SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO DISTRIBUCIÓN, ESTABILIDAD Y ASOCIACIÓN DE LA AFLATOXINA M1 CON LAS PRINCIPALES PROTEÍNAS DE LA LECHE DE VACA, DURANTE LA MANUFACTURA Y ALMACENAMIENTO DE QUESO FRESCO SIMILAR AL QUESO TURRIALBA ELABORADO EN COSTA RICA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencia de Alimentos para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencia de Alimentos GUADALUPE CHAVARRÍA MOLINA Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii DEDICATORIA A Dios que me permite la vida para tener todas las experiencias posibles. A mi familia, especialmente a mi madre, Matilde Molina Vásquez, quien con su luz, amor, sabiduría, carisma y positivismo me inculco la idea de que todo es posible con trabajo y esfuerzo y me apoyo en todos mis proyectos a lo largo de mi vida. A mi padre Jaime Chavarría Alpízar, mis hermanos Gustavo, Vanesa y María del Pilar, a mis familiares y amigos por ser mi red de apoyo siempre. iii AGRADECIMIENTOS A mis profesores Ph.D. Eric Wong González, Director de la tesis; Ph.D. Marianela Cortés Muñoz, asesora de tesis; Ph.D. César Rodríguez Sánchez, asesor de tesis que han sido guía y apoyo invaluable para llevar adelante este proyecto. A mis compañeros del Centro de Investigación en Nutrición Animal (CINA-UCR) Ph.D. Andrea Molina Alvarado, encargada del proyecto de investigación; MSc. Fabio Granados Chinchilla, Químico de Aplicación; Licda. Geovana Méndez y Licda. Astrid Leiva Gabriels, del Laboratorio de Microbiología. A todos ellos por su extraordinario apoyo en el desarrollo de esta investigación. A M.Sc. Diana Víquez Barrantes del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos, por su valiosa colaboración. A todos los que de una u otra forma han sido parte de este proceso y me han acompañado en todo este camino, especialmente Graciela Paniagua Moya. A todos, muchas gracias. iv “Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencia de Alimentos de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado Maestría Académica en Ciencia de Alimentos.” ____________________________________________ M.Sc. Fabio Granados Chinchilla Representante de la Decana del Sistema de Estudios de Posgrado ____________________________________________ Ph.D. Eric Wong González Director de Tesis ____________________________________________ Ph.D. Marianela Cortés Muñoz Asesora ____________________________________________ Ph.D. César Rodríguez Sánchez Asesor ____________________________________________ M.Sc. Rebeca López Calvo Directora Programa de Posgrado en Ciencia de Alimentos ____________________________________________ Guadalupe Chavarría Molina Candidata v INDICE GENERAL DEDICATORIA ................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................... iii INDICE GENERAL ............................................................................................................. v RESUMEN......................................................................................................................... vii INDICE DE CUADROS .................................................................................................. viii INDICE DE FIGURAS ...................................................................................................... ix LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................. x LISTA DE ANEXOS .......................................................................................................... xi CAPITULO 1. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 1 CAPITULO 2. OBJETIVOS............................................................................................... 4 2.1. Objetivo general ...................................................................................................... 4 2.2. Objetivos específicos ............................................................................................. 4 CAPITULO 3. MARCO TEÓRICO ................................................................................... 5 3.1 Generalidades del mercado de la leche ............................................................... 5 3.2 La leche bovina ........................................................................................................ 6 3.3 El queso ..................................................................................................................... 8 3.4 Principales proteínas de la leche .......................................................................... 9 3.4.1 Caseína ............................................................................................................ 10 3.4.2 β-lactoglobulina (β-Lg) ................................................................................... 12 3.4.3 α-lactoalbúmina (α-La) ................................................................................... 13 3.4.4 Albúmina sérica bovina (ASB) ...................................................................... 14 3.4.5. Lactoferrina bovina (LFB) ............................................................................. 14 3.5 Micotoxinas, Aflatoxina M1 y legislación ............................................................ 16 3.5.1 Micotoxinas ...................................................................................................... 16 3.5.2 Aflatoxina M1 .................................................................................................... 19 3.5.3 Legislación de AFM1 en Costa Rica ............................................................. 20 3.6 Antecedentes de afinidad de aflatoxina M1 con proteínas .............................. 20 3.7 Variables que influencian el reparto de AFM1 en queso fresco ..................... 24 vi 3.7.1 Tecnología de elaboración del queso .......................................................... 25 3.7.2 Influencia de cultivo microbiano bacterias ácido lácticas (BAL) sobre AFM1 ........................................................................................................................... 27 CAPITULO 4. ARTÍCULO DISTRIBUCIÓN, ESTABILIDAD E INTERACCIÓN DE AFLATOXINA M1 CON PROTEÍNAS EN QUESO FRESCO. ................................... 31 Abstract .......................................................................................................................... 31 Keywords: ...................................................................................................................... 32 4.1 Introduction ............................................................................................................. 32 4.2 Materials and methods .......................................................................................... 33 4.2.1. Reagents ......................................................................................................... 33 4.2.2. Cheese preparation ....................................................................................... 34 4.2.3. Enumeration of lactic acid bacteria (LAB) in fresh cheese ..................... 35 4.2.4. Aflatoxin M1 interaction with milk, cheese, and whey proteins ............... 35 4.2.5. Protein precipitation and crosslinking with formaldehyde ....................... 36 4.2.6. HPLC-based AFM1 detection ....................................................................... 36 4.2.7. AFM1 interaction with purified proteins ....................................................... 37 4.2.8. Statistical analyses ........................................................................................ 38 4.3 Results and discussion ......................................................................................... 38 4.3.1. AFM1 carry-over from contaminated milk to cheese and whey .............. 38 4.3.2. AFM1 stability in cheese ................................................................................ 39 4.3.3. AFM1 interaction with milk, cheese, and whey proteins .......................... 41 4.4 Conclusion .............................................................................................................. 44 4.5 References .............................................................................................................. 45 CAPITULO 5. OBSERVACIONES ADICIONALES .................................................... 50 CAPITULO 6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ..................................... 54 6.1 Conclusiones generales........................................................................................ 54 6.2 Recomendaciones generales .............................................................................. 55 CAPITULO 7. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 56 CAPITULO 8. ANEXOS .................................................................................................. 69 vii RESUMEN Las micotoxinas son productos naturales originados por el metabolismo secundario de varios hongos toxigénicos que existen en la naturaleza. Las aflatoxinas B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) y G2 (AFG2) son un grupo de toxinas cancerígenas producidas principalmente por los hongos A.parasiticus y A. flavus. Se encuentran comúnmente en cultivos, granos, piensos y forrajes de los que se alimentan los rumiantes y por lo tanto, puede estar presentes en la leche. Una vez ingerido por los mamíferos a través de la dieta o la lactancia, AFB1 se oxida en el hígado para dar lugar a AFM1; un potencial carcinógenico que puede ser encontrado en leche, queso y otros productos lácteos. A pesar de que su estructura está compuesta por átomos de oxígeno y dobles enlaces, se considera que AFM1 es muy poco soluble en agua y es termoestable; por lo tanto, los procesos de fabricación convencionales no lo eliminan de la leche. Como consecuencia, se puede encontrar en el suero y en diferentes tipos de queso. En este trabajo se buscó elucidar la distribución y reparto de AFM1 en queso fresco y suero durante su manufactura, así como determinar el nivel de interacción de dicha toxina con varias proteínas de la leche, queso y suero. Adicionalmente, se analizó el comportamiento de asociación in vitro de la caseína, -lactoalbúmina, - lactoglobulina, albúmina sérica bovina, lactoferrina y una mezcla de estas con una concentración fija de AFM1 después del entrecruzamiento covalente. Se analizó tambien la afinidad de las fracciones de caseina (s,  y ) con la AFM1. Finalmente se estudio la estabilidad de la AFM1 en queso fresco durante el almacenamiento en presencia de un cultivo protector de bacterias ácido lácticas. Los resultados demuestran que hasta 70% de los niveles de AFM1 presente en leche enriquecida con 0.5 y 1.5 g L-1 fue liberada en el suero durante la manufactura de queso fresco mediante proceso estandarizado. Las proteínas del suero y leche con más moléculas de AFM1 unidas fueron α-lactalbúmina y caseína con 88% y 81% respectivamente. La fracción de caseina que mostró mayor afinidad a la AFM1 fue la s caseína que unió el 100% de la AFM1 .También se observó una disminución sustancial, de hasta 75%, de la concentración de AFM1 durante el almacenamiento del queso por 28 días que correlaciona inversamente con los conteos de bacterias acido lácticas (r= -0,825, p= 0,011) Este conocimiento puede servir como base para intervenciones en la industria láctea con la intención de aumentar la seguridad del queso y otros productos lácteos. viii INDICE DE CUADROS Cuadro 1 Composición química de la leche de vaca. 7 Cuadro 2 Propiedades de las principales proteínas de la leche. 9 Cuadro 3 Descripción de la fosforilación de las fracciones de caseína. 10 ARTICULO Cuadro 1 Physicochemical characterization of starter milk, manufactured cheese and whey and performance of the chromatographic methods used for determination of AFM1 in these matrices. 