UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO EFECTO DE DISTINTAS CONCENTRACIONES DE ADITIVOS Y CONDICIONES DE PROCESAMIENTO EN LA GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO DE ESPORAS DE Clostridioides difficile IN VITRO Y EN UN MODELO CÁRNICO. Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología. Marcy González Vargas 991814 Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2024 ii DEDICATORIA A YWHE iii AGRADECIMIENTO Gracias a la Universidad de Costa Rica por permitirme una vez más obtener un grado académico, por todos los profesores que se disponen para que cada día miles de estudiantes aprendan de la mejor forma para llegar a ser los mejores profesionales que pueden ser. Gracias a Mauricio por creer en mí, a Eric por siempre ayudarme sin importar la hora y el día y a Carlos por todos sus conocimientos. Gracias a todo el personal del Laboratorio de Anaerobios, CIET y el CITA por el apoyo en este proyecto. Gracias a mi familia de sangre (papi, mami, Tavo y Kate) y mi familia en la fe (Sil, Vale, Yu, Mari y Ser) por siempre apoyarme. Gracias a Roberto por darme una perspectiva diferente de la vida. iv v TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA .................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... iii HOJA APROBACIÓN ........................................................ ¡Error! Marcador no definido. TABLA DE CONTENIDO .................................................................................................... v RESUMEN ......................................................................................................................... viii LISTA DE CUADROS ........................................................................................................... x LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ xi LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................ xii CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1 1.1 Clostridioides difficile .............................................................................................. 1 1.1.1 Generalidades .................................................................................................... 1 1.1.2 Patogénesis de la infección con C. difficile (ICD) ............................................ 2 1.1.3 Estructura de la espora, esporulación y germinación ....................................... 6 1.1.4 Clasificación de C. difficile ............................................................................. 12 1.1.5 Epidemiología del ICD ................................................................................... 14 1.1.6 Casos comunitarios de C. difficile .................................................................. 16 1.1.7 Recuperación de C. difficile en medios de cultivo .......................................... 18 1.2 Productos cárnicos ................................................................................................. 21 1.3 Presencia de C. difficile en alimentos .................................................................... 24 1.3.1 Estratégias para la prevención de C. difficile en alimentos ............................ 33 CAPITULO II. OBJETIVOS ................................................................................................ 41 vi 2.1 General ................................................................................................................... 41 2.2 Específicos ............................................................................................................. 41 2.2.1 Optimizar la cantidad de taurocolato utilizada en medios líquidos de enriquecimiento para la germinación y crecimiento de esporas de C. difficile. ................ 41 2.2.2 Determinar el efecto de aditivos propios de la producción de productos cárnicos (nitrito, eritorbato de sodio, cloruro de sodio y lactato de potasio) sobre la capacidad de cepas de C. difficile para germinar y crecer en medio de cultivo. .................................... 41 CAPITULO III. METODOLOGÍA ...................................................................................... 42 3.1. Cepas utilizadas y obtención de suspensiones de esporas ..................................... 42 3.2. Optimización de una metodología para estimular la germinación y crecimiento de C. difficile en Caldo Infusión Cerebro Corazón (CICC) ................................................... 42 3.3. Determinación del efecto de varios aditivos propios de la producción de productos cárnicos sobre la capacidad de germinación y crecimiento de C. difficile en medio de cultivo. ............................................................................................................................... 44 3.4. Determinación del efecto de la congelación previa en la germinación y crecimiento de C. difficile en medio de cultivo. ................................................................................... 45 3.5. Determinación del efecto de la prereducción del medio en el crecimiento y la germinación de C. difficile ................................................................................................ 46 3.6. Determinación del efecto de variaciones en los factores intrínsecos y extrínsecos más significativos sobre la capacidad de cepas de C. difficile para germinar y crecer en un producto cárnico modelo. .................................................................................................. 47 CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 50 4.1. Optimización de una metodología para estimular la germinación y crecimiento de C. difficile. ......................................................................................................................... 50 4.2. Efecto del nitrito, eritorbato de sodio, cloruro de sodio y lactato de potasio sobre la capacidad de cepas de C. difficile para germinar y crecer en medio de cultivo ................ 59 4.3. Determinación del efecto de la congelación previa en la germinación y el crecimiento de C. difficile ................................................................................................. 64 vii 4.4. Determinación del efecto del tiempo de pre-reducción en la germinación y el crecimiento de C. difficile ................................................................................................. 68 4.5. Determinación del efecto de variaciones en la concentración de nitrito sobre la capacidad de cepas de C. difficile para germinar y crecer en un producto cárnico modelo 72 CAPÍTULO V. CONCLUSIONES ...................................................................................... 82 CAPÍTULO VI. RECOMENDACIONES ............................................................................ 84 CAPÍTULO VII. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................... 85 viii RESUMEN Clostridiodes difficile es uno de los principales agentes infecciosos causantes de la diarrea nosocomial, la cual se asocia con altas tasas de morbilidad y mortalidad, además de altos costos en atención médica. Las esporas son la forma infectante de C. difficile y se transmiten por medio de la ruta fecal-oral. Diversos estudios en América del Norte y otras partes del mundo (incluyendo Costa Rica) han demostrado niveles importantes de contaminación de carne cruda con esta bacteria. Lo anterior podría representar un riesgo de contagio para el consumidor a nivel comunitario. Una problemática en los estudios de prevalencia son las diferentes técnicas utilizadas para el aislamiento de C. difficile y ningún estudio se ha dado a la tarea de realizar una evaluación sistemática de los factores que pueden afectar el crecimiento de este microorganismo en los medios de enriquecimiento. En este estudio se optimizó la concentración de taurocolato el cual es el componente más importante en la germinación de la espora de esta bacteria y cuya respuesta puede estar relacionada con la cepa involucrada. La dosis infectante de este microorganismo sigue siendo desconocida y su prevalencia es cada vez mayor y, tomando en cuenta que la ruta de infección es fecal- oral, este estudio determinó la capacidad de este microorganismo de crecer en un alimento procesado de origen cárnico, en el cual se utiliza materias primas que contienen este microorganismo. Para todos los estudios se utilizaron 3 cepas aisladas en Costa Rica de muestras clínicas y una cepa de referencia lo que permitió determinar si hay diferencias en su capacidad de germinar y crecer en cada una de las condiciones que se evaluaron en este trabajo. Las condiciones utilizadas fueron aquellas propias de los procesos productivos de embutidos a nivel nacional y de esta forma se pudo tener un panorama más claro de si esta bacteria podría ser un riesgo en productos de origen cárnico. ix Entre los principales resultados, al optimizar la cantidad de taurocolato y temperatura de activación para las cepas C30 y NAP7/RT078, se encontró que el modelo es significativo, para NAP1/RT027 el modelo no lo fue y para el VP1 10463 sí se presenta un modelo significativo y presenta significancia en los efectos cuadráticos por lo que el valor predicho de 0,7182 se puede alcanzar con varias combinaciones dentro del modelo. Al analizar el efecto de la adición de nitrito, sal, eritorbato y lactato, la combinación de los cuatro ingredientes cárnicos resultó en una inhibición significativa del crecimiento y para el caso del efecto de los ingredientes individuales, se reportó inhibición significativa para nitrito, lactato y sal en el caso de todas las cepas a excepción del aislado de referencia VPI/104693; para esta cepa de referencia se encontró una inhibición significativa solo en el caso del lactato. Al analizar efecto del tiempo de congelación previo en el crecimiento de esporas de C. difficile se observa que las cepas de los genotipos NAP1/RT027, NAP7/RT078 y C30 no presentan diferencia significativa en los diferentes tiempos de congelación y para el caso de la cepa de referencia VPI 10463 no se encontró un resultado lógico. En lo que respecta al tiempo de prerreducción del medio en el crecimiento de esporas de C. difficile todas las cepas crecieron aun cuando el medio no estaba prereducido (0 horas) y no se encontró diferencia significativa para los tiempos de 0 y 3 horas para ninguna de las cepas con excepción de la C30. Por último, se realizó un modelo secundario con la cepa del genotipo NAP1/RT027 con las tasas de crecimiento a diferentes concentraciones de nitritos se obtuvo una ecuación polinómica de segundo orden que mejor tuvo el ajuste y donde se puede observar una relación directamente proporcional (p < 0,05) entre la tasa de crecimiento y la concentración de nitrito (ppm). Todos los resultados indican que C. difficile es una bacteria que, no solo puede ser un patógeno de origen alimentario, sino que resiste condiciones típicas de la industria de cárnicos listos para consumir. x LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile. ..................... 25 Cuadro 2. Diseño central compuesto para la optimización de la cantidad de taurocolato y la temperatura de activación de las esporas de C. difficile. ...................................................... 43 Cuadro 3. Variables independientes y su nivel para el diseño central compuesto. .............. 44 Cuadro 4. Análisis estadístico del diseño central compuesto a diferentes concentraciones de taurocolato y temperaturas para la cepa de C. difficile C30. ................................................ 51 Cuadro 5. Análisis estadístico del modelo central compuesto a diferentes concentraciones de taurocolato y temperaturas para la cepa de C. difficile NAP7/078. ..................................... 53 Cuadro 6. Análisis estadístico del modelo central compuesto a diferentes concentraciones de taurocolato y temperaturas para la cepa de C. difficile NAP1/027. ..................................... 