UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO DETECCION DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIFUNGICOS: ANALISIS DE LAS METODOLOGIAS EXISTENTES Y SUS APLICACIONES Trabajo final de graduación sometido a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Especialidades en Microbiología para optar al grado y título de Especialidad en Micología Médica GISELLE VIQUEZ BARQUERO Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2025 ii DEDICATORIA Quiero dedicar este trabajo a mi compañero Gonzalo, gracias por apoyarme siempre, por la paciencia, comprensión y sacrificio durante todo este proceso, por las palabras de aliento y motivación que me han ayudado a salir adelante y no rendirme. Gracias por estar siempre presente, incondicionalmente, por creer en mi y sostenerme en los momentos de crisis. iii AGRADECIMIENTO Mi profundo agradecimiento en primer lugar a Dios por darme la fuerza, sabiduría y salud para alcanzar esta meta. Al Sistema de Estudios de Posgrado (SEP) de a Universidad de Costa Rica por darme la oportunidad de ingresar a esta especialidad. A este grupo de compañeros de especialidad tan lindo, tan unido, que me ha motivado y brindado su amistad desde el primer momento. A mi amigo el Dr. Javier Oviedo por motivarme siempre a seguir superándome y estar pendiente de todo este proceso. A dos grandes maestros que me enseñaron el amor por esta rama de la microbiología tan hermosa como lo es la micología; la Dra. Jeannette Rodríguez como mi jefatura años atrás y el Dr. Edgar López como mi profesor de grado. A todos y cada uno de los profesores de la especialidad por sus enseñanzas y el tiempo brindado durante esta formación, en especial a la Dra. Ingrid Salas coordinadora de la especialidad. A mi tutor, el Dr. Allan Valverde por su apoyo, consejos, motivación y el esmero que ha puesto para que este proyecto sea una realidad. A mis dos lectoras; la Dra. Daniela Jaikel y la Dra. Mariamalia Cob por su ayuda y tiempo invertido en la revisión de este documento. iv v TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA .................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... iii TABLA DE CONTENIDO .................................................................................................... v RESUMEN ......................................................................................................................... viii ABSTRACT ........................................................................................................................... ix LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. x LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................. xi ANTECEDENTES ................................................................................................................. 1 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................... 4 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 6 Objetivo general .................................................................................................................. 6 Objetivos específicos .......................................................................................................... 6 METODOLOGÍA ................................................................................................................... 7 CAPÍTULO I. MECANISMOS DE ACCION DE LOS ANTIFÚNGICOS .......................... 8 Inhibidores de la síntesis y función del ergosterol ............................................................ 10 Azoles ........................................................................................................................... 11 Polienos ........................................................................................................................ 14 Alilaminas .................................................................................................................... 18 Morfolinas .................................................................................................................... 18 Inhibidores de la síntesis de la pared celular .................................................................... 19 Lipopéptidos ................................................................................................................ 19 Inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos y división nuclear ..................................... 21 Pirimidinas: (5- fluorocitocina) ................................................................................. 21 Griseofulvina ............................................................................................................... 23 vi CAPITULO II. MECANISMOS DE RESISTENCIA ......................................................... 25 Azoles ............................................................................................................................... 25 Aumento en la expresión de las bombas de eliminación activa ................................... 26 Modificación de la diana ............................................................................................... 29 Aumento en el número de copias de la diana ............................................................... 31 Sustitución del ergosterol .............................................................................................. 33 Alteración en la importación de esteroles ..................................................................... 34 Formación de biopelículas ............................................................................................ 35 Polienos ............................................................................................................................ 37 Alilaminas ........................................................................................................................ 39 Lipopéptidos (Equinocandinas) ..................................................................................... 42 Fluocitosina ...................................................................................................................... 46 CAPITULO III. METODOLOGÍAS Y ESTRATEGIAS PARA LA DETECCIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIFÚNGICOS ........................................ 50 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .................................................................... 51 PCR Convencional: ....................................................................................................... 53 PCR tiempo real: ........................................................................................................... 54 Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR): ................ 54 Secuenciación de primera generación: método de Sanger ................................................ 58 Secuenciación masiva en paralelo (SMP) o secuenciación de nueva generación (NGS) . 61 Secuenciación de tercera generación ................................................................................ 62 Pirosecuenciación ............................................................................................................. 65 Microarreglos (Microarrays) ............................................................................................ 66 Tecnología del Sistema de Amplificación Refractaria a Mutaciones (ARMS) ................ 69 Análisis de Curvas de Melting o de fusión ....................................................................... 72 vii Espectrometría de Masas (EM-MALDI TOF) .................................................................. 76 CONCLUSIONES ................................................................................................................ 87 RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 90 REFERENCIAS .................................................................................................................... 91 viii RESUMEN El presente trabajo es una revisión bibliográfica que incluye una revisión inicial de los mecanismos de acción de los diferentes grupos de antifúngicos tanto en lo que respecta a síntesis y función de la membrana plasmática, como síntesis de la pared celular y síntesis de ácidos nucleicos. Posteriormente, se describen los principales mecanismos de resistencia por grupo de antifúngico, también se hace referencia a las diferentes técnicas moleculares de detección de aquellas mutaciones que conllevan a la resistencia a los antifúngicos, tales como la secuenciación, los microarreglos, reacción en cadena de la polimerasa, la tecnología ARMS, análisis de Curvas de Melting o de fusión, se incluye en este apartado la espectrometría de masas, no como un método de detección de mutaciones sino como un método que está tomando auge en la discriminación de aislamientos sensibles y resistentes a los antifúngicos. Por último, se incluyen algunos ejemplos de las aplicaciones de estas técnicas moleculares en la detección de mutaciones relacionadas a la resistencia a los antifúngicos. ix ABSTRACT The following study is a literature review that includes an initial review of the action mechanisms of different antifungal groups, both in terms of synthesis and function of the plasma membrane, as well as cell wall synthesis and nucleic acid synthesis. Subsequently, the main resistance mechanisms by antifungal group are described, and molecular techniques for detecting those mutations that lead to antifungal resistance, such as sequencing, microarrays, polymerase chain reaction, ARMS technology, and melting curve analysis. Mass spectrometry is included in this section, not as a method for detecting mutations but as a method that is gaining popularity in the discrimination of susceptible and resistant isolates to antifungals. Finally, some examples of the applications of these molecular techniques in the detection of mutations related to antifungal resistance. x LISTA DE FIGURAS Figura 1. El fracaso terapéutico en las micosis……....…………………………………….9 Figura 2. Vía biosíntesis del ergosterol..…………………………………………………...11 Figura 3. Enzimas implicadas en el mecanismo de acción de los azoles...…..………….....13 Figura 4. Mecanismo de acción de los azoles…..…………..………………………………13 Figura 5. Interacción de la anfotericina B con el ergosterol por medio de la micosamina…16 Figura 6. Mecanismo de acción de la anfotericina B……………………………….………17 Figura 7. Mecanismo de acción 5-fluocitocina……………………………………………..23 Figura 8. Componentes de la reacción de PCR …………………………………………..…52 Figura 9. Esquema convencional de PCR…………………………………………………..52 Figura 10. Fases de la PCR …………………………………………………………..