37 Cuadro 2 Aflatoxin M1 distribution in whey and fresh cheese that were derived from artificially contaminated milk with two different toxin concentrations at day zero. 39 ix INDICE DE FIGURAS Figura 1 Estructura química de AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. 18 Figura 2 Estructura química de AFM1 y AFM2. 19 Figura 3 Estructura terciaria de α-La. Estructuras secundarias: α-hélice (magenta); 310 hélice (azul); hoja β (amarilla); giro (cian) y espiral aleatoria (marrón). Regiones Hidrofóbicas: caja hidrofóbica (verde) y grupo aromático I (naranja). 51 Figura 4 (A) Representación gráfica de las interacciones del AFM1 con el α-La en la región de la caja hidrofóbica. Diagrama de interacciones hidrofóbicas (líneas blancas punteadas) de AFM1 con los aminoácidos de la caja hidrofóbica. 52 Figura 4 (B) Representación gráfica de las interacciones del AFM1 con el α-La en la región de la caja hidrofóbica. Presentación imagen estéreo de los enlaces de hidrógeno (líneas punteadas negras) formadas con AFM1 y los aminoácidos de la caja hidrofóbica. 52 ARTICULO Figura 1 (A) Lactic acid bacteria enumeration and protein stability (discontinuous line and right ordinate, number in brackets represent mean protein concentration) during cheese maturation. 39 Figura 1 (B) Toxin levels, in function of time, during fresh cheese ripening in storage at 4C for the 1.5 g L-1 spike level. 39 Figura 2 (A) AFM1 concentration in function of mixture of cheese and whey main proteins. 42 Figura 2 (B) AFM1 concentration in function of increasing concentrations of casein (cheese main protein) and -lactalbumin (whey main protein). 42 x LISTA DE ABREVIATURAS UCR Universidad de Costa Rica CINA Centro de Investigación en Nutrición Animal CITA Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos FAO Food and Agriculture Organization FDA Food Drug Administration TM Toneladas métricas AF Aflatoxinas AFB1 Aflatoxina B1 AFM1 Aflatoxina M1 AFM2 Aflatoxina M2 AFB2 Aflatoxina B2 AFG1 Aflatoxina G1 AFG2 Aflatoxina G2 ASB Albumina Sérica Bovina α - LA α - Lactoalbúmina β - LG β - Lactoglobulina LFB Lactoferrina bovina HPLC High Performance Liquid Chromatography IARC International Agency Research on Cancer ADN Ácido desoxirribonucleico RTCR Reglamento Técnico Costa Rica GRAS Generally Recognized As Safe QPS Qualified Presumption of Safety BAL Bacterias Ácido Lácticas xi LISTA DE ANEXOS Anexo 1 Recomendaciones para elaboración de queso fresco Turrialba. Aseal; 2013. Anexo 2 Inserto de fabricante con método de extracción para AFM1 en fase sólida con columnas de inmunoafinidad AflaStarTM M1 R. Anexo 3 Protocolo para fijar la unión de proteínas mediante formaldehído. Cold Spring Harbor Protocols. Cshprotocols.cshlp.org Anexo 4 Protocolo para precipitar proteínas mediante ácidotricloroacético. Cold Spring Harbor Protocols. Cshprotocols.cshlp.org Anexo 5 Ficha técnica del cloruro de calcio marca Calcivac “Promotor de la coagulación de la leche” de Vaco S.A Laboratorios. Anexo 6 Ficha técnica del cuajo CHYMAX EXTRA “Coagulante líquido” de la marca CHR Hansen. Anexo 7 Ficha técnica del cultivo láctico FD-DVS STI-14 “Thermophilic lactic acid culture Streptococcus thermophilus” de CHR Hansen. Anexo 8 Lic.DDA-MAG: 011-052 VAP FEED Alimento Balanceado para vacas lecheras de alto potencial genético para producción láctea. 1 CAPITULO 1. JUSTIFICACIÓN Las Aflatoxinas son un tipo de micotoxinas producidas en su mayoría por hongos del ambiente y son responsables de la pérdida de billones de dólares en la economía mundial por contaminar diferentes cultivos causando muchos efectos sobre la salud humana y de los animales. De las aflatoxinas descritas hasta ahora la Aflatoxina B1 es considerada una de las más importantes por su toxicidad y es a partir de ésta que se produce la aflatoxina M1 (AFM1) en la leche de los rumiantes (Shabeer et al., 2022). La incidencia mundial de AFM1 en la leche y los productos lácteos en décadas pasadas ha emergido como uno de los problemas más críticos debido al alto consumo de estos alimentos y los peligros potenciales de AFM1 para la salud humana, especialmente en grupos de edad inmunológicamente vulnerables (Campagnollo et al., 2016). Se ha reportado que la AFM1 exhibe propiedades carcinogénicas (Ostry et al., 2016; Einolghozati et al., 2021; EFSA, 2020), citotóxicas, teratogénicas y genotóxicas. Además, a largo plazo la exposición a AFM1 conduce a inmunosupresión, hepatocarcinoma y retraso en el crecimiento en niños. La exposición a AFM1 plantea un grave riesgo para la salud debido a su probable interacción con el ADN (Zhang et al., 2015; Monter Arciniega et al., 2022). Estudios sobre la relación de AFM1 con hepatitis han revelado una mayor vulnerabilidad de portadores de hepatitis hacia el carcinoma hepatocelular si han estado expuestos a alimentos contaminados con aflatoxinas (Giolo et al., 2012; EFSA, 2020). Aproximadamente 0,55–0,60 millones de casos de carcinoma hepatocelular se notifican cada año, entre los cuales alrededor de 0,025-0,15 millones de casos son atribuidos a la exposición a las AF por medio de la dieta (Muaz et al., 2021). Además, se ha relacionado su alta toxicidad a bajas concentraciones con el desarrollo de cáncer de riñón (Sarmast et al., 2021). 2 La AFM1 resiste temperaturas entre 260 y 320ºC sin descomponerse y permanece estable en la leche y derivados tras procesos industriales como la pasteurización, la ultrapasteurización (Monter Arciniega et al., 2022), el autoclavado y esterilización (Sarmast et al., 2021), lo que genera un riesgo a la salud humana. Se ha mencionado también que la AFM1 puede asociarse a la caseína de la leche, debido a que aumenta su hidrofobicidad durante la etapa de proteólisis en la elaboración del queso, condición necesaria para que AFM1 se una a la caseína (Monter Arciniega et al., 2022). La leche y los productos lácteos juegan un papel importante en la dieta humana para todos los grupos de edad debido a la gran cantidad de ingredientes y elementos esenciales como proteínas, lípidos y calcio. Numerosos estudios sobre la leche bovina han demostrado que AFM1 se une a las proteínas de la leche, y en particular a caseína, que se concentra en la cuajada durante la fabricación de queso (Brackett  Marth, 1982; López et al., 2001). Consecuentemente, el consumo de leche y sus derivados contaminados con micotoxinas es un importante mecanismo de transferencia de AFM1 a los consumidores; sin embargo, estudios han demostrado que la tasa de ocurrencia de AFM1 en la leche y su arrastre a varios productos lácteos es variable (Campagnollo et al., 2016; Kamkar et al., 2014; Sarmast et al., 2021). Uno de los productos lácteos favoritos a nivel global es el queso, que varía en tipos (blando, semiduro y duro) y orígenes, así como en los métodos que se utilizan para su producción. Todas estas variables y especificaciones influyen en la transferencia de AFM1 de la leche al queso (Mohajeri et al., 2013; Campagnollo et al., 2016). En Costa Rica, un 80% del total de la leche que llega a las pequeñas y medianas empresas procesadoras se destina para la produccion de queso mientras que en las grandes industrias se estima que se transforma cerca del 10% de la leche en queso (Villalobos García, 2017). 3 Algo que llama la atención es que se ha demostrado recientemente que los quesos frescos contienen los niveles de AFM1 más altos en comparación con los demás tipos de queso (Khaneghah et al., 2021). A raíz de esto, es relevante elucidar la forma como se distribuye la AFM1 de la leche al queso y al suero durante la fabricación de queso fresco, así como evaluar su estabilidad durante el almacenamiento y conservación. Este trabajo aborda ambas interrogantes. Adicionalmente, se analizó la interacción de AFM1 con las principales proteínas de la leche. Este conocimiento pueden servir de base para nuevas investigaciones a futuro, ya que, por ejemplo, el suero que se elimina luego de la fabricación del queso constituye cerca del 80-90% del volumen de la leche utilizada y representa una fuente importante de nutrientes que se aprovechan en la elaboración de queso Ricotta, suplementos para consumo animal, productos de panadería, refrescos para hidratar, concentrados de proteína para deportistas, agentes microencapsulantes en alimentos, agentes estabilizantes de emulsiones o componente de fórmulas infantiles y otros alimentos (Delboni et al., 2016; Cattaneo et al., 2013). También, estas proteínas del suero son modificadas y utilizadas como hidrocoloides alimenticios en distintas aplicaciones: como reemplazadores de grasa en productos alimenticios, estabilizador de espumas, como ingrediente funcional para modificar estructura y viscosidad de los alimentos o para mejorar el rendimiento de los quesos (Wolz et al., 2016; Zhang et al., 2015). http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X15302034 4 CAPITULO 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo general Estudiar la asociación de la AFM1 con las principales proteínas de la leche de vaca, su distribución y estabilidad durante la manufactura y almacenamiento de un queso fresco similar al Turrialba. 2.2. Objetivos específicos 2.2.1 Ensayar in vitro la asociación de AFM1 a la caseína, albúmina sérica bovina, β-lactoglobulina, α-lactoalbúmina y lactoferrina para comparar su nivel de afinidad. 2.2.2 Estudiar la distribución de la toxina AFM1 en el queso y suero durante el proceso de manufactura del queso fresco mediante ensayo controlado para estimar la proporción de reparto en cada fracción. 2.2.3 Evaluar la estabilidad de la AFM1 durante el tiempo (28 días) y condiciones de almacenamiento (bolsa plástica a 4°C) del queso fresco preparado con leche artificialmente contaminada con la toxina. 5 CAPITULO 3. MARCO TEÓRICO 3.1 Generalidades del mercado de la leche A nivel mundial el consumo de leche y sus derivados ha aumentado considerablemente a través del tiempo gracias a la industrialización de esta actividad. Actualmente, la leche que se comercia proviene principalmente de vacas (81%), búfalos (15%), cabras, ovejas y camellas (4% combinadas) (Walstra et al., 2006 ;OECD/FAO, 2021). La leche de vaca al ser la que más se produce es utilizada para consumo como tal o en forma de una gama de productos lácteos. Según datos suministrados por la agencia de las Naciones Unidas, a través de la Organización de Alimentos y Agricultura (Food and Agriculture Organization; FAO), en su informe Anuario Estadístico sobre Agricultura y Alimentación Mundial del año 2021, la producción mundial de leche, para el año 2019, fue de 883 283 700 toneladas métricas (TM), con un crecimiento del 0,41% con respecto al año 2018 (FAO, 2021). En los países desarrollados, el consumo per cápita anual de productos lácteos se proyecta crecerá modestamente de 283,6 kg en 2018-2020 a 302,4 kg en el 2030, en comparación con un aumento de 128,4 kg a 151,2 kg en los países en vias de desarrollo (OECD/FAO, 2021). A nivel de la región centroamericana, Costa Rica es el segundo mayor productor de leche de vaca después de Nicaragua. En el año 2019 tuvo una producción estimada de 1189100 TM de leche, aproximadamente 2,4% más que el año 2018 (FAO, 2021) mostrando un consumo promedio per cápita de 217 kg de productos lácteos/año durante el año 2016 (Cámara de Productores de Leche Costa Rica, 2022). Esta actividad económica generó en nuestro país, en el 2020, por concepto de exportaciones un ingreso de 152.66 millones de dólares, correspondiente a un 6 volumen de 92,96 millones de kg netos de productos lácteos, muy por encima de otras actividades del sector pecuario nacional como lo son la industria avícola, porcina y de ganado de carne (Cámara de Productores de Leche Costa Rica, 2022). Para el el año 2021, se exportó un estimado de 116 millones de dólares en productos lácteos, donde los principales productos comercializados fueron leche en polvo, fluida y deslactosada, helados, mantequilla, yogurt, queso fresco, mezclas y pastas lácteas. El destino de estos productos fue principalmente mercados de Centroamérica y el Caribe (PROCOMER, 2021; Cámara de Productores de Leche Costa Rica, 2022). Se ha estimado que existen en el país unas 26 957 fincas dedicadas a la actividad lechera, 17 399 en la modalidad de doble propósito y 9 558 bajo el sistema de lechería especializada. Las fincas lecheras de doble propósito abarcan cerca de 691 609 hectáreas de la superficie del territorio nacional y las de lechería especializada abarcan 239 900 hectáreas. Con una productividad media de 7,683 L de leche/hectárea/año y una productividad diaria de 2,5 millones de litros de leche al día. Del total de la leche producida diariamente en el país, el 60,0% es procesada por la industria formal, la cual está compuesta en general por 43 empresas y el restante 40,0% es procesada por el sector informal artesanal (Cámara de Productores de Leche de Costa Rica, 2013). Los datos anteriores sugieren la enorme importancia de la industria lechera tanto a nivel mundial como nacional. 