54 Cuadro 7. Análisis estadístico del modelo central compuesto a diferentes concentraciones de taurocolato y temperaturas para la cepa de C. difficile VP1/10463. .................................... 55 Cuadro 8. Valores de absorbancia (nm) de cuatro cepas de C. difficile expuestas a diferentes ingredientes cárnicos y su combinación después de 12 horas de incubación. ...................... 60 Cuadro 9. Valores de absorbancia de cuatro cepas de C. difficile expuestas a diferentes tiempos de congelación después de 12 horas de incubación. ............................................... 66 Cuadro 10. Valores de absorbancia de cuatro cepas de C. difficile expuestas a diferentes tiempos de pre-reducción después de 12 horas de incubación. ............................................ 70 Cuadro 11. Tasas de crecimiento y R2 para los modelos primario de dos cepas de C. difficile en carne de cerdo a diferentes concentraciones de nitrito y empacada al vacío. .................. 76 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Gráfico de contorno de diferentes concentraciones de taurocolato (%) y temperaturas (°C) de activación para la cepa de C. difficile C30. ........................................ 51 Figura 2. Gráfico de contorno de diferentes concentraciones de taurocolato (%) y temperaturas (°C) de activación para la cepa de C. difficile NAP7/078 .............................. 52 Figura 3. Gráfico de contorno y superficie de respuesta a diferentes concentraciones de taurocolato (%) y temperaturas (°C) de activación para la cepa de C. difficile NAP1/027. . 54 Figura 4. Gráfico de contorno y superficie de respuesta a diferentes concentraciones de taurocolato (%) y temperaturas (°C) de activación para la cepa de C. difficile VP1/10463. 55 Figura 5. Modelos primarios de NAP1/027 a diferentes concentraciones de nitrito (A: 0 ppm, B:50 ppm, C:100 ppm, D: 150 ppm, E: 200 ppm y F: 250 ppm) y diferentes tiempos (0, 24, 48, 72 y 96 horas) en un modelo de carne de cerdo. ............................................................. 74 Figura 6. Modelos primarios de NAP7/078 a diferentes concentraciones de nitrito (A: 0 ppm, B:50 ppm, C:100 ppm, D: 150 ppm, E: 200 ppm y F: 250 ppm) y diferentes tiempos (0, 24, 48, 72 y 96 horas) en un modelo de carne de cerdo. ............................................................. 75 Figura 7. Representación gráfica y las ecuaciones obtenidas entre la tasa de crecimiento (log10/h) de C. difficile versus concentración de nitrito (ppm) para la cepa NAP1/027. ...... 80 xii LISTA DE ABREVIATURAS  ADN: ácido desoxi-ribonucleíco  APE: Agua peptonada estéril  ATCC: American Type Culture Collective  ATP: adenosin trifosfato  CA ICD: infección por C. difficile asociada por la comunidad  CDC: Center of Disease of Control and Prevention  CDCA: ácido quenodesoxicólico  CDTA ADP: ribosiltransferasa  CICC: Caldo Infusión Cerebro Corazón  CIM: concentración inhibitoria mínima  DACD: diarrea asociada a C. difficile  DPA: ácido dipicolínico  GR: germinación GerA  HACCP: Análisis de Peligro y Puntos Críticos de Control  HA ICD: infección por C. difficile asociada a hospitales  ICD: infección con C. difficile  LIBA: Laboratorio de Investigación en Bacterias Anaerobias  log: logaritmo  NaCl: Cloruro de sodio  nm: nanómetros  PAGE: electroforesis de gel de poliacrilamida  PBS: Buffer de Fosfatos  PCR: reacción de la cadena de la polimerasa  PFGE: electroforesis en gel de campo pulsado  PMN: polimorfonucleares  ppm: partes por millón xiii  RG: receptores germinantes  RT: ribotipo  RICD: infección recurrente por C. difficile  RTCR: Reglamente Técnico Centroamericano  TCDA: toxinas de pared celular  UFC: unidades formadoras de colonia  UV: ultravioleta 1 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN 1.1 Clostridioides difficile 1.1.1 Generalidades Clostridioides difficile se describió por primera vez como parte de la microbiota normal en muestras de heces de niños sanos en 1935 y la llamaron originalmente Bacillus difficilis por su morfología y la dificultad para cultivarla (Hall & O’Toole, 1935) y todavía se detecta en una cantidad considerable de niños sanos (Rousseau, et al., 2012); en el 2016 se transfirió del género Clostridium a Clostridioides (Lawson et al., 2016). Se creía que C. difficile era un comensal hasta que en los años 70 fue reconocido como el agente etiológico asociado con colitis pseudomembranosa e infección de heridas y pulmón (Bartlett, 2009). Esta bacteria es causante del 10-35% de las diarreas asociadas con antibióticos y la causa más común de diarrea nosocomial, la cual está asociada con una elevada morbilidad y mortalidad (Ricciardi et al, 2007). C. difficile es una bacteria Gram positiva, formadora de esporas y anaerobia obligada; crece más lentamente que otros clostridios y esto hace que sea más difícil de aislar porque a menudo es superada por otras bacterias en cultivos mixtos. La secuenciación del genoma de una cepa virulenta epidémica reveló que C. difficile comparte alrededor del 15% de sus secuencias de codificación con C. botulinum y C. tetani y alrededor del 11% de su genoma consiste en elementos genéticos móviles, algunos de los cuales contienen genes de resistencia a antibióticos. Estos elementos móviles incluyen transposones y profagos que pueden pasarse horizontalmente de una célula de C. difficile a otra y probablemente juegan un papel importante en la rápida evolución de esta bacteria en la última década. Algunos profagos son inducidos durante la infección y puede aislarse como partículas virales libres en muestras fecales (Meessen-Pinard et al., 2012). Además, C. difficile posee un genoma "abierto" con niveles extremos de plasticidad, con acceso e intercambio frecuente con múltiples entornos de host y grupos de genes bacterianos (Knight et al., 2015). 2 C. difficile puede detectarse en muestras de heces de muchos niños sanos menores de1 año y un pequeño porcentaje de adultos. Aunque estos datos respaldan el potencial de fuentes endógenas de infección humana, hay evidencia que este patógeno es transmisible y adquirido de fuentes externas (Cohen et al., 2010). De hecho, C. difficile se encuentra a menudo en el ambiente y puede sobrevivir durante largos períodos como esporas. 1.1.2 Patogénesis de la infección con C. difficile (ICD) C. difficile es una causa infecciosa importante de diarrea nosocomial que se asocia a altas tasas de morbilidad y mortalidad, además de altos costos en atención médica (Tillotson & Tillotson, 2011). Los síntomas de la infección con C. difficile (ICD) típicamente se presentan como diarrea acuosa, fiebre, anorexia, dolor o sensibilidad abdominal y náuseas (Jeneau et al., 2013). En ciertos casos la infección puede progresar a colitis pseudomembranosa, colitis fulminante, megacolon tóxico, shock y muerte (Bartlett et al., 1978; Warny et al., 2005; Wenisch et al., 2012). Esta bacteria es responsable de un 15 a 20% de diarrea asociada con antibióticos de origen hospitalario (Cohen et al., 2010). Los factores de riesgo para ICD incluyen el uso de antibióticos o inhibidores de la bomba de protones, aumento de la edad, cirugía gastrointestinal, baja inmunocompetencia, enfermedad crónica complicada o estancias prolongadas en centros de atención de salud (Jeneau et al., 2013). La recurrencia de ICD también es común ya que se presenta en un 20 a 35% de los pacientes que padecieron la enfermedad; de estos pacientes hasta un 45% experimentan una segunda recurrencia. En ciertos casos las recurrencias, pueden conducir al trasplante de microbiota fecal (FMT) (Shaughnessy et al., 2016). Las esporas son la forma infectante de C. difficile y se transmiten a través de la ruta fecal-oral, generalmente después del contacto con superficies contaminadas (por ejemplo, bañeras, sondas de termómetro rectal), o con frecuencia después del contacto con manos contaminadas de los trabajadores de salud (Jeneau et al., 2013). Durante el curso de ICD, C. difficile inicia una vía de esporulación que culmina en la producción de una espora latente, lo que permite que el patógeno persista en el huesped y se disemine por medio del contacto paciente-paciente y contaminación ambiental. En efecto, cepas que no pueden formar esporas 3 durante ICD son incapaces de persistir en el tracto del colon del huésped y realizar transmisión horizontal (Deakin et al., 2012). El ambiente del hospital se ha estudiado extensamente como una fuente externa para la adquisición de C. difficile. Las esporas de C. difficile contaminan el ambiente hospitalario de los pacientes hospitalizados con ICD y pueden persistir allí por al menos 5 meses, contribuyendo con la posterior transmisión y enfermedad, requiriendo prácticas de limpieza esporicida (lejía, vapor de peróxido de hidrógeno y tecnología UV, etc.) para una eliminación adecuada (Shaughnessy et al., 2016). La incidencia de ICD varía ampliamente en diferentes estudios según el tipo de hospital, tipo de cuidado (cuidado agudo vs. largo plazo), población de pacientes (ancianos frente a los jóvenes) y la presencia o ausencia de brotes nosocomiales (Yousef & Nazer, 2014). Por el contrario, se sabe poco sobre la posible presencia de esporas de C. difficile en el ambiente fuera de los hospitales y en el ambiente familiar de pacientes con ICD, incluido el entorno físico y los habitantes humanos y animales. Un estudio canadiense de los hogares en los que ningún individuo tenía antecedentes de ICD encontró C. difficile en 5.3% de los sitios en 31% de los hogares; el ribotipo 027 fue la variante más común de C. difficile (25% de los aislados) (Shaughnessy et al., 2016). C. difficile tiene numerosas adaptaciones que le permite crecer y sobrevivir en el intestino de los mamíferos, incluyendo la capacidad de tolerar los ácidos biliares y degradar etanolamina, un compuesto importante que proporciona carbono y nitrógeno para el crecimiento. Además, C. difficile puede sintetizar y tolerar altos niveles de un compuesto bacteriostático llamado p-cresol (que contribuye al olor del estiércol de caballo) que se considera como un compuesto que puede mejorar su competitividad contra otros microorganismos intestinales (Bomers et al., 2012). Entre las personas inmunocompetentes y que no han recibido tratamiento con antibióticos, C. difficile no causa problemas debido en parte a la flora comensal del intestino e inmunidad mediada por anticuerpos; sin embargo, en el ambiente de una flora de mucosa anormal o alterada, las esporas colonizan el intestino y luego germinan y las bacterias vegetativas comienzan a producir toxinas (Yousef & Nazer, 2014). Debido a que la 4 germinación de la espora es necesaria para la patogénesis, los compuestos que previenen la germinación de las esporas podrían ser una forma atractiva de prevenir las infecciones primarias o recurrentes (Bhattacharjee et al., 2016). C. difficile produce dos toxinas principales, TcdA y TcdB, que afectan las reacciones fisiológicas normales en las células intestinales, resultando en colitis y diarrea asociada a C. difficile (DACD) (Voth & Ballard, 2005). Algunas cepas hipervirulentas de C. difficile son capaces de producir, además de toxinas A y B, una toxina binaria (CDT) codificada por los genes cdtA y cdtB (Pasquale et al., 2012). Las toxinas A y B se sintetizan principalmente durante la fase log tardía y la fase estacionaria de crecimiento. Las toxinas TcdA y TcdB entran en las células por endocitosis mediada por receptor (Papatheodorou et al., 2010). Tanto las toxinas TcdA como TcdB son glicosiltransferasas (GTPasas) que atacan y alteran las vías de señalización intracelular reguladas por la familia Rho de pequeñas GTPasas, provocando la alteración del citoesqueleto de actina, lo que da como resultado la apoptosis e induce la secreción de una variedad de citocinas proinflamatorias. Esto produce la pérdida de la barrera epitelial intestinal al abrir las articulaciones entre las células, aumentando la permeabilidad