aspira el paquete leucocitario, rico en células mononucleares hacia la cámara de recolección donde las plaquetas se le retornan al paciente, mientras que las células mononucleares son retenidas. Al estar saturada la cámara el sistema inicia la fase de recolección, esta consiste en vaciar las células mononucleares acumuladas en la bolsa de recolección antes de continuar con las siguientes recopilaciones(Sanderson et al., 2017). Diferentes estudios han permitido el uso de diversos equipos de recolección y protocolos, actualmente se utiliza el set modificado que permite al operador controlar y modificar la bomba de flujo para proporcionar un flujo continuo y remover el paquete leucocitario acumulado en el canal sin necesidad de la cámara de colección(Sanderson et al., 2017). El proceso continuo para obtener células mononucleares, conocido por sus siglas en inglés como CMNC (Continuous Mononuclear Collection), el cual se representa en la figura 3. Este consiste en un sistema de recolección que obtiene la sangre del paciente 30 (rojo), antes de ingresar al equipo, esta se mezcla con el anticoagulante (naranja) y es bombeada dentro de una centrífuga que tiene diferentes compartimentos, los cuales semejan una red de tuberías como se observa en la figura 2, así la sangre es centrifugada a la velocidad requerida con el fin de obtener un producto empaquetado con un factor de 4.5 el cual está predeterminado por el fabricante. El sistema de manejo automatizado, AIM (Automated interface managment) por sus siglas en inglés ajusta el flujo de plasma para controlar que las células mononucleares fluyan hacia el puerto de recolección (morado) como se observa en la figura 3. Por otro lado, la bomba de plasma impulsa el plasma (amarillo) fuera del canal hacia el paciente o hacia una bolsa específica para plasma. Los glóbulos rojos son movilizados fuera del canal y hacia el reservorio donde se combinan con el plasma para ser retornados al paciente (celeste)(“Spectra Optia Apheresis System,” 2012) Figura 2. Centrífuga encargada de realizar la separación de los diferentes componentes sanguíneos(“Spectra Optia Apheresis System,” 2012). 31 Figura 3. Representación esquemática del proceso de separación de componentes sanguíneos realizado por el equipo “Spectra Optia Apheresis”. Rojo: sangre del paciente. Naranja: sangre del paciente junto con anticoagulante. Morado: células mononucleares recuperadas. Amarillo: plasma del paciente. Celeste: plasma, glóbulos rojos y demás restos celulares. Imagen facilitada por el Dr. Pablo Mora Fallas (elaboración propia) Según la literatura este sistema ha tenido muy buenos resultados en cuanto a la calidad del producto obtenido, se consideran contaminantes de la recolección células diferentes a las mononucleares, plaquetas y glóbulos rojos (Cousins et al., 2012). En un estudio multicéntrico observacional realizado en donadores sanos se demostró una eficacia de 77% de recolección de células CD34+ y un 99% de viabilidad en las células leucocitarias recolectadas (Cousins et al., 2012). Con respecto a los contaminantes, tanto para granulocitos como para plaquetas se reportó menos de un 20% de estas células. Otros estudios similares, han encontrado eficacias del 98%(Sanderson et al., 2017). 3.2.2 Aspiraciones repetidas a partir de cresta ilíaca La otra técnica que se puede utilizar al realizar la recolección celular es la más antigua, se realizan múltiples punciones en la cresta ilíaca. Es un proceso que requiere anestesia, además de médicos con experiencia. Debido a que es necesario obtener una cantidad suficiente de células se realizan aspiraciones de volúmenes que pueden ir desde los 2 mL hasta los 250mL según el centro médico donde se realicen.(Dufour, 2019). 