…….53 Figura 11. Método de secuenciación didesoxi de Sanger…………………………………..60 Figura 12. Método de Sanger donde cada ddNTP está marcado con un fluoróforo diferente y la posterior señal emitida por fluorescencia………………………………………………...61 Figura 13. Diagrama de Microarreglos……………………………………………………..68 Figura 14. Esquema del principio de la Tecnología ARMS………………………………...69 Figura 15. Actividad del agente fluorescente. A: ADN doble cadena saturado con el colorante. B: Aumento gradual de la temperatura. C: Inicio de la desnaturalización y disminución de la fluorescencia…………………………………………………………….73 Figura 16. A: Curva de fusión para un amplicón único y puro. B: Curva de fusión para dos amplicones diferentes………………………………………………………………………73 Figura 17. Esquema del espectrómetro de masas MALDIT-TOF………………………….77 Figura 18. Alteraciones en el espectro de masa de una cepa de C albicans expuesta a diferentes concentraciones de antifúngico………………………………………………….82 xi LISTA DE ABREVIATURAS ABC: ATP Binding Cassette AMB: Anfotericina B CMI: Concentración Mínima Inhibitoria HS: Hot Spot LOH: Pérdida de heterocigocidad MFS: Major Facilitators Superfamily CDR: Candida Drug Resistance MDR: Multi Drug Resistance ATP: Adenosin Trifosfato C35: Carbono 35 5-FC: 5-Fluorocitocina 5-FU: 5-Fluorouracilo 5-FUMP: 5-fluorouridina monofosfato LCR: Líquido Cefalorraquídeo ROS: Especies reactivas de Oxígeno dNTPs: Desoxinucleótidos Tri Fosfato EM: Espectrometría de masas CLSI: Clinical and Laboratory Standars Institute SDA: Agar Sabouraud AM: Azul de Metileno HRMA: High Resolution Melting Analysis xii TRB: Terbinafina SE: Enzima escualeno epoxidasa 1 ANTECEDENTES Las infecciones fúngicas son un problema de salud pública, que han aumentado considerablemente en los últimos años; dentro de estas se incluyen las producidas por hongos resistentes y multirresistentes a los antifúngicos (Castro et al, 2019). Las características de las micosis invasoras están cambiando ya que día a día se describen nuevas especies patógenas y la frecuencia de aislamientos resistentes a los antifúngicos ha aumentado (Mellado et al, 2002). Por lo tanto, en aras de contribuirle al médico a brindar el tratamiento más adecuado es que es importante analizar la información sobre la sensibilidad de estos microorganismos (Castro et al, 2019). Los adelantos tecnológicos han logrado dar solución o mejoría al abordaje de muchas enfermedades; por ejemplo, se realizan trasplantes de órgano sólido y médula ósea, que han permitido incrementar la sobrevida y mejorar las condiciones de vida a muchos. Por otro lado, es importante señalar que, para su éxito, estos procedimientos van de la mano con tratamientos de inmunosupresión profunda de estos pacientes, lo que los hace extremadamente susceptibles a la invasión por cualquier microorganismo, especialmente hongos, que se caracterizan por ser excelentes oportunistas (Mellado et al, 2002). También son susceptibles aquellos pacientes con quimioterapia; especialmente si presentan neutropenia, los pacientes diagnosticados con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) con bajos conteos de linfocitos T CD4 y pacientes que reciben dosis prolongadas de inmunosupresores como corticoesteroides (Nocua et al, 2020). El aumento en las tasas de morbilidad y mortalidad asociado al incremento en la incidencia de las micosis en pacientes inmunosupresos tiene mucha relación con la gran capacidad que tienen los hongos de adaptarse a los cambios ambientales y al inevitable desarrollo de resistencias a los antifúngicos dada su exposición continua a los tratamientos de uso comunitario e intrahospitalario (Pontón & Quindós, 2006). Destaca como grupo blanco los pacientes con neoplasias hematológicas cuya susceptibilidad disminuida se atribuye al uso profiláctico del fluconazol generando resistencia y favoreciendo la aparición de numerosas infecciones con especies de Candida no albicans y otras levaduras afines (Gómez, 2010). 2 El diagnóstico de las micosis sistémicas no es tan sencillo ya que las herramientas disponibles para ello tienen un bajo rendimiento, por lo que como medida preventiva los protocolos de tratamiento incluyen la profilaxis con antifúngicos, lo que suma un nuevo componente que facilita el desarrollo de resistencias secundarias a estos fármacos (Mellado et al, 2002). El objetivo principal de las pruebas de susceptibilidad que se realizan in vitro es la detección de aislamientos entre la población que son resistentes (o poco susceptibles) o bien monitorear el desarrollo de resistencia durante el tratamiento, lo que podría orientar el éxito o fracaso del tratamiento antifúngico (Castro et al, 2019). Para el estudio de la susceptibilidad in vitro a los antifúngicos ya se están desarrollando nuevas herramientas que están orientadas tanto a la metodología proteómica (MALDI-TOF MS) como a las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, estas podrían optimizar la detección de resistencias microbianas, favoreciendo así la eficacia de la terapia antifúngica. Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos permiten la detección de mutaciones de genes que están relacionados con la resistencia a los antifúngicos. Así por ejemplo en el caso de los azoles y las levaduras los genes involucrados son el MDR o CDR y el ERG11, mientras que en los hongos filamentosos es el gen Cyp51A; en lo que respecta a la resistencia a las equinocandinas las mutaciones se encuentran en los genes FKS y FKS1 para hongos filamentosos y todas las especies de Candida excepto Nakaseomyces glabratus en cuyo caso el gen involucrado es el FKS2 (Castro et al, 2019). Las estrategias de prevención para evitar o disminuir la resistencia a los antifúngicos, deben realizarse a nivel epidemiológico, diagnóstico, profiláctico y terapéutico (Mellado et al, 2002). La estrategia que podría constituirse en la más adecuada para poder controlar la resistencia a los antifúngicos y poder evitar las consecuencias que el desarrollo de la resistencia puede ocasionar a largo plazo es el conocimiento de los mecanismos moleculares de resistencia, que hasta permitiría diseñar como nuevas opciones otras moléculas más potentes que puedan retrasar la aparición de esta resistencia (Mellado et al, 2002). Por lo tanto, es necesario que se mejoren las técnicas de detección y diagnóstico precoz para que con ello se pueda establecer un tratamiento efectivo que mejore la evolución de aquellos 3 pacientes con micosis oportunistas. Dentro de las estrategias para alcanzar este objetivo se tiene el aumento de las dosis o la creación de nuevas formulaciones menos tóxicas, pero más efectivas; desarrollo de nuevas moléculas con mejor actividad o la identificación de nuevas dianas, así como combinaciones entre antifúngicos o de antifúngicos con inmunomoduladores (Mellado et al, 2002). Se puede prever que para un futuro próximo haya un aumento de cepas resistentes; puede que un elemento que se ha convertido en un peligro es la posible ocupación del nicho ecológico cercano al ser humano por especies resistentes, lo anterior debido al uso indiscriminado de los azoles en la agricultura lo que, además de favorecer la aparición de cepas resistentes podría desplazar las especies sensibles, cambiando así la población que infecta al ser humano. Sumado a esto los hongos filamentosos patógenos humanos comparten nichos ecológicos con los fitopatógenos por ser ubicuos, a lo que hay que sumarle la utilización de antifúngicos en la clínica humana (Mellado et al, 2002). Las recientes investigaciones se han enfocado en la comprensión de la síntesis de la pared celular de los hongos, dada la importancia de esta en la supervivencia de la célula fúngica y por el hecho de que los componentes estructurales de esta no se encuentran en las células de los mamíferos; esto con el objetivo de diseñar antifúngicos específicos dirigidos al bloqueo de esta estructura. También se ha enfocado la atención en enzimas extracelulares y de pared que participan en su remodelación (Niño, 2021). 4 JUSTIFICACIÓN En la actualidad, las infecciones fúngicas se han convertido en una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en ser humano, en especial aquellas con su sistema inmunológico debilitados (Rabaan et al, 2023) Estas infecciones afectan a más de mil millones de personas en el mundo; de las cuales, al menos 1 millón de ellas sufren de infección invasiva, principalmente por especies de Aspergillus, Candida, Cryptococcus y Pneumocystis (Papon et al, 2020; Firacative, 2020) Así mismo, estas infecciones se asocian con altas tasas de mortalidad, que oscilan entre 20 % y 50 %, a pesar de la disponibilidad de agentes antifúngicos potentes (Papon et al, 2020). Según Hossain y colaboradores (2022) para el 2020 se reportó 1.7 millones de muertes por estas infecciones. Este total de muertes anuales es similar o incluso, puede superar las mortalidades anuales debidas a la malaria, la tuberculosis o el VIH (Gow et al, 2022; Firacative, 2020). Las infecciones fúngicas representan una amenaza importante para la salud pública y, como componente poco reconocido de la resistencia a los antimicrobianos, constituyen una crisis emergente a nivel mundial (Fisher et al, 2022). Las infecciones fúngicas son cada vez más comunes, ello a pesar de que en la actualidad se cuenta con un mayor conocimiento de ellas, así como de métodos de tratamiento para contrarrestarlas, y esto se debe en gran medida, a la aparición regular de resistencias a los antifúngicos utilizados en el ámbito clínico (Rabaan et al, 2023). De hecho, Gow y colaboradores (2022), subrayan que el impacto de estas infecciones se ha visto exacerbado por el aumento constante de cepas y especies resistentes, lo que refleja el uso generalizado de los antimicóticos, ya sea para profilaxis o como terapia. Es por ello por lo que, en 2022 la Organización Mundial de la Salud desarrolló una lista de patógenos fúngicos prioritarios, que incluye los 19 hongos más importantes para la salud pública (Organización Mundial de la Salud [OMS], 2022; Rabaan et al, 2023). Esta lista, basada en la gravedad de la infección, constituye la primera iniciativa de ámbito mundial para clasificar por prioridad los patógenos fúngicos, considerando para ello las necesidades 5 no atendidas en materia de investigación y desarrollo, así como la importancia percibida para la salud pública (OMS, 2022; Rabaan et al, 2023) 6 OBJETIVOS Objetivo general Conocer los mecanismos de acción de los antifúngicos, los mecanismos de resistencia descritos actualmente, así como las metodologías utilizadas para su detección en el Laboratorio de Micología. Objetivos específicos 1. Describir los mecanismos de acción de las diferentes familias de antifúngicos. 2. Describir los mecanismos de resistencia a los antifúngicos descritos actualmente. 3. Describir las metodologías para detección de mecanismos de resistencia a los antifúngicos y sus aplicaciones. 7 METODOLOGÍA Para este trabajo se realizó una revisión sistemática y exhaustiva en diferentes bases de datos como Scielo, Access Medicine, BioMed Central, Free Medical Journals, Ovid, Google, Google académico, PubMed, ScienceDirect, Wiley Online Library, EBSCO, JAMA y New England Journal of Medicine. Además, se consultaron sitios web de organizaciones internacionales a las que les competen temas en salud como los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés). Se utilizaron palabras clave en español e inglés como, por ejemplo: antifúngicos, mecanismos de resistencia, resistencia a los antifúngicos, Candida auris, Candida albicans, Trichophyton rubrum, Trichophyton indotineae, Terbinafina, Anfotericina B, Azoles, Fluconazol, farmacodinámica antifúngica, antimicóticos, Flucitosina, entre otros. Se incluyeron artículos científicos y libros especializados que aportaban información valiosa para el cumplimiento de los objetivos, tales como artículos, páginas web. Otro de los criterios de selección se basó en que la información fuera lo más reciente posible por lo que se incluyó la literatura comprendida en el rango de 1999-2025, tanto en inglés como en español. 8 CAPÍTULO I. MECANISMOS DE ACCION DE LOS ANTIFÚNGICOS Es esencial profundizar en el conocimiento de la resistencia a los antifúngicos para el desarrollo de estrategias terapéuticas y profilácticas eficaces que permitan prevenir y evitar los problemas que en la actualidad debe enfrentar el personal sanitario al enfrentarse a las micosis provocadas por hongos resistentes (Pontón & Quindós, 2006). El concepto de resistencia de los hongos a los antifúngicos se puede clasificar en resistencia microbiológica y resistencia clínica; la resistencia microbiológica a su vez se subdivide en: intrínseca o innata que es la que presentan todas las cepas de una misma especie y que no tiene relación con la exposición al antifúngico; en resistencia primaria que es cuando aparecen espontáneamente cepas resistentes a un antifúngico en una especie normalmente sensible al antifúngico, sin haber tenido un contacto previo con estos; y en resistencia secundaria o adquirida es aquella que se desarrolla después de la exposición al antifúngico y que se puede deber a alteraciones fenotípicas o genotípicas que se van a manifestar de forma estable o transitoria (Mellado et al, 2002; López et al, 2016). Por su parte la resistencia clínica se define como crecimiento o falta de inhibición de un microorganismo en el foco de infección, aunque en este haya concentraciones terapéuticas del antifúngico, esta resistencia se relaciona con factores dependientes del fármaco, como la penetración y distribución del mismo, su naturaleza fungistática o fungicida, su mecanismo de acción y su interacción con otros fármacos; por factores relacionados con el paciente, como lo son el estado inmunológico, el lugar de la infección y el posible incumplimiento terapéutico, o bien por una combinación de ambos factores, pacientes que son portadores de válvulas, catéteres, etc, o bien cuando los niveles del antifúngico son bajos en sangre debido a interacciones con otros fármacos. En la Figura 1 se enumeran las posibles razones de fracaso terapéutico (Mellado et al, 2002; Pontón & Quindós, 2006). 