3.2 La leche bovina El alto consumo de la leche y sus derivados se atribuye a las cualidades nutritivas y funcionales porque contiene proteínas de alto valor biológico, hidratos de carbono en forma de lactosa, grasas, vitaminas y minerales (Fox et al., 2015), constituyendo 7 un alimento de extraordinaria importancia ya que se considera como una fuente de macro y micronutrientes para la nutrición y salud humana (Willett et al., 2020). El Cuadro 1 muestra la composición de la leche de vaca. En éste se observa los aportes a la dieta de los distintos componentes basados en una porción de 100 gramos de leche fresca. Cuadro 1. Composición química promedio/usual de la leche de vaca. Componente Cantidad / 100 g Unidad Componente Cantidad / 100 g Unidad Energía 64,0 kcal Zinc 360,0 µg Agua 88,0 g Colesterol 13,0 mg Grasa 3,5 g Ácido pantoteico 0,3 mg Proteína 3,3 g Vitamina C 1,0 mg Lactosa 4,8 g Vitamina E 0,1 mg Ácido oleico 1,1 g Vitamina A 40,0 µg Ácido linoleico 0,2 g Caroteno 20,0 µg Calcio 120,0 mg Tiamina 40,0 µg Fosforo 100,0 mg Riboflavina 170,0 µg Potasio 150,0 mg Vitamina B6 50,0 µg Sodio 50,0 mg Vitamina B12 0,5 µg Cloro 100,0 mg Biotina 3,5 µg Magnesio 12,0 mg Vitamina D 0,1 µg Hierro 50,0 µg Solidos totales 12.7 g (Stavrinos et al., 2001; Fox et al., 2015). Sin embargo, la leche al ser una suspensión altamente nutritiva se convierte también en un sustrato ideal para el crecimiento de diversos microorganismos de deterioro, así como patógenos. Adicionalmente, es importante considerar que el estado higiénico de la leche y los productos lácteos pueden ser afectados por la presencia de sustancias químicas como residuos de antimicrobianos, antihelmínticos, pesticidas, bifenilos policlorados (PCBs), dioxinas, furanos, metales pesados, elementos radioactivos y micotoxinas (Stavrinos et al., 2001) Al someter la leche a diversos procesos como centrifugación, procesos térmicos, evaporación, filtración a traves de membranas, concentración mediante secado, coagulación enzimática, coagulación ácida, fermentación y congelación, se puede 8 obtener materia prima como crema, leche descremada, cuajo de caseina, caseina ácida, suero y queso para la creación de diversos productos para el consumo humano (Fox et al., 2015). 3.3 El queso El queso es un grupo muy variado de productos lácteos, elaborados en todo el mundo; la fabricación de queso se originó en el Medio Oriente durante la Revolución Agrícola, hace aproximadamente unos 8.000 años. La producción y el consumo de queso, varían mucho entre países y regiones. El queso es el ejemplo clásico de un alimento de conveniencia: se puede utilizar como plato principal de una comida, como postre o merienda, como relleno de sándwich, ingrediente alimentario o condimento. (Fox et al., 2015). Aunque la mayoría de los quesos tradicionales tienen un contenido de grasa bastante alto, son fuentes ricas en proteínas y, en la mayoría de los casos, en calcio y fósforo. La producción de cuajada de queso es esencialmente un proceso de concentración en el que la grasa de la leche y la caseína se concentran unas diez veces mientras que las proteínas del suero, la lactosa y las sales solubles se eliminan del suero. (Fox et al., 2015). La producción de todas las variedades de queso implica un protocolo por lo general similar, con varios pasos de los cuales algunos se modifican para dar un producto con las características deseadas. Los principales pasos generales son 1. Selección, estandarización y, en la mayoría de los casos, pasteurización de la leche. 2. Acidificación, generalmente a través de la producción in situ de ácido láctico por el cultivo iniciador. Opcionalmente en este paso se puede agregar CaCl2 y colorante (agregando extracto de carotenoides sintético o natural, ejemplo Annatto que contiene bixina y norbixina) 3. Coagulación de la leche por acidificación y temperatura o proteólisis limitada por enzima (cuajo). 4. Deshidratación del coágulo para producir la cuajada de queso, mediante una 9 variedad de técnicas, algunos de los cuales son específicos de la variedad de queso. Se puede cortar, mover, calentar, acidificar, agregar NaCl, separar el coágulo del suero (desuerado), voltear y prensar 5. Formar la cuajada en formas características. 6. Para la mayoría de las variedades, maduración (maduración) de la cuajada durante la cual la característica se desarrollan el sabor y la textura del queso (Fox et al., 2017). En el caso del queso fresco este está listo para su consumo inmediatamente de terminar el prensado. 3.4 Principales proteínas de la leche Como se observa en el Cuadro 2, la leche de vaca está compuesta de 33 g/L de proteína, distribuidas en 28 g/L de caseína ( 80% ) y 5 g/L ( 20%) de proteínas del suero (Fox et al., 2015). Cuadro 2. Propiedades de las principales proteínas de la leche Propiedades Caseínas Proteínas del suero αs1-B 8P αs2-A 11P β-A2 5P κ-B 1P α-La-B β-Lg-B Albumina sérica Peso molecular 23,614 25,230 23,983 19,023 14,176 18,363 66,267 Residuos/Moléculas Aminoácidos 199 207 209 169 123 162 582 Prolina 17 10 35 20 2 8 34 Cisteína 0 2 0 2 8 5 35 Disulfuroa 0 0 0 0 4 2 17 Fosfato 8 11 5 1 0 0 0 Carbohidratos 0 0 0 b c d 0 Hidrofobicidad (KJ/residuo) 4.9 4.7 5.6 5.1 4.7 5.1 4.3 Residuos cargados/mol 34 36 23 21 28 30 34 (Fox et al., 2015). Donde: a = Puentes disulfuro intramolecular, b = variable (ver texto), c = Una pequeña fracción de las moléculas, d = O excepto por la variante dave (DV) 10 3.4.1 Caseína La caseína es una proteína altamente compleja. Pertenece a la familia de proteínas que unen metales, específicamente se asocian con calcio, magnesio y zinc (Boland, et al., 2020). Está compuesta por varias fracciones distintas:  s1 caseína (37%),  s2 caseína (10%),  -caseína (12%),  caseína (35%) y  caseína (6%). Las cuatro fracciones de caseína exhiben variabilidad o también llamada microheterogeneidad debido a variabilidad en el grado de fosforilación. Todas las caseínas son fosforiladas, pero en un grado variable (αs1 8-9 P; αs2 10-13 P; β 4-5 P; κ 1-2 moléculas de P por molécula de caseína). El número de grupos fosfato es indicado así αs1 -CN 8P. En el Cuadro 3 se muestra una descripción de la fosforilación de las distintas fracciones de caseína. Cuadro 3. Descripción de la fosforilación de las fracciones de caseína. Caseína Número de residuos de fosfato αs1 8, pero ocasionalmente puede tener 9 αs2 10, 11, 12 o hasta 13 β 5, pero ocasionalmente puede tener 4 κ 1 pero ocasionalmente puede tener 2 ó 3 La heterogeneidad de la caseína también está dada por la existencia de puentes disulfuro en αs2 y κ-caseína, por la hidrólisis de la β- αs1- αs2 caseína por la plasmina, o variaciones en el grado de glicosilación de κ – caseína que resulta en varias formas moleculares de la κ-caseína. También influyen polimorfismos genéticos en todas las proteínas de la leche, resultando en cerca de 60 variantes de caseína y proteínas del suero (estas variables genéticas se indican en letras latinas). La frecuencia con la que ocurren ciertas variantes genéticas es específica de la raza de vaca que da origen a la leche. Varias propiedades tecnológicamente 11 importantes de las proteínas de la leche, por ejemplo, las propiedades para cuajar durante la fabricación de queso, la estabilidad al calor, el rendimiento y la proporción de las proteínas en la leche están correlacionadas con ciertos polimorfismos y se están realizando importantes investigaciones sobre este tema (Fox et al., 2015; Goulding et al; 2020). Las distintas fracciones de caseína, en presencia de calcio, forman una estructura llamada micela. Estas son grandes partículas coloidales altamente hidratadas. Unen cerca de 1.6-2.7 g H2O g-1 proteína y adquieren una voluminosidad de 3-7 mL g-1. Esto sugiere que la micela tiene una estructura porosa en la cual las proteínas ocupan el 25% del volumen total (Fox et al., 2015). Aún se desconoce cómo se organiza dicha estructura, sin embargo, se cree que cada fracción de caseína expone hasta cierto punto las regiones hidrofílicas en la superficie de la micela y las regiones hidrofóbicas se ubican principalmente al interior de la micela (Goulding et al; 2020). Los residuos de aminoácidos polares y no polares en la estructura primaria de las caseínas de leche bovina no están distribuidos de manera uniforme, por el contrario, ocurren en clusters dando como resultado regiones hidrofílicas e hidrofóbicas a cada fracción de caseína. Esto le confiere a las micelas su cualidad emulsionante y espumante. Al ser las caseínas relativamente pequeñas, relativamente hidrofóbicas, anfipáticas, moléculas de estructura flexible o aleatoria, con niveles relativamente bajos de estructuras secundarias y terciarias es difícil poder acertar con un modelo que defina la estructura de la micela definitivamente (Fox et al., 2015). Las caseínas son fácilmente susceptibles a la proteólisis en contraste con las proteínas globulares como las de suero de la leche, que son resistente a la proteólisis en su estado nativo. Durante el proceso de fabricación de queso la - caseína es la única fracción de caseína que es hidrolizada por acción de la enzima quimosina en la etapa inicial de la formación del cuajo. También es importante 12 mencionar que la caseína es fácilmente hidrolizable por proteinasas secretadas por microorganismos de deterioro en el producto (Fox et al., 2015). Cabe señalar es que cuando se calienta la leche durante el proceso de fabricación del queso la κ – caseína interactúa con β- lactoglobulina del suero de la leche para formar un complejo unido por puentes disulfuro el cual modifica muchas propiedades de las micelas incluyendo su capacidad de formar el cuajo y su estabilidad al calor (Fox et al., 2015). 