32 En donadores sanos el riesgo de presentar complicaciones serias es bajo, por lo general con una hidratación adecuada y algunas veces con transfusiones de sangre, el proceso se realiza de forma ambulatoria sin necesidad que el donante sea hospitalizado (Bompoint et al., 2018). Por lo general el volumen cosechado de médula ósea es entre 10-15 ml por kg, esto para lograr la cantidad de CD34+ necesarias; lo que lleva a una pérdida de 800-1000 ml de sangre en un donador adulto. Muchas veces se les realiza transfusiones antes para minorizar los síntomas y también son aceptables las soluciones salinas o coloidales (Bompoint et al., 2018). 3.3 Recuento de células CD34+ Posterior al proceso de recolección, por cualquiera de los dos procesos mencionados anteriormente, se debe realizar el conteo de células CD34+ recolectadas, el recuento obtenido de estas células tiene un impacto directo en el éxito o no del procedimiento. Por lo tanto, al llegar a un consenso con respecto a uso de los parámetros de laboratorio podría llevar a una optimización en el proceso de recolección de CD34+(Makar et al., 2014). Sin embargo, autores como Makar et al mencionan que no hay consenso en cuanto al uso de pruebas para realizar el recuento. El proceso de recolección por lo general se realiza al día 5 de haber iniciado la movilización, sí el número de células obtenido es inadecuado, ó sea que no se alcanza un recuento de 2*106 cel/kg se puede continuar con el uso de G-CSF por 1-2 días(Dufour, 2019). Los niveles requeridos van a variar entre centros, pacientes y enfermedad de fondo(Bompoint et al., 2018). La medición de células CD34+ en sangre periférica antes de realizar la leucoaféresis no es mandatoria pero podría ayudar a estimar la recolección esperada y la duración del procedimiento (Dufour, 2019). Durante los últimos años la EBMT ha buscado la estandarización de los análisis por citometría de flujo, así como las implicaciones clínicas que tiene esta cuantificación de células CD34+ (Serke & Johnsen, 2001). Como se sabe, este es un antígeno que identifica a las células en un estadio temprano de diferenciación hematopoyética y que 33 ha demostrado ser muy útil en el proceso de movilización además de ser informativo a la hora de hacer predicciones con respecto al injerto (Serke & Johnsen, 2001). En el cuadro 6 se resume el protocolo que recomienda la EBMT para realizar la cuantificación de células CD34+ el cual es el que se utiliza en Costa Rica, tanto en el Hospital Nacional de Niños Dr. Carlos Sáenz Herrera, como en el Hospital San Juan de Dios. Tiempo de análisis 0-24 h después de la obtención, mantener a temperatura ambiente y sin agitación Recuento celular Conteo leucocitario del producto diluido 1:10 PBS (2 muestras diferentes) en analizador automatizado Volumen necesario 100µL de sangre o producto de leucoaféresis (0.5-1.0*106 células por prueba) Anticuerpo utilizado para realizar la prueba Ac CD34 clase III, y Ac pan-CD45 Anticuerpo control Definido por el usuario Dilución del anticuerpo Definido por una titración apropiada Incubación Definida por el usuario, normalmente 10- 15 min Lisis eritrocitaria Solución de lisis basada en cloruro de amonio Lavados No necesarios Fijación No necesaria, si el análisis se hace en las siguientes 4 horas Análisis Mínimo 50000 eventos celulares, debris eliminados utilizando CD45 Estimación de CD34 Número total de producto de leucoaféresis por Kg de paciente 34 (1) CD34% y número total de CD45+ en el producto o (2) Medidas volumétricas Cuadro 6. Protocolo recomendado por la EBMT para realizar el recuento de células CD34+. Con respecto a los métodos van a permitir una enumeración de células madre hematopoyéticas CD45+/CD34+ dobles positivas viables. Entre las muestras que se pueden analizar está la sangre periférica normal y movilizada, productos de leucoaféresis frescos y descongelados, médula ósea fresca y descongelada, y sangre de cordón umbilical fresca y descongelada. El análisis se puede realizar por doble plataforma en el cual se necesita conocer el total de leucocitos presentes en la muestra, por lo tanto la muestra también debe ser procesada por un analizador automatizado de hematología. El primer paso del procedimiento consiste en realizar marcaje de las células CD34+ con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y CD34 con ficoertitina (PE). Como control negativo, en Costa Rica se utiliza CD45FITC/isotipo 1 IgG1, este lo que permite es diferenciar las señales inespecíficas de las que son verdaderamente producidas por la unión Ac-CD34. (Jara-Segura et al., 2018). Otra metodología para realizar el recuento de células CD34+ es utilizando plataforma única, en donde el único equipo que se utiliza es el citómetro de flujo, por lo tanto, se utilizan microesferas con una concentración, tamaño e intensidad de fluorescencia conocida y así se determina el conteo absoluto de células CD34+. Para este proceso, según Jara et al., es necesario diluir la muestra para obtener recuentos menores o iguales a 2*106leucocitos/µL y el proceso de marcación es igual al explicado anteriormente. Y después de realizar el marcaje se adiciona la misma cantidad de esferas que el volumen de muestra utilizado (Jara-Segura et al., 2018). 35 Para ambas metodologías se debe compensar y calibrar el equipo, adquirir los eventos, eliminando restos celulares presentes que puedan afectar el análisis. Para este paso se utiliza el forward scatter (FSC) frente al side scatter (SSC) como se representa en la figura 4 donde los restos celulares corresponde al área marcada y representada en color gris(Biosciences, 2011). Figura 4. Descripción del área de detritos celulares que debe ser eliminada para realizar el análisis por citometría de flujo de las células CD34+. Obtenida de (Biosciences, 2011) Posteriormente, se deben seleccionar las células CD45+ y CD34+, como se observan en la figura 5, donde primero se enfrenta el SSC, ante el CD45 y las células representadas en azul corresponden a las células CD45+ y las celestes a los linfocitos. Luego de esto se seleccionan las células CD34+, en el gráfico donde se enfrenta SSC vs CD34. 36 Figura 5. Representación de la selección de áreas CD45+ y CD34+ por citometría de flujo. (Biosciences, 2011) En el caso de realizar el análisis por plataforma única se debe de comparar FITC vs SSC para seleccionar los eventos que representan las microesferas. (Jara-Segura et al., 2018). El conteo absoluto de CD34+ se obtiene con la concentración de esferas que otorga la casa comercial. Este proceso de recuento de células CD34+ es muy importante ya que como se ha mencionado antes este valor permite predecir las posibilidades de éxito que va a tener el trasplante, ya que se ha observado que a mayor recuento de CD34+ se da de forma más efectiva el injerto en el paciente. 4. Sistema de histocompatibilidad mayor (MHC) y la importancia de su evaluación pre-trasplante así como en el manejo post para evitar el rechazo injerto versus huésped. Antes de realizar el trasplante es muy importante saber si las células del donador van a ser compatibles con las del receptor para evitar en la mayor medida posible. La enfermedad eefermeda de injerto versus huésped. Como se sabela función principal del sistema inmune es generar una respuesta ante diferentes organismos. El complejo mayor de histocompatibilidad es el encargado de regular esta red del sistema inmune; sus genes van a participar en el reconocimiento de antígenos propios por los linfocitos T, en un proceso que incluye el reconocimiento de determinantes antigénicos extraños en unión 37 con antígenos propios, estos son las moléculas HLA codificadas por el MHC, este proceso se conoce como restricción de reconocimiento de antígenos y es el que le permite al sistema inmune responder a antígenos extraños, al mismo tiempo que reconoce activamente y no responde a los propios del individuo(Morales, 2014). La importancia que tiene la histocompatibilidad en el manejo de trasplantes, es que estas moléculas HLA también van a actuar como antígenos extraños al ser tan polimórficas, lo que va llevar a que sean un obstáculo a la hora de realizar trasplantes (Morales, 2014). Por lo tanto, es necesario que los centros donde se realicen trasplantes cuenten con las técnicas más sensibles para evitar complicaciones que van a afectar la morbilidad y mortalidad del paciente trasplantado. 