9 Figura 1. El fracaso terapéutico en las micosis. Tomado de Pontón & Quindós, 2006. Una vez que se ha realizado la prueba de susceptibilidad o caracterización fenotípica de la resistencia, se debe realizar el análisis molecular que identifique los mecanismos de resistencia. Si bien es cierto las pruebas de susceptibilidad in vitro ayudan a elegir la mejor alternativa de tratamiento al reducir la posibilidad de que se dé un fallo terapéutico, estas poseen la limitante de que no se sabe con seguridad si son capaces de detectar la resistencia in vitro a la anfotericina B, además de ser técnicas cuya complejidad metodológica no permite que se puedan realizar en todos los laboratorios. El estudio molecular es la estrategia más importante para poder evitar las consecuencias que a largo plazo puede ocasionar el desarrollo de la resistencia, además para desarrollar moléculas más potentes y seguras que las eviten (Mellado et al, 2002). En general los mecanismos que se han identificado por los cuales una célula que inicialmente es sensible se hace resistente son: 1. Incapacidad del fármaco para alcanzar la diana dentro de la célula, esto se puede dar por barreras de permeabilidad o a sistemas de bombeo activo del compuesto al 10 exterior (Mellado et al, 2002). 2. Cambios en la interacción del fármaco y la diana, debido a un aumento del número de copias de la diana o por modificaciones debido a mutaciones (Mellado et al, 2002). 3. Modificaciones en las enzimas de las vías metabólicas (Mellado et al, 2002). 4. Alteraciones en la degradación o modificación del fármaco a nivel intracelular (Mellado et al, 2002). No son muchos los grupos de antifúngicos de los que se dispone, esto se debe en parte a la estrecha relación evolutiva entre los hongos y los humanos, siendo esto una limitante en el número de blancos hongo específicos que pueden utilizarse para el desarrollo de nuevos fármacos antifúngicos (Lee et al, 2023). Actualmente, en la práctica clínica los grupos de fármacos antifúngicos que se utilizan se clasifican con base en diferentes características como su mecanismo de acción, su estructura química, espectro de acción y tipo de micosis contra la que actúan en azoles, polienos, alilaninas, morfolinas, lipopéptidos, pirimidinas y griseofulvina (Rivera et al, 2020; Bonifaz, 2012). Estos fármacos se dirigen a diferentes procesos celulares, como la biosíntesis de la membrana celular, la biosíntesis de la pared celular, o la biosíntesis de ácidos nucléicos y división nuclear; ya sea inhibiendo (fungistático) o eliminando (fungicida) el crecimiento de la célula patógena (Bhattacharya et al, 2020). A continuación, se detallarán estos grupos de antifúngicos según su mecanismo de acción. Inhibidores de la síntesis y función del ergosterol El ergosterol es el componente mayoritario de las membranas celulares, tanto de la membrana plasmática como de la membrana mitocondrial y es vital para el mantenimiento y función de estas. La biosíntesis del ergosterol es catalizada por una cascada de 25 enzimas diferentes (figura 2). Esta vía es un blanco ideal porque el ergosterol es un lípido esencial para los hongos y no está presente en las células humanas (Bhattacharya et al, 2020). 11 Figura 2. Vía de biosíntesis del ergosterol. Tomado de Bhattacharya et al, 2020. Azoles Generalidades: son moléculas sintéticas, se clasifican en dos grupos, los imidazoles que contienen dos moléculas de nitrógeno en el anillo azólico e incluyen al clotrimazol, econazol, ketoconazol, miconazol y tioconazol. Los triazoles que contienen tres moléculas de nitrógeno en el anillo azólico e incluye al fluconazol, itraconazol, voriconazol, isavuconazol y posaconazol (Bhattacharya et al, 2020; Cuenca, 2010). Son la familia más amplia de los antifúngicos (Pontón & Quindós, 2006). Los imidazoles tienen actividad frente a levaduras, 12 dermatofitos y algunos hongos miceliales no dermatofitos, pero por su toxicidad aumentada con respecto a los triazoles son poco utilizados en la práctica hospitalaria (Cuenca, 2010). Los triazoles son los más recomendados para el tratamiento de las micosis invasivas, tienen una afinidad mucho mayor por las enzimas fúngicas que por las humanas, por esta razón muestran mucho menos toxicidad que los imidazoles y pueden administrarse a dosis más elevadas (Cuenca, 2010; Espinel, 2008). A pesar de que Pichia kudriavzevii (Candida krusei) y Nakaseomyces glabratus (Candida glabrata) presentan sensibilidad disminuida a fluconazol, su espectro de acción se restringe a la mayoría de las especies de Candida y Cryptococcus. El voriconazol tiene un espectro de actividad que incluye Candida, Cryptococcus neoformans, Fusarium, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, dermatofitos, Histoplasma capsulatum, Malassezia, Pseudallescheria boydi, Sporothrix schenckii y Absidia corymbifera (Pontón & Quindós, 2006). La aparición de aislamientos de Candida resistentes principalmente al fluconazol se ha favorecido por el hecho de que estos fármacos son los más prescritos en la práctica clínica y se utilizan de forma indiscriminada (Oliveira et al, 2013). La mayoría de los hongos filamentosos tienen resistencia intrínseca a ketoconazol y fluconazol por lo que no tienen utilidad en las infecciones fúngicas invasivas por estos hongos (Mellado et al, 2002). Pichia kudriavzevii presenta resistencia intrínseca a estos fármacos. El itraconazol y el voriconazol tienen un espectro de acción más amplio ya que se extiende a la mayor parte de las cepas de Aspergillus spp., por su parte los mucorales presentan resistencia natural al voriconazol. El espectro de acción del posaconazol si se extiende a los mucorales (Cuenca et al, 2010). Mecanismo de acción: se unen de manera no competitiva al grupo hemo que forma parte de muchas enzimas que están implicadas en la síntesis de ergosterol especialmente la 14-α demetilasa (Cuenca et al, 2010; Czajka, 2023). Básicamente interfieren en la síntesis del ergosterol al bloquear la conversión del lanosterol en ergosterol, uniéndose a la enzima 14-α demetilasa (Erg11); enzima unida a la membrana en el retículo endoplásmico y la que cataliza 13 la eliminación del grupo 14-α metil del lanosterol, este bloqueo da como resultado la inhibición de la síntesis de ergosterol, con lo cual se produce una alteración de la permeabilidad de la membrana de las células fúngicas y la acumulación de esteroles metilados que resultan tóxicos para la célula. Sin embargo, este bloqueo inhibe el crecimiento de la célula, pero no la mata, por lo que su efecto es meramente fungistático (Mellado et al, 2002; Espinel, 2008; López et al, 2016). Por ejemplo, cuando se inhibe la Erg11 otras enzimas de la vía como: Erg6p, Erg25p, Erg26p, Erg27p y Erg3p sintetizan el esterol tóxico fungistático 14-α-metilergosta 8-24 (28) dienol (Bhattacharya et al, 2020) (figuras 3 y 4). Figura 3. Enzimas implicadas en el mecanismo de acción de los azoles. Tomado de Bhattacharya et al, 2020. Figura 4. Mecanismo de acción de los azoles. Tomado de Nocua et al, 2020. 14 Los azoles también son responsables de elevar los niveles de las especies reactivas del oxígeno (ROS). Tanto la producción de esteroles tóxicos como las ROS elevadas inhiben el crecimiento del hongo (Bhattacharya et al, 2020). De las 36 familias de las enzimas del citocromo P-450 (CYP), hay siete (CYP51-57) que existen en distintas especies fúngicas. Actualmente, se conocen las secuencias del gen CYP51 en algunos mamíferos, plantas, varias levaduras y algunos hongos filamentosos; en Aspergillus spp. se conoce que esta enzima Cyp51 está codificada por dos genes que codifican las isoenzimas, Cyp51A y Cyp51B que son 60 % idénticas, complicando el estudio de las resistencias (Mellado et al, 2002; Cuenca, 2010; Lee et al, 2023). La mutación en Cyp51A está bien caracterizada y confiere resistencia a los triazoles en A. fumigatus, pero el papel de la resistencia azoles en la mutación Cyp51B no está muy claro. (Lee et al, 2023). Los azoles en el anillo imidazólico o triazólico tienen un átomo de nitrógeno mediante el cual se unen a la protoporfirina ligada a hierro en el centro activo de la enzima; mientras que la unión del resto de la molécula del azol va a depender de la estructura de cada azol. Cada especie fúngica varía en su conformación exacta del sitio activo, la unión de cada azol con las diferentes clases de enzimas va a determinar su espectro de acción. La sustitución del anillo imidazólico por el anillo triazólico ha permitido aumentar la especificidad de la unión a la enzima (Pontón & Quindós, 2006). Polienos Generalidades: desarrollados desde la década de 1950, fueron los primeros antifúngicos de amplio espectro disponibles para infecciones fúngicas invasivas (Angulo & Santos, 2022). Son producto del metabolismo secundario de bacterias del orden Actinomycetales, y fueron los primeros compuestos con actividad antifúngica específica. Se clasifican en trienos, tetraenos, pentaenos, exaenos y heptaenos de acuerdo con el número de dobles enlaces conjugados en su estructura. En la actualidad se utilizan más frecuentemente los tetraenos como la nistatina y natamicina, y el heptaeno anfotericina B (AMB) (Rivera et al, 2020). 15 Son activos contra gran variedad de hongos, la anfotericina B ha sido el fármaco de elección para el tratamiento de las micosis sistémicas (Pontón & Quindós, 2006). Pero es raramente requerido en casos de Candidiasis invasiva (Bhattacharya et al, 2020). Es utilizada vía intravenosa principalmente para el tratamiento de micosis de alta patogenicidad como C. immitis, H. capsulatum, B. dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, C. neoformans y especies de Aspergillus y Mucorales (Rivera et al, 2020). Por su baja absorción no se cuenta con presentación vía oral. La limitante para su uso es su elevada toxicidad, por lo que a mediados de 1990 se realizaron formulaciones como la AMB liposomal, AMB complejo lipídico y AMB de dispersión coloidal; sin embargo, no se ha podido eliminar la nefrotoxicidad, presentándose especialmente en dosis altas o cuando se administra por periodos prolongados (Angulo & Santos, 2022). Scedosporium spp., Fusarium spp. y Trichosporon spp., poseen resistencia intrínseca a la AMB (Mellado et al, 2002). La nistatina se encuentra en presentación tópica y oral, utilizada principalmente para el tratamiento de infecciones cutáneas y de mucosas causadas por Candida spp., no posee actividad contra dermatofitos (Rivera et al, 2020). La formulación convencional de nistatina produce efectos tóxicos graves por lo que no es posible su utilización en forma de infusión parenteral, solo se emplea en forma de ungüento o soluciones en infecciones superficiales (Cuenca, 2010). La natamicina es utilizada de forma tópica para el tratamiento de queratitis micótica causada por hongos filamentosos como Fusarium spp., Acremonium spp. y Aspergillus spp (Rivera et al, 2020). Mecanismo de acción: Los polienos se unen al ergosterol de la membrana plasmática y esta unión genera que se formen poros por los que la célula fúngica va a perder iones monovalentes como Na+, K+, H+, Cl-, y moléculas carbonadas, lo que posteriormente conduce a la muerte celular (Mellado et al, 2002; Espinel, 2008; Bhattacharya et al, 2020). Esta interacción se da por la micosamina, que es un componente estructural (figura 5) (Rivera et al, 2020). 