Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 www.mag.go.cr/rev agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr IDENTIFICACIÓN MOLECULAR Y MORFOLÓGICA DE LAS ESPECIES DE Fusarium spp., ASOCIADAS AL CULTIVO DE PIMIENTA NEGRA (Piper nigrum) EN SARAPIQUÍ Y GUATUSO EN COSTA RICA Gabriela Chinchilla-Salazar1/*, Mónica Blanco-Meneses2, Óscar Castro-Zúñiga3 Palabras clave: Fusarium spp; Piper nigrum; pimienta negra; enfermedades de suelo; sintomatología; marcadores moleculares. Keywords: Fusarium spp; Piper nigrum; black pepper; soil diseases; symptomatology; molecular markers. Recibido:16/10/2019 Aceptado: 18/12/2019 RESUMEN ABSTRACT Introducción. La pimienta es una especie Molecular and morphological de la familia de la Piperaceae, originaria de la identification of Fusarium spp., associated Costa de Malabar, situada en Kerala al sur de with black pepper (Piper nigrum) cultivation la India. En Costa Rica, las principales plan- in Sarapiquí and Guatuso in Costa Rica. taciones de pimienta se localizan desde Upala Introduction. Pepper is one of the Piperaceae hasta Talamanca, e incluye toda la franja costera family, native to the Malabar Coast, located in y la parte baja de Sarapiquí. Según estudios de Kerala in Southern India. In Costa Rica, main factibilidad, el país cuenta con el potencial para pepper plantations are located from Upala to producir pimienta con altos parámetros de cali- Talamanca including the entire coastal and lower dad. Sin embargo, las enfermedades vasculares strip of Sarapiquí. According to feasibility studies, son una de las principales limitantes del cultivo. Costa Rica has the potential to produce pepper Objetivo. El objetivo de esta investigación fue with high quality parameters; however, vascular el aislamiento e identificación molecular y mor- diseases are one of the main crop limitations. fológica de las especies de Fusarium asociadas Objective. To isolatate, and molecularly and al cultivo de la pimienta (Piper nigrum L.) en morphologically identify species of Fusarium 2 de las principales zonas productoras del país. associated with the cultivation of pepper (Piper Materiales y métodos. Se recolectaron treinta nigrum L.) in 2 of the main productive areas of muestras de plantas enfermas de distintas fincas the country. Materials and methods. Thirty en las zonas de Sarapiquí y Guatuso, se descri- samples from diseased plants were collected bieron detalladamente los síntomas observados from different farms located in Sarapiqui and en el sistema radical y/o la base del tallo para Guatuso, symptoms observed in the radical * Autora para correspondencia. Correo electrónico: 2 Universidad de Costa Rica, Facultad de Ciencias maria.chinchillasalazar@ucr.ac.cr Agroalimentarias, Centro de Investigaciones en 1 Universidad de Costa Rica, Facultad de Ciencias Protección de Cultivos, Costa Rica. Agroalimentarias, Centro de Investigaciones en 0000-0003-2642-3899. Protección de Cultivos, Costa Rica. 3 Universidad de Costa Rica, Facultad de Ciencias 0000-0002-0814-512X. Agroalimentarias, Centro de Investigaciones en Protección de Cultivos, Costa Rica. 0000-0002-5999-5749. 10 AGRONOMÍA COSTARRICENSE cada una de las plantas recolectadas. Los vein- system and/or the stem base were described in tiún aislamientos de Fusarium spp. obtenidos se detail for each plant. The twenty one isolates identificaron molecularmente con la secuencia of Fusarium spp. obtained were identified with parcial del gen Factor de Elongación 1α (EF-1α) the partial sequence of the molecular marker y para la identificación morfológica se utilizaron Elongation Factor 1α (EF-1α) gene and for the los medios de cultivo PDA y Carnation Leaf-pie- morphogical identification using the PDA and ce Agar (CLA). Resultados y conclusiones. Se Carnation Leaf Agar (CLA) culture media were confirmó la presencia de Fusarium oxysporum used. Results and conclusions. The presence en las muestras provenientes de Sarapiquí, así of Fusarium oxysporum was confirmed in como la presencia de Fusarium solani en ambas the samples from Sarapiquí, and the presence zonas muestreadas. Se reporta por primera vez, of Fusarium solani was confirmed in the la presencia de las especies Fusarium concen- samples from both areas. The presence of the tricum y Fusarium proliferatum asociadas a la species Fusarium concentricum and Fusarium marchitez vascular. proliferatum associated with vascular wilt is reported for the first time. INTRODUCCIÓN mientras que en otros países solamente alcanzan como máximo el 5% (Monge et al. 2013). La pimienta es una planta perenne de La piperina es responsable del sabor los trópicos, originaria de la Costa de Malabar, picante de la pimienta utilizada como condi- situada en Kerala al sur de la India. Pertenece a mento. También posee propiedades analgésicas y la familia Piperaceae y al género Piper, el cual antinflamatorias, las cuales son utilizadas como abarca más de 100 especies distintas, sin embar- ingrediente activo de medicamentos orales por go, la variedad económicamente más importante su fácil absorción, incluso por sus propiedades es la pimienta negra (Piper nigrum L.) (Maistre antioxidantes, se utiliza como anticancerígeno. 1969, Ahmad et al. 2012, Da Luz et al. 2017). También es un compuesto importante para la Los principales países productores son formulación de repelentes, ovicidas, insecticidas Brasil, India, Indonesia, Malasia y Sri Lanka para algunas moscas, escarabajos, gorgojos y (Andújar y Moya 2009). En Costa Rica, las prin- larvas (Ravindran 2005). cipales plantaciones de pimienta se localizan A pesar de lo anterior, la producción desde Upala hasta Talamanca, además en toda nacional solo es capaz de abastecer el 30% de la franja costera y la parte baja de Sarapiquí la demanda del grano para la exportación. Las (Araya 2014). enfermedades vasculares representan una seria En el 2014, según el VI Censo Nacional limitante para el cultivo de pimienta, ya que Agropecuario, se estimaron un total de 316 fin- reducen los rendimientos e incluso pueden oca- cas productoras de pimienta con una extensión sionar la pérdida total de las plantaciones. En total de 665,8 hectáreas, de las cuales el 93,3% Brasil, por ejemplo, enfermedades producidas se ubica en la provincia de Heredia y Alajuela. por Fusarium redujeron en un 32,4% la produc- Otra característica importante de la producción ción entre el 2006 y 2016 (Da Costa et al. 2019). de pimienta, en este país, es su potencial para la En los países productores de pimienta exportación, ya que según un estudio de factibi- como India, Malasia, Indonesia, Brasil y Tai- lidad realizado en 2013 destaca que la pimienta landia, se reporta que uno de los problemas más producida en Costa Rica presenta altos niveles importantes en las plantaciones de la pimienta de piperina, que pueden llegar a superar el 7%, negra es la enfermedad del amarillamiento, Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 11 también conocida como muerte lenta. En 1988 se fitosanitario, a lo largo del tiempo y en diferentes identificó como agente causal de esta enferme- regiones a nivel mundial. dad a Fusarium solani f. sp. piperis (teleomorfo: Mediante esta investigación, se logró Nectria haematococca f. sp. piperis) (Salgado et determinar el impacto causado por Fusarium al. 2016, Shahnazi et al. 2014). spp. en las plantaciones muestreadas y el escaso A nivel nacional, Céspedes (1988) y conocimiento que existe de este cultivo en Costa Villalobos et al. (2009) indican la presencia de Rica. La producción de pimienta (Piper nigrum) la especie F. oxysporum ha causado marchitez es