4.1 Herencia y generalidades del sistema de histocompatibilidad 4.1.1 Generalidades sistema de histocompatibilidad El complejo mayor de histocompatibilidad corresponde a un grupo de genes que se encuentran en el cromosoma 6, a este también se le conoce como complejo antígeno leucocitario humano (HLA). Esta región genética, codifica por tres clases de moléculas y además hay genes que se consideran MHC clásicos y otros como no clásicos. En la figura 6 se observa la organización del HLA en los humanos, donde hay regiones que codifican la clase I (rosado), la clase II (azul) y la clase III (verde), donde la I y la II son las que se conocen como clásicas. Mientras que los de la clase III corresponde a otros componentes del sistema inmune, como proteínas del complemento y los factores de necrosis tumoral(Punt, 2020). 38 Figura 6. Organización del complejo mayor de histocompatibilidad en humanos. Obtenido de Inmunología por Kuby. Los genes de la MHC clase I codifican por glicoproteínas que se van a expresar casi que en todas las células nucleadas, y la función principal de estos productos es presentar antígenos exógenos a las células T CD8+. Por su parte, los genes MHC clase II codifican por glicoproteínas que van a estar expresadas en células presentadoras de antígenos (macrófagos, células dendríticas y células B) y van a presentar principalmente antígenos exógenos a células T CD4+. Mientras que las MHC clase III codifican por proteínas con funciones inmunes pero que no tienen una función directa con la presentación de antígenos a las células T(Punt, 2020). Los genes MHC clase I van a estar codificados en diferentes loci que son el HLA-A, HLA-B y HLA-C. La región de clase II del MHC contiene tres loci en humanos, HLA- DP, HLA-DQ y HLA-DR. Una característica particular con las moléculas MHC II es que pueden estar presentes múltiples genes en una o ambas cadenas (la α y la β) dentro de un locus, esto quiere decir que se puede poseer más de un gen DR de la cadena β en uno o ambos cromosomas y que todos se expresen en la misma célula. Además se pueden parear productos génicos de DR de la cadena α con productos de la cadena β; lo que llevaría a que en una misma célula se presenten varias moléculas MHC II únicas(Punt, 2020). Con las moléculas MHC clase III funciona un poco diferente, ya que estas no tienen participación en el procesamiento y presentación de antígenos. Estos genes codifican por proteínas con otras funciones muy importantes para el sistema inmune como los factores del complemento, etc(Punt, 2020). 39 4.1.2 Herencia y expresión de los genes MHC Los genes dentro del locus MHC son altamente polimórficos. Los genes de MHC (clase I, II y III) se encuentran muy juntos y la recombinación entre genes es más común cuando los genes están muy separados, Esta es la razón que sustenta que la mayoría de individuos heredan los alelos codificados por estos genes como un conjunto, el cual se conoce como haplotipo. Y cada individuo hereda un haplotipo proveniente del padre y otro de la madre(Punt, 2020). Lo más común es que los individuos sean heterocigotos para MHC, sin embargo, en poblaciones altamente endogámicas la descendencia podría ser homocigota, ó sea con moléculas MHC idénticas ya que los haplotipos heredados de la madre y los heredados del padre son idénticos(Punt, 2020). Con respecto a la expresión, estos genes lo hacen de forma codominante, lo que quiere decir que tanto los del padre como los de la madre se expresan al mismo tiempo y en las mismas células. En la figura 7, se observa una representación de la posible herencia en una familia humana típica, donde existe una posibilidad de una en cuatro que dos hermanos hereden los mismos haplotipos maternos y paternos, lo que los haría histocompatibles. También se puede observar que la descendencia podría aceptar injertos de cualquiera de sus padres. Sin embargo, no podrían aceptar injerto de su descendencia porque la mitad de