16 Figura 5. Interacción de la anfotericina B con el ergosterol por medio de la micosamina. Tomado de Rivera et al, 2020 Para la AMB y nistatina se ha demostrado que alteran la permeabilidad, por la capacidad para formar poros en la membrana fúngica, siendo este un mecanismo complementario que incrementa la potencia de ambos antifúngicos. Esto porque el grupo hidroxilo del C35 de la AMB es crítico para que se dé el ensamblaje de este canal iónico que atraviesa la bicapa lipídica, y al eliminar este C35 de la AMB se inhibe la formación del canal iónico y no se altera su capacidad de unión al ergosterol, conservando su actividad antifúngica. Es posible evaluar la formación de este canal mediante la salida de potasio (Rivera et al, 2020). La AMB se acumula en la membrana fúngica que contenga ergosterol y forma una estructura oligomérica que es la que actúa como canal iónico (Huang et al, 2024). El diámetro del poro determina el tipo y tamaño de la molécula que sale de la célula, normalmente AMB forma poros de mayor tamaño, facilitando así el transporte de moléculas más grandes, comparado con la nistatina que forma poros más pequeños (Huang et al, 2024). También se ha descrito como un nuevo mecanismo de acción que AMB extrae el ergosterol de la membrana fúngica, actuando como una especie de esponja, esto produce inestabilidad en la membrana, e interrumpe procesos celulares esenciales como la endocitosis y la regulación de la función de las proteínas membrana, esto ya que muchos de los procesos celulares dependientes de ergosterol están controlados por proteínas de membrana que se 17 unen directamente al ergosterol. Esto explica la poca frecuencia de la resistencia a los polienos, debido a que es poco probable que los esteroles de membrana alternativos como el lanosterol funcionen correctamente en estos procesos en células resistentes a los fármacos, reduciendo así la supervivencia y patogenicidad celular (figura 6) (Quiles & García, 2021; Huang et al, 2024). Figura 6. Mecanismo de acción de la anfotericina B. 1) formación de canales que alteran la permeabilidad, 2) Secuestramiento del ergosterol lo que produce inestabilidad de la membrana. Tomado de Rivera et al, 2020. La AMB se encuentra como monómero y como polímero, esto es importante en su interacción con los hongos ya que si está como polímero mata las levaduras al extraer el ergosterol de sus membranas, pero si está en la forma monomérica tiende a insertarse en las membranas que contienen ergosterol para formar poros acuosos (Huang et al, 2024). Además de la unión a los esteroles de membrana, los polienos se unen con los esteroles intracelulares, lo que causa daño a la célula principalmente en las vías de la respiración celular. También tiene efectos inmunomoduladores, activando funciones de los linfocitos como lo es la secreción de linfoquinas (Cuenca, 2010). También hay otros mecanismos indirectos de daño a las células fúngicas, como el aumento en la producción de ROS en biopelículas fúngicas por parte de la AMB y la nistatina, esto hace que antes de que los compuestos poliénicos permeabilicen la membrana se disminuya la viabilidad de hongos filamentosos y levaduras, esto produce un efecto fungicida más fuerte que la interacción con el ergosterol (Rivera et al, 2020; Huang et al, 2024). 18 Se ha observado la secreción de IL-1β en altas concentraciones con respecto a los azoles al tratar células dendríticas y macrófagos murinos con AMB, nistatina y natamicina; lo que posiblemente se dé como una respuesta a la secreción de iones de potasio por la formación de los canales iónicos. (Rivera et al, 2020). Es importante resaltar que la AMB es un antifúngico fungicida tanto para levaduras como para hongos miceliales, y que es el antifúngico con mayor espectro de acción (Cuenca, 2010). Alilaminas Generalidades: este grupo incluye la terbinafina (TRB), (Lamisil), flunarizina y naftifina (Bhattacharya et al, 2020). Tiene actividad frente a los dermatofitos, levaduras y hongos filamentosos, y presenta sinergismo con los azoles (Mellado et al, 2002). Se utiliza como tratamiento de micosis superficiales, principalmente infecciones por dermatofitos, porque básicamente tienen acción fungicida contra los dermatofitos y fungistática contra Candida albicans. Son utilizados por lo tanto de manera tópica, o en el caso de las tiñas la forma oral de terbinafina (Angulo & Santos, 2022). Mecanismo de acción: la TRB ejerce su acción mediante la inhibición de la enzima escualeno epoxidasa (Erg1p), una enzima implicada en la síntesis de ergosterol. Su acción es fungicida (figura 2) (Mellado et al, 2002; Pontón & Quindós, 2006). La muerte fúngica se debe a una mayor permeabilidad de la membrana por una alta concentración de escualeno y no a la deficiencia de ergosterol (Espinel, 2008). Morfolinas Las morfolinas se utilizan comúnmente en la agricultura y tienen una alta toxicidad en humanos (Bhattacharya et al, 2020). La amorolfina inhibe las enzimas D14 reductasa (Erg24) y la D8– D7isomerasa (Erg2p) (figura 2) (Pontón & Quindós, 2006). Su aplicación clínica es para el tratamiento de dermatofitos en uñas, la presentación es una solución de laca para uñas que contiene clorhidrato de amorolfina al 5% (Bhattacharya et al, 2020). 19 Inhibidores de la síntesis de la pared celular La pared celular es el blanco de varios antifúngicos, la capa más externa de la célula fúngica, rígida y es la primera línea de defensa, protegiendo a la célula del estrés osmótico. Las enzimas involucradas en la biosíntesis de la pared celular son blancos importantes de los antifúngicos debido a que las células de los mamíferos no tienen paredes celulares. A este grupo de antifúngicos pertenecen los lipopéptidos como las equinocandinas, dentro de las que se encuentran la caspofungina, micafungina y anidulafungina (Bhattacharya et al, 2020). Lipopéptidos Equinocandinas: Generalidades: son una familia de fármacos pertenecientes a las candinas, se inicia su desarrollo desde 1974 pero hasta el año 2001 se aprueba la utilización de caspofungina en humanos (Cuenca, 2010). En el año 2004 se aprueba la micafungina y para el año 2006 la anidulafungina (Angulo & Santos, 2022). Este antifúngico es fungicida para Candida y fungistático para hongos filamentosos, ya que inhibe el crecimiento en la terminación de la hifa (Quiles & García, 2021). Su espectro no incluye los hongos que contienen 1,6-β glucano en su pared como en el caso de Cryptococcus spp., hongos dimórficos y los mucorales. Tampoco tienen actividad contra Fusarium y Scedosporium (Quiles & García, 2021). Se ha extendido su uso como profilaxis y tratamiento por lo que se reporta que más del 60 % de los pacientes con candidemia han recibido equinocandinas ya que por lo general tienen una adecuada farmacocinética y poca interacción con otras drogas, por lo que instituciones como Infectious Diseases Society of America (IDSA), European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID), Japanese Society for Medical Mycology (JSMM) y Japanese Mycoses Forum (JMF) las recomiendan en sus guías, así como la caspofungina y la micafungina son también recomendadas en Japón como primera línea de tratamiento para aspergilosis pulmonar crónica (Hori & Shibuya, 2018). 20 En la medida en que ha aumentado la aplicación de equinocandinas también los fracasos clínicos debido a organismos resistentes, especialmente Candida spp (Hori & Shibuya, 2018). Mecanismo de acción: Actúan inhibiendo de forma específica pero no competitiva la síntesis del β-1,3 glucano, uno de los principales componentes de la pared celular fúngica, esto al unirse a la subunidad catalítica de la β-1,3 glucano sintetasa (FKS1p), la que es una enzima necesaria para la formación de polímeros de β-D-1,3 glucano, es codificada por los genes FKS1, FKS2 y FKS3. Esta enzima es un complejo de tres proteínas Fks1p, Fks2p y Fks3p (Pontón, 2008; Mellado et al, 2002; Bhattacharya et al, 2020). Utiliza uridina difosfato glucosa (UDG-glucosa) para la formación de los polímeros de β-D-1,3 glucano (Bhattacharya et al, 2020). La β-1,3-D-glucano sintasa comprende una subunidad catalítica en la membrana plasmática y una subunidad reguladora localizada en el citoplasma. En Saccharomyces cerevisiae la subunidad catalítica es una proteína integral de aproximadamente 215 kDa con 16 hélices transmembrana, mientras que la subunidad reguladora es una pequeña proteína de unión a GTP, Rho1 (Hori & Shibuya, 2018). Las equinocandinas actúan produciendo hinchamiento y lisis celular en las zonas de crecimiento de la pared (zona apical) (Pontón, 2008). Sin embargo, este efecto trae consigo también, la activación de los genes relacionados con la biosíntesis de la pared, como una medida compensatoria por parte del Hongo, a través de la vía de integridad celular de la Proteína Kinasa C (Reinoso et al, 2003). Además, estas alteraciones en la pared pueden exponer el β-1,3-D-glucano en la superficie celular facilitando la interacción de este antígeno con la dectina-1, que es el receptor para el β-1,3-D-glucano, lo que activa la secreción de citocinas por parte de las células de la inmunidad innata (Pontón, 2008). Este tipo de antifúngicos se podrían utilizar en terapia combinada con otros antifúngicos que actúan sobre la membrana plasmática como azoles o anfotericina B ya que su mecanismo de acción no muestra resistencia cruzada con estos (Mellado et al, 2002). 21 Inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos y división nuclear Pirimidinas: (5- fluorocitocina) Generalidades: las pirimidinas fueron aprobadas como tratamiento antifúngico en 1960; su mecanismo de acción se base en interferir con la síntesis de ADN y ARN de las células fúngicas (Angulo & Santos, 2022). También conocida como 5-fluorocitosina (5-FC), aproximadamente un 10 % de las C. albicans presentan resistencia intrínseca a la flucitosina, mientras que un 30 % de los aislamientos de esta especie desarrollan resistencia durante el tratamiento con fluocitocina (Espinel, 2008). Este fármaco es recomendado para el tratamiento de infecciones fúngicas en sitios en donde la penetración de otros fármacos es limitada, como en infecciones del tracto urinario, cerebro, ojos o válvulas cardiacas (Zohra et al, 2021). Es la terapia de primera línea para el tratamiento de la meningitis criptococóccica, administrándose en combinación con la AMB como terapia de inducción, lo que da como resultado la esterilización rápida del LCR. Es posible obtener este mismo efecto si se utiliza en combinación con el fluconazol. Además, la 5-FC también puede ser utilizada como complemento de la AMB o el fluconazol en el tratamiento de infecciones sistémicas complejas como septicemia, endocarditis, meningitis o infecciones pulmonares causadas por cepas susceptibles de Candida o Cryptococcus. Su uso como monoterapia es limitado debido a la tendencia al rápido desarrollo de resistencia, por lo que sólo se utiliza para el tratamiento de cistitis por Candida en caso de resistencia al fluconazol, ya que se alcanzan concentraciones elevadas en orina y, también para el tratamiento de cromoblastomicosis causadas por algunos hongos melanizados (Chandra, 2009; Zohra et al, 2021). De acuerdo con la IDSA (del inglés Infectious Diseases Society of America) no se recomienda el uso de 5-FC como terapia en cualquier forma de aspergilosis debido a una aparente carencia de actividad de este compuesto in vitro. No se recomienda el uso de 5-FC en dermatofitos debido a que este compuesto no tiene actividad contra ellos (Zohra et al, 2021). 