3.4.2 β-lactoglobulina (β-Lg) La β-Lactoglobulina (β-Lg) representa el 50% de las proteínas del suero, es decir, el 12% de la proteína total en la leche bovina. Es una proteína globular típica muy compacta y ha sido muy bien caracterizada. Su masa molecular es de aproximadamente 18 kDa por monómero. Existen dos principales variantes genéticas, A y B, que ocurren más frecuentemente (Fox et al., 2015). Puede existir, dependiendo del pH en tres formas: como monómero (pH < 3.5 y >7.5), como dímero (pH= 5.5 – 7.5) o como octámero (pH= 3.5 – 5.5). Consiste en 162 residuos de aminoácidos por monómero, contiene dos puentes disulfuro intramoleculares y 1 mol de cisteína por monómero. Esta cisteína es de especial importancia porque, como se mencionó anteriormente después de un proceso de desnaturalización térmica, reacciona con el disulfuro intermolecular de -caseína y afecta de forma significativa la coagulación del cuajo y la estabilidad de la leche al calor (Boland et al., 2020). También como se señaló antes, la β-Lg es muy resistente a la proteólisis cuando se encuentra en su constitución nativa. Esto sugiere que su función primaria no es nutricional y que tiene otros roles biológicos. La β-Lg es miembro de la familia de proteínas llamada lipocalinas (Boland et al., 2020). Los miembros de la familia de las lipocalinas se caracterizan por varias 13 propiedades comunes de reconocimiento molecular: la capacidad de unirse a una gama de pequeñas moléculas hidrofóbicas, unirse a receptores específicos de la superficie celular y la formación de complejos con macromoléculas solubles (Flower, 1996). Se ha mencionado que β-Lg mediante su capacidad para unirse a los ácidos grasos, estimula la actividad de las lipasas, que puede ser su principal función fisiológica. Normalmente si los ácidos grasos están libres las lipasas están inhibidas (Fox et al., 2015). También se ha mencionado que la β-Lg juega un rol en el metabolismo del fosfato en la glándula mamaria, en transferir inmunidad pasiva a los recién nacidos, tiene la habilidad de unir y transportar vitamina A y D, ácido palmítico, fosfolípidos, retinol y componentes aromáticos (Fenelon et al., 2019). 3.4.3 α-lactoalbúmina (α-La) La α-La pertenece a la familia de proteínas que unen metales, específicamente se asocia con calcio (Boland et al., 2020). Alrededor del 20% de la proteína del suero bovino (3,5% de la proteína total de la leche) es α-lactoalbúmina que es la principal proteína de la leche humana. La α-La es una pequeña proteína que contiene 123 residuos de aminoácidos. Su masa molecular es de aproximadamente 14 kDa. También tiene una estructura altamente compacta y globular (Goulding et al; 2020). Su estructura primaria y terciaria tiene similitud con la lisozima, que es una importante proteína bacteriostática, con actividad lítica principalmente sobre bacterias gran positivas, y que está ampliamente distribuida en la naturaleza (Wu et al; 2019) Su función biológica es contribuir a la síntesis de lactosa junto con la enzima lactosa sintetasa. Existe una correlación directa entre la concentración de α-La y la lactosa presente en la leche. α-La es una metaloproteína que contiene 2 átomos de Ca+2 por molécula junto a cuatro residuos de Aspartato estos residuos son altamente conservados en todas las α-La y en la lisozima. Esta habilidad de 14 unir Ca+2 le confiere estabilidad a la temperatura. Puede recuperar su conformación después de la desnaturalización. Esta habilidad la pierde cuando el pH<5.0 pues los residuos de Aspartato se protonan y pierden su capacidad de unir calcio. Una vez que esto sucede, la α-La es desnaturalizada a bajas temperaturas y no recupera su conformación cuando se enfría (Boland et al., 2020). 3.4.4 Albúmina sérica bovina (ASB) La leche bovina normal contiene un nivel bajo de albúmina sérica sanguínea (ASB) (0.1–0,4 g L−1; 0,3–1,0 % del total). La masa molecular de BSA es aproximadamente 65 kDa; contiene 582 residuos de aminoácidos, 17 disulfuros y un sulfhidrilo. Todos los disulfuros involucran cisteínas que están relativamente cerca en la cadena polipeptídica, por lo tanto, se organiza en una serie de bucles relativamente cortos. La molécula tiene forma elíptica y se divide en tres dominios. Debido a su función biológica, ASB se ha estudiado ampliamente. Controla la presión osmótica de la sangre (y por lo tanto regula la captación de fluidos de los tejidos), transporta hormonas de la tiroides y otras hormonas, ácidos grasos y muchos medicamentos, se une al Ca2+ y amortigua el pH (Fox et al., 2015). Se cree que no se sintetiza en glándula mamaria, sino que es transferida de la circulación materna a la leche (Fenelon et al., 2019). Probablemente tiene poco o nada importancia en la leche, aunque al unir metales y ácidos grasos, puede permitirle estimular la actividad de la lipasa (Fox et al., 2015). También se ha descrito que en leche la ASB se une a zinc, cobre y tiroxina. Básicamente la función más aceptada es la de ser fuente de aminoácidos a los animales lactantes (Fenelon et al., 2019). 3.4.5. Lactoferrina bovina (LFB) Pertenece a la familia de proteínas que unen metales, específicamente se asocia con hierro (Fe) (Boland et al., 2020). La LFB estructuralmente, es una glicoproteína que une átomos de hierro y consta de una sola cadena polipeptídica de 15 aproximadamente 700 aminoácidos, con una masa molecular aproximada de 78 kDa. Las concentraciones en la leche bovina son mucho más bajas que en la leche humana y oscilan entre 0,8 g L-1 en la primera leche o calostro a 0,1 g L-1 en leche madura (Fenelon et al., 2019). Su estructura es similar a la Transferrina que es una proteína que transporta hierro en sangre, pero su afinidad por el hierro es 300 veces más alto. La presencia de LFB en glándula mamaria depende de la prolactina. Su concentración es más alta durante etapa temprana del embarazo (Fox et al., 2015). Aunque la función exacta de los glicanos (carbohidratos unidos a la proteína) no se entiende completamente, pueden proteger a LFB de la proteólisis y están involucrados en el reconocimiento de receptores. Su bioactividad ha sido ampliamente documentada. Tiene cualidades bactericidas y bacteriostáticas. Los efectos bacteriostáticos de LFB resultan, en parte, de su capacidad para retener el hierro que las bacterias requieren para su crecimiento. De esta forma mejora la biodisponibilidad del hierro a nivel intestinal (Goulding et al; 2020). Inhibe el crecimiento bacteriano al permeabilizar la pared celular de las bacterias uniéndose a polisacáridos a través de su extremo N terminal (Fox et al., 2015). También exhibe actividades antioxidantes, anti carcinogénica, antivirales, antifúngicos y antiprotozoarios. que probablemente son distintas de su capacidad para quelar el hierro. Los péptidos resultantes de la proteólisis de LFB también tienen actividad antibacteriana. Incluso se ha mencionado su capacidad para promover la proliferación de Lactobacillus y Bifidobacterium contribuyendo así a una microbiota intestinal beneficiosa (Fenelon et al., 2019). La LFB también participa en la modulación de la respuesta inmune e inflamación, existe evidencia que sugiere que aumenta el número y actividad de los linfocitos B, los linfocitos T y las células asesinas naturales. Puede acelerar la maduración de células B y T y aumentar la expresión de receptores celulares. También se sabe que puede atravesar la barrera hematoencefálica y tiene un efecto supresor 16 del estrés. Puede mejorar el desarrollo neuronal y cognitivo postnatal (Fenelon et al., 2019). 3.5 Micotoxinas, Aflatoxina M1 y legislación 3.5.1 Micotoxinas El término “micotoxina” fue implementado en 1962 en una inusual crisis veterinaria cerca de Londres, Inglaterra, donde aproximadamente unos 100 mil pavos murieron por una misteriosa enfermedad asociada a la ingesta de semillas contaminadas, enfermedad que fue conocida como “Enfermedad X” de los Pavos. Este brote llevo al descubrimiento de las aflatoxinas y a una serie de investigaciones sobre toxinas fúngicas como contaminantes de alimentos para humanos y animales (Shephard, 2009; Monter Arciniega et al., 2022). Se ha reportado que, cada año, cerca del 25% de los productos alimenticios están siendo contaminados con micotoxinas (Mollayusefian et al., 2021). En los hatos lecheros, las raciones de alimento para vacas en producción de leche se formulan combinando uno o dos forrajes (que aportan fibra), concentrados (aportan energía y proteína), sales minerales, vitaminas, aditivos, tampones, probióticos y otros (Cerdas Ramírez, 2014). Las micotoxinas son productos naturales de bajo peso molecular producidos como metabolitos secundarios por hongos filamentosos ubicuos (naturales, del ambiente) principalmente por Aspergillus parasiticus, A. flavus y A. nomius (Abadura et al., 2022). Estos hongos infectan las plantaciones y frutos en el campo y se desarrollan en los alimentos si las condiciones del ambiente como humedad (80-90%), actividad de agua (aw), temperatura (25-30C), pH y concentración de oxígeno son adecuadas para su crecimiento (Bosco  Mollea, 2012; Mollayusefian et al., 2021; Shabeer et al., 2022). Las micotoxinas son toxicas y químicamente 17 heterogéneas, capaces de causar enfermedad y muerte en seres humanos y otros vertebrados, no tienen significancia bioquímica en el crecimiento y desarrollo de los hongos y su tamaño puede variar desde formas simples de cadenas de 4 carbonos (toxina moniliforme) hasta sustancias complejas tales como fomopsinas (Zain, 2011; Monter Arciniega et al., 2022); En Costa Rica se comercializan alimentos balanceados para vacas lecheras cuya formulación en su mayoría está compuesta por maíz/sorgo/trigo (50±10%), acemite de trigo/salvadillo de trigo/semolina de arroz, pulpa de naranja, pulpa de remolacha, harina de coco, harina de coquito de palma africana, cascarilla de soya, harina de soya, soya integral, harina de frijol (15-20%), deshidratados de la destilería de maíz DGSS (15%) y otros subproductos como semilla de algodón, gluten de maíz, melaza de caña, entre otros (12%). El restante 3% se completa con núcleos minerales y otros suplementos (Lic. DAA-MAG: 011-052, ver anexo 8). Relacionado con esto, es interesante observar que las vacas al inicio de la lactancia tienen una dieta compuesta por 50% forraje y 50% alimento balanceado donde por cada kg de alimento se va a obtener un estimado de 3 kg de leche. Considerando que cada vaca va a consumir un aproximado de 4-10 kg de alimento diario se puede estimar el rendimiento de leche que esta dieta va a proporcionar por día (Cerdas Ramírez, 2014) y a su vez proyectar el aporte que el alimento hace en cuanto a la presencia de micotoxinas en la leche en caso de que el alimento esté contaminado. Actualmente se conocen más de 300 micotoxinas, sin embargo, las más estudiadas son aquellas a las que se les asocia un potencial carcinogénico o tóxico (Zain, 2011). Entre las más importantes desde esta persepectiva, se encuentran la zearalenona, fumonisina (B1 y B2), toxina T2/HT2, deoxinivalenol (DON), ocratoxina A y aflatoxinas (B1, B2, G1, G2, M1, M2) (Creppy, 2002; Monter Arciniega et al., 2022). Las letras B y G se refieren al color de la fluorescencia (azul o verdosa) observada bajo luz UV, mientras que los subíndices 1 y 2 indican el componente mayor y menor respectivamente (Abadura et al., 2022). Hasta el momento han sido 18 reconocidas 20 tipos diferentes de aflatoxinas, siendo la aflatoxina B1 (AFB1) la más frecuente y con el más alto potencial carcinogénico (Mollayusefian et al., 2021). En la Figura 1 se muestra la estructura química de las aflatoxinas AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2. Figura 1. Estructura quimica de AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Químicamente hablando, este grupo particular de contaminantes son componentes heterocíclicos cumarinicos unidos a anillos de tetrahidrofurano, las AFB1 y AFB2 contienen adicionalmente un anillo ciclopentano, mientras que AFG1 y AFG2 poseen en su lugar una delta lactona (Campagnollo et al., 2016). La producción de aflatoxinas, por ejemplo, AFB1 y AFG1, se ve favorecida en climas tropicales y subtropicales (Bbosa et al., 2013; Britzi et al., 2013) similares al que se tiene en Costa Rica. Una vez ingeridas por mamíferos a través de la dieta, AFB1 es oxidada por el citocromo P450 en el hígado (grupo hidroxilo en la posición 4) a un epóxido reactivo intermediario más polar o a la forma AFM1 (4-monohidroxilato) que es la más común. Al ser una molécula compuesta por 7 átomos de oxígeno y siete dobles enlaces, su solubilidad en agua es bastante pobre (IARC, 2002). Se ha reportado que 0.3-6.2% de la AFB1 presente en los alimentos para animales es transformada en AFM1 y aparece en la leche 12 horas después de ser ingerida por primera vez y sus niveles bajan a valores no detectables después de 72 horas de la última ingesta (Mollayusefian et al., 2021; Abadura et al., 2022). 