moléculas se verán como “no propias” lo que llevaría a rechazo(Punt, 2020). Figura 7. Posibilidades de herencia de haplotipos HLA en familia humana típica. Obtenida de Inmunología por Kuby. 40 En los últimos años los estudios genéticos han permitido identificar más de 15000 alelos, estos se han basado principalmente en individuos de ascendencia europea y hay poblaciones como India o África donde los datos del genoma que se tienen disponibles actualmente no son representativos para la población. Por lo tanto aunque se tiene una idea de la amplia diversidad, aún se subestima el polimorfismo del MHC humano(Punt, 2020). Las implicaciones clínicas que tiene el no tener un genoma completo representativo del total de la población son sumamente importantes ya que por ejemplo, se dice que en Estados Unidos las personas con ascendencia africana tienen que esperar mucho más por un trasplante con respecto a los caucásicos; esto sumado a las diferencias raciales y económicas existentes(Punt, 2020). 4.2 Pruebas de laboratorio-emparejamiento HLA Con el monitorear y disminuir evitar la enfermedad de injerto vs huésped, existen diferentes métodos tanto serológicos como genéticos, los cuales comparan por lo general 10 alelos HLA; entre mayor sea el emparejamiento se disminuye el riesgo que el paciente sufra de enfermedad injerto vs huésped (Fraint et al., 2020). Para poder realizar un trasplante alogénico, es obligatorio realizar la determinación de los antígenos HLA en donante y receptor, el éxito en el trasplante a largo plazo está relacionado directamente con la compatibilidad entre ambos individuos en este sistema inmunitario (Ruiz et al., 2019). Con respecto a la determinación de HLA, la detección solía realizarse utilizando métodos serológicos, sin embargo las metodologías han ido cambiando con el paso del tiempo y ahora se prefieren los procedimientos moleculares debido a que estos permiten mayor definición a nivel alélico; esto se va a traducir en una probabilidad menor de rechazo(Ruiz et al., 2019). 41 4.2.1 Determinación HLA por métodos serológicos Los métodos serológicos, consisten en tipificar los alelos del sistema HLA que se expresan en un individuo. A partir de sangre total se recuperan los linfocitos del receptor y se enfrentan con sueros que contienen anticuerpos anti especificidades de HLA conocidas, por lo general provenientes de mujeres multíparas(Howell et al., 2010). Posteriormente, se adiciona complemento proveniente de conejo con el fin de producir la lisis celular en aquellos sueros que contengan anticuerpos específicos contra los determinantes antigénicos expresados en la superficie celular; esta técnica que fue ampliamente utilizada por muchos años se le llama prueba de microlinfocitoxicidad de Terasaki (Ruiz et al., 2019). Entre las principales limitaciones de esta metodología estaba la necesidad de contar con linfocitos vivos y en muchos candidatos a trasplante el recuento de estas células es bajo, además la resolución obtenida es adecuada para trasplantes renales pero no para trasplante de células madre hematopoyéticas(Howell et al., 2010). 4.2.2 Determinación de HLA por métodos moleculares En la actualidad las pruebas serológicas prácticamente han sido reemplazadas por técnicas moleculares, sin embargo pueden ser útiles si existe la necesidad de determinar algún alelo en particular expresado en la superficie celular(Howell et al., 2010).Se han incorporado técnicas moleculares que representan un gran avance en los estudios y selección de donantes, buscan compatibilidad en 5 loci, ó sea una identidad 10/10 a nivel alélico (Morales, 2014). Entre las ventajas de estas técnicas están que se requiere una cantidad muy pequeña de muestra, las células no deben estar viables para realizar el análisis, los procedimientos son fáciles de automatizar y se obtienen resultados más exactos y detallados. La desventaja que se puede mencionar es el costo debido a que tanto los equipos y los reactivos tienen un costo mayor que las pruebas serológicas (Arrieta-Bolaños & Salazar- Sánchez, 2010). 