una actividad económica realizada por peque- y F. solani ha afectado el sistema radical, aun- ñas personas productoras, las cuales no cuentan que no se indica cuáles fueron las bases que se con información técnica actualizada (Monge et utilizaron para realizar la identificación de estas al. 2013). Por estas razones, el objetivo de esta especies. investigación fue el aislamiento, la identifica- La identificación de las especies de Fusa- ción morfológica y molecular de las especies rium, desde el punto de vista taxonómico tra- de Fusarium asociadas al cultivo de la pimienta dicional, se basa en estudios de la morfología (Piper nigrum L.) en 2 de las principales zonas de las estructuras reproductivas asexuales del productoras del país. hongo; los macroconidios, los microconidios, las clamidosporas y la célula conidiógena (Šišić et MATERIALES Y MÉTODOS al. 2018). Sin embargo, varios autores coinciden en que la identificación morfológica es compleja, Recolección de las muestras ya que muchas especies no presentan diferencias morfológicas entre sí. La identificación molecu- La recolección de muestras se realizó en lar, mediante la extracción de ADN y la secuen- 14 fincas localizadas en Sarapiquí y Guatuso. En ciación de genes informativos, permite separar cada finca se observaron los diferentes síntomas estas especies (Summerell 2019). Por ejemplo, asociados con Fusarium spp; el material vegetal el gen EF-1α (Factor de Elongación 1α) se uti- fue llevado al Laboratorio de Fitopatología del liza para este fin, porque tiende a evolucionar Centro de Investigación en Protección de Culti- a nivel de esta especie a una velocidad superior vos (CIPROC) de la Universidad de Costa Rica. en comparación con otros genes de uso común Descripción de los síntomas (Choi et al. 2018). Además, según Geiser et al. (2004), En el laboratorio se realizó una descrip- O΄Donnell et al. (2008) e Ismail et al. (2015) ción detallada de los síntomas generales e inter- el gen EF-1α en el genoma de Fusarium está nos de los tejidos afectados, el sistema radical y/o presente en una única copia, no se han detectado la base del tallo, esto para cada una de las plantas copias ortólogas, posee una riqueza de regiones recolectadas. intrónicas y un alto nivel de polimorfismo entre Se analizaron 30 muestras de plantas las especies estrechamente cercanas. Por estas enfermas de las distintas fincas; los códigos razones, esta región genómica tiene una alta uti- utilizados para la identificación se conformaron lidad filogenética (Choi et al. 2018). por las iniciales de la zona de procedencia de la Realizar estudios que combinen las téc- planta (PV o PSC) y el número de planta de la nicas morfológicas y moleculares enfocados a cual se obtuvo el tejido enfermo. Sin embargo, la caracterización a nivel de especie tienen gran en las muestras 19, 22, 26 y 28 en una misma importancia, ya que permiten generar informa- planta se observaron 2 síntomas distintos. Para ción más robusta de las características de los calificarlos se agregó al código de identificación patógenos. Esto permite determinar un problema las iniciales de cada síntoma; RA: Rama aérea, Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 12 AGRONOMÍA COSTARRICENSE R: Raíz, T: Tallo, RH: Raíz hilachada, HV: Haces posteriormente se maceró fuertemente. Luego, se vasculares, RL: Raíz larga y RI: Raíz interna. Por agregó 150 µL del buffer de lisis CTAB (Hexade- lo tanto, se trabajó con un total de 34 muestras cyltrimethyl ammonium bromide) y se agitó por sintomáticas. 