del intestino y la acumulación de líquido, seguida de la aparición de diarrea (Jank & Aktories, 2008; Voth & Ballard, 2005). La función celular alterada interrumpe la integridad de la mucosa, activa apoptosis de células epiteliales y potencian el reclutamiento de polimorfonucleares neutrófilo (PMN) al sitio de la acción de la toxina. La infiltración de PMN es el sello distintivo de la colitis pseudomembranosa. No hay correlación entre la gravedad de la enfermedad y los niveles de toxina en materia fecal (Bobak et al., 2008). Algunos datos demuestran que los niveles de TcdA se correlacionan bien con síntomas de la enfermedad, mientras que los anticuerpos dirigidos específicamente contra esta toxina ejercen un efecto protector. TcdA actúa principalmente en el epitelio intestinal, causando secreción de líquido, inflamación y necrosis tisular, mientras que TcdB con su tropismo celular amplio actúa como una potente citotoxina (Bobak et al., 2008). La importancia de las toxinas A y B para la patogenicidad de la ICD ha suscitado controversias. Anteriormente, se creía que la toxina A era el principal factor de virulencia en la ICD, sin embargo, estudios recientes con cepas mutantes de C. difficile (que producen solo la toxina A o B) mostraron 5 que solo la TcdB es esencial para la virulencia (Lyras et al., 2009). En estudios adicionales, con los modelos de infección en hámsteres y cepas mutantes de C. difficile, se observó que las cepas TcdA- / TcdB + y TcdA + / TcdB- fueron capaces de causar la enfermedad (Kuehne et al, 2010; Kuehne, Cartman &MINTON, 2011). El efecto de la toxina binaria en la patogenia no se entiende bien, pero se encuentra asociada con cepas hipervirulentas y parece aumentar la actividad de la toxina A y B en un mecanismo que se cree que interrumpe la respuesta inmune del huésped (Janoir 2016). En un estudio que involucró a 265 pacientes, aquellos infectados con cepas capaces de producir la toxina binaria tuvo una mayor tasa de letalidad que aquellos infectados con cepas que no producen esta toxina (Bacci et al., 2011). Cepas de C. difficile que albergan la toxina binaria pero que carecen de Toxina A y B también se han recuperado de pacientes con ICD; esto sugiere que las dos últimas toxinas no son necesariamente requeridas para causar síntomas de infección (Eckert et al., 2015). Las cepas que producen la toxina binaria, en ausencia de TcdA y TcdB, se observaron en casos de ICD en individuos inmunodeprimidos (Androga et al., 2015; Eckert et al., 2015; Grandesso et al., 2016). La toxina binaria está compuesta por dos cadenas: una molécula tiene actividad ADP-ribosiltransferasa (CDTA) y el segundo componente (cdtB) participa en la unión de la toxina a la célula huésped y es responsable de la translocación de la enzima en el citosol. La toxina binaria actúa sobre la G-actina inhibiendo la polimerización de la actina, lo que facilita la colonización por inducción de la formación de protuberancias de las células (Gerding et al., 2014). Además de estos factores, C. difficile es capaz de formar una biopelícula en una superficie abiótica, pero la robustez de la biopelícula formada varía entre las cepas. Las células bacterianas se incrustan en una matriz compuesta de ADN, proteínas y polisacáridos, que incluye varias proteínas y toxinas de la pared celular (TCDA) (Janoir, 2016; Pantaléon et al., 2015; Semenyuk et al., 2014). La formación de biofilm por C. difficile es modulada por los reguladores centrales (Spo0A y Luxs), y componentes de la superficie tales como flagelos y la cisteína proteasa Cwp84 (Dawson et al, 2012; Pantaléon et al, 2015). 6 Existe una fuerte evidencia de la capacidad de C. difficile para formar biopelículas in vivo. En un estudio con ratas, se observó que las células de C. difficile formaban agrupaciones en asociación con tejido dañado, lo que podría sugerir la formación de micro-colonias (Lawley et al., 2009). La investigación demuestra que las células de C. difficile se asignan a comunidades multicelulares en asociación con la mucosa del huésped (Semenyuk et al., 2015). Se sabe que las biopelículas contribuyen con la resistencia a antibióticos de C. difficile, así como al estrés por el oxígeno (Dawson et al., 2012; Semenyuk et al., 2014) y promueven la persistencia de esporas resistentes (Crowtherther et al., 2014). Se hace necesario definir el papel de la formación de biopelículas en ICD y sus recurrencias. 1.1.3 Estructura de la espora, esporulación y germinación Las bacterias colonizan ecosistemas increíblemente diversos y a menudo toleran grandes fluctuaciones dentro de un entorno particular. Una estrategia altamente exitosa que permite a una célula o población escapar de condiciones que amenazan la vida es la producción de esporas. Las endosporas bacterianas, por ejemplo, se han descrito como las células más duraderas en la naturaleza (Nicholson et al., 2000). Estas células altamente resistentes y latentes pueden soportar una variedad de tensiones, incluidas la exposición a temperaturas extremas, agentes que dañan el ADN y enzimas (Errington, 2003). La capacidad de formar endosporas parece restringida a los Firmicutes (Traag et al., 2010), uno de los primeros philos bacterianos ramificados (Ciccarelli et al., 2006). Especies formadoras de esporas están representadas en la mayoría de las clases, incluyendo las Bacilia, Clostridia, Erysipelotrichi y Negativicutes (aunque evidencia convincente para excluir esta clase ha sido presentada [Yutin & Galperin. 2013]). Las endosporas son encontradas más comúnmente en los bacilos, pero también aparecen en células filamentosas y cocos (Hutchison et al, 2016). La diversidad de bacterias productoras de endosporas y sus variados estilos de vida sugieren que la vía de esporulación es finamente acoplada a la vida en un entorno particular, y es una ventaja de supervivencia celular, dispersión y, en algunos casos, reproducción (Hutchison et al, 2016). El modo sencillo y más conocido de esporulación implica una división celular asimétrica que conduce a la formación de una célula madre y una espora más 7 pequeña (Yudkin & Clarkson, 2005; Piggot & Hilbert, 2004). El inicio de la esporulación en Bacillus subtilis se desencadena por la falta de nutrientes y por una alta densidad celular (Errington, 2003; Piggot & Hilbert, 2004). Sin embargo, la decisión de esporular está estrictamente regulada, porque este proceso intensivo en consumo de energía sirve como último recurso para estas células hambrientas. En las primeras etapas de esporulación, la regulación genética depende principalmente del factor sigma de fase estacionaria σH y el regulador maestro transcripcional Spo0A (Britton et al, 2002; Hilbert & Piggot, 2004). Antes de la división celular asimétrica, el cromosoma se replica y cada origen de la replicación migra rápidamente a un polo diferente de la célula (Webb et al, 1997). Posteriormente, las regiones proximales al origen se unen a los polos opuestos y el ADN cromosómico se extiende de un polo a otro para formar un filamento axial (Kay & Warren, 1968; Ryter et al, 1966). La remodelación del peptidoglucano septal permite la migración de la membrana de la célula madre alrededor la espora (Errington, 2003; Hilbert & Piggot, 2004; Gutierrez et al, 2010; Meyer et al, 2010). Eventualmente, el borde líder de la membrana migratoria de la célula madre se encuentra, y la fisión establece la doble membrana de la espora de la célula madre. Al final, la célula madre sufre muerte celular programada y lisis, lo que libera la endospora madura (Hosoya et al, 2007, Nugroho et al, 1999.). La estructura de la espora es mucho más compleja que la de la célula vegetativa debido a sus múltiples capas. La capa exterior es el exosporium, una delgada y delicada capa hecha de proteína. Dentro de esta se encuentran las cubiertas compuestas por capas de proteínas específicas de las esporas. Dentro de estas se encuentra el cortex el cual consiste en peptoglicano de enlaces cruzados y dentro de esta se encuentra el protoplasto con la membrana celular usual y todas las demás organelas (Mandigan et al, 2003). Una espora puede permanecer dormida por años, pero puede convertirse en una célula vegetativa relativamente rápido. Este proceso involucra tres fases: activación, germinación y crecimiento. La activación ocurre durante una señalización adecuada por nutrientes específicos. Las características de muchos de los genes ger que se requieren para la óptima germinación de las esporas de Bacillus sugieren que son receptores de nutrientes germinantes particulares y/o proteínas de transporte (Moir & Smith, 1994; Moir et al, 1990). Las proteínas 8 de transporte son las más probables que se involucren centralmente en la germinación de endosporas, ya que hay flujos significativos de Na+, K+ y H+ hacia el exterior, así como la posterior recaptación de K+ en las primeras etapas de la germinación (Swerdlow et al, 1981). Normalmente moléculas de nutrientes como aminoácidos y azúcares sirven como germinantes, actuando como iniciadores de la germinación de esporas. Además de la germinación inducida por nutrientes, hay productos químicos como la dodecilamina y el Ca2+ DPA que pueden inducir la germinación, y también desencadenantes físicos, incluida la alta presión hidrostática y la abrasión, pueden iniciar la germinación (Black et al, 2005; Gould, 1969; Jones et al, 2005; Moir y Smith, 1990; Moir, 2006; Paidhungat y Setlow, 2002; Setlow B., 2003; Setlow P., 2003). Después del primer contacto de la espora con el germinante, la espora se compromete a germinar en cuestión de segundos. El primer evento es el reconocimiento del germinante por una familia de proteínas de membrana tripartita que actúan como receptores (de la familia Ger). Dichas proteínas están codificadas, en general, como operones tricistrónicos que contienen tres genes de proteínas distintos, las subunidades A, B y C que forman un complejo receptor en la membrana de la espora (Paredes-Sabja et al., 2011). Aparte de utilizar metabolitos, las endosporas también pueden germinar detectando fragmentos de peptidoglicano. Esta vía de germinación es independiente de los receptores Ger, pero usa como receptor una quinasa de membrana Ser/Thr de tipo eucariótico (PrkC) (Shah et al., 2008). Después de la activación del receptor de germinación, el núcleo de la endospora se rehidrata y los cationes del núcleo de la endospora, incluyendo el depósito grande del complejo Ca2+/ DPA, se liberan al ambiente (Moir, 2006). Otro proceso importante que ocurre durante la germinación es la descomposición de proteínas específicas (por ejemplo, las SASP) y de ciertas estructuras (por ejemplo, la corteza). Se cree que los metabolitos liberados durante estos procesos de degradación sirven como materias primas para la célula en desarrollo (Trunet et al., 2017). A medida que las secuencias completas del genoma se hicieron disponibles, los estudios comparativos para buscar genes conservados de esporulación se hicieron factibles. Se han 9 identificado 45 genes específicos para la esporulación y además se encontraron diferencias en el contenido de genes de esporulación entre los genomas de Clostridia y Bacillis, y dificultades para identificar exactamente los genes de esporulación de Clostridia utilizando las secuencias de B. subtilis (Onyenwoke et al, 2004). A pesar del importante papel que juegan las esporas de C. difficile en ICD, nuestro conocimiento de la biología de este grupo es menos que el de otros organismos bien estudiados como B. subtilis, el grupo Bacillus anthracis y Clostridium perfringens. Esto se debe, en parte, a la observación de que menos del 25% de las proteínas de la capa de esporas de B. subtilis tienen homólogos en C. difficile, haciendo las predicciones difíciles (Henriques & Moran, 2007). Por otra parte, no hay ortólogos de la familia de receptores de germinación GerA (GR) predichos para C. difficile, e incluso los componentes conservados de las vías