42 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica más utilizada actualmente y existen diferentes tipos que pueden ser utilizados, entre estos se encuentran la PCR con primers de secuencia específica (PCR-SSP) en donde se utilizan paneles de secuencias específicas que amplifican alelos o grupos de alelos HLA, donde se determina la presencia o ausencia de amplificación del material genético para un par de primers en particular que va a ser determinado en un gel de agarosa. Es un método que se considera de baja resolución y por lo general, es necesario utilizar un panel secundario para alcanzar el nivel tamizaje necesario(Howell et al., 2010). Otra técnica comúnmente empleada es el uso de ensayos es la hibridización utilizando sondas oligonucleótidos (PCR-SSOP), esta es más apropiada para la determinación de múltiples oligonucleótidos y se volvió más práctica aún al combinarse con amplificaciones específicas productos de PCR en formato de dot blot. (Erlich, 2012). En Costa Rica se utiliza el PCR en tiempo real la cual es una extensión del PCR-SSP, el ADN del paciente es extraído con primers alelo-específicos. Por lo general, en estos ensayos el ADN es aislado se mezcla con un colorante fluorescente el cual se agrega a platos de 384 pocilllos con primers alelo-específicos. Posteriormente el producto del PCR alcanza altas temperaturas y la liberación del colorante se utiliza como detector. Se utiliza un software que analiza las diferentes curvas y se le asignan los alelos específicos. Entre las ventajas de esta metodología es que se reduce el tiempo de análisis y la potencial contaminación ya que los productos no son manipulados posterior a la amplificación y tiene una excelente discriminación entre los tipos de HLA (Madden & Chabot-Richards, 2019). Después de obtener los resultados de compatibilidad se debe decidir si es factible utilizar el donador seleccionado. El donador óptimo es el hermano idéntico en ambos alelos en los locus HLA-A, B, C, DRB1 y DQB1 y se le conoce como el donador con la combinación perfecta 10/10, el problema es que solo va a estar disponible para un 15- 30% de los pacientes dependiendo del número de niños en las familias (Nowak, 2008). En aquellos sujetos que no tienen en su familia posibles donadores una buena opción es 43 conseguir un donador no relacionado con una combinación perfecta (10/10), encontrar este tipo de donador varía entre un 30-70% dependiendo del registro de donadores y la etnia del paciente (Nowak, 2008). Los demás pacientes que requieran trasplante poseen tres alternativas adicionales, donador familiar haploidéntico (5-9/ 10 alelos combinados), parcialmente combinados con cordón umbilical (3-6/6 alelos combinados en A, B y DRB1) y donadores no emparentados parcialmente combinados (7-9/10)(Nowak, 2008). Estas combinaciones pueden ser aceptadas por el médico tratante, sin embargo el efecto adverso que pueda tener el sistema de histocompatibilidad va a depender de la compatibilidad entre alelos. (Nowak, 2008). La correlación entre la tipificación del HLA y la disponibilidad de tecnología de alta resolución se ha evaluado en trasplantes de personas no relacionadas donde se obtiene la máxima supervivencia con una compatibilidad 8/8 en HLA-A, B, C y DRB1. Además se identificó que las incompatibilidades peor toleradas son las que se producen en HLA- A y DRB1, mientras que las de HLA-DQ y-DP no parecen estar relacionadas con la supervivencia de estos pacientes (Arrieta-Bolaños & Salazar-Sánchez, 2010). Además, en la literatura se reporta que cada incompatibilidad en el nivel de alta resolución en la tipificación reduce entre un 8 y 12% las probabilidades de supervivencia a 5 años de los pacientes sometidos a trasplante (Arrieta-Bolaños & Salazar-Sánchez, 2010). Es importante mencionar que hoy en Costa Rica se cuenta con las técnicas moleculares para realizar la determinación de HLA que se considera como deseable en los trasplantes de células madre hematopoyéticas, donde se dispone de HLA-A, -B, -C, –DRB1, DRB345 y DQB1. Sin embargo, con la llegada de metodologías como la secuenciación masiva en países más desarrollados se han comenzado a incorporar estas técnicas ´para la determinación de HLA, reportando entre sus principales ventajas que esta permite unir polimorfismos que se encuentren dentro del amplicón (ambigüedades) y la determinación masiva de un gran número de secuencias por corrida, lo que proveería de muchas secuencias exónicas e intrónicas por gen(Erlich, 2012). 