22 Aproximadamente, un 6 % de los pacientes tratados con 5-FC presentan efectos secundarios gastrointestinales como vómito, náuseas, diarrea, dolor abdominal y otros efectos más severos como la hepatotoxicidad y depresión de la médula ósea (Zohra et al, 2021; Angulo & Santos, 2022). Las concentraciones más elevadas de 5-FU se detectan en el plasma de los pacientes que recibieron el fármaco vía oral en comparación de los que lo recibieron intravenoso; esto se cree se debe posiblemente a la conversión de la 5-FC a 5-FU por parte de la microflora intestinal (Costa et al, 2015; Zohra et al, 2021). Mecanismo de acción: es un fármaco fungistático que inhibe la síntesis de ácidos nucléicos y proteínas en la célula fúngica, es un profármaco, es decir, que para su activación necesita ser metabolizado, entonces el fármaco debe ser tomado por la célula mediante la citosina permeasa (Fcy2) que es codificada por el gen FCY2 y otros homólogos codificados por FCY21y FCY22 para convertirlo en 5-FU por la citosina desaminasa (Fcy1), enzima que no está presente en las células humanas y es codificada por el gen FCY1. Hay dos mecanismos por los cuales la 5-FC ejerce su acción antifúngica, primero, por la uracil fosforibosil transferasa (Fur1) se convierte en 5-fluorouridina monofosfato (5-FUMP), que es fosforilado por dos quinasas pasando a 5-fluorouridina trifosfato (5FUTP), que se incorpora al ARN en lugar de la uridina trifosfato (UTP), alterando la aminoacilación del ARNt, alterando el conjunto de aminoácidos e inhibiendo la síntesis de las proteínas. El segundo mecanismo es el metabolismo del 5-FUMP que también puede ser convertido en 5-fluorodesoxiuridina monofosfato (5FdUMP) por la uridina monofosfato-pirofosforilasa. El 5-FdUMP es un inhibidor la timidilato sintasa, que es una enzima importante en la biosíntesis de ADN y produciendo un ARN aberrante y la inhibición celular (Chandra et al, 2009; Cuenca, 2010; Bhattacharya et al, 2020; Zohra et al, 2021). Además, la 5-FC actúa interfiriendo en el metabolismo de las pirimidinas y la síntesis de proteínas, su actividad provoca lisis celular y muerte (Chandra et al, 2009) (Figura 7). 23 Figura 7. Mecanismo de acción 5-fluocitocina. La 5- fluorocitocina (5-FC) es transportada al interior de la célula por la enzima citosina permeasa, ahí es convertida por la enzima citosina desaminasa a 5- fluorouracilo (5-FU), que es convertido por la uracil fosforibosil transferasa a 5-fluorouridina monofosfato (5-FUMP). Esta puede seguir dos vías: se incorpora al ARN alterando la aminoacilación del ARNt e inhibiendo la síntesis de proteínas; o también puede ser convertido por la uridina monofosfato-pirofosforilasa en 5- fluorodesoxiuridina monofosfato (5FdUMP), que inhibe la timidilato sintasa, enzima importante en la biosíntesis de ADN. Tomado de Bhattacharya et al, 2020 Griseofulvina Generalidades: Es un producto metabólico del Penicillium griseofulvum, descrito por primera vez por Oxford y colaboradores en 1939. Desde entonces ha sido ampliamente utilizada hasta hoy para tratamiento de las dermatomicosis (Álvarez et al, 1986). Su espectro de acción está reducido a los dermatofitos, en especial Microsporum canis y algunas especies de Trichophyton, especialmente los queratinofílicos y queratinolíticos (Pontón & Quindós; 2006Martínez et al, 2023). Se administra exclusivamente por vía oral. Debido a su naturaleza poco soluble, su principal problema es la dificultad de su absorción a nivel de tracto intestinal, por lo que esta es dependiente de varios factores como la dieta, dosis, formulación y tamaño de las partículas. Por esta razón, en su administración es importante la forma de la presentación empleada, así como que se administre con alimentos grasos (Sánchez et al, 1999; Martínez et al, 2023;). 24 Este medicamento se distribuye en todo el organismo, especialmente por la piel y sus anexos, incluyendo las glándulas sudoríparas. Se metaboliza en el hígado y se excreta por heces y orina. Aunque su vida media es de (24-30) horas, debido a los problemas de su absorción, se recomienda suministrarla cada 6 horas para mantener los niveles sanguíneos estables y reducir los efectos secundarios (Sánchez et al, 1999) La cefalea es el efecto adverso más frecuente, pero no requiere suspender la medicación para que cese la cefalea. Otros efectos adversos son las molestias gastrointestinales, sequedad de boca y pérdida temporal del sabor; incluso reacciones alérgicas en forma de urticaria, eritema y fotosensibilidad. Es un inductor enzimático que acelera el metabolismo de otros fármacos, entre los que destacan los anticoagulantes orales, el fenobarbital y sedantes (Sánchez, et al, 1999) Este antifúngico es teratogénico en animales, razón por la cual no se recomienda su uso en el embarazo; además, por su efecto sobre los espermatozoides, los varones deben abstenerse de procrear mientras están utilizando el medicamento (Sánchez et al, 1999) Mecanismo de Acción: Este antifúngico es fungistático, ya que su acción se limita a bloquear la reproducción del hongo (Sánchez et al, 1999). Según Martínez y colaboradores (2023), cuando el dermatofito se une a la queratina, la griseofulvina se fija en la tubulina fúngica inhibiendo el ensamblaje de los microtúbulos del huso mitótico, evitando así la división celular. Debido a lo anterior, es que su acción se limita únicamente sobre los hongos que se encuentran en fase reproductiva, conforme el tejido crece, las células sanas van desplazando a las células infectadas, siendo este el motivo por el cual la curación requiere de varias semanas o meses, dependiendo de la velocidad de recambio de las células enfermas (Sánchez et al, 1999; Martínez et al, 2023). Este fármaco sigue siendo eficaz y seguro, constituyéndose en la primera elección para el tratamiento de tiña capitis. Tiene las mismas tasas de curación que otros antifúngicos como la terbinafina o itraconazol; pero tiene como desventaja que sus pautas posológicas son del doble de duración que los anteriores (Sánchez et al, 1999). 25 CAPITULO II. MECANISMOS DE RESISTENCIA La resistencia a los antifúngicos se puede definir de tres formas, como resistencia microbiológica o como resistencia clínica, e incluso como una combinación de ambas. En cuanto a la resistencia microbiológica, esta se observa cuando el crecimiento de un organismo o patógeno infectante es inhibido por una concentración de agente antimicrobiano superior al rango observado para las cepas de tipo silvestre. Por otro lado, la resistencia clínica se define por la situación en la que el organismo infectante es inhibido por la concentración del agente antimicrobiano que está asociada con una alta probabilidad de fracaso terapéutico. Es decir, el patógeno es inhibido por una concentración de antimicrobiano superior a la que podría alcanzarse de forma segura con la dosificación normal. Respecto a la definición compuesta, la resistencia está presente cuando los aislados no son inhibidos por las concentraciones habitualmente alcanzables del agente con esquemas de dosificación normales y/o cuando muestran un valor de CIM que cae en el rango donde existe una mayor probabilidad de la presencia de los mecanismos específicos de resistencia microbiana, y donde la eficacia clínica contra el aislado no se ha demostrado de forma fiable en estudios de tratamiento (Pfaller, 2012). Azoles La resistencia a los azoles puede ocurrir por varios mecanismos como: mutaciones que modifican la diana, sobreexpresión del gen ERG11, sobreexpresión de bombas de eliminación, interferencia con la acción sobre la 14-α demetilasa, alteraciones en otras enzimas de la biosíntesis del ergosterol y la disminución de la permeabilidad de la membrana plasmática al fármaco. Se menciona que en cepas de C. albicans resistentes se ha demostrado en un 85 % de los casos la sobreexpresión de genes que codifican las bombas de eliminación, en un 65 % de los casos mutaciones en el gen ERG11, y en un 35 % la sobreexpresión del gen ERG11 (Pontón & Quindós, 2006). Las especies de Candida pueden presentar plasticidad genómica, esto resulta en pérdida de heterocigocidad, aumento en el número de copias cromosómicas, aneuploidía o formación 26 de isocromosomas; lo que puede alterar la expresión de ERG11 o de las bombas de expulsión de fármacos. (Perlin & Wiederhold, 2017). Aumento en la expresión de las bombas de eliminación activa En levaduras el mecanismo de resistencia más frecuente es debido al aumento de expresión o activación de los genes que codifican bombas de eliminación activa, lo que produce una disminución de las concentraciones intracelulares del fármaco; estas bombas de eliminación son los transportadores ABC (del inglés ATP Binding Cassette), codificados por genes CDR que son los responsables de la resistencia a casi la totalidad de los azoles y los transportadores MFS (del inglés Major Facilitators Superfamily), codificados por los genes MDR1, responsables de la resistencia al fluconazol (Mellado et al, 2002; Gómez, 2010; Vale et al, 2012). Estos transportadores son un sistema de bombeo activo que se localizan en la membrana citoplasmática y contribuyen a la resistencia de casi todos los azoles al expulsar el fármaco hacia el exterior de la célula (López et al, 2016). La bomba MSF transporta dos solutos hacia distintos lados de la membrana plasmática de la célula fúngica, utiliza como fuente de energía un gradiente de protones (H+), en lugar de ATP, para translocar moléculas (Fuentes et al, 2014). La sobreexpresión de ambos tipos de bombas no permite la acumulación intracelular del fármaco, por lo que estos mecanismos pueden estar involucrados no solo en la resistencia a azoles sino también a otros antifúngicos (Fuentes et al, 2014). En las células sensibles a los azoles hay una baja expresión de los genes CDR y MDR, mientras que en las células resistentes los azoles hay sobreexpresión de los genes CDR y MDR por lo que los azoles son menos efectivos contra la lanosterol 14-α- demetilasa (López et al, 2016). La resistencia a azoles se puede relacionar con variaciones genómicas como la pérdida de heterocigocidad o LOH (por sus siglas en inglés loss of heterozygosity) y la aneuploidía. Esta pérdida de heterocigocidad se puede dar en regiones genómicas específicas que albergan determinantes de resistencia a azoles como ERG11 y TAC1 (Lee et al, 2023). Si un alelo de un gen está mutado LOH puede copiar la mutación al segundo alelo, LOH se ha observado en aislamientos clínicos de C. albicans en CaTAC1, CaERG11 y CaMRR1 lo que 27 correlaciona con el aumento de la resistencia a azoles debido a que estas mutaciones son homocigotas (Bhattacharya et al, 2020; Lee et al, 2023). Se ha demostrado que la actividad de las bombas de eflujo es más alta en el complejo Candidozyma haemuli (Candida haemulonii) que en otras especies de Candida no albicans como P. kudriavzevii, C. tropicalis y Clavispora lusitaniae, explicando así su baja sensibilidad a los azoles (Huang et al, 2024). En C. albicans y otras especies de levaduras como N. glabratus se han descrito hasta diez genes diferentes relacionados con la producción de los transportadores ABC, los llamados CDR1-CRD10. En cepas con aumento en la expresión de los genes CDR1 y CDR2 se ha observado que presentan resistencia a azoles (Cuenca, 2010). En cepas de C. albicans sensibles a fluconazol el gen MDR1 no se expresa durante el crecimiento in vitro, pero en aislamientos clínicos resistentes a fluconazol se encuentra sobre expresado (Pontón & Quindós, 2006). La trisomía en el cromosoma 3 y cromosoma R en C. albicans se correlacionan con el aumento en la resistencia a los triazoles. En el cromosoma 3 se encuentran los genes que codifican para las bombas de eflujo CDR1 y CDR2, por lo que el aumento en el número de copias del cromosoma 3 aumenta la expresión de dichos genes. Esta trisomía en el cromosoma 3 se desarrolla por exposición prolongada a los azoles (Bhattacharya et al, 2020). También en C. albicans se relaciona con la resistencia a los azoles la aneuploidía segmentaria, en donde dos copias del brazo izquierdo del cromosoma 5 que contienen CaERG11 y CaTAC1 forman un isocromosoma. Esta aneupolidía resulta en una mayor dosis de genes que codifican tanto para la diana azólica ERG11 como para el factor de transcripción Tac1 que regula el eflujo del fármaco (Lee et al, 2023). La aneuploidía en el cromosoma 6 en donde se encuentra el gen MDR1 que codifica por la bomba de eflujo también se relaciona con esta resistencia debido al aumento en su expresión (Bhattacharya et al, 2020; Lee et al, 2023). 