19 3.5.2 Aflatoxina M1 Aflatoxina M1 (AFM1) tiene un bajo peso molecular aproximadamente 328 g mol -1 (Cattaneo et al., 2013) y es producida en mayor proporción que la AFM2 por lo que la primera es la de mayor interés y preocupación. Ambas son metabolizadas en el hígado, como se explicó anteriormente, como parte de la detoxificación de la molécula y son eliminadas del cuerpo de la vaca a través de la orina, las heces y la leche, de ahí la importancia que tiene en este estudio (Bbosa et al., 2013). En la Figura 2 se muestra la estructura química tanto de la AFM1 como de la AFM2. Figura 2. Estructura química de AFM1, AFM2 La conversión de AFB1 a AFM1 es influenciada por algunos factores nutricionales, incluido el tipo de alimento, la cantidad ingerida, velocidad de la digestión y factores fisiológicos de los animales por ejemplo raza, estado de salud, capacidad de desintoxicación del hígado, período de lactancia, rendimiento de la producción de leche y factores ambientales incluyendo estación, clima, ubicación geográfica y nivel de desarrollo de la región (Mollayusefian et al., 2021). Estas toxinas generan varios problemas tanto a humanos como a los animales. En estos últimos por ejemplo, se han reportado problemas a nivel reproductivo, inmunológico, de ganancia de peso, entre otros. Adicional a esto se sabe que son altamente cancerígenas, teratogénicas (Bbosa et al., 2013) y de difícil tratamiento para ser eliminadas de los alimentos ya que son termoresistentes por lo que no se desactivan con tratamientos térmicos y permanecen en los alimentos por largos periodos de tiempo (Bosco & Mollea, 2012). 20 Debido a sus características, la AFM1 es considerada un serio problema de higiene en los alimentos pues como se mencionó por su resistencia al calor mantiene su estructura intacta por lo que puede estar presente en leche comercialmente disponible y en subproductos lácteos. Sumado al alto consumo de estos productos en la población su impacto puede ser importante sobre todo en niños en etapa de crecimiento cuya vulnerabilidad es mayor. Tambien se ha descrito la presencia de AFM1 en leche materna (Mohammadi, 2011; Abadura et al., 2022). El riesgo potencial de la exposición a AFM1 vía consumo de leche y/o subproductos lácteos ha sido demostrado en varios estudios. Se sabe en general que AFM1 puede causar daño al ADN, mutación de genes, anomalías cromosomales y transformación celular en células de mamíferos in vitro en insectos, eucariotas menores y bacterias. Aunque es menos tóxica que la AFB1 su regulación sigue siendo sumamente importante (Scaglioni et al., 2014). 3.5.3 Legislación de AFM1 en Costa Rica En Costa Rica se estableció como límite máximo de residuos en el producto entero sea leche, queso o demás derivados lácteos AFM1 un límite de  0.5 g Kg-1 según lo descrito en el Reglamento Técnico Centroamericano RTCA 67.04.75:17 Productos Lácteos. Quesos Madurados. Especificaciones" basado en el (Codex Alimentarius, 1995, p.35). 3.6 Antecedentes de afinidad de aflatoxina M1 con proteínas Un dato relevante es que la AFM1 es soluble principalmente en la fase acuosa de la leche, sin embargo, tiene particular afinidad por otros componentes de carácter proteico (Prandini et al., 2009). Al respecto, existen estudios que muestran que durante la producción del calostro la AFM1 es excretada asociada a la fracción de inmunoglobulinas presentes en la leche (Coppock et al.,2009). Se ha encontrado también que la AFM1 tiene una afinidad especial por la caseína (Brackett et al., 21 1982; López et al., 2001; Indyk et al., 2021), principal proteína presente en la leche y que va a formar la cuajada con la que se fabrica el queso. En relación con esto, es importante notar que el contenido de proteína total por cada kg de leche es de aproximadamente 33,0 g, donde 26,4 g (80,0%) corresponden a caseína y el restante 20,0% lo componen otras proteínas en orden de cantidad presente: β-lactoglobulina 4,3 g (13,0%), α-lactoalbúmina 1,5 g (4,6%), albúmina sérica bovina (ASB) 0,4 g (1,2%), lactoferrina 0,1 g (0,4%), inmunoglobulinas 0,7 g (2,1%) y el restante porcentaje es de proteosa peptona y otras proteínas de menor relevancia (Walstra et al., 2006). Mientras, el suero contiene 2% lactoferrina, 4% caseína, 6% ASB, 23% α-lactoalbumina y 65% β- lactoglobulina (Gellrich et al., 2014). Aún no se ha elucidado la forma en que la toxina AFM1 se acopla a la caseína, pero se cree que ésta unión se da en regiones ricas en residuos de aminoácidos con carácter hidrofóbico (Prandini et al., 2009). Aunque la afinidad de AFM1 con la caseína de la leche es conocida, existe muy poca información sobre la interacción de la AFM1 con proteínas del suero. Éstas últimas son altamente susceptibles a desnaturalización inducida por altas temperaturas; ya que el tratamiento térmico altera significativamente su estructura secundaria y por tanto afecta la interacción entre las proteínas. Consecuentemente, cuando las proteínas del suero se exponen a altas temperaturas, pueden exhibir grupos reactivos capaces de interaccionar con otros componentes como probablemente la AFM1. Esto podría también explicar porque durante la fabricación del queso, a partir de leche no pasteurizada, cuando las proteínas del suero están en su configuración nativa, AFM1 no parece reaccionar con ellas y prefiere la caseína por la cual la afinidad es probablemente mucho más alta en esas condiciones (Cattaneo et al., 2013). Algo muy interesante que podría explicar las posibles diferencias en cuanto a afinidad de cada fracción de proteína del suero con la AFM1 es que hay estudios donde se demostró que la α -La y la β- Lg, a un mismo pH, presentan cargas positivas y negativas y que forman complejos con otras moléculas a través de 22 fuerzas electroestáticas. Esto sucede cuando el pH de la solución está por encima de uno de los puntos isoeléctricos (pI) de una proteína y por debajo del pI de la otra. Se han reportado diferentes pI para α -La (4.2-4.5 o 4.6-4.9 o 5.0), para β- Lg (4.6 o 4.8 o 5.1 o 5.2 5.1-5.5) y para LFB (8.7 o 8.8 o 9). En un estudio de simulación, Delboni et al. (2016) utilizaron valores de pI de 5.0, 4.8, 9.6 para α - La, β- Lg y LFB, respectivamente. Llama la atención que en diversos reportes indican que la β–Lg forma complejos con otras moléculas, mientras que la α – La no lo hace (Delboni et al., 2016). Se ha visto, por ejemplo, que la LFB tiene una enorme habilidad para formar complejos y que se asocia con la β – Lg, pero no se sabe si también lo puede hacer con la α – La. Incluso se ha demostrado que β – Lg y LFB se asocian tanto en una relación estequiométrica de 1:1, como en clusters β-Lg2–LF–β-Lg2 formando heterocomplejos (Delboni et al., 2016). En el estudio de Delboni et al. (2016) se evidenció que la energía de interacción entre la α–La y LFB es débil, mientras que, en contraste, β – Lg y LFB muestran una fuerte atracción entre ellas. Al parecer la fuerza que conduce la formación de los complejos de la LFB en este estudio está relacionada con interacciones electrostáticas, donde la carga de la proteína juega un rol clave. Incluso en las pruebas de simulación, el complejo α -La - β- Lg mostró ser inestable, por lo que se considera poco probable su asociación. Lo contrario sucedió con el complejo β- Lg – LFB, donde β-Lg interactúa mejor con LFB que con α -La (Delboni et al., 2016). Otro aspecto importante, para comprender la formación de complejos entre moléculas, es que la concentración de sal influye en el pI de las proteínas y por ende en las fuerzas que prevalecen durante las interacciones con otras proteínas o moléculas. Una pequeña cantidad de sal con una alta concentración de proteína puede tener una fuerza iónica equivalente a la de un sistema concentrado con alto 23 contenido de sal. En esta condición, la concentración máxima de sal donde el complejo puede ocurrir se reduce. A baja concentración de sal, los complejos α– La – LFB y β–Lg -LFB tienen una marcada tendencia a formarse, lo cual no sucede a altas concentraciones de sal (Delboni et al., 2016). Usando un modelo de integración numérica aplicado a sistemas moleculares llamado simulación Monte Carlo, Delboni et al. (2016) lograron teorizar cómo interactúan las proteínas β–Lg, α–La y LFB bajo ciertas condiciones de pH y concentración de sal. Su modelo sugiere que hay un rango o ventana de pH y concentración de sal en el cual las proteínas son más susceptibles a formar complejos entre ellas, siendo el pH fisiológico (6.5) el más favorable. La ventana de pH para lograr la formación de los complejos con una concentración de sal de 150 mM fue α -La -LFB (pH=5.0-9.6), β-Lg – LFB (pH=4.8-9.6). La interacción entre α -La - β-Lg solo se puede predecir para valores de pH entre 4.8-4.9, ya que, como se mencionó, la conformación muestra niveles de energía que la hacen inestable (Delboni et al., 2016). Con todos estos hallazgos se podría sugerir para nuestra investigación que existe probabilidad de que la α - La pueda mostrar mayor interacción con la AFM1 respecto a las demás proteínas del suero a ensayar, ya que se encuentra libre en ese momento, bajo las condiciones de pH y sal durante la fabricación del queso fresco. Así, considerando la conocida afinidad de la AFM1 por la caseína e inmunoglobulinas de la leche, y dado que no se conocen datos sobre la unión de la AFM1 a otras proteínas como la β-lactoglobulina, α-lactalbúmina, albúmina sérica bovina y lactoferrina, es que se seleccionaron éstas y la caseína como objeto de estudio en este trabajo. 24 3.7 Variables que influencian el reparto de AFM1 en queso fresco En este estudio, se planteó la interrogante de cuál sería la forma de distribución de la toxina AFM1 en el queso fresco que se fabrica en Costa Rica. Se ha descrito para otros tipos de queso, como el queso Cheddar, queso procesado para untar, queso Brick, queso parmesano y queso Mozzarella, que las concentraciones de AFM1 fueron 4,3, 1,9, 1,7, 5,8 y 8,1 veces superiores, respectivamente, en relación a la leche descremada con la que fueron elaborados (Cattaneo et al., 2008). Con respecto a quesos frescos más suaves, análogos al queso fresco elaborado en Costa Rica, la concentración de AFM1 fue entre 2,5-3,5 veces más alta que la encontrada en la leche utilizada en su fabricación (Yousef & Marth, 1989; Oruc et al.,2006). En general, existe evidencia suficiente que sustenta la estabilidad de la toxina AFM1 en diferentes tipos de queso durante su almacenamiento (Iha et al., 2013), no obstante resultados previos, de un estudio realizado en Costa Rica donde se analizó la concentración de AFM1 en queso y leche fluida comercializada, muestra que los quesos comercializados presentan valores promedio de toxina menores a los presentes en leche. Así mismo se observó que, de las muestras colectadas, un menor porcentaje de muestras de queso mostró niveles detectables de toxina en comparación al número de muestras de leche positivas (Chavarría et al., 2015). Asumiendo como cierto que la AFM1 es afín a la caseína de la cuajada, era de esperar que se diera un efecto de concentración de la toxina cuando se produjo el queso a partir de leche naturalmente contaminada con AFM1. Sin embargo, esto no se demostró en dicho estudio. Por tanto, se presume que en este caso el efecto de la tecnología de fabricación puede jugar un papel importante en la distribución de la toxina. Estudios previos mencionan que el aumento de la presencia de AFM1 en queso va en función del tipo de queso elaborado (si es fresco o madurado), la tecnología aplicada en la elaboración y la cantidad de agua eliminada durante el proceso la 25 cual se ve afectada por factores como la temperatura del tratamiento enzimático para elaborar el cuajo, tiempo de prensado, saturación de la salmuera y el pH (Mohammadi, 2011; Abadura et al., 2022). 