de germinación y esporulación parecen estar reguladas diferencialmente en C. difficile en relación con C. perfringens y B. subtilis. La superficie de la espora de C. difficile es más divergente. La capa de la espora está recubierta por una capa superficial adicional, el exosporium, donde solo el grupo de ortólogos similares al colágeno BclA de B. cereus se conservan en cierta medida (Paredes-Sabja et al., 2014). Las señales que desencadenan la esporulación de C. difficile in vivo o in vitro no han sido identificadas, pero podrían estar relacionados a los estímulos ambientales, como la inanición de nutrientes, el quórum sensing y otros factores de estrés no identificados (Higgins & Dworkin, 2012). Edwards et al (2016) demostraron que las esporas poseen alta resistencia al etanol, al peróxido de hidrógeno y al cloroformo, mientras que las células vegetativas de C. difficile se destruyeron rápidamente ante estos agentes. En muchas especies de Bacillus y Clostridium, la decisión de entrar en la esporulación está regulada por varias histidinas quinasas huérfanas que pueden fosforilar el principal regulador transcripcional Spo0A. El genoma de la cepa 630 de C. difficile codifica cinco histidina quinasas huérfanas (CD1352, CD1492, CD1579, CD1949 y CD2492). Aunque el mecanismo por el cual Spo0A se fosforila durante el inicio de la esporulación de C. difficile no está clara, la ausencia de proteínas de B. subtilis implicadas en la transferencia del grupo 10 fosforilo de las histidinas quinasas a Spo0A (es decir, Spo0F y Spo0B), sugiere que el grupo fosforilo se transfiere directamente de las histidina quinasas a Spo0A, como observado en Clostridium acetobutylicum (Steiner et al., 2011). La estructura general y la morfología de las esporas de C. difficile es similar a lo que se ha visto en otras bacterias formadoras de endosporas, pero las capas más externas son particularmente diferentes y los componentes que gobiernan el ensamblaje de la capa de esporas son divergentes a los definidos para B. subtilis y/o el grupo B. cereus (Paredes-Sabja et al., 2014). Aunque las funciones de las capas más externas (es decir, capa de esporas y exosporium) en ICD y la patogénesis no están claras, informes recientes indican sobre sus posibles funciones. Se demostró que la superficie de la espora de C. difficile interactúa con los receptores de superficie no identificados de las células del epitelio intestinal. Análisis TEM de células Caco-2, modelo de adenocarcinoma de colon han demostrado que las proyecciones similares a pelos presentes en la superficie de las esporas de C. difficile R20291 estaban cerca de la membrana plasmática y microvellosidades de monocapas diferenciadas e indiferenciadas de células Caco-2, lo que sugiere que estas proyecciones de exosporas de C. difficile favorecen la aproximación de esporas y células epiteliales intestinales (Mora-Uribe et al., 2016). La infección in vitro de macrófagos con esporas de C. difficile reveló que las esporas se vuelven citotóxicas para los macrófagos posiblemente al alterar la membrana fagosomal por medio de las interacciones superficie-membrana de las esporas. También se demostró que la capa de exosporium confiere hidrofobicidad a la superficie de las esporas afectando su adherencia a superficies inertes (Paredes-Sabja et al., 2014). La germinación de esporas de C. difficile es iniciada por ciertos ácidos biliares (presumiblemente una señal del huésped) y glicina como co-germinante (presumiblemente una señal de nutrientes). Los ácidos biliares son ácidos pequeños y esteroides que la vesícula biliar libera en el tracto digestivo para ayudar a la absorción de las grasas y el colesterol. El hígado sintetiza dos familias de ácidos biliares: derivados del ácido cólico y derivados del ácido quenodesoxicólico (CDCA). Cada una de estas familias está conjugada con una taurina (ácido taurocólico [TA] o ácido taurochenodesoxicólico) o una glicina (ácido glicocólico o ácido glicohemodeoxicólico). La germinación de esporas de C. difficile es estimulada por el 11 ácido cólico, mientras que los derivados de CDCA inhiben la germinación mediada por ácido cólico. Según estudios previos, las esporas de C. difficile pueden tener una interacción más estrecha con los inhibidores de la germinación que con los activadores de la germinación (Bhattacharjee et al., 2016). Sin embargo, algunas cepas de C. difficile son capaces de germinar en medio rico en nutrientes sin taurocolato, sugiriendo que los mecanismos y / o la especificidad de los receptores de germinante (RG) son complejos. C. difficile no codifica el receptor germinante clásico, embebido en membrana, tipo ger, en cambio, la germinación de esporas de C. difficile procede a través de una novedosa ruta de germinación que implica la estimulación directa de la hidrólisis de la corteza y la posterior liberación de CaDPA del núcleo de la espora (opuesta a la germinación mediada por receptor germinativo en B. subtilis o Clostridium perfringens) (Bhattacharjee et al., 2016), para lo cual se sabe que la SleC es vital para este proceso (Gutelius et al., 2014). De hecho, un estudio reciente de Francis et al. (2013) demostró que CspC, una de las tres serinas proteasas Csp codificadas por C. difficile, actúa como RG de sal biliar. Curiosamente, la CspC (y CspA) de C. difficile se piensa que no tiene acción catalítica y una única mutación puntual en CspC (G457R) altera la especificidad germinativa de las esporas de C. difficile y permite que las esporas germinen en presencia de quenodesoxicolato, que es el inhibidor competitivo de la germinación mediada por taurocolato (Sorg & Sonenshein, 2009). En particular, se requiere CspC para la liberación de Ca-DPA de las esporas en respuesta a la glicina y taurocolato, pero no es claro si la liberación de Ca-DPA inducida por CspC se debe a la activación directa de los canales de DPA o activación de la maquinaria de hidrólisis de la corteza (Francis et al., 2013). La maquinaria implicada en la degradación de la corteza de esporas de C. difficile es similar a la encontrada en las esporas de C. perfringens en que las Csps y SleC son todas esenciales para la germinación de esporas en C. difficile. Sin embargo, la vía de señalización que conduce a la activación de SleC en respuesta al germinante difiere significativamente entre estas dos especies. La vía de señalización precisa por la cual se activa la maquinaria de hidrolización del cortex empezando por CspC no es clara (Francis et al., 2013). 12 1.1.4 Clasificación de C. difficile Para clasificar las diferentes variedades de C. difficile los tres métodos más comunes son toxinotipado, fingerprinting (mediante el uso de electroforesis en gel de campo pulsado para obtener el patrón NAP) y ribotipado. Toxinotipado se basa en polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (Rupnik, 2008) en fragmentos A3 (Toxina A) y B1 (Toxina B) del PaLoc en comparación con la secuencia de la cepa de referencia VPI 10463 (Carroll & Bartlett, 2011). Actualmente, hay 28 toxinotipos conocidos. Sin embargo, el PCR para ribotipado es el método dominante para tipar C. difficile (Indra et al., 2009). El ribotipado utiliza primers específicos complementarios a los sitios dentro del operón de ARN y se aplicó por primera vez a C. difficile por Gurtler (1993), que se dirigió al proceso de amplificación en la región espaciadora entre las regiones 16S y 23S rRNA. Se demostró que C. difficile posee múltiples copias de los genes de rRNA, que no solo variaban en número entre las cepas sino también en tamaño entre diferentes copias en el mismo genoma. Este enfoque fue simplificado por Cartwright et al. (1995) quien lo aplicó a 102 aislamientos obtenidos de 73 pacientes sintomáticos. Usando los mismos primers que Gurtler, sus fragmentos de PCR de rango de tamaño similar podrían separarse mediante electroforesis directa en gel de agarosa en lugar de geles de PAGE desnaturalizantes. Además, demostraron que los patrones de bandas no se vieron afectados por la cantidad de ADN utilizada en la reacción, y que el marcador ribotipo PCR era estable y su expresión reproducible. El poder discriminatorio se comparó con los serogrupos de Delmée y dio diferentes patrones de bandas para cada uno de los 19 serogrupos (Brazier, 2001). El fingerprint se realiza por medio de la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) que permite analizar todo el genoma después de la digestión con endonucleasas de restricción de corte raro, como SmaI, KspI, SacII o NruI, que producen hasta 10 polimorfismos de longitud de fragmento por cepa. PFGE se ha aplicado con éxito a muchos géneros diferentes y se utilizó para investigar 22 aislamientos de C. difficile de un brote en una instalación de atención a personas mayores y 30 aislamientos no relacionados epidemiológicamente. Este método es muy discriminatorio, pero entre las desventajas se encuentran el costo inicial del 13 equipo, la lentitud del procedimiento de electroforesis y su complejidad. Bidet et al. (2000) comparó los tres métodos y concluyó que la ribotipificación de la PCR, aunque marginalmente menos discriminatoria que la PFGE, ofrecía la mejor combinación de ventajas. Se han encontrado aislamientos no tipificables por PFGE debido a la degradación del ADN extraído, los cuales se han demostrado pertenecen al serogrupo G, que corresponde al ribotipo 1 de la PCR en la biblioteca de Stubbs et al. (Brazier, 2001). En un estudio se analizó el contenido genómico de 48 cepas de C. difficile que representan 21 ribotipos diferentes. El cálculo de dendrogramas basados en distancia de matriz utilizando el método de unión de vecinos para 14 genes conservados (genes estándar de marcadores filogenéticos) de los genomas de las cepas de C. difficile demostraron que los genes de cepas con el mismo ribotipo generalmente se agrupan juntos. Además, ciertos ribotipos siempre se agrupan y forman grupos de ribotipos, es decir, ribotipos 078, 033 y 126, así como los ribotipos 002 y 017, lo que indica su relación. Comparaciones, de los contenidos de genes de genomas de ribotipos que se agruparon de acuerdo con el análisis de genes conservados, revelaron que el número de genes comunes de los pertenecientes a cada uno de estos tres grupos de ribotipos, fueron muy similares para el grupo 078/033/126 (a lo sumo 69 genes específicos entre las diferentes cepas con el mismo ribotipo) pero menos similar para el grupo 002/017 (86 genes diferencia). Parece que el ribotipo es indicativo no solo de un patrón específico del espaciador intergénico ARNr 16S-23S amplificado pero también refleja diferencias específicas en las secuencias de nucleótidos de los genes conservados analizados en este estudio (Kurka et al., 2014). Lemee et al. (2004) determinó que C. difficile tiene una población clonal y la correlación entre la ribotipificación y el toxinotipado es muy alto. Un método de tipado adicional usa el análisis de endonucleasa de restricción. De acuerdo con el análisis de microarrays, hay 4 clades principales de cepas de C. difficile: el hipervirulento, el toxina defectuoso (toxina A neg pero toxina B posit.), el HA1 (principalmente aislamientos humanos) y HA2 (principalmente aislamientos de animales). Los genomas de algunas cepas hipervirulentas presentan varias delecciones en comparación con la cepa de referencia 630, el genoma del cual ha sido secuenciado (Stabler et al., 2006). 14 Recientes estudios genómicos comparativos sobre C. difficile se centran en cepas con PCR-ribotipo 027, 078 y cepas relacionadas con estos ribotipos. Aproximadamente el 50% de todas las infecciones por C. difficile en América del Norte y el Reino Unido pertenecían al PCR-ribotipo 027 durante 2003 a 2005, mientras que, por otro lado, solo el 5% de todas las ICD en 34 hospitales europeos se tipificaron como PCR-ribotipo 027 en 2008. Los ribotipos PCR más comunes en Europa son 014/020 (16%), 001 (9%) y 078 (8%) (Kurka et al., 2014). 