44 4.3 Evaluación del injerto mediante estudio de quimeras Posterior a haber realizado el trasplante es necesario una constante evaluación de diversos parámetros con el fin de ver la evolución y estudiar el éxito o no del tratamiento realizado; e identificar el quimerismo es parte importante de este seguimiento. El quimerismo es el análisis del origen genotípico de la hematopoyesis post-trasplante (Bader et al., 2005), y es muy importante su determinación ya que da información con respecto al estado del injerto, recaída de la enfermedad, rechazo e incluso riesgo de enfermedad injerto versus huésped (Khan et al., 2004). En un inicio se creía que la hematopoyesis completa del donador era necesaria con el fin de mantener el injerto posterior al alo-trasplante de células hematopoyéticas. Sin embargo, en las últimas décadas se ha observado que la hematopoyesis por parte del donador y del receptor puede coexistir lo que se conoce como quimera mixta. Sí todas las células hematopoyéticas posterior a trasplante son del donador se dice que el paciente presenta una quimera completa. Se ha visto que esto es un proceso, y que pacientes que presenten quimera mixta después pueden presentarla completa y viceversa(Bader et al., 2005). 4.3.1 Métodos para analizar el quimerismo Se han desarrollado metodologías, todas bajo el mismo principio de utilizar diferencias en marcadores genéticos polimórficos y sus productos. Entre los métodos se incluyen citogenética, fenotipeo de glóbulos rojos, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción e hibridación de fluorescencia in situ del cromosoma sexual; siendo las principales limitaciones que son técnicas muy desgastantes y que no permiten caracterizar a todos los pacientes (Bader et al., 2005). Con el descubrimiento de la PCR se han utilizado diferentes técnicas asociadas para estudiar el quimerismo de pacientes trasplantados permitiendo caracterizar a todos los pacientes e incluso aumentado significativamente la sensibilidad (0.1-0.001%) de esta prueba(Bader et al., 2005)(Bailón, 2019). Para el diagnóstico de quimerismo en Costa 45 Rica se utiliza el análisis de STR (Short Tandem Repeats), estas son secuencias cortas de ADN altamente polimórficas, las cuales se repiten en cada sujeto de forma individual. Por lo tanto, cada persona, tendrá diferente número de unidades de repetición lo que permite que estas regiones del ADN sean útiles para identificar y diferenciar material genético. Estas regiones se marcan con primers específicos y se amplifican mediante PCR. Posterior a la amplificación se separan los fragmentos mediante electroforesis capilar para comprobar el número de repeticiones, se establecen los patrones y se comparan las muestras en estudio para establecer relaciones entre estas, como se observa en la figura 8 (Arce Jiménez et al., 2015)(Bailón, 2019). Además el quimerismo se cuantifica mediante software utilizando el área bajo los picos alélicos con el fin de estimar la cantidad relativa de ADN de donante y de receptor como se ejemplifica en la figura 8. Figura 8. Representación de la electroforesis a la que se someten los productos de PCR con el fin de determinar la quimera en el paciente trasplantado y el cálculo que realiza para estimar la cantidad relativa de ADN presente. Imagen obtenida de (Bailón, 2019). A manera de cierre, queda claro la complejidad que representa un trasplante de células madre hematopoyéticas. El éxito del mismo depende de muchas variables, comenzando con