28 En C. albicans mutaciones en el gen TAC1 que codifica por el factor de transcripción Tac1p que regula las bombas de eflujo CDR1 y CDR2 da como resultado la sobreexpresión de la bomba y la resistencia a los azoles. Estas mutaciones incluyen T225A, V736A, N972D, N977D, G980E y G980W. De la misma manera mutaciones en el gen MRR1 que codifica por el factor de transcripción Mrr1p incluyen P683S y P683H, mientras que para C. dubliniensis las mutaciones en este gen MRR1 incluyen T374I, S595Y y C866Y. Hay otros factores de transcripción que regulan la expresión de las bombas, pero a la fecha no se han relacionado con la resistencia en aislamientos clínicos (Bhattacharya et al, 2020). En N. glabratus las mutaciones en el factor de transcripción Pdr1 que inducen sobreexpresión de transportadores ABC incluyen L328F, R376W, D1082G, T588A, T607S, E1083Q, Y584C, D276Y, L280F, N691D, S316I, D261G, R293I, R592S, G583S, S343F y R376G. También la mutación L946S aumenta la expresión del transportador MFS en N. glabratus. (Bhattacharya et al, 2020; Perlin & Wiederhold, 2017). Candidozyma auris, contiene el homólogo CDR1 de C. albicans y se encuentra sobre expresado en aislamientos que han mostrado aumento en la tolerancia a fluconazol. Este aumento de la expresión de este homólogo de transportador correlaciona con el aumento en el número de copias del factor de transcripción TAC1 en dicha cepa cuando se compara con su progenitora (Bhattacharya et al, 2020). De la misma manera se han observado alteraciones cromosómicas en aislamientos clínicos de N. glabratus, como reordenamientos segmentarios en el cromosoma M que alberga el gen CgCDR1 que codifica la bomba de eflujo y en el cromosoma F que contiene el gen CgPDH1 que también codifica por una bomba de eflujo (Bhattacharya et al, 2020). Una biopelícula precoz es más susceptible a los antifúngicos, debido a que en ella hay una sobreexpresión de los genes que codifican para ergosterol, como el gen ERG25, ERG6, y ERG16, pero a medida que la biopelícula madura estos genes disminuyen y se elevan drásticamente los genes codificantes para las bombas de eflujo, lo que explica la resistencia a los antifúngicos azoles (Pinilla et al, 2018). Debido a un perfil transcripcional alterado de la vía del ergosterol con el fin de mantener una mejor fluidez de la membrana, las células formadoras de biopelículas tienen una concentración significativamente menor de ergosterol 29 en su membrana celular, especialmente en las últimas etapas de la formación de la biopelícula, así las células en biopelículas maduras contienen aproximadamente la mitad de ergosterol que las células planctónicas (Amann, 2025). En los hongos filamentosos se desconocen la mayoría de los mecanismos moleculares y bioquímicos que explican la resistencia, pero estudios en hongos fitopatógenos sugieren que los mecanismos de resistencia son similares a los que se han descrito para levaduras. En ellos se han descrito genes homólogos de los descritos para levaduras como lo son para A. fumigatus (MDR1 y MDR2), A. flavus (MDR1), A. nidulans (atrA, atrB y atrC) y en Penicillium digitatum (PMR1 y PMR5); todos pertenecientes a la familia de los transportadores ABC; sin embargo, el aumento de su expresión se relaciona con resistencia a diferentes antifúngicos y no directamente con la resistencia a los azoles (Mellado et al, 2002). En un estudio realizado por Fuentes y colaboradores con respecto a la cuantificación de las bombas de eflujo observaron diferencias significativas entre las cepas resistentes y las sensibles en todas las bombas estudiadas; observaron una sobreexpresión de las bombas analizadas en más de la mitad de las cepas resistentes, correlacionando así con la resistencia fenotípica de las cepas. También en una de las cepas se encontró la presencia de una sobreexpresión del gen ERG11, así como una sobreexpresión de los genes de las bombas de eflujo CDR1 y CDR2, evidenciando así que la resistencia a azoles es un fenómeno multifactorial (Fuentes, 2014). Modificación de la diana En segundo lugar, se tienen las mutaciones del gen ERG11 lo que afecta la diana de los azoles, ya que causa una alteración estructural de la enzima 14-α esterol demetilasa (Erg11p), esta enzima es clave en la síntesis del ergosterol donde el lanosterol y sus derivados son su sustrato. Esta enzima es producto del gen CYP51 en hongos filamentosos y del gen ERG11 en levaduras (Mellado et al, 2002). Estas mutaciones disminuyen la unión del azol con el sitio activo de la enzima (Bhattacharya et al, 2020; Lee et al, 2023). Se han reportado más de 140 distintas sustituciones de aminoácidos en la enzima Erg11 en aislamientos clínicos de C. 30 albicans, la mayoría en tres regiones de puntos calientes. Algunas de estas sustituciones implican residuos expuestos en el sitio activo, afectando directamente la unión al azol, mientras que otras se dan en la superficie proximal de la enzima y contribuyen indirectamente con la resistencia a azoles influyendo en las interacciones con el citocromo P450 reductasa (Lee et al, 2023). Se han identificado mutaciones puntuales en el gen ERG11 de aislamientos resistentes de C. albicans, como son A61V, A114S, Y132F, Y132H, K143Q, K143R, Y257H, S405F, G448E, F449S, G464S, R467K y I471T, las que contribuyen con la resistencia a los azoles en C. albicans (Bhattacharya et al, 2020). También se han asociado mutaciones puntuales del gen ERG11 en otras especies de Candida resistentes a azoles como C108G, C423T y A1581G en N. glabratus, y A497C y G1570A en P. kudriavzevii (Bhattacharya et al, 2020). Para Aspergillus spp., se han descrito dos mecanismos de resistencia a azoles que son mutaciones puntuales de CYP51A y concentración reducida del fármaco intracelular, este podría ser por una sobrexpresión de las bombas de eflujo o por una penetración reducida del fármaco (Espinel, 2008). La resistencia cruzada a itraconazol y posaconazol se ha relacionado con mutaciones específicas en CYP51A debido a sustituciones de aminoácidos en la glicina 54, o sustituciones en metionina 220 se han asociado con resistencia a itraconazol y diferentes perfiles de susceptibilidad en otros azoles (Espinel, 2008). En A. fumigatus la modificación con un plásmido que contenga el gen CYP51 lo hace resistente al itraconazol (Mellado et al, 2002). En un estudio realizado por V. Oliviera y colaboradores encontraron una nueva mutación L321F en el gen ERG11 en cepas de C. albicans resistentes a fluconazol, posteriormente analizaron cepas sensibles a fluconazol y la nueva mutación no se encontró en ninguno de ellos, lo que indica su asociación con las cepas resistentes. En esta nueva mutación el aminoácido presenta propiedades físicas diferentes ya que la lisina es altamente hidrofílica mientras que la fenilalanina es altamente hidrofóbica lo que puede provocar una estructura 31 proteica modificada ya que las interacciones de los aminoácidos con el agua son cruciales para la estabilidad y plegamiento de la proteína. Esta mutación se encuentra en la hélice central de la molécula lo que puede alterar la estructura tridimensional y esta hélice está descrita como sitio de unión de la enzima (Oliviera et al, 2013). En C. auris estas mutaciones en ERG11 también contribuyen a su reducida susceptibilidad a los azoles, se hace referencia a un estudio reciente donde se menciona una mutación de Erg11 (F444L) que no se ha descrito previamente, identificada en aislamientos clínicos del clado IV resistentes a azoles (Lee et al, 2023). Aumento en el número de copias de la diana Se ha visto en levaduras que durante la exposición a los azoles hay un aumento de la transcripción del gen ERG11, aún en células sensibles, se cree que este aumento se da como respuesta de la célula a la disminución de ergosterol o a la acumulación de esteroles tóxicos; y en los hongos filamentosos los niveles de expresión de CYP51 pueden ocasionar el desarrollo progresivo de resistencia a los azoles. (Mellado et al, 2002). En el caso de cepas de Penicillium digitatum que son resistentes a trifumizol, que es un azol de uso agrícola, se ha demostrado que presentan un activador de la transcripción en el promotor del CYP51, y el número de copias de esta secuencia repetida en tándem correlaciona directamente con la CMI a triflumizol (Mellado et al, 2002). Se sugiere una relación entre los cambios en la vía de la síntesis de ergosterol y la resistencia a los azoles; una deleción en el gen UPC2 (homólogo de UPC2/ECM22 genes en S. cerevisiae) en C. albicans, codifica para el factor de transcripción Upc2, que es un regulador de la mayoría de los genes ERG involucrados en la síntesis de ergosterol, la sobreexpresión del gen UPC2 aumenta la resistencia a los azoles (Espinel, 2008). Upc2p es un factor de transcripción que regula la mayoría de los genes de la biosíntesis de ergosterol como CaERG2 y CaERG11 en C. albicans, la sobreexpresión génica de UPC2 puede ser inducida por la exposición a los azoles y puede compensar la inhibición de las enzimas diana. Sobreexpresión que puede ser impulsada por las mutaciones de ganancia de función (por sus siglas en inglés Gain of function GOF) y su consecuente resistencia al fluconazol. Así, 32 mutaciones en el gen UPC2 como la sustitución A643V o G648D pueden causar que Upc2 se libere de un represor induciendo hiperactividad. Esta mutación A643V afecta el dominio regulador C-terminal y en consecuencia la función normal de UPC2 (Czajka, 2023). Además, es auto regulado, inducido por crecimiento anaeróbico y por bajos niveles de ergosterol. Upc2p está bien caracterizado en C. albicans, el extremo N-terminal es el dominio de unión al ADN y el extremo C-terminal el dominio de activación/regulación. El ergosterol se une al dominio C-terminal de Upc2p y regula negativamente la transcripción de UPC2 (Bhattacharya et al, 2020; Lee et al, 2023). En Upc2 se da un cambio conformacional que es dependiente del ligando y las mutaciones interfieren con la unión del ligando lo que conlleva a una activación constitutiva (Lee et al, 2023). Mutaciones como G648D, G648S, A643T, A643V, Y642F, G304R, A646V y W478C se han descrito en aislamientos clínicos resistentes a azoles. Hay siete de estas mutaciones que incrementan la expresión de CaERG11. Así mismo otras mutaciones en CaUPC2 aumentan la expresión de otros genes de la vía del ergosterol, como por ejemplo la mutación A643V en CaUPC2 induce la expresión de CaERG2, CaERG3, CaERG5, CaERG6, CaERG9 y CaERG10. Dado que C. albicans es diploide, mutaciones en ambos alelos de CaUPC2 causan mayor resistencia que las mutaciones en un solo alelo (Bhattacharya et al, 2020). En el caso de N. glabratus el genoma tiene dos genes homólogos de CaUPC2; CgUPC2A y CgUPC2B. Por su parte CgUPC2A es un importante regulador de la vía del ergosterol y se requiere para la resistencia a azoles, la deleción en este gen produce sensibilidad en los azoles mientras que no se han observado efectos en las cepas con CgUPC2B delecionado. Hasta el momento no se han reportado mutaciones en CgUPC2A o CgUPC2B (Bhattacharya et al, 2020; Lee et al, 2023). La expresión de CYP51A/ERG11 como respuesta a la exposición a los azoles es regulada por la proteína de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP por sus siglas en inglés), siendo SrbA en A. fumigatus y Sre1 en C. neoformans (Lee et al, 2023). 