3.7.1 Tecnología de elaboración del queso Como se mencionó anteriormente, los procesos para fabricar queso llevan pasos similares sin embargo se pueden fabricar quesos frescos, que están listos para el consumo o quesos maduros que se almacenan por un periódo de tiempo para obtener caracteristicas de textura, aroma y sabor que los diferencian. Durante el almacenamiento, conforme pasan los días, ocurre en el queso una serie de reacciones bioquímicas catalizadas por microorganismos o por enzimas cuya intensidad va a depender de la temperatura de almacenamiento, refrigeración (menor a 15 °C) para la conservación y donde los cambios son lentos o temperatura de maduración (entre 9-16°C) donde los cambios son más rápidos. Entre otras cosas, se metaboliza la lactosa residual, el lactato y el citrato. También se da la lipólisis y metabolismo de ácidos grasos en algunos tipos de queso, así como proteólisis y catabolismo de aminoácidos. La fermentación de la lactosa a ácido láctico principalmente es causada por microorganismos principalmente del cultivo iniciador o por contaminación accidental con otras bacterias en quesos artesanales. Esto modifica el pH durante el almacenamiento. Los cambios en la textura, apariencia y sabor del queso se dan por la hidrólisis de la matriz proteica y por incremento del pH debido al catabolismo del ácido láctico y producción de NH3 por la deaminación de los aminoácidos. Esto último afecta también la estabilidad y actividad de muchas enzimas que probablemente están involucradas en el desarrollo del sabor (Fox et al., 2017). Se ha demostrado que los cambios en los niveles de AFM1 en el queso madurado están probablemente relacionados con la actividad de las enzimas proteolíticas y lipolíticas. La proteólisis afecta las áreas hidrofóbicas de la caseína de forma que 26 no estén disponibles para unirse con AFM1. Además, los ácidos grasos, que son liberados por las enzimas lipolíticas, pueden actuar como un agente para cambiar el enlace hidrofóbico de AFM1 en queso. La naturaleza de los enlaces químicos es otro factor que afecta potencialmente el nivel de AFM1 durante la maduración de varios quesos. Ya que el enlace de AFM1 con la caseína es hidrofóbico y no covalente, podría permitir que AFM1 se libere más fácilmente al entorno del queso. Por lo tanto, el nivel de toxinas podría disminuir en el queso madurado (Sarmast et al., 2021). Otro dato interesante es que se encontró reportes de incremento de la concentración de toxina en queso según se tratara de queso duro (168%), semiduro (68.7%) o blando (60.6%). Se dice que la concentración más alta en queso duro está relacionada a mayor drenaje del suero y pérdida de humedad durante el procesamiento (Sarmast et al., 2021). Todas las operaciones anteriores pueden influenciar el reparto de AFM1 pues van a generar cambios en la estructura de las moléculas con grupos afines y por ende posibilitan o no la unión de la toxina. La toxina, como ya se mencionó, es termoestable. Acá lo más importante a considerar es la estabilidad de las proteínas de la leche a la temperatura, concentración de sal, iones calcio, pH, etc. que pueden causar su desnaturalización y por ende exponer grupos reactivos afines a AFM1, o bien incluso deshacer interacciones ya existentes entre AFM1 con alguna estructura química por pérdida de afinidad, cambios conformacionales o disolución de los enlaces. Al respecto, todas las caseínas tienen un alto contenido de aminoácidos no polares (35-40%) (Fox et al., 2015) que pueden ser posibles sitios de unión de la AFM1 si quedan expuestos durante el proceso de fabricación del queso por efecto de enzimas como la quimosina u otras proteinasas, durante la coagulación. La caseína como tal es muy estable a altas temperaturas. La leche a su pH natural de 6.7 puede ser calentada a 100C /24 horas sin coagular y resiste el 27 calentamiento a 140°C hasta 20 min. Tales tratamientos térmicos severos causan muchos cambios en la leche, por ejemplo, producción de ácidos a partir de la lactosa que resulta en una disminución del pH y cambios en el equilibrio salino, que eventualmente provocan la precipitación de la caseína. Las proteínas de suero, por otro lado, son relativamente termolábiles, siendo completamente desnaturalizadas por calentamiento a 90 °C durante 10 min (Fox et al., 2015). Adicionalmente, las proteínas del suero a diferencia de las caseínas permanecen solubles a pH= 4.6; también son solubles en presencia de saturación de NaCl, se mantienen solubles después de la coagulación de las caseínas con la enzima quimosina (Fox et al., 2015), esto las puede volver disponibles para interaccionar con la AFM1. Las proteínas del suero al ser estables en las condiciones definidas en este estudio para la preparación del queso (65C / 30 min) se van a drenar y perder mediante el proceso de corte de la cuajada, prensado y volteado del queso durante el almacenamiento. Es por ello que se debe medir la concentración de AFM1 en el suero después de la elaboración del queso. 3.7.2 Influencia de cultivo microbiano bacterias ácido lácticas (BAL) sobre AFM1 Paralelamente en este trabajo se investigó la estabilidad de la toxina AFM1, durante el almacenamiento del producto en anaquel. Investigaciones anteriores muestran que la estabilidad de AFM1 durante el almacenamiento y maduración del queso puede ser variable. Se ha reportado, por ejemplo, que la concentración de AFM1 en queso Cheddar, Brick, Limburger, Camembert y Tilsit incrementó durante la etapa temprana de maduración y disminuyó posteriormente mientras que en el queso Gouda o Mozarella no cambió apreciablemente (Oruc et al., 2006). 28 Se ha descrito previamente que las BAL y los probióticos pueden reducir la cantidad de aflatoxina libre en la leche y los productos lácteos por varios mecanismos entre ellos unión de la aflatoxina a las células bacterianas, y tal vez, su descomposición estructural. (Nguyen et al., 2019). Las BAL se utilizan como microorganismos grado alimentario para la producción de una variedad de productos lácteos fermentados. También las BAL son los organismos probióticos más comunes utilizados para hacer alimentos funcionales. Las BAL son bien conocidas por su metabolismo fermentativo en el que convierten carbohidratos simples en ácidos orgánicos y otros productos finales. (Öztürkoğlu et al., 2018) Las BAL incluyen un amplio rango de bacterias Gram-positivas, catalasa negativa, no móviles, no formadoras de esporas, productoras de ácido láctico como el principal producto final de la fermentación. (Walstra et al., 2006) Según sus requerimientos de temperatura para crecimiento se clasifican en mesofílicas (20- 30C) o termofílicas (37-45C) (Fashandi et al., 2018) Debido a su estatus GRAS (Generalmente Reconocido como Seguro) y presuntamente seguro (QPS) provisto por la FDA, las BAL han llamado mucho la atención de los investigadores en relación a su potencial como bioconservadores (Nasrollahzadeh et al., 2022). Streptococcus thermophilus es un miembro del cluster BAL. Un grupo bacterias filogenéticamente relacionado que juega un rol muy importante en las fermentaciones de alimentos. S. thermophilus crece mejor de 42-45C, pero puede sobrevivir a 60C/30 minutos, produce exopolisacaridos (EPS) que imparten propiedades reológicas deseables como viscosidad y es heterotrófico, requiere carbohidratos simples como fuente de energía, y aminoácidos preformados como fuente de nitrógeno. Es una bacteria bien adaptada al ambiente de la leche, siendo su hábitat primario (Hutkins et al., 2014). Particularmente, es importante mencionar que, aunque la AFM1 es usualmente estable, la presencia de bacterias lácticas como Streptococcus thermophilus, la 29 cual es utilizada como cultivo láctico protector en la elaboración del queso, ha demostrado un efecto de disminución de la AFM1 en otros productos como yogurt (Elsanhoty et al., 2014). Se ha observado que factores como la temperatura, período de incubación, pH, tipo de cepa BAL, nivel de contaminación, número de microorganismos, así como las sustancias nutricionales pueden afectar indirectamente la cantidad de AFM1 al influir en la crecimiento y actividad de las BAL. Se ha descrito que durante el almacenamiento en presencia de BAL el pH disminuye, aumenta la acidez, así como aumenta la proteólisis y lipólisis haciendo que AFM1 disminuya (Nguyen et al., 2019). Estudios previos mencionan que la unión de la AFM1 a las BAL se da en las primeras horas de almacenamiento. Se ha evidenciado que en yogurt a 4C un 59% de la AFM1 se redujo después de dos semanas de almacenaje. Otro estudio mostró una ligera reducción de 3.2% en queso respecto a la concentración inicial en leche (Arab et al., 2012). Otra investigación señala que la cepa de S.thermophilus ST-36 redujo en un 39.16% la concentración de AFM1 en leche , la cual inicialmente era de 10 g Kg -1 (Sarimehmetoglu et al., 2004). Así mismo Govaris et al. (2002) en su investigación encontraron que S. thermophilus ST-36 produjo una reducción de 22% de AFM1 partiendo de una concentración inicial de 50 g Kg-1. Otro grupo de investigadores observaron una disminución en la concentración de AFM1 durante el almacenaje del queso Tarkhineh en el cual utilizaron S. thermophilus como cultivo iniciador y lo atribuyen a la presencia de BAL (Moradi et al., 2021). En el caso de las BAL, la pared celular bacteriana juega un papel importante en la unión a aflatoxinas. Las aflatoxinas se unen a los componentes de la pared celular a través de interacciones débiles no covalentes como puentes de hidrógeno o fuerzas de Van Der Waals y esta unión puede verse afectada por condiciones ambientales como pH, concentración de sal, etc. Los polisacáridos, ácidos 30 teicoicos y la capa de peptidoglicán de la pared celular son considerados de carácter hidrofóbico y han sido los elementos más importantes relacionados a la unión de AFM1 a la pared bacteriana (Arab et al., 2012; Assaf et al., 2019). Esta conclusión se obtuvo después de realizar un experimento donde se aplicó un tratamiento a las bacterias con periodato y pronasa E que causaron una degradación no específica de los carbohidratos y proteínas de la pared celular resultando en la incapacidad de las bacterias en unirse a la AFM1 (Muaz et al., 2021). Se ha observado que los tratamientos con calor y cambios del pH incrementan las uniones de AFM1 a los componentes de la pared celular de las bacterias, al desnaturalizarse las proteínas degradándose a péptidos pequeños y en el caso de los polisacáridos dañando el enlace glicosídico y perdiendo el peptidoglicán y los monosacáridos exponiendo así más sitios de unión a AFM1 (Nasrollahzadeh et al., 2022; Fashandi et al., 2018; Nguyen et al., 2019). Algo importante de tener presente es que las fuerzas que mantienen la unión entre AFM1 y la pared bacteriana son débiles, por lo que esta unión puede ser reversible (Muaz et al., 2021). Esto puede hacer que en el caso del proceso de almacenaje del queso fresco durante el drenado del suero se pierda parte de la AFM1. Adicionalmente, la afinidad de la pared celular de las BAL a la AFM1 es variable según la cepa, esto se ha evidenciado en diversos estudios (Sarmast et al., 2021) por lo que debe considerarse cuando se evalúen los datos de este trabajo. Partiendo de esta información, como parte de esta investigación, se indagó si durante el tiempo de almacenamiento la concentración de la toxina sufre algún cambio a través del tiempo que podría ser atribuido a los recuentos de BAL o a otros relacionados con la composición química o a las condiciones de almacenamiento del queso fresco. 