la patología de fondo. Se ha intentado destacar en el presente trabajo, el desarrollo de un programa de trasplante de células madre hematopoyéticas debe de ir de la mano con un laboratorio que cuente con la tecnología necesaria para realizar las diferentes 46 pruebas necesarias para garantizar el éxito de este riguroso proceso. Además es necesario garantizar personal capacitado y actualizado en estas pruebas. Según la Memoria de Donación y Trasplante 2019, realizada por el Ministerio de Salud de Costa Rica, en el país en el 2019 se realizaron 94 trasplantes de médula ósea, desglosados de la siguiente manera: 5 en el Hospital Nacional de Niños de los cuales 4 fueron autólogos y 1 alogénico; 48 en el Hospital San Juan de Dios donde 39 fueron autólogos y 9 alogénicos y 41 trasplantes autólogos en el Hospital México.(Gamboa et al., 2019). Por lo tanto, se considera que de la mano de la creciente demanda de este procedimiento en el país debe ir el crecimiento del personal y las tecnologías necesarias para cumplir con lo requerido para garantizar el éxito de este tratamiento como se mencionó anteriormente. Como punto a desarrollar en esta revisión, se mencionaron las pruebas un poco más especializadas sin embargo estas deben de estar complementadas por determinaciones de laboratorio más rutinarias como lo puede ser un hemograma o la determinación de serologías virales juegan un papel muy importante con respecto a las decisiones que debe de tomar el médico a la hora de realizar el trasplante. Como corolario en la figura 9 esquematiza de forma sencilla los diferentes puntos donde el laboratorio clínico tiene relevancia a la hora de realizar un trasplante, tanto en la preparación previa, durante el procedimiento y posterior a este para garantizar el éxito del injerto y la sobrevida libre de enfermedad del sujeto trasplantado. 47 Figura 9. Puntos de control del laboratorio clínico previo, durante y posterior a un trasplante de células madre hematopoyéticas. Elaboración propia. 48 Conclusiones Es completamente necesario que un centro que realice trasplante de médula ósea cuente con las tecnologías y personal necesario y capacitado para realizar las diferentes pruebas especializadas necesarias para llevar a cabo un trasplante de médula ósea y este resulte exitoso. En Costa Rica las principales malignidades hematológicas que son trasplantadas en población adulta son mieloma múltiple, leucemias agudas y Linfoma de Hodgkin. Antes de realizar un trasplante de médula ósea el paciente seleccionado debe cumplir con una serie amplia de requisitos para garantizar su sobrevida. Existe la necesidad de estandarizar los recuentos celulares de CD34+, así como determinar cuándo es necesario o no realizar estas determinaciones para garantizar el éxito del trasplante de médula ósea. La determinación de HLA es uno de los roles más importantes en donde el laboratorio está involucrado directamente para garantizar que se realice el trasplante. Contar con las mejores tecnologías para este paso es mandatorio a la hora de realizar el trasplante. La evaluación del quimerismo post-trasplante aporta información muy valiosa como lo es el estado del injerto, posibilidad de recaída, rechazo e incluso riesgo de enfermedad injerto versus huésped. 49 Referencias bibliográficas Arce Jiménez, I., Cubillo Suarez, W., Hütt Centeno, E., Rivera Arenas, A., & Rodríguez Mena, D. (2015). Implicaciones médico legales del quimerismo. 32(1). Arrieta-Bolaños, E., & Salazar-Sánchez, L. (2010). Tipificación molecular de los antígenos leucocitarios humanos, Estado del arte y perspectivas para los transplantes de células madre en Costa Rica Molecular typing of Human Leukocyte Antigens, State-of-theart and Perspectives for Stem cell Transplantation. Acta Médica Costarricense, 52(1), 8–15. https://www.scielo.sa.cr/pdf/amc/v52n1/art03v52n1.pdf Bacigalupo, A., Ballen, K., Rizzo, D., Giralt, S., Lazarus, H., Ho, V., Apperley, J., Slavi, S., Pasquini, M. 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