33 La aneuploidía puede conferir tolerancia cruzada a diferentes fármacos, ya que cambia el número de copias de muchos genes de forma simultánea y en un momento dado (Lee et al, 2023). Sustitución del ergosterol Otro mecanismo de resistencia menos común es la alteración en la vía de la biosíntesis de los esteroles que resulta en la sustitución del ergosterol por otro esterol en la membrana citoplasmática. Se ha visto que este mecanismo puede asociarse a varios genes, entre ellos el ERG3 y ERG6 (Vale et al, 2012). Gen ERG3: Este mecanismo es crítico en la resistencia a los azoles consiste en la inactivación de la enzima esterol Δ5,6 desaturasa que es codificada por el gen ERG3, esta enzima cataliza la formación de un doble enlace carbono-carbono en el sustrato en las últimas etapas de la síntesis de ergosterol (Vale et al, 2012). Específicamente por mutaciones de pérdida de función en ERG3 que conducen a un bloqueo en la acumulación de esterol tóxico 14-α-metil-3,6-diol, y que de lo contrario se acumularía en respuesta a la inhibición de Erg11 mediada por los azoles (Lee et al, 2023). Esta enzima convierte el episterol en ergosta-5,7,24 (28)-trienol durante la síntesis de ergosterol (Bhattacharya et al, 2020). Entonces, cuando Erg11 es inhibido la enzima Erg3 es la responsable de la conversión de los esteroles 14-α-metilados intermediarios no tóxicos acumulados debido a la acción de los azoles, básicamente el 14-α-metilfecosterol, en el esterol tóxico 14-α-metil ergosta-8,24(28)- dien-3β,6α-diol, tanto en C. albicans como N. glabratus (Vale et al, 2012; Bhattacharya et al, 2020) (figura 3). Mutaciones como el cambio de un ácido aspártico por ácido glutámico en la posición 19, produce la inhibición de la enzima y confiere resistencia a los azoles, dando lugar a la acumulación de un esterol no tóxico (14α-metilfecosterol) para la célula (Espinel, 2008). Por lo tanto, una disrupción en ERG3 da como resultado un incremento en la resistencia a azoles en C. albicans. Se ha reportado que un cambio de una glutamina por alanina en la 34 posición 139 de Erg3p (Q139A) se relaciona con resistencia a azoles en aislamientos de N. glabratus (Bhattacharya et al, 2020). Gen ERG6: la enzima Δ24 esterol C-metil transferasa o Erg6p es una enzima no esencial en la biosíntesis de ergosterol, contribuye con la formación del diol tóxico a partir del lanosterol. Se observa una resistencia significativa a los azoles en C. albicans con una deleción heterocigota de ERG6, mientras que en S. cerevisiae Erg6p muestra un aumento a la resistencia a los azoles, un aumento en la permeabilidad de la membrana y una baja actividad de la bomba de eflujo Pdr5p. Lo anterior sugiere que la resistencia a azoles dependiente de ERG6 es el resultado de la formación del esterol tóxico y no a una sobreexpresión de bombas de eflujo (Bhattacharya et al, 2020). Alteración en la importación de esteroles La importación de esteroles es un posible mecanismo de resistencia a azoles que se ha identificado recientemente. La importación exógena de esteroles puede compensar la disminución de los niveles de ergosterol de la célula debido a la acción de los azoles. La importación de esteroles se ha caracterizado en S. cerevisiae, C. albicans y N. glabratus. (Bhattacharya et al, 2020). Tanto S. cerevisiae como N. glabratus importan esteroles bajo condiciones anaeróbicas o microaerofílicas, para lo que utilizan importadores como Aus1p y Pdr11p mostrando así resistencia a los azoles. Aumentos en la importación de esteroles se pueden dar por las mutaciones en UPC2, defectos en la biosíntesis de ergosterol y grupo hemo. Estos aumentos se pueden reflejar en cepas de S. cerevisiae con mutaciones ScERG1 y ScERG7. (Bhattacharya et al, 2020). En el caso de C. albicans importa los esteroles aeróbicamente, por lo que puede aumentar la resistencia a los azoles importando colesterol y suero de la sangre. (Bhattacharya et al, 2020). 35 Formación de biopelículas Las levaduras pueden crecer libremente (planctónicamente) o desarrollar una matriz extracelular (por sus siglas en inglés extracelular matrix ECM) para unirse y formar una comunidad organizada de células microbianas. Esta matriz está compuesta de polisacáridos y proteínas, la produce la levadura como protección contra factores estresantes como los antimicóticos y el sistema inmunológico del huésped. Las biopelículas están estructuradas de manera que proporcionan el espacio adecuado para que entren los nutrientes y salgan desechos, proporcionando a la vez un entorno estable capaz de tolerar concentranciones extremadamente altas de antimicrobianos (Tsui, 2016; Czajka, 2023). C. albicans es la que más se asocia a la formación de biopelículas, pero también se asocian otras especies como: C. auris, N. glabratus, C. dubliniensis, P. kudriavzevii, C. parapsilosis y C. tropicalis (Czajka, 2023). La biopelícula se puede desarrollar durante el tratamiento antifúngico, permitiendo así que las células sean más resistentes. Dentro de los antifúngicos que se han citado como menos eficaces, incluso dentro de las 72 horas del desarrollo/maduración de la biopelícula se encuentran los azoles y los polienos. En el caso de C. albicans con biopelícula la resistencia puede aumentar hasta 1000 veces para el tratamiento con fluconazol y aproximadamente 10 veces para el tratamiento con AMB, en comparación con las células planctónicas (Czajka, 2023). En general las biopelículas fúngicas muestran un aumento de hasta 20000 veces la CMI antifúngica en comparación con las células planctónicas (Tsui, 2016). Esta resistencia a los antifúngicos se da tanto por las mutaciones genéticas que promueven la resistencia en las células planctónicas como por factores que incluyen la protección física, aumento de la densidad celular de la comunidad microbiana, células persistentes y secreción vesicular extracelular. Por lo que es importante considerar si esta característica está presente al momento del diagnóstico (Czajka, 2023). Así, la resistencia y tolerancia de C. albicans a los antifúngicos es multifactorial y compleja, pero se atribuye en gran medida a la presencia de la matriz extracelular, la regulación positiva de las bombas de eflujo de fármacos (independientemente de la exposición a los fármacos) y la presencia de células persistentes (Kaur, 2023). 36 La proteína de superficie específica de la hifa de C. albicans Als3, funciona como una adhesina, media la unión a las células epiteliales, células endoteliales y las proteínas de la matriz extracelular. También desempeña un papel importante en la formación de biopelículas en superficies protésicas (Liu, 2011). El gen ALS3 codifica por una glicoproteína en la superficie celular se menciona como posible biomarcador de su formación (Czajka, 2023). La matriz de la biopelícula es compleja y los principales constituyentes polisacáridos son α - manano, β-1,6 glucano y el β-1,3 glucano, que a pesar de estar en menor cantidad constituye un componente crítico de la matriz extracelular y es el responsable del secuestro del antifúngico impidiendo la difusión del fármaco, por lo tanto, se ha convertido en el objetivo principal para el tratamiento de infecciones por Candida. Tratamiento que complementado con la enzima β-1,3 glucanasa puede descomponer la molécula alterando así la arquitectura de la biopelícula. Se ha demostrado que las paredes de las células asociadas a biopelículas son dos veces más gruesas y contenían más carbohidratos y β-1,3 glucanos que las células planctónicas (Tsui, 2016; Czajka, 2023). Además, la sobrexpresión del gen FKS1 puede aumentar la producción de β-1,3 glucano en las biopelículas de Candida, y se ha demostrado que este aumento afecta la susceptibilidad de las biopelículas de C. albicans a los antifúngicos al aumentar los niveles de secuestro de éstos, evitando que alcancen sus objetivos celulares. Se ha demostrado que las enzimas glucano transferasas como Bg12 y Phr1, así como también la exoglucanasa Xog1, son necesarias para le ensamblaje del β- glucano de la matriz extracelular y están involucradas en su transporte postraduccional desde la célula hasta la matriz extracelular, por lo que tienen funciones en el secuestro de fármacos antimicóticos (Czajka, 2023; Kaur, 2023). Estudios refieren que, en células de asociadas a biopelículas tratadas, se observa un aumento significativo en la expresión de los genes ERG1, ERG3, ERG11 y ERG25, lo que indica una mayor capacidad de las biopelículas para responder al estrés antifúngico (Tsui, 2016). Los genes que codifican para las bombas de eflujo CDR1, CDR2 y MDR1 se ha demostrado que se expresan significativamente en cepas de Candida asociadas a biopelículas, pero parece no influir en la resistencia a las equinocandinas en este tipo de infecciones por Candida, por lo que la combinación de equinocandinas con otros fármacos puede ser una de las opciones 37 más potentes para tratar una infección asociada a una biopelícula (Tsui, 2016; Czajka, 2023; Amann, 2025). La expresión de los genes CDR y MDR parece ser inducida por la unión de C. albicans a la superficie de un sustrato, es decir, durante la etapa de adherencia de la formación de la biopelícula y permanecen regulados positivamente a medida que la biopelícula madura, independientemente de si hay o no un antimicótico presente; por lo que es intrínseca a la formación de la biopelícula y no se desencadena por la presencia de los fármacos azólicos (Tsui, 2016; Kaur, 2023). Polienos La resistencia más comúnmente descrita tiene que ver con las mutaciones en los genes ERG que codifican enzimas relacionadas con la síntesis de ergosterol (Quiles & García, 2021). Estas mutaciones se relacionan con los genes ERG3 y ERG11, se ha descrito que la disrupción en ambos genes causa disminución en los niveles de ergosterol y resistencia en C. albicans y N. glabratus a la AMB; sin embargo, esta resistencia en aislamientos clínicos no ha sido bien caracterizada (Bhattacharya et al, 2020). Esta resistencia está descrita en levaduras y menos común en hongos filamentosos. En levaduras como C. albicans la resistencia se debe a la mutación de la enzima C-5,6 esterol desaturasa (Quiles & García, 2021). Esta mutación siempre se acompaña de mutaciones en el gen ERG11, por lo que siempre hay resistencia cruzada con los azoles, dando lugar a aislamientos multirresistentes (Mellado et al, 2002; Espinel, 2008; Quiles & García, 2021). En otras levaduras como C. haemuli (C. haemulonii) o C. auris la resistencia se debe a mutaciones en varios genes como ERG2, ERG3, ERG6 (Quiles & García, 2021). Se ha propuesto que la escasa cantidad de cepas con resistencia a los polienos tiene que ver con que son utilizados en tratamientos cortos debido a su toxicidad y a lo que se presume es una desventaja evolutiva como lo es la asociación de la resistencia con la deficiencia en ergosterol (Mellado et al, 2002). La reducción de la síntesis de ergosterol es un mecanismo de resistencia fúngica ante los polienos, así como el tener una mayor actividad de la enzima 38 catalasa para reducir el daño por la peroxidación de los lípidos, que es inducida durante el tratamiento con AMB (Rivera et al, 2020). Como ya se ha mencionado anteriormente, las bombas de eflujo pueden contribuir a la resistencia antifúngica a la anfotericina B (AMB), particularmente en especies de Candida. Si bien se cree que el mecanismo principal de AMB es menos susceptible a las bombas de eflujo porque se dirige a los lípidos de la membrana (ergosterol), la aparición de la actividad de la bomba de eflujo, especialmente en biopelículas o en respuesta a otros medicamentos, puede conducir a la resistencia a AMB. Esto puede ocurrir a través de una mayor expresión de bombas de eflujo, como la bomba CDR1, que puede ser inducida por otros antimicóticos o medicamentos contra el cáncer. (Lee et al, 2023) (O’keeffe y Kavanagh, 2004) Las bombas de eflujo contribuyen con la resistencia antifúngica a la Anfotericina B de manera indirecta, ya que el mecanismo de acción de AMB, que se une al ergosterol en la membrana celular