31 CAPITULO 4. ARTÍCULO DISTRIBUCIÓN, ESTABILIDAD E INTERACCIÓN DE AFLATOXINA M1 CON PROTEÍNAS EN QUESO FRESCO. En este apartado, se hace un cambio a un capítulo de publicación, el cuál puede ser accesado a través de esta cita Chavarría Molina, G., Molina Alvarado, A., Leiva Gabriel, A., Méndez Hernández, G., Wong González, E., Cortés Muñoz, M., Rodríguez Sánchez, C & Granados Chinchilla, F. (2017). Distribution, stability, and protein interactions of Aflatoxin M1 in fresh cheese. Food Control, 73, 581-586. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2016.09.005 DISTRIBUTION, STABILITY, AND PROTEIN-INTERACTIONS OF AFLATOXIN M1 IN FRESH CHEESE Abstract Aflatoxin M1 (AFM1), a metabolite resulting from the hepatic metabolism of aflatoxin B1, is a potential carcinogen that can be found in milk, cheese, and others dairy products. In this work, we aimed to elucidate the distribution and fate of AFM1 in fresh cheese and whey during cheese manufacturing and storage as well as the level of interaction of this toxin with various milk, cheese, and whey proteins. Additionally, we analyzed the in vitro behavior of casein, -lactalbumin, - lactoglobulin, bovine serum albumin (BSA), lactoferrin, and mixtures thereof, with a fixed concentration of AFM1 after covalent crosslinking. Our results show that up to 70% of the AFM1 levels present in milk spiked with 0.5 and 1.5 g L-1 are released in whey during fresh cheese manufacturing. The whey and milk proteins with more AFM1 molecules bound were -lactalbumin and casein, with 88% and 81%, respectively. We also observed a substantial decrement in AFM1 concentration https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2016.09.005 32 during ripening that correlated inversely with plate counts of lactic acid bacteria and directly with the whey-draining process that occurs during fresh cheese maturation or storage. This knowledge may serve as a basis for interventions in the dairy industry aiming to increase the security of cheese and other dairy products. Keywords: Aflatoxin M1: Fresh cheese, Milk, Whey, Cheese manufacturing, Milk protein interactions. 4.1 Introduction The aflatoxins B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) and G2 (AFG2) are a group of carcinogenic toxins produced by various fungi (Zain, 2011; Bbosa et al., 2014). They are commonly found in crops, grains, feedstuff, and forage from which ruminants feed and therefore can occur in milk (Kabak, Dobson & Var, 2006). Once ingested by mammals through the diet or lactation, AFB1 is oxidized in the liver at its hydroxyl group at the 4-position to give rise to AFM1; a potential carcinogen (IARC, 2002; Prandini et al. 2009; Bbosa et al., 2014). Despite containing 8 oxygen atoms and 7 double bonds, AFM1 is considered to be very slightly soluble in water (IARC, 2002) and is heat stable; hence conventional manufacturing processes do not remove it from milk (Ellis, Smith, Simpson, & Oldham, 1991). As a consequence, it can be found in whey and different types of cheese (Cattaneo, Marinoni, Iametti, & Monti, 2013; Mohammadi, 2011; Chavarría, Granados- Chinchilla, Alfaro-Cascante, & Molina, 2015). AFM1 levels in cheese are influenced by a variety of factors, including the milk used and its origin. Other technological features, such as cheese type, renneting, press time, salt concentration, final pH, and the amount of water eliminated during processing (Mohammadi, Alizadeh, Bari, Tajik, 2008; Mohammadi, 2011), also impact final levels of AFM1. Studies have shown that AFM1 concentrations in cheese do not change even after three months of storage (Deveci, 2007). Therefore, these potential carcinogens persist during ripening and storage and can reach end consumers. This situation may represent a relevant public health issue on account of the importance of cheese in human 33 nutrition. Indeed, it is projected that the worldwide cheese production will increase ca.~2% per year and that cheese consumption is especially high (ca. 12.5 kg per capita per year) in developed countries (Ayyash, Sherkat, & Shah, 2014; Lafougere, 2012). Whereas whey contains 2% lactoferrin, 4% casein, 6% BSA, 23% -lactalbumin and 65% -lactoglobulin, milk is composed of 0.4% lactoferrin, 1.2% BSA, 4.6% - lactalbumin, 13% -lactoglobulin and 80% casein (Haug, Høstmark, Harstad, 2007; Gellrich, Meyer, & Wiedemann, 2014). It is known that AFM1 binds to proteins through non-covalent interactions (Prandini et al., 2009) and studies have demonstrated that AFM1 has an affinity for the hydrophobic regions of casein (Bianco et al., 2012; Brackett & Marth, 1982; Lopez, Ramos, Ramadan, Bulacio, & Perez, 2001). Compared to ricotta cheese, for example, fresh cheese is very rich in proteins (Cattaneo et al., 2013). Thus fresh cheese could retain AFM1 more avidly. With this hypothesis in mind, we aimed to determine the distribution and stability of AFM1 during fresh cheese manufacturing as well as the level of interaction of this toxin with different whey and milk proteins. Finally, since lactic acid bacteria (LAB) show enhanced AFM1 binding in contaminated matrices (Bovo, Corassin, Rosim, & Oliveira, 2013; Corassin, Bovo, Rosim, & Oliveira, 2013; Dalie, Deschamps, & Richard-Forget, 2010), LAB populations were assessed in parallel to understand AFM1 fate and behavior during cheese maturation and storage. 4.2 Materials and methods 4.2.1. Reagents An AFM1 standard (>98.00%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) was used for fresh cheese contamination and in all protein-interaction assays. Calibration curves for AFM1 quantification were prepared with a certified analytical standard containing 34 0.5 g mL-1 of this analyte in acetonitrile (Biopure™, Romer Labs Diagnostic GmbH, Tulln, Austria). HPLC grade acetonitrile and methanol were purchased from J.T. Baker (Avantor Materials, PA, USA). Sodium ethylenediaminetetraacetate (Na2EDTA), sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium chloride (NaCl), paraformaldehyde and 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) were purchased from Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). All reagents used were ACS grade. All solutions were prepared with ultrapure water (final conductivity = 0.055 S cm-1) obtained with a Millipore Elix 35/Milli-Q Advantage A10 system (Millipore, Bedford, MA, USA). In the preparation of fresh cheese, we used an aqueous calcium chloride (CaCl2) solution (37 g/100 g, Calcivac®, Vaco S.A Laboratories, San Jose Costa Rica) to form curd, a chymosin solution for milk coagulation (CHY-MAX® EXTRA, CHR Hansen, Milwaukee, USA), and a thermophilic LAB as a starter culture (FDDVS STI-14, CHR Hansen, Milwaukee, USA). 4.2.2. Cheese preparation Raw milk used for cheese manufacturing was collected at five farms located at San José de la Montaña, Costa Rica and transported to the laboratory at 4 C. The basal levels of AFM1 in these milk samples was determined according to the methods AOAC® OMAS SR 974.17; 980.21; 986.16; and 2000.08 (AOAC International, 2016) and their chemical composition (i.e. fat, non-fat milk solids, density, added water, protein and cryoscope freezing point) was studied with the Ekomilk milk analyzer (MILKANA KAM98-2A, Everest instruments, INDIA) (Table 1). Within the first 24 h after collection, each milk sample was divided into two equal volumes and spiked with AFM1 until final concentrations of 0.5 and 1.5 ng mL-1 were reached, notwithstanding the initial levels of AFM1 in the raw material. After spiking, contaminated milk batches were continuously stirred for 10 min to ensure complete AFM1 dispersion. Traditional techniques, similar to those used to make Costa Rican “Turrialba” cheese (Granados & Álvarez, 2007), were employed for fresh cheese preparation. Briefly, spiked milk samples were pasteurized at 65 C for 30 min in a 35 water bath, cooled to 38 C, and mixed with 1.5 g CaCl2/100 g of sample. Subsequently, the milk was cooled to 35 C and mixed with 10 mg of the aforementioned LAB culture. Coagulation was achieved through addition of chymosin and incubation of the mixture for 35 min at 33 C. The resulting curd was cut into cubes with an edge length of 1-2 cm, salted with 1 g NaCl/100 g of sample, and drained into screens (1 mm aperture size). After draining, the curd was fitted into molds which were maintained for 24 h at 4 C pressed under their own weight. Physicochemical analyses, including Ca, Na, ash, total nitrogen (expressed as protein), and fat content, were performed on each batch of final product (Table 1). To monitor protein stability, a batch of cheese was analyzed with AOAC® OMASR method 2001.14 at days 0, 7, 14, 21 and 28 in triplicate. 4.2.3. Enumeration of lactic acid bacteria (LAB) in fresh cheese The abundance of LAB in each cheese batch during storage at 4C was determined at days 0, 7, 14, 21 and 28 by triplicate using plate counts (Coeuret, Dubernet, Bernardeau, Gueguen, & Vernoux, 2003). Briefly, we homogenized 10 g of fresh cheese in 90 mL peptone water. After this homogenization step, serial decimal dilutions of the resulting suspensions were spread by duplicate onto Mann-Rogosa- Sharpe agar plates (MRS, Oxoid, Wade Road, United Kingdom) which were incubated under microaerophilic conditions at 20 C for 72-120 h. Non-sporulated Gram-positive bacilli negative for the catalase test were further identified as LAB with the API™ 50 CH system (BioM_erieux, Marcy l’Etoile, France). 4.2.4. Aflatoxin M1 interaction with milk, cheese, and whey proteins To study the interaction of AFM1 with whey or milk proteins, under controlled conditions, we mixed 0.905 ± 0.235 mg AFM1 L-1 (as per HPLC analysis) with solutions containing 0.5, 1.0 and 2.0 g whey protein mix/100 g or 1.75, 3.5 and 7.0 g milk protein mix/ 100 g, (composition of each mixture detailed below) 12.5 mL of deproteinized whey obtained through cold ultrafiltration, 12.5 mL of 0.1 mol L-1 36 HEPES (pH 7.0), 0.85 g/100 mL NaCl in order to increase ionic strength, and 0.1 mmol L-1 EDTA to avoid metal induced crosslinking during formaldehyde precipitation (as described in 2.5). The whey protein mix contained 57.1% [501.50 mg] -lactoglobulin, 22.9% [200.9 mg] -lactalbumin, 6.9% [60.53 mg] BSA, 2.4% [20.78 mg] casein and 1.6% [16.70 mg] lactoferrin. In turn, the mixture of milk protein was composed of 79.4% [697.54 mg] casein, 12.9% [113.40 mg] - lactoglobulin, 5.5% [48.75 mg] -lactalbumin, 1.8% [15.54 mg] BSA and 0.3% [2.31 mg] lactoferrin. The detailed composition of this deproteinized whey, as well as the procedure followed to obtain it appears in Table 1. 4.2.5. Protein precipitation and crosslinking with formaldehyde Protein-AFM1 interactions in the aforementioned whey and milk protein suspensions were stabilized through crosslinking for 60 min with 25 mmol L-1 paraformaldehyde (Nadeau & Carlson, 2007). After that, the reactions were quenched with 25 mmol L-1 of sodium dodecyl sulfate. Protein complexes were precipitated with trichloroacetic acid (Link & LaBaer, 2011) and the precipitates were passed through Whatman 41 filters (GE Healthcare Bio- Sciences, Pittsburgh, PA). The resulting supernatants were later analyzed for AFM1 by HPLC (as described in 2.6). 4.2.6. HPLC-based AFM1 detection The concentration of AFM1 in milk, whey, cheese, and supernatants from the protein precipitations was determined with a previously described method that combines enzyme-assisted extraction, immunoaffinity clean-up, and high-performance liquid chromatography coupled with a fluorescent detector (HPLC-FLD) (Chavarría et al., 2015). The recovery, variation, and limit of detection (LoDs) of this method in milk, whey and cheese are shown in Table 1. AFM1 concentrations were measured in each cheese batch during storage at 4  C at days 0, 7, 14, 21 and 28 by triplicate. 37 Table 1 Physicochemical characterization of starter milk, manufactured cheese and whey and performance of the chromatographic methods used for determination of AFM1 in these matrices. 