1.1.5 Epidemiología del ICD C. difficile infecta tanto a los animales como a los humanos, y las diferencias y similitudes en estas infecciones fueron revisadas recientemente. Los ribotipos predominantes de C. difficile varían con las especies animales y la ubicación geográfica, pero existe una superposición entre las cepas animales y las humanas. C. difficile causa diarrea en lechones y caballos. Algunos aislamientos de cerdos y terneros diarreicos son indistinguibles de una cepa patogénica humana importante, el ribotipo 078. La presencia de C. difficile en animales utilizados como alimento es una indicación del potencial de transferencia de este patógeno a la carne durante el sacrificio y el procesamiento de los animales. Algunos estudios informan la presencia de esta bacteria en 3-5% de ganado de engorde en Canadá, 6.6% de rumiantes (bovinos y caprinos) en 30 granjas suizas, 8.6% de cerdos holandeses en sacrificio, 4.9% de pavos en Italia, 2.3% de pollos de engorde en Texas, y en ciervos de cola blanca criados en 36.7% de granjas evaluadas en Ohio. C. difficile también se ha detectado en muestras fecales de ovejas en los Países Bajos (Doyle, 2014). En los últimos años se ha reportado que la epidemiología de ICD en humanos ha manifestado cambios importantes. Recientemente datos de Canadá, Europa y los Estados Unidos revelan un aumento en la incidencia y gravedad de la enfermedad. Esto ha sido atribuido a múltiples factores, incluyendo cambios en la situación demográfica, aumento del uso de antibióticos de espectro amplio y aparición de una cepa hipervirulenta conocida como 15 NAP1 / BI / 027. Esta variedad es caracterizada por una mayor producción de esporas y niveles más altos de toxinas A y B, la presencia de toxina binaria y resistencia a antibióticos fluoroquinolónicos más nuevos, como la moxifloxacina. La propagación mundial de esta cepa ha sido confirmada y esto puede ser explicado por el movimiento de personas, animales, vectores y objetos inanimados en fronteras internacionales (Yousef & Nazer, 2014). El ribotipo 078, que se ha asociado con alimentos de animales y humanos, es una variedad emergente adicional de C. difficile en Europa y EE. UU (Indra et al., 2015). Otros datos revelan que la prevalencia del ribotipo hipervirulento 027 ha ido disminuyendo en algunos países. Desde la aparición y propagación del ribotipo 027, los datos de Europa en el año 2010 reportaban que la prevalencia de esta cepa estaba disminuyendo. Inglaterra vio una disminución dramática en la prevalencia del ribotipo 027 desde el establecimiento de una red nacional de ribotipificación en 2007. El ribotipo 027 disminuyó significativamente entre 2007 y 2010, pasando del 55% al 21% de prevalencia, coincidiendo con una disminución significativa en la incidencia de ICD y la mortalidad relacionada. La disminución en la prevalencia de 027 probablemente se debió a reducciones significativas en el uso de fluoroquinolonas durante este período, aunque el aumento en la conciencia y el control de la infección también pudieron haber afectado la incidencia de la enfermedad (Wilcox et al., 2012). Otro de los cambios importantes es la aparición de casos de infección con C. difficile en personas que no poseen los factores de riesgo clásicos. Antes, la ICD se consideraba una enfermedad nosocomial de personas mayores y ahora se presentan casos en personas más jóvenes que no han tenido contacto con ambientes hospitalarios. En un estudio reciente en los Estados Unidos, un 32% de todos los casos de ICD fueron clasificados como adquiridos en la comunidad (Lessa, 2013). Además, se ha visto un incremento en diagnósticos en personas jóvenes con ningún historial de uso de antibióticos (Gladys et al, 2014). En un estudio para determinar la prevalencia de C. difficile en casas de personas con ICD recurrente (R-ICD), los sitios más comunes con C. difficile positivo fueron la aspiradora (41%), el inodoro (27%) y el lavabo del baño (17%). Nueve (90%) de 10 hogares con 16 múltiples muestras positivas para C. difficile tenían un solo genotipo presente cada uno. Sin embargo, a pesar de la presencia de la bacteria, se desconoce si se encontró como causa o consecuencia de R-ICD (Shaughnessy et al., 2016). La dosis infecciosa de C. difficile requerida para causar la enfermedad depende de las características de virulencia de una cepa y la susceptibilidad del huésped. No hay datos de dosis infecciosa para humanos, pero un experimento con ratones demostró que la exposición a <7 esporas / cm2 de espacio en la jaula durante 1 hora seguida de una dosis de clindamicina fue suficiente para causar enfermedad de forma reproducible en animales sanos. Si bien no es seguro cómo esto se relaciona con las infecciones humanas, indica que la dosis infecciosa puede ser bastante baja, particularmente en aquellos que están siendo tratados con antibióticos (Lawley & Young, 2013). 1.1.6 Casos comunitarios de C. difficile Las infecciones asociadas con la comunidad se definen como aquellas que ocurren en pacientes sin hospitalización en los últimos 3 meses y se diagnosticaron en una clínica para pacientes ambulatorios o se diagnosticaron dentro de las 48 horas posteriores al ingreso en el hospital. Si los síntomas aparecen después de 48 horas, es probable que la infección haya sido adquirida en el hospital. Aparentemente, algunos casos supuestos de CA no tienen los factores de riesgo tradicionales para la infección, pero es posible que una investigación posterior revele que el paciente haya tomado antibióticos o haya tenido un contacto cercano con un paciente hospitalizado. Sin embargo, para otros no hay fuentes de infección reconocidas ni factores de riesgo obvios. (Hensgens et al., 2012). En los últimos años, C. difficile ha causado un número cada vez mayor de casos fuera de los hospitales, entre personas más jóvenes y sanas sin antecedentes recientes de uso de antibióticos. La epidemiología y la transmisión de esta infección adquirida en la comunidad no se conocen bien. Aunque el uso de antibióticos y supresores de ácido gástrico parece estar relacionado con la ICD asociada a la comunidad (CA-ICD), el 27% de los casos de CA-ICD en un estudio estadounidense no recibió antibióticos durante los 6 meses previos a la 17 enfermedad y el 17% no tiene factores de riesgo generalmente asociados con ICD (Kuntz et al, 2011). En comparación con los pacientes con ICD adquirido en el hospital (HA-ICD), los pacientes con ICD comunitaria (CA-ICD) tiene una mortalidad más baja y hospitalizaciones más cortas, pero algunos pueden tener un peor pronóstico (Jeneau et al., 2013). Se han producido incrementos en CA-ICD en los Estados Unidos y en Europa. Los informes de la CDC en 2005 describieron por primera vez infecciones graves en 4 estados en personas consideradas con bajo riesgo de infección (Centers for Disease Control and Prevention, 2005). El sistema de vigilancia en Connecticut en 2006 encontró que aproximadamente el 25% de los casos de ICD no tenían factores de riesgo establecidos (Rabatsky et al., 2008). Se examinaron los registros de casos de ICD que ocurrieron durante aproximadamente 15 años en Olmstead Co., Minnesota, para detectar diferencias entre los casos de CA y HA. La incidencia de ambos tipos de casos aumentó significativamente durante este tiempo. Los casos CA-ICD representaron alrededor del 41% del total y eran más jóvenes, más propensos a ser mujeres, y tenían infecciones menos graves y menos condiciones comórbidas (Khanna et al., 2012). Los datos recientes del Reino Unido indican que las tasas de ICD en general han disminuido desde aproximadamente 2006-2007, pero la proporción de casos adquiridos en la comunidad han aumentado (Jen et al., 2008). Un estudio intensivo de 3 meses en los Países Bajos en 2007-2008 de inicio comunitario de ICD encontró que el 26% de los pacientes no habían usado antibióticos durante los 6 meses previos a la infección ni habían sido ingresados en una institución de salud el año anterior. Se detectaron 13 ribotipos de PCR diferentes, y algunos de ellos nunca se habían detectado en brotes hospitalarios (Bauer et al., 2009). La aparición de casos comunitarios de ICD hace surgir la pregunta acerca de las posibles fuentes de contaminación en el ambiente fuera del hospital. Los humanos y las mascotas pueden portar C. difficile de forma asintomática. Las tasas de prevalencia de portadores varían según el grupo, por ejemplo, de 6 a 13% para adultos sanos, de 20 a 30% para pacientes recientemente hospitalizados y de 51% para residentes de centros de atención a largo plazo durante un brote de ICD, lo que concuerda con el aumento de portadores como resultado de 18 la exposición a la contaminación ambiental y una mayor exposición a antimicrobianos en hospitales y centros de atención a largo plazo (Galdys et al., 2014). Para el caso de los recién nacidos y bebés sanos se reporta hasta 70% de colonización por C. difficile. La colonización por C. difficile se ha demostrado en 10% de los perros domésticos sanos y en hasta 40% de los gatos y perros en clínicas veterinarias, aunque se desconoce si esto se relaciona con la transmisión de ICD a humanos. En un estudio de perros domésticos, en los pocos casos en que se detectó en un hogar cepas caninas y ambientales de C. difficile, los aislamientos exhibieron diferentes ribotipos, aunque la mayoría de las cepas de C. difficile representaban cepas toxigénicas previamente reportadas en humanos (Shaughnessy et al., 2016). En los Países Bajos, se observa una superposición entre la ubicación de las granjas porcinas y la aparición de infecciones por C. difficile ribotipo 078 en humanos, que aumentan en prevalencia. El hecho de que las infecciones con ribotipo 078 en humanos ocurrieron en una población más joven y fueron más frecuentemente adquiridas en la comunidad que las infecciones con ribotipo 027, junto con el hecho de que 078 es el ribotipo de PCR predominante en lechones, sugiere una fuente común (Goorhuis et al., 2008). 1.1.7 Recuperación de C. difficile en medios de cultivo Una consideración importante en el estudio de la transmisión de C. difficile y las fuentes ambientales es la eficiencia de métodos para la germinación óptima de las esporas y el crecimiento de bacterias vegetativas. Varios medios de cultivo y técnicas se han utilizado para investigar la prevalencia del microorganismo. Por ejemplo, esporas de 108 cepas de C. difficile (69 toxigénicos, 39 no toxigénicos) no calentadas y esporas calentadas a 80 °C durante 10 minutos mostraron baja germinación en un medio sin lisozima, pero esta aumentó en mil veces en presencia del compuesto (5 μg / ml) y en otras 100 veces (dando 100% de germinación) después del tratamiento con tioglicolato de sodio y la inoculación en un medio que contiene lisozima (Lund & Peck, 2015). También se ha reportado que la adición de la sal bilial de taurocolato de sodio a un medio selectivo aumenta la recuperación de esporas de C. difficile aisladas de muestras clínicas, 19 después de aplicar un choque térmico a 56 ° C durante 10 minutos para inactivar células vegetativas de bacterias (Lund & Peck, 2015). Se informó que el taurocolato (y otros colatos) y la glicina actúan como co-germinantes para las esporas de C. difficile (Lund & Peck, 2015), pero las esporas de diferentes aislamientos clínicos difieren en respuesta a las sales biliales, según el método empleado (Heeg et al., 2012). Por ejemplo, en agar infusión cerebro-corazón la germinación se produjo y no aumentó con la inclusión de taurocolato. Por otro lado, la inclusión de lisozima (5 μg / ml) en un medio selectivo que contiene colato de sodio (una alternativa menos costosa a taurocolato), aumentó la recuperación de C. difficile de ambientes de sala de hospital, mientras que la exposición previa de hisopos con tioglicolato alcalino no aumentó aún más la recuperación. En una evaluación de los métodos de cultivo para la recuperación de la cepa toxigénica