y forma poros, no se basa directamente en proteínas (enzimas), lo que lo hace menos susceptible a las bombas de eflujo en comparación con otros medicamentos como los azoles. Sin embargo, las bombas de eflujo pueden ser un factor de resistencia importante de considerar. (Huang et al, 2024) Estudios realizados por O’keeffe & Kavanagh, 2004 han mostrado que otros fármacos, como la adriamicina utilizada en quimioterapia, pueden inducir en las células fúngicas un aumento en la expresión de bombas de eflujo como CDR1 en el modelo C. albicans. Este aumento de la actividad de la bomba de eflujo puede disminuir la concentración intracelular de AMB, lo que lleva a tolerancia o resistencia (O’keeffe & Kavanagh, 2004; Huang et al, 2024). La actividad de la bomba de eflujo es especialmente importante durante las primeras etapas de la formación de biopelículas fúngicas. Los estudios han demostrado que los genes de la bomba de eflujo se regulan al alza durante el crecimiento de la biopelícula, lo que puede contribuir a la resistencia general de la biopelícula a AMB. Las biopelículas son 39 aproximadamente ocho veces más resistentes a la AMB que las células planctónicas (Taff et al, 2013). Alilaminas La resistencia a la TRB es muy infrecuente, pero se ha relacionado con una mutación en el gen ERG1 (Pontón & Quindós, 2006). En los dermatofitos esta resistencia se ha atribuido a polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en el gen de la enzima escualeno epoxidasa (SQLE). Las sustituciones de aminoácidos dan lugar a cambios estructurales que alteran la conformación de la enzima reduciendo la unión al fármaco y sin interrumpir la biosíntesis del ergosterol de la célula. Las diez mutaciones puntuales (A1179T, T1178C, C1191A, T1189C, T1189A, T1189G, T1305A, T1305G, T1306C y C1380T) llevan a la sustitución de aminoácidos en una de las cuatro posiciones (Leu393, Phe397, Phe415 e His440), las que corresponden a CMI elevadas “in vitro” para la terbinafina. Estas mutaciones modifican la estructura de la proteína provocando interferencia en la unión de la terbinafina a las enzimas diana y por ende una disminución de la susceptibilidad en las especies del género Trichophyton (Shankarnarayan et al, 2020; Gupta et al, 2025). La resistencia a TRB se documentó por primera vez en el 2003, al encontrar que la resistencia en una cepa de T. rubrum era causada por una mutación puntual sin sentido en el gen SQLE y que provocaba la sustitución de aminoácidos L393F, situación que ha ido aumentando con el tiempo (Blanchard et al, 2023). Los aislamientos de T. rubrum por lo general siguen siendo susceptibles a la terbinafina; sin embargo, las mutaciones en el gen SQLE detectadas con más frecuencia en T. rubrum son F397L y F397I, seguido L393F y S395P. En el caso de T. indotineae P397L surge como la más dominante, seguida de la mutación A448T, L393S es menos frecuente seguida de S436A. Sin embargo, se ha documentado que la sustitución A448T no es un factor principal de la resistencia a la terbinafina por si sola, esto por cuanto se ha evidenciado que tal mutación se encuentra tanto en aislados sensibles como resistentes a la terbinafina, además de que esta mutación se localiza en la superficie de la proteína SQLE, lejos del punto de la TRB, lo que concuerda con su falta de impacto directo en la susceptibilidad a la TRB. Se ha reportado que la posición H440 se encuentra cerca del sitio 40 de unión de la enzima y las mutaciones se han asociado a bajos niveles de resistencia a la TRB en aislamientos de Trichophyton (Gupta et al, 2025). Hay un aumento en el número de casos de resistencia a TRB causados por un nuevo taxon reportado en India del complejo T. mentagrophytes/T. interdigitale, el que ya se considera una especie separada llamada Trichophyton indotineae (Blanchard et al, 2023). Este es un patógeno emergente, y conocido por causar severas dermatofitosis como tiña corporis y tiña cruris. Se caracteriza por presentar una elevada resistencia a TRB, y la alta prevalencia de aislamientos con tal característica se atribuye a la frecuencia de las sustituciones de aminoácidos en la enzima escualeno epoxidasa, donde cambia la leucina por la fenilalanina en la posición 393 (L393F) y la fenilalanina por la leucina en la posición 397 (F397L) (De Paepe et al, 2023). Se ha informado también esta resistencia en aislamientos de T. rubrum por las mutaciones sin sentido L393F y F397L, en el gen de la enzima escualeno epoxidasa. Así como resistencia cruzada en otros inhibidores de la enzima escualeno epoxidasa (SE) como la butenafina y el tolfnaftato. También se encontró resistencia a la terbinafina en A. nidulans, la sustitución de fenilalanina por leucina en la posición 391 (F391L) SE y la mutación equivalente en el gen ERGA de A. fumigatus (Espinel, 2008; De Paepe et al, 2023). El cambio de aminoácido en el codón 397 (F397L) SE se ha notificado en varios países como Estados Unidos, Japón, Rusia, Irán, Grecia, Suiza, Francia, Bélgica, Alemania, Dinamarca, Finlandia, Polonia y Canadá; por lo que las infecciones por dermatofitos resistentes a terbinafina no se limitan solo al sur de Asia (Cañete et al, 2023). Cañete-Gibas y colaboradores evaluaron los perfiles de susceptibilidad de los aislamientos de dermatofitos provenientes de varias instituciones de Estados Unidos entre los años 2021- 2022 e identificaron especie que consideraron presentaban resistencia in vitro. De los aislamientos analizados el 18.6 % fueron resistentes a TRB y de ellos el 87.5 % se confirmó que 21 aislamientos eran de T. rubrum y 21 aislamientos eran T. indotineae. La resistencia a itraconazol fue rara. Con el fin de determinar la presencia de aislamientos previos con 41 resistencia a TRB, los investigadores realizaron una revisión de la susceptibilidad a los antifúngicos en las bases de datos entre 2001 y 2020, encontrando 32 asilamientos de Trichophyton resistentes a TRB. De estos, tres fueron identificados como T. indotineae, siendo que el primero en ser aislado data del 2017. Demostrando que la resistencia a TRB en dermatofitos fue relativamente común y que T. indotineae está presente en diversas zonas de Estados Unidos. Ninguno de los aislados analizados diferentes a Trichophyton fue resistente a la TRB o a itraconazol. Se analizó la secuencia del gen de la SE en 11 de los 21 aislamientos de T. indotineae, ocho presentaron variantes que condujeron a la sustitución de F397L dentro de la enzima SE; sin embargo, esta sustitución de aminoácidos no se encontró en el aislado que data del 2017. Se identificó un cambio de aminoácido de leucina a serina en el codón 393 (L393S), la cual es conocida por conducir a una resistencia de alto nivel a la TRB, y no se encontró en los restantes diez aislados (Cañete et al, 2023). En el estudio realizado por Gabriela Blanchard y colaboradores encontraron que la resistencia a la TRB había aumentado de 0.63% en el 2013 a 1.3% en el 2021. Analizaron un total de 5634 aislamientos de los que el 0.83 % (47 cepas), 39 de T. rubrum y 8 de T. mentagrophytes/T. interdigitale tenían resistencia in vitro a TRB; identificación molecular reveló que del complejo mencionado cinco correspondían a T. interdigitale y tres T. indotineae. El tamizaje molecular detectó una mutación en SQLE en todos los casos, como L393F, L393S, F397L, F397I, F397V, Q408K, F415I, F415S, F415V, H440Y; también detectaron deleción en A398, A399 y G400 en T. rubrum. Las mutaciones L393F y F397L fueron las más frecuentes; sin embargo, todas las mutaciones encontradas en el complejo T. mentagrophytes/T. interdigitale fueron F397L y solamente en una cepa encontraron la L393S (Blanchard et al, 2023). Shen y colaboradores en 2020 motivados por el aumento en la resistencia a terbinafina y fracaso terapéutico consecuente, realizaron un estudio utilizando la terapia fotodinámica (TFD), esta se basa en la combinación de un fotosensibilizador, luz y oxígeno para crear especies reactivas del oxígeno fotoactivas. Utilizaron cepas de T. rubrum y T. interdigitale silvestre y con resistencia a TRB, y azul de metileno como fotosensibilizador. Los aislamientos con resistencia a TRB albergaban mutaciones en SQLE F397L, L393F, L393S, 42 F415S y F397I. La combinación de la terapia fotodinámica con el azul de metileno inhibió por completo todos los aislados independientemente del tiempo de incubación antes de la iluminación, la susceptibilidad de la terbinafina y la presencia de mutaciones SQLE. Solo se observó una ligera disminución de la eficacia en dos cultivos pigmentados de T. interdigitale, especulando los autores, que esto podría deberse a interferencia de la melanización en la luz inducida para la formación de especies reactivas del oxígeno. Concluyeron los autores que la susceptibilidad de la TRB al complejo TFD-AM es igual para cepas susceptibles y resistentes. Lipopéptidos (Equinocandinas) La resistencia a caspofungina es inusual, la alteración del gen FKS1 que codifica la enzima a la que se dirigen las equinocandinas es el mecanismo de resistencia mejor estudiado en las equinocandinas (Pontón, 2008). Este mecanismo de resistencia involucra un limitado número de sustituciones de aminoácidos en la región hot spot del producto del gen FKS, que es la subunidad catalítica de la β-1,3-D-glucano sintasa (Perlin & Wiederhold, 2017; Hori & Shibuya, 2018) Estas mutaciones disminuyen la sensibilidad de la enzima por el fármaco dando lugar a CMI elevadas y se han relacionado con fracasos terapéuticos (Shields et al, 2012); Perlin & Wiederhold, 2017). En la mayoría de las especies de Candida hay tres genes FKS; FKS1, FKS2 y FKS3 (Perlin & Wiederhold, 2017). Las mutaciones en FKS1 son las que se relacionan con la resistencia a todas las especies de Candida a excepción de N. glabratus. Estas mutaciones FKS1 incluyen sustituciones de aminoácidos en dos regiones altamente conservadas de la Fks1 llamadas hot-spot 1 (HS1) y hot-spot 2 (HS2), en S. cerevisiae y varios hongos patógenos. En S. cerevisiae la región HS1 abarca de Phe639- Pro647 y en C. albicans de Phe641-Pro649; HS2 en S. cerevisiae abarca Asp1353-Leu1360 y en C albicans Asp1357-Leu1364 (Hori & Shibuya, 2018). En N. glabratus la β-1,3-D-glucano sintetasa también está codificada por tres genes (FKS1, FKS2 y FKS3), pero tanto las mutaciones de FKS1 como las FKS2 son las que se relacionan con la reducción de la sensibilidad a las equinocandinas y por ende con el fracaso de la terapia con las mismas (Shields et al, 2012; Perlin & Wiederhold, 2017). La disrupción simultánea de ambos genes es letal en N. glabratus, lo que sugiere que son funcionalmente redundantes 43 (Hori & Shibuya, 2018). Análisis in vitro han demostrado que la β-1,3-D-glucano sintetasa codificada por FKS mutados de aislamientos de N. glabratus es menos sensible a las equinocandinas. La identificación de estas mutaciones puede ser más sensible que las pruebas de sensibilidad a los antimicóticos para la detección de aislamientos con resistencia a las equinocandinas. Son pocos los aislamientos de Candida que se han estudiado en el mundo, sin embargo, la prevalencia de las mutaciones de FKS parece ser baja. Se necesitan más estudios con un número sustancial de aislamientos para determinar si las pruebas de genotipo de FKS juegan un papel en el manejo de la candidiasis invasiva (Shields et al, 2012). Si bien en los aislamientos clínicos de N. glabratus las mutaciones que están relacionadas con la resistencia ocurren tanto en FKS1 como FKS2, la frecuencia de las sustituciones de aminoácidos en Fks2 es el doble que las de Fks1. Las sustituciones de aminoácidos más relevantes en N. glabratus es incluyen S629P, F625△ y F625C en Fks1 y F659△, S663F, R1378S, R1378G, S663P, P667H, P667T, E655G y E655K en Fks2 (Hori & Shibuya, 2018; Bhattacharya et al, 2020). Las cepas con resistencia adquirida a las equinocandinas tienen mutaciones en las regiones hot spot de los genes FKS, mientras que algunas de las especies de hongos que