4.2.7. AFM1 interaction with purified proteins To refine the results obtained with controlled protein mixtures, we repeated the formaldehyde crosslinking experiments using 1.88, 3.75 and 7.50 g casein/100 g solution and 0.25, 0.75, 1,25 or 2.50 g -lactalbumin/100 g solution. Additionally, the same treatment was applied to similar concentrations of BSA (130.22 mg), - lactoglobulin (104.35 mg), casein (143.95 mg), -lactalbumin (106.97 mg), lactoferrin (100.43 mg) using a fixed 0.5 g L-1 AFM1 concentration in a total volume of 25 mL. A similar assay was performed for each of the three commercially available casein fractions s [100.91 mg],  [104.30 mg],  [111.23 mg]). A supplementary assay was also done to simulate the natural fraction ratio of casein (Modler, 1985). In this experiment, 17.81, 9.65 and 2.45 mg mL-1 of s, ,  were used, respectively. Recoveries obtained for the resulting supernatants were normalized based on their masses. 38 4.2.8. Statistical analyses t- and U Mann-Whitney tests were applied to investigate whether the results obtained for high and low AFM1 concentrations differed. An ANOVA analysis with blocking (disregarding the variability of LAB counts among batches) was performed to assess whether LAB counts changed across time. Similarly, an ANOVA test coupled with a post hoc Tukey analysis was used to determine whether AFM1 levels diminished as a function of time. These assays were performed using IBM PAWS Statistics 22 (Armonk, NY). P values below 0.05 were considered to be significant. To explain the interaction of AFM1 with increasing protein concentrations, logarithmic curves (slopes, intercepts and determination coefficients) were constructed using Sigmaplot 13 software (Systat Software Inc., San Jose, CA). A value of r ~ 0 was deemed as lack of association. 4.3 Results and discussion 4.3.1. AFM1 carry-over from contaminated milk to cheese and whey We manufactured cheese with milk contaminated with two AFM1 levels (0.5 and 1.5 g L-1) to calculate the carryover of AFM1 from contaminated milk to fresh cheese and whey. For both concentrations assayed, a higher percentage of AFM1 was retained in whey (0.5 g L-1: mean value [70.4 ± 22.0] %; 1.5 g L-1: mean value [73.1 ± 14.0] %) rather than in cheese irrespective of the spike level (Table 2). Similar results were obtained in a previous study (López et al., 2001), in which up to 60% of AFM1 was retained by whey. This may be further influenced, as the milk quantities used in fresh cheese manufacturing are considerably lower (ca. 6-8 L of milk to produce 1 kg cheese) than those used for matured cheese. Other researchers obtained similar results in the production of Minas Frescal cheese, where a 30.6% - 42.3% carry-over was reported (Fernandes, Correa, Rosimc, Kobashigawac, & Oliveira, 2012). 39 4.3.2. AFM1 stability in cheese To monitor AFM1 and protein stability during storage in cheese we measured both concentrations in cheese at days 0, 7, 14, 21 and 28 by triplicate. Also the variation in LAB density during storage was analyzed. At day 0, the manufactured cheese had an average concentration of AFM1 0.42 ± 0.26 g L-1 (Table 2). Table 2 Aflatoxin M1 distribution in whey and fresh cheese that were derived from artificially contaminated milk with two different toxin concentrations at day zero. After 28 days of storage, between 10.1 and 70.7% of these AFM1 levels remained in cheese (Fig. 1b). This decay in AFM1 concentration correlated directly with the starter milk levels of non-fat milk solids (r = 0.747) and milk protein (r = 0.769) (Table 1). The abundance of culturable LAB in the cheese was correlated inversely (r =0.825) with the AFM1 concentration (Fig. 1a,b) during storage. Fig. 1. (A) Lactic acid bacteria enumeration and protein stability (discontinuous line and right ordinate, number in brackets represent mean protein concentration) 40 during cheese maturation. (B) Toxin levels, in function of time, during fresh cheese ripening in storage at 4 C for the 1.5 g L-1 spike level. Dissimilar letters represent significant differences with p < 0.05. a/a: p = 0.0981 a/b: p = 0.006; b/c: 0.0152; c/d: p =0.0233. w/x: p = 0.011; x/y: p = 0.0201; x/x: 0.107; x/z: p = 0.0189. We also noted a time-dependent decrease in cheese protein content that correlated with the increase of LAB population density in the samples (r = 0.878) (Fig. 1a). Though the mechanism behind this results is still unclear, our data (Fig. 1a, b) seems to reinforce publications stating that LAB may decontaminate AFM1 in cheese (Bovo et al., 2013) and other matrices (Corassin et al., 2013; Zinedine, Faid, & Benlemlih, 2005), (Fig. 1a,b). Corassin et al. (2013) previously introduced the idea of using such microorganisms to decrease aflatoxin contamination issues in the dairy industry. This idea is suited for the Costa Rican scenario. Previous reports (Hernández-Mendoza, Guzán-de-Peña, & García, 2009) have already documented the interaction between AFM1 and teichoic acids and other bacterial cell wall components of probiotic bacteria and yeasts (Gonçalves, Rosim, Gonçalves et al., 2015; Gonçalves, Rosim, Oliveira, & Corassin, 2015; Hernández- Mendoza et al., 2009). Empirical observations indicated that as LAB counts increase with time, more difficulties are faced with the cheese extract/digests going through the immunoaffinity columns, probably due to higher cellular debris. In this regard, Bovo and coworkers (Bovo et al., 2013; Bovo, Tuanny, Rosim, Fávaro, & Oliveira, 2014) have already established that non-viable cell counts affect toxin sequestration. Hence one might argue that bacterial structures may remain despite milk pasteurization and as such milk non-viable microorganisms may still influence the results observed. Lipolysis and proteolysis, which in turn may affect toxin binding capabilities, may also contribute to the decrease of AFM1 concentration during cheese ripening and storage (McSweeney, 2004). 41 Finally, since cheese pH changes as a function of time, the electrostatic and hydrophobic forces that mediate protein-toxin interactions may vary during the ripening process. (Deveci, 2007) already demonstrated that AFM1 remains in White Pickled cheese for up to 3 months of storage in brine and that approximately 31% of the AFM1 passed to whey while only about 3% passed to the brine during ripening. Therefore, salting may prevent the subsequent loss of AFM1 during cheese storage possibly due to an increase in ionic strength and disruption of the interaction between toxin and protein or due to accelerated dehydration of the cheese (Ayyash et al., 2014) and transference of AFM1 to whey. In a similar fashion, Cattaneo and coworkers (Cattaneo et al., 2013) demonstrated that AFM1 retention and distribution in ricotta cheese (a whey-based product) is also dependent on processing and manufacturing. In fact, ca. 6% of its initial concentration stays in the ricotta cheese, the remainder is lost in the liquid portion. Ultrafiltration and spray- drying can also contribute reducing AFM1 levels in a significant manner from contaminated whey (Cattaneo et al., 2013). These data are consistent with our findings. 4.3.3. AFM1 interaction with milk, cheese, and whey proteins To study the interaction of AFM1 with milk and whey proteins, we exposed purified AFM1 to a mixture of milk and whey main proteins in 3 different concentrations (maintaining the respective protein proportion), precipitated the AFM1 - protein complexes and measured the remnant AFM1 in the supernatant (Fig. 2a). We found an inverse correlation between the concentration of milk (r = - 0.997) and whey (r = - 0.986) proteins mix and the remnant concentration of AFM1 in the supernatant. The slope of the curve depicting reductions in AFM1 concentration in supernatants as a function of increasing protein concentrations for whey proteins (mx = - 0.157) was almost half of that obtained for milk proteins (mx = - 0.441) (Fig. 2a). 42 Fig. 2. AFM1 concentration in function of (A) mixture of cheese and whey main proteins (B) increasing concentrations of casein (cheese main protein) and - lactalbumin (whey main protein). Numbers in square brackets represents AFM1 remnant concentration from the, initially, 0.90 ± 0.23 g L-1 spiked solutions. To analyze the affinity of AFM1 for milk and whey proteins in detail, we repeated these experiments using AFM1 0.90 ± 0.23 g L-1 and 1.88, 3.75 and 7.50 g of casein (major milk and cheese protein)/100 g solution and 0.25, 0.75, 1.25 and 2.50 g of -lactalbumin (major whey protein)/100 g solution (Fig. 2b). As expected, the remnant concentration of AFM1 in the supernatant correlated inversely with the concentration of casein (r = - 0.987) and -lactalbumin (r = - 0.977) in the solution, probably due to the relatively high concentration of casein in milk (ca. 80 g casein/100 g protein). While the supernatant that was derived from the treatment with 2 g of a-lactalbumin/100 mL showed no signal for AFM1 in the HPLC assay, that from the experiment with the same concentration of casein exhibited an AFM1 concentration of 0.65 ± 0.12 g L-1, representing a reduction of 27.2% (Fig. 2b). However, curves depicting reductions in AFM1 concentration in supernatants as a function of increasing protein concentrations had similar slopes (mx = - 0.323, - lactalbumin vs. mx = - 0.463, casein, Fig. 2b). In contrast to the AFM1 affinity to - lactalbumin alone (with 0.5 g protein/100 mL, recovery = 52.4%, Fig. 2b), a synergic effect on AFM1 affinity and sequestration was observed when a combination of - 43 lactoglobulin, -lactalbumin, and BSA was assayed. In this case, at 0.5 g protein/100 mL, only 27.8% AFM1 was recovered (Fig. 2a). The opposite was true for the milk protein distribution simulation where a more dramatic drop in the remaining AFM1 concentration was observed if only casein (with 2 g protein/100 mL, recovery = 64.4%, Fig. 2b) was used instead of the milk proteins mix (with 2 g protein/100 mL, recovery = 79.1%, Fig. 2a). This may occur due to strong competition between proteins, especially considering that non- specific, non-covalent forces are involved in these interactions. To determine the level of affinity of the milk, cheese and whey proteins to AFM1, we exposed solutions of -lactalbumin, casein, -lactoglobulin, lactoferrin and BSA (each with a concentration ca. 4 mg mL-1) to 0.5 g L-1 AFM1. In accordance with our previous results (Fig. 2a-b), -lactalbumin [87.7%; (0.082 ± 0.021) g L-1 AFM1.] and casein [80.6%; (0.129 ± 0.174) g AFM1 L-1 solution] showed a high affinity towards AFM1. In decreasing affinity, the remainder of the proteins behaved as follows: -lactoglobulin [49.7%; (0.348 ± 0.090) g L-1], lactoferrin [47.9%; (0.336 ± 0.087) g L-1] and BSA [7.5%; (0.447 ± 0.116) g L-1]. To assess whether the affinity of AFM1 is related to a particular subunit of casein, a similar assay was performed for each of the three commercially available casein fractions casein (s, , ). All casein fractions showed a differential affinity to AFM1: s -casein [100%; <0.014 g L-1], -casein [54.5%; (0.262 ± 0.068) g L-1], k casein [21.4%; (0.452 ± 0.118) g L-1] and a mixture of subunits s, ,  exhibited a rather low relative affinity [26.9%; (0.420 ± 0.110) g L-1]. These results hint towards an antagonistic effect among fractions and may explain the differential prevalence of AFM1 in cheese types with different fraction ratios (e.g. Primosale, Robiola, Grana Padano, Ricotta). Based on the molecular weight of each protein and AFM1 and each solution concentration, one may obtain an approximation of the number of molecules of 44 AFM1 that are associated with each protein (our calculation considers the initial molecules added minus the number of molecules that remain in the supernatant after protein precipitation) =2.28 x 1012 to