C. difficile ATCC 9689 de heces y muestras de hisopo, el método más sensible fue el choque térmico (80 C por 10 min) seguido de enriquecimiento en un medio que contiene caldo de ciclosporina-cefoxitina manitol con taurocolato, lisozima (5 μg / ml) y cisteína, seguido de plateo en un medio nutritivo con 5% de sangre de oveja (Hink et al., 2013). En general, se ha observado que el uso del tratamiento químico con lisozima resulta en un daño subletal a las capas propias de la espora y sus enzimas asociadas favoreciendo el crecimiento en presencia de sales biliares (Permpoonpattana et al., 2011, 2013). Por ejemplo, la eliminación del exosporium de las esporas de C. difficile resulta en un aumento de formación de colonias en un medio que contiene taurocolato (Escobar-Corte’s et al., 2013). El uso de lisozima y taurocolato en un medio de cultivo puede dar una recuperación máxima de esporas de C. difficile. Se ha visto también que la adición de sangre a los medios de cultivo es ventajosa ya que esta puede ser una fuente adicional de lisozima (Lund & Peck, 2015). De acuerdo con Limbago et al. (2012), la mejor recuperación de una cepa de C. difficile de muestras de carne es por medio de enriquecimiento en caldo infusión cerebro-corazón seguido de plateo en agar sangre o en medios de agar selectivos con taurocolato. Tyrrell et al. (2013) informaron que el tratamiento con alcohol seguido de plateo en un medio selectivo que contiene sangre de caballo y taurocolato dio la mayor recuperación de muestras fecales positivas para toxina. En el mismo estudio, un medio de enriquecimiento selectivo que contiene lisozima y taurocolato, sin pretratamiento con alcohol, seguido de un plateado en 20 medio selectivo que contenía sangre de caballo y taurocolato, permitió la recuperación de C. difficile del 9% de muestras toxina positiva que fueron negativas en el plateo directo. Otro estudio demostró que el pre-enriquecimiento en caldo de carne cocida antes del plateo en un medio selectivo mejoró la recuperación; sin embargo, algunas muestras fueron positivas en cultivo directo pero no después del enriquecimiento (Lund & Peck, 2015). Se necesita tomar en consideración las condiciones anaeróbicas estrictas utilizadas para cultivo de C. difficile (Singer, 2010). Las esporas de muchos Clostridium spp. pueden sobrevivir y germinar en condiciones aeróbicas, pero las bacterias vegetativas serán inactivadas en tales condiciones. De hecho, el inicio del crecimiento de clostridios puede prevenirse mediante presencia de bajos niveles de oxígeno. Necesariamente una detección sensible de bajos números de esporas viables de algunos Clostridium spp. por medio de cultivo requiere de condiciones estrictamente anaeróbicas (Lund & Peck, 2015). Pese a todo esto, se ha logrado el aislamiento exitoso de C. difficile en medio de cultivo sin incubación en una cámara anaeróbica (Cadnum et al., 2014), utilizando medio con cisteína como agente reductor y que fue hervido antes de utilizar para eliminar el oxígeno; no hubo ninguna demostración de que un número muy bajo de C. difficile se lograra aislar, y la sensibilidad del medio no fue determinada lo cual es necesario para determinar la incidencia de la bacteria (Lund & Peck, 2015). Pese a las dificultades técnicas para el cultivo en el laboratorio y la naturaleza fastidiosa de C. difficile, ningún estudio se ha dado a la tarea de realizar una evaluación sistemática de los factores que pueden afectar el crecimiento de este microorganismo. Los estudios de aislamiento a partir de alimentos se han enfocado en aplicar los mismos métodos de cultivo que se utilizan en clínica, sin tomar en cuenta el efecto que diferentes factores intrínsecos y extrínsecos asociados con alimentos podrían tener sobre C. difficile. La optimización de metodologías de cultivo es crucial para la posterior evaluación del comportamiento de C. difficile en alimentos, de manera que se pueda generar mayor conocimiento acerca del eventual papel de esta bacteria como patógeno de transmisión alimentaria. 21 1.2 Productos cárnicos Históricamente el sector cárnico a través de todo su proceso, desde la crianza del animal hasta el consumo del producto, provee una serie de actividades relacionadas que generan trabajo y contribuyen a la economía del país. En el 2019 se estima que en Costa Rica había 1 023 953 cabezas ganado vacuno y 385 373 cabezas de ganado porcino destinados para la producción de carne. Debido a la necesidad de utilizar el 100% de la canal, muchos de los empresarios dedicados a este sector se asocian o fundan empresas de producción de embutidos y de esta forma aprovechan al máximo los recortes (INEC, 2021). Por otro lado, el consumo de carne y de productos cárnicos se ha asociado con un mayor riesgo de desarrollar enfermedades crónicas como la obesidad, el cáncer y los accidentes cerebrovasculares. Los cambiantes requisitos de los consumidores y la creciente competencia ha impulsado la búsqueda de nuevos ingredientes y nuevas tecnologías para el procesamiento de los productos cárnicos (Weiss et al., 2010). Por otra parte, factores como menos tiempo para elaborar alimentos, incorporación de la mujer a la fuerza laboral, la preferencia de productos fáciles y rápidos de preparar, productos de precio accesible y productos con buen sabor han hecho de los embutidos un producto de consumo masivo (Aguilar et al, 2001). En Costa Rica, la industria de los embutidos y el procesamiento de carne ha venido evolucionando desde operaciones manuales hasta la situación actual, con el establecimiento de plantas procesadoras con diferentes dimensiones, diversos grados de automatización en sus procesos y condiciones de infraestructura específicas para asegurar productos de calidad e inocuos. En los últimos años, esta preocupación por la calidad de los productos es lo que les ha permitido a las empresas del sector cárnico costarricense experimentar un aumento tanto en el volumen de producción de los alimentos como en la variedad de los embutidos ofrecidos a nivel nacional, entre los que se pueden citar mortadela, salchichón, salchichas, paté, salame, chorizo y jamones (Guillén, 2007). 22 Costa Rica produce, por mes, más de 5 mil toneladas de embutidos por mes, junto con jamón prensado, bacon, y mortadela. Dos empresas grandes costarricenses producen más del 70% de la producción nacional. Además, hay tres o cuatros empresas medianas y muchos micro negocios de carnicerías donde elaboran el famoso "salchichón" que no falta en la mayoría de los restaurantes del país tico. Este embutido se elabora con carne de res en trozos, lo que le brinda una mordida cárnica y se usa funda curva 40 milímetros (Escoto, 2019). Centroamérica es una región que año a año va incrementando su producción y, también, las intraexportaciones entre sus países. En esta balanza, Costa Rica y Guatemala son los que más exportan aprovechando sus cadenas de comercialización en toda la región. Esta situación permite que sea un sector atractivo para la inversión y para la atención de los grandes fabricantes mundiales de maquinaria, equipos y consumibles así como productores de materias primas y aditivos (Escoto, 2019). En Costa Rica el Reglamento técnico RTCR 411:2008 Productos Cárnicos Embutidos: Salchicha, Salchichón, Mortadela y Chorizo (Especificaciones Nº 35079-MEIC-MAG-S) es el que define las condiciones para la preparación de los embutidos. Los embutidos son productos elaborados a base de una mezcla de carnes y menudencias, aditivos alimentarios, especias, con o sin agregados de origen vegetal, enfundados en envolturas naturales o artificiales de tal manera que se obtiene un producto inocuo, agradable y apto para el consumo humano. Los aditivos utilizados en este tipo de productos tienen funciones tanto de sabor como de características sensoriales. A continuación, se detallan aquellos más comunes: ● Sal: ayuda en la conservación, sabor, acentúa el color, fija el agua, favorece la emulsificación. Se utiliza a concentraciones del 2%. ● Fosfatos: aumentan la fijación de agua en la carne, influyen indirectamente en su suavidad, disminuye la pérdida de proteínas, emulsiona las grasas, reduce el encogimiento. La carne aumenta de 16 a 96% en volumen, el corte del embutido es parejo y liso, se usa alrededor del 6-7% de concentración. 23 ● Nitritos y nitratos: Le da el color al embutido y evita el crecimiento de microorganismos patógenos. Se permite hasta 365 mg/kg residual de nitrito. ● Eritorbato de sodio: funciona como antioxidante y estabilizante permitiendo mantener el color y sabor natural de los alimentos y prolongar el tiempo de almacenamiento sin ningún tipo de toxicidad ni efectos secundarios. Actúa como acelerador del curado en embutidos, además de que les proporciona una coloración más uniforme y un sabor más agradable. ● Lactato: las sales de lactato se usan ampliamente en la industria de la carne por su capacidad para mejorar el sabor, la seguridad y la vida útil, y varios estudios han informado sobre la actividad antimicrobiana contra varios microorganismos patógenos de deterioro y transmitidos por los alimentos (Aymerich et al., 2005). ● A parte de estos aditivos se les adiciona especias para conferirle sabor al embutido. Las operaciones que se utilizan para la elaboración de productos cárnicos varían dependiendo el tipo de embutido, sin embargo, ninguna de ellas excepto la cocción, tienen efecto sobre la microbiota de la mezcla. Para los embutidos cocidos se les aplica un tratamiento térmico que alcance en su punto más frío 72°C por el tiempo que garantice la inocuidad del producto. En este sentido, se han realizado estudios sobre la resistencia de las esporas de C. difficile a diferentes condiciones. Lim et al. (2016) realizaron un estudio sobre la resistencia de las esporas a los aditivos utilizados en embutidos, al probar nitrito de sodio (250 ppm), nitrato de sodio (4000 ppm) y metasulfito de sodio (1000 ppm) no observándose ningún tipo de efecto bactericida. Rodriguez-Palacios y LeJeune (2011) determinaron la resistencia al calor en diferentes condiciones encontrando que a 85°C por 15 min o 96°C por 2 min se reduce la probabilidad de recuperación de las esporas en carne. Respecto al comportamiento de C. difficile en alimentos, no existen estudios formales sobre su capacidad de crecimiento o sobrevivencia en el producto terminado durante el almacenamiento. El uso de modelos predictivos se constituye en una opción práctica para este tipo de estudios. Para realizar modelos predictivos en productos cárnicos se utilizan los 24 métodos de análisis basados en medios de cultivos ya que permiten tener una estimación del número de bacterias presentes en el producto alimenticio (USDA, 2018). 1.3 Presencia de C. difficile en alimentos C. difficile se ha aislado de varios animales y una gran variedad de alimentos derivados de estos, pero no hay pruebas suficientes para confirmar la hipótesis de una enfermedad transmitida por alimentos o zoonosis. El cuadro 1 muestra un resumen de la detección de C. difficile en los alimentos. Probablemente, la primera descripción de C. difficile en los alimentos fue hecha en 1996 por Broda et al. En este estudio, el microorganismo se aisló de muestras descompuestas de carne envasada al vacío. Sin embargo, C. difficile se ha encontrado también en el tracto intestinal de muchos tipos de animales comestibles, incluyendo ganado, cerdos, ovejas y aves de corral (Hensgens et al., 2012; Koene et al., 2012). Ribotipos encontrados en bovinos, porcinos y aves de corral son los que causan enfermedades en humanos. Informes de la prevalencia de C. difficile toxigénico en muestras de carne van desde 75 al 100% de las muestras analizadas (Hensgens et al., 2012). En América del Norte tasas relativamente altas de prevalencia han sido reportadas en productos de carne cruda; en algunos estudios se ha reportado la presencia de C. difficile hasta en un 42% de carne de vacuno, un 41% de carne de cerdo y un 44% de muestras de pavos. Además, C. difficile toxigénico se encontró en 23- 50% de carnes crudas en los Estados Unidos, en 14% de las salchichas de verano listas para comer y en 63% de braunschweiger listas para el consumo (Songer et al., 2009). Ribotipos 078 y 027, que se encuentran comúnmente en infecciones humanas, fueron detectados. La mayoría de las cepas aisladas de alimentos tienen un genotipo idéntico al de los aislamientos humanos y animales de la misma área geográfica u otras partes del mundo (Rupnik & Songer, 2010). 25 Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile. Alimento Cantidad de muestras Prevalencia de C. difficile (%) Observaciones Local Referencia Productos cárnicos (salchicha, ternera / cerdo / pavo molido, chorizo y salchicha de hígado de cerdo) 88 42,00 73% de los aislamientos identificados como ribotipo 078 y 27% de los aislamientos identificados como ribotipo 027 Tuscon (EUA) Songer et al. (2009) Carne de res, cerdo y pollo 84 0 Austria Indra et al. (2009) Ensalada lista para comer 40 7,50 75% de los aislamientos identificados como ribotipo 017 (A- / B +) y 25% de los aislamientos identificados como ribotipo 001 Escocia Bakri et al. (2009) Carne molida mixta (muestras compuestas por cerdo y ternera) 70 4,29 66,67% de los aislamientos identificados como ribotipo AI-57 (AI se refiere al aislado en Austria) y 33,33% de los aislamientos identificados como ribotipo 053 Austria Jöbstl et al. (2010) Carne de vacuno envasada al vacío 13 15,38 Se analizaron 8 muestras deterioradas y 5 muestras no deterioradas Estado de São Paulo, Brasil Marques (2010) 26 Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile (continuación). Alimento Cantidad de muestras Prevalencia de C. difficile (%) Observaciones Local Referencia Carne de pollo 203 12,80 Aislamientos identificados como ribotipo 078 Canadá Weese et al. (2010) Productos cárnicos (venta minorista) 40 7,50 Muestras de carne de cerdo molida, salchicha ahumada cerdo y pavo molido Texas (EUA) Harvey et al. (2011) Pescados y mariscos 119 4,80 80% de los aislados identificados como ribotipo 078 y 20% mostró perfil toxigénico A- / B- Canadá Metcalf et al. (2011) Carne (carne molida, ternera, cerdo y de pollo) 147 11,50 6.25% de los aislados presentaron al menos un gen de virulencia evaluados (A- / B +), 35% de los aislamientos presentó los genes tcdA y tcdB (A + / B +) y el 58,75% de los aislamientos no presentó los genes tcdA y tcdB (A- / B-) Campinas (Brasil) Tsuchiya (2012) Productos cárnicos 102 2,00 Aislamientos identificados como ribotipo 078 Pittsburgh (EUA) Curry et al. (2012) 27 Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile (continuación). Alimento Cantidad de muestras Prevalencia de C. difficile (%) Observaciones Local Referencia Productos de carne Cerdo 31 35,48 Aislamientos identificados como ribotipo 078 Pittsburgh (EUA) Curry et al. (2012) Carne molida 956 0 EUA Kalchayanand et al. (2013) Carne 200 2 Aislamientos positivos para genes tcdA y tcdB pero negativos para la delección de los genes tcdC y cdtB. Costa Rica Quesada et al. (2013) Productos cárnicos 133 2,30 El 25% de los aislamientos como ribotipo 078, 50% de aislamientos identificados como ribotipo 014, 12,5% de los aislados identificado como ribotipo UCL57 y 12,5% de los aislados identificado como ribotipo UCL378 Bélgica Rodríguez et al. (2014) Productos cárnicos listo para el consumo (riñón bovino estofado y ternera cocido) 395 12,40 Costa de Marfil Kouassi et al. (2014) 28 Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile (continuación). Alimento Cantidad de muestras Prevalencia de C. difficile (%) Observaciones Local Referencia Carne (búfalo, caprino, ovino, bovino de ganado vacuno joven y ganado lechero adulto) 660 2,00 53,9% de los aislados identificados como ribotipo 078, 30,8% dne los aislados presentaron los genes tcdA y tcdB, y 7.7% de los aislados mostró el gen tcdB Irak Rahimi, Jalali, Weese (2014) Pescado y mariscos 67 4,50 Cepas aisladas de mejillones y salmón presentaron el perfil toxigénico V y la cepa aislada de camarón presentó el perfil toxigénico XII Texas (EUA) Norman et al. (2014) Productos cárnicos (carne de res, hamburguesa después modelada y hamburguesa después congelación) 100 7,0 28,5% de los aislamientos identificados como cepas toxigénicas Irak Esfandiari et al. (2014) Carne de cerdo 100 2,00 Aislado muestra el perfil toxigénico A- / B- Connecticut (EUA) Mooyottu et al. (2015) Comida para el consumo doméstico 188 0,53 Aislar identificado como ribotipo 078 Bélgica Rodríguez et al. (2015) 29 Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile (continuación). Alimento Cantidad de muestras Prevalencia de C. difficile (%) Observaciones Local Referencia Alimentos árabes listos para el consumo 368 1,36 20% de los aislamientos tenían la genes tcdA, tcdB y cdtB; 80% de los aislados presentaron el gen tcdA y tcdB Irak Rahimi, Afzali, Baghbadorani (2015) Moluscos bivalvos 925 3,90 22,2% de los aislados identificados como ribotipo 078/126, 8,3% de aislamientos identificados como ribotipo 010 y 19,4% de los aislados identificado como ribotipo 001 Sur de Italia Troiano et al. (2015) Carne de pollo (75 muestras de muslo con muslo, 75 muestras mama, 60 muestras de ala, 60 muestras muslo y 40 muestras de hígado) 310 8,06 20% de los aislamientos presentados gen tcdB y 32% de los aislamientos presentó el gen tcdA. Ninguno aislado presentado gen para la toxina binaria Turquía Guran, Ilhak (2015) Productos cárnicos (carne de hamburguesa carne molida, pepita de pollo, chorizo y carne enlatada) 570 1,20 83,3% (5/6) de los aislados identificados como cepas toxigénicas Irak Rahimi, Khaksar (2015) 30 Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile (continuación). Alimento Cantidad de muestras Prevalencia de C. difficile (%) Observaciones Local Referencia Carne (vacuno, ovino y cabra) 600 1,50 61,1% de los aislamientos identificados como ribotipo 078. No detectado contaminación en muestras de carne cabra Jazan (Arábia Saudita) Bakri (2016) Alimentos para el consumo en el hospital (gelatina y verduras / pan / cereales) 1.871 0,22 Aislado de muestra de gelatina identificado como ribotipo 001 y el aislado de la muestra de verduras / pan / cereales identificados como ribotipo 027 Saint Louis (EUA) Kwon et al. (2016) Comida casera 188 1,06 Aislamientos identificados como ribotipo 078 Ohio (EUA) Rodriguez- Palacios, Ilic, Lejeune (2017) Productos cárnicos de cerdo listos para consumo (colon / piel / oreja / cuero, cocido a fuego lento) 65 23,00 20% de los aislamientos tenían el gen tcdA y tcdB Taiwan Wu et al. (2017) Productos cárnicos de cerdos crudos (carne suelo y piel) 62 27,00 9% de los aislamientos tenían el gen tcdA y tcdB Taiwan Wu et al. (2017) 31 Cuadro 1. Prevalencia de la contaminación de los alimentos por C. difficile (continuación). Alimento Cantidad de muestras Prevalencia de C. difficile (%) Observaciones Local Referencia Raíces vegetales de cultivo convencional y orgánico (papa, remolachas, cebollas y zanahoria) 100 30,00 51,2% de los aislamientos identificados como cepas toxigénicas, siendo el 81,8% de las aislamientos identificados con perfil A + B + CDT- (81,8%) y 2,3% de los aislados presentó perfil A + B + CDT + Australia Lim et al. (2018) Verduras de hoja y raíces (patatas,e jengibre, rúcula, hojas diente de león, lechuga y achicoria) 154 28,00 El 8,7% de los aislamientos (10/115) fueron identificadas como cepas toxigénicas, ribotipo 014/020 Eslovenia Tkalec et al. (2019) Alimentos cocinados para consumo hospitalario (pasta, arroz, sopa, patata, espinaca, zanahoria, guisante, calabacín y carne de pollo / ternera / cerdo) 296 0,30 Aislar identificado como ribotipo 014/020, perfil toxigénico 0 (tcdA + tcdBcdtA- cdtB-) Italia Primavilla et al. (2019) Ensalada para consumo en el hospital (tomate y lechuga) 54 1,90 Aislar identificado como ribotipo 126, perfil toxigénico V (tcdA- tcdB- cdtAcdtB-) Italia Primavilla et al. (2019) 32 Por otro lado, las tasas de prevalencia más bajas (de hasta 4.3% y 2.7% en carne de res molida/cerdo y carne de pollo, respectivamente) han sido reportados en Europa. A diferencia de muchos informes de América del Norte, una encuesta de 1755 muestras de carne al por menor, incluida la carne de res molida, aves de corral molidas, pechuga de pollo, y chuletas de cerdo, probadas por los laboratorios estatales de salud pública de los Estados Unidos y 60 muestras analizadas por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, no detectó C. difficile (Limbago et al., 2012). Las diferencias en la prevalencia informada pueden deberse en parte al uso de diferente metodología. Por ejemplo, en un estudio canadiense, se aisló C. difficile toxigénico en 28 de 230 (12%) de las muestras de carne molida de venta al por menor y carne de cerdo molida. De 28 muestras positivas, 20 fueron positivos por enriquecimiento, pero no por plateo directo. El límite de detección del método de enriquecimiento fue declarado como ≤ 10 esporas/g. En cuatro muestras de carne molida vendida al por menor que fueron positivas por cultivo directo, se encontraron entre 20-240 esporas/g y en cuatro muestras de carne de cerdo molida que fueron positivas por cultivo directo se reportaron 20-60 esporas/g. C. difficile se detectó en 12.8% de muestras de carne de pollo, pero solo pudo ser detectado por enriquecimiento, lo que indica que los números presentes fueron ≤ 10 esporas/g (Weese et al., 2010). Estos informes indican que C. difficile toxigénico puede estar presente en productos cárnicos, generalmente a baja concentración. En Costa Rica se realizó un estudio en donde se aisló un genotipo toxigénico regional de C. difficile encontrado previamente en personas que presentan la infección. En el estudio se logró aislar a C. difficile en (2%) muestras de carne para el consumo humano: 1 de 67 muestras de carne de res, 2 de 66 de carne de cerdo y 1 de 67 de carne de aves de corral. Estos cuatro aislamientos fueron positivos para los genes tcdA y tcdB, pero negativos para la deleción de los genes tcdA y tcdB (Quesada-Gómez et al., 2013). Este estudio demuestra que en nuestro país las esporas de esta bacteria también pueden ser encontradas en carnes y ser un riesgo de contagio para el consumidor a nivel comunitario. 33 En otros estudios se ha encontrado C. difficile en vegetales. En un estudio realizado en Francia se encontró que un 2.9% de las muestras dieron positivo para cepas toxigénicas (Eckert et al., 2013) y en Canadá la prevalencia fue de 4,5% en vegetales donde el 60% de los aislamientos eran ribotipo 078 el cual posee las tres toxinas (Metcalf et al., 2010). En Australia, un estudio analizó raíces vegetales de cultivos orgánicos y tradicionales (papas, remolachas, cebollas y zanahorias), y se observó la incidencia de contaminación por C. difficile en el 30% de las muestras. Los resultados positivos de C. difficile presentados son 55,6% de las muestras de papa orgánica, 50% de las muestras de papa cultivada convencionalmente, 22,2% de las muestras de remolacha orgánica, 5,6% de las muestras de cebolla orgánica y 5,3% de zanahoria orgánica. El 51,2% (22/43) de los aislamientos se identificaron como cepas toxigénicas, predominantemente TcdA +/ TcdB + /CDT- (81,8%). Un aislamiento mostró un perfil TcdA +/ TcdB +/ CDT + (2,3%) (Lim et al., 2018). En Eslovenia, una investigación analizó la prevalencia de C. diffcile en 154 muestras de verduras de hoja y raíces (64 muestras de lechuga de cordero, 22 muestras de lechuga, 11 muestras de hojas de diente de león, 2 muestras de lechuga tierna, 2 muestras de rúgula, 2 muestras achicoria, 1 muestra mezcla vegetales de hoja, jengibre y 15 muestras de 75 muestras de papa). Los resultados positivos de presencia de C. difficile se encontraron en el 18,2% de las muestras (28% de las muestras de papa, 9,4% de las muestras de hortalizas de hoja y 6,7% de las muestras de jengibre). Se aislaron 115 cepas de C. difficile, la incidencia de cepas toxigénicas fue del 8.7% de los aislamientos, predominantemente el ribotipo 014/020 (Tkalec et al., 2019). De esta forma se evidencia la presencia de esta bacteria en alimentos de origen animal y vegetal lo cual puede representar un riesgo mayor de contaminación para aquellas personas susceptibles a la enfermedad (Kwon et al., 2016). 1.3.1 Estratégias para la prevención de C. difficile en alimentos Los alimentos de origen animal han sido una fuente importante de enfermedades y las intervenciones para prevenir la exposición y los brotes posteriores de infecciones de los 34 patógenos conocidos transmitidos por los alimentos existen (Hoorfar et al., 2011). Estos patógenos son diseminados por reservorios animales a través de las heces al suelo y al pasto. Esto puede provocar rebaños infectados; contaminar la granja, productos agrícolas, el agua y el medio ambiente. Además, los patógenos entéricos de los animales destinados al consumo pueden contaminar la carcasa durante el procesamiento y transmitirse al consumidor. Según Hoorfar et al. (2011), con el fin de prevenir la exposición a microorganismos patógenos en los alimentos, determinar la presencia y entendiendo el comportamiento de los microorganismos objetivo es un requisito previo. Después de esto, agregar intervenciones en varias etapas puede ayudar a reducir o prevenir la transmisión a lo largo de la cadena alimentaria. Además, a pesar de la introducción de nueva información científica, novedosos métodos de detección e intervenciones en la cadena alimentaria, se deben incorporar medidas a lo largo de toda la cadena alimentaria para garantizar la inocuidad de los alimentos. Para los patógenos zoonóticos y transmitidos por los alimentos conocidos, la bioseguridad, el manejo de las granjas y las estrategias de biocontención pueden reducir la exposición del ganado a los patógenos. Además, se sabe que el HACCP en granjas ha tenido éxito para E. coli 0157:H7 y Listeria monocytogenes. Sin embargo, con la información actual, fabricando intervenciones e implementando esquemas amplios a lo largo de la cadena alimentaria no parece factible. Además, la viabilidad económica de tales intervenciones limita su uso (Hoorfar et al., 2011). Basado en estudios realizados con patógenos alimentarios conocidos (por ejemplo, E. coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria monocytogenes) 71˚C es la temperatura de cocción recomendada para carne molida y mezclas de carne (carne molida de res, cerdo, cordero y ternera, hamburguesas, salchichas, albóndigas, pasteles de carne, etc.) y carne de cerdo. La letalidad necesaria para inactivar suficientemente estos patógenos se logra instantáneamente a esta temperatura (Servicio de inspección y seguridad alimentaria de los Estados Unidos, 1999). 35 La D100˚C para las esporas de C. difficile osciló entre 2,5 a 33,5 min, en comparación con D100˚C de 6 a 17,6 min para las esporas de C. perfringens (Nakamura et al., 1985). Se logra una reducción de las esporas de cepas de C. difficile que representan distintos ribotipos cárnicos y bovinos por 2 log10 después de calentar a 71˚C durante 120 min (Rodríguez- Palacios et al., 2010). Además, informaron una supervivencia de esporas del 10 % cuando las muestras calentadas a 71 ˚C durante 30 minutos se recalentaron a 85 ˚C durante 10 min. Sin embargo, se observó una inactivación total cuando las muestras se calentaron a 71˚C durante 30 min seguido de recalentamiento a 85˚C durante 20 min. Una limitación importante de este estudio es la determinación de la cinética de inactivación se realizó en un medio tampón. Otro estudio determinó los efectos del calentamiento a cuatro temperaturas diferentes: 63, 71, 85 y 96 °C (Rodríguez-Palacios y Lejeune, 2011). La matriz utilizada (3% carne molida, 30% de carne molida y salsa de carne (0% de grasa) se inoculó con una mezcla 1:1:1:1 de C.difficile PCR ribotipos 027, 078, 077 y ATCC 9689 y se realizaron los estudios térmicos. Dichos estudios revelaron que el envejecimiento de las esporas afecta la resistencia térmica de las esporas a 63˚C. A una temperatura de 63˚C se logró reducir la concentración de esporas en 1 log10 durante 30 minutos, si las esporas estaban frescas. Sin embargo, para las esporas envejecidas, el tratamiento térmico durante 30 minutos a esta temperatura aumentó la concentración de esporas en un 30%. Este aumento se debió a la reactivación de esporas superdormidas debido a tratamiento térmico subletal. Además, se observó una reducción de 5 a 6 log10 en la concentración de esporas observado después de 15 minutos de calentamiento a 85˚C independientemente de la edad de las esporas. Además, calentar a 96˚C durante 1 a 2 min condujo a una reducción de 6 log10. Además, el porcentaje de grasa en la carne molida posiblemente puede afectar los valores D de las esporas de C. difficile. La sugerencia al final del estudio fue cocinar los alimentos a más de 85˚C para asegurar la destrucción adecuada de las esporas de C. difficile en alimentos. Redondo-Solano et al. (2016) probaron la resistencia térmica de cuatro cepas de esporas de C. difficile (tres hipervirulentas y una no hipervirulenta) en agua peptonada (AP) y carne de cerdo individualmente a 70, 75, 80, 85 y 90°C utilizando dos métodos de recuperación 36 (taurocolato y lisozima). Se observó una mayor resistencia térmica de las esporas de C. difficile en la carne que en el agua peptonada utilizando el método de la lisozima. La hipervirulencia de las cepas de C. difficile no se asoció con una mayor resistencia térmica en la carne. Los valores z para las esporas de C. difficile en la carne estuvieron entre 6,21 y 7,21°C, y fueron 11,24 y 12,12°C utilizando los métodos de recuperación de taurocolato y lisozima, respectivamente. Los valores D y z de las esporas de C. difficile fueron mayores tanto en AP como en cerdo que los otros valores reportados en la literatura. Un choque térmico subletal puede seleccionar más organismos resistentes de la población de esporas. Por citar un ejemplo, la D100˚C para esporas de 9 de cada 10 cepas de C. perfringens aumentaron significativamente (p < 0,05) después de un choque de calor subletal a 75˚C durante 20 minutos (Juneja et al., 2003). Además, el choque térmico puede inducir mayor resistencia en esporas parcialmente activadas de B. stearothermophilus ATCC 7953 a 100˚C que esporas latentes (Beaman et al., 1988). La resistencia de Salmonella Thompson a 54 y 60˚C aumenta si las células se sometieron a un tratamiento térmico a 48˚C durante 30 minutos antes de realizar el estudio térmico (Mackey y Derrick, 1987). Este efecto se observó en todos los medios de calentamiento (caldo de soja tríptico, huevo entero líquido, leche reconstituida al 10% y 40% y carne molida). Para Listeria monocytogenes, un tratamiento térmico a 48˚C durante 120 minutos antes de la realización de estudios térmicos aumentó el D64˚C en 2,4 veces; sin embargo, no hubo cambios significativos en el aumento observado cuando las células se calentaron a 48˚C durante 30 o 60 minutos (Farber y Brown, 1990). Otra posible razón de las diferencias en las resistencias reportadas puede asignarse a diferentes cepas. Por ejemplo, para C. perfringens, variaciones significativas en la resistencia al calor de cepas se han reportado. De igual forma se puede utilizar las bajas temperaturas para controlar bacterias patógenas en alimentos. Un estudio indicó que las esporas de Clostridium welchii, uno de los principales organismos que deterioran la carne y los productos cárnicos, pueden sobrevivir al almacenamiento en congelación a -5 y -20 °C durante hasta 26 semanas (Barnes et al., 1963). Los primeros trabajos sobre congelación de alimentos citados por Georgala y Hurst (1963) demostraron que las esporas pueden permanecer viables más de 100 días a -2-20 °C. 37 Al revisar los estudios de congelación y descongelación, Young et al. (1968) concluyeron que Bacillus y Clostridium spp. sobrevivirían a ciclos diarios de -70 °C en hielo seco seguidos de 4,5 horas de descongelación a 25 °C. Un estudio sobre el efecto del almacenamiento de endosporas de Bacillus cereus a 4 °C en PBS durante hasta 1 mes mostró una pérdida de viabilidad (Cronin y Wilkinson, 2008). Otro estudio sobre C. perfringens encontró reducciones de menos de 1,3 y 1,6 log en la viabilidad en medio de esporulación de esporas de algunas cepas de C. perfringens después de un almacenamiento de hasta 6 meses a 4 y - 20 °C, respectivamente (Li y McClane, 2006). Deng et al. (2015) determinó la sobrevivencia de las esporas de C. difficile a bajas temperaturas. Aunque la viabilidad de las esporas disminuyó, todavía se observó una viabilidad significativa después de 4 meses a -20 °C, es decir, 3,5 y 3,9 log UFC/ml y -80 °C, es decir, 6,0 y 6,1 log UFC/ml para las cepas R20291 y M120, respectivamente. La misma tendencia se observó para M120 a 4 °C y 23 °C, mientras que para R20291 el cambio de viabilidad no fue significativo a 4 °C pero aumentó significativamente a 23 °C (p > 0,05). Después de 10 ciclos de congelación-descongelación, la viabilidad de ambas cepas disminuyó, pero una fracción significativa permaneció viable (4,3 y 6,3 log UFC/ml para la cepa R20291 y M120, respectivamente). Sorprendentemente, ambas cepas mostraron una mayor viabilidad en un modelo de carne que en solución salina fosfato tampón. Se observó una disminución pequeña pero significativa (p < 0,05) de 6,7 a 6,3 log UFC/ml en la viabilidad de M120 después de 2 meses de almacenamiento en el modelo de carne, mientras que la disminución desde un inicio de 3,4 log UFC/ml observada para R20291 no fue significativa. (p = 0,12). Por lo que las de C. difficile pueden sobrevivir en condiciones de baja temperatura hasta por 4 meses. Otras estrategias es el posible uso de antimicrobianos en los alimentos para lograr el control de esta bacteria. En este sentido las carnes listas para el consumo producidas comercialmente, incluidas las carnes no tratadas térmicamente, a menudo contienen conservantes alimentarios para evitar el deterioro y prolongar la vida útil. El nitrito de sodio y el nitrato son conservantes alimentarios muy utilizados en combinación en carnes listas para el consumo. El nitrito ayuda a desarrollar el sabor, reacciona con la mioglobina para 38 producir nitrosil-hemocromo, que da el color rosado característico de la carne procesada e inhibe el crecimiento de bacterias patógenas y de deterioro como Clostridium botulinum (Sindelar & Milkowski, 2012). El nitrato actúa como reservorio para la producción de nitrito a través de la enzima nitrato reductasa producida por microorganismos como estafilococos y lactobacilos. El metabisulfito de sodio es un conservante alimentario que se utiliza en embutidos crudos. En un estudio Lim et al (2016) determinaron las concentraciones mínimas inhibidoras (CIM) y concentraciones mínimas bactericidas (CBM) de nitrito de sodio, nitrato de sodio y metabisulfito de sodio contra C. difficile. Los valores de CIM para nitrito de sodio, nitrato de sodio y metabisulfito de sodio fueron 250 μg/ml, >4000 μg/ml y 1000 μg/ml, respectivamente. No se observó actividad bactericida para los tres conservantes alimentarios. Este estudio demostró que C. difficile puede sobrevivir en presencia de conservantes alimentarios en concentraciones superiores a los niveles máximos permitidos actualmente en las carnes listas para el consumo lo que hace necesario investigar que este tipo de alimentos actúen como fuente de C. difficile. La concentración mínima de nitrito que inhibe el crecimiento de Clostridium botulinum es 4 × 10−5 –8 × 10−5 g/g (Rivera et al., 2019) lo cual es inferior a lo encontrado para C. difficile en este estudio. Contrario a lo observado para la bacteria C. difficile, estudios han demostrado el efecto inhibitorio y hasta bactericida del nitrito en otros esporulados de importancia en alimentos (Beuchat et al, 2001). Redondo et al (