15 segundos en vortex. La mezcla se incubó por 60 minutos a 65ºC. Luego en cámara de gases Aislamientos de Fusarium spp se agregó 300 µL de cloroformo isoamyl alcohol A partir del material vegetal, extraído de (24:1) a cada muestra; se mezcló manual y sua- cada uno de los síntomas, se realizaron los aisla- vemente (50 veces) y se centrifugó a 14 000 rpm mientos. La desinfección del material se realizó durante 15 minutos. Seguidamente, se extrajo el con hipoclorito de sodio al 1% y alcohol al 70% supernadante (fase líquida de la suspensión) a un durante un minuto. Posteriormente, se realizaron nuevo tubo Eppendorf de 1,5 mL. 3 lavados con agua destilada. Al nuevo tubo se le agregó 300 µL de cho- De cada muestra, se colocaron en un plato roformo isoamyl alcohol que se volvió a mezclar Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar manual y suavemente, 50 veces y se centrifugó (PDA) 5 fragmentos provenientes de la zona de a 14 000 rpm durante 10 minutos. Posteriormen- avance. Se incubaron en una cámara a tempe- te, se extrajo el supernadante a un nuevo tubo ratura ambiente (23 a 26°C) en condiciones de Eppendorf de 1,5 mL, se agregó 20 µL de acetato oscuridad durante 15 días. de sodio 3M y 300 µL de etanol puro de 95% frío, A partir de los 170 fragmentos procesa- se mezcló de forma manual y se almacenó por 24 dos, se tuvieron 105 crecimientos de micelio horas a -20ºC. relacionado a Fusarium spp. Finalmente, se Las muestras se centrifugaron a 14 000 seleccionaron las colonias según los distintos rpm durante 20 minutos, luego se eliminó el colores observados en el plato petri de cada acetato y el etanol, se limpió el pellet de ADN muestra. De esta selección, se obtuvieron 21 ais- con 150 µL de etanol al 70% frío. A conti- lamientos de Fusarium spp. nuación, se centrifugó a 12 000 rpm por 10 En los restantes 65 fragmentos, 4 corres- minutos, se decantó cuidadosamente el etanol, pondieron a Phytophthora spp. (muestra PV 3), se dejó boca abajo cada eppendorf sobre una en 10 se aisló Trichoderma spp. en las muestras toalla estéril para eliminar el exceso de etanol y PV 6 y PV 9, en 5 solamente hubo crecimiento se dejó secar por 30 minutos. Para almacenarlo bacteriano (PV 13), 10 fragmentos tuvieron se disolvió el pellet en 50 µL de buffer TE y se crecimiento de Lasidiplodia spp, (muestras PV almacenó a -20ºC. 21 y PV 27) y en los restantes 35 fragmentos Se determinó con un espectrofotómetro correspondiente a las muestras PV 4, PV 7, PV Eppendorf BioPhotometer Plus, la concentración 14, PV 15, PV 16, PSC 20 y PV 29, no hubo y pureza del ADN extraído de cada muestra. crecimiento de ningún organismo asociado al Amplificación por medio de PCR síntoma analizado. Para la amplificación (PCR) de la Caracterización molecular región parcial del gen que codifican para el Factor de Elongación 1α (EF-1α), se utiliza- Extracción de ADN ron los siguientes cebadores específicos: EF1 (5’ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC3’) y La extracción de ADN se realizó a partir EF2 (5’GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCAT de micelio puro según la metodología de Trout TT3’) (Karlsson et al. 2015). et al. (1997). El perfil término utilizado consistió en A una pequeña porción de micelio se 3 fases: una desnaturalización inicial a 96ºC le agregó 150 µL del buffer de extracción y durante 2 minutos, seguido por 35 ciclos de Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 13 desnaturalización a 96ºC durante 1 minuto con las secuencias que se encuentran en la base de una temperatura de anillamiento de 50°C, final- datos GenBank. mente una extensión a 72ºC por 1 minuto, seguidos de una extensión final, también a 72ºC Caracterización morfológica durante 10 minutos (Abd-Elsalm et al. 2003). Las características morfológicas macros- Los productos del PCR se visualizaron cópicas, como el color y la textura de las colo- mediante electroforesis, se utilizó un gel de nias, así como las características microscópicas agarosa (0,8%), el buffer de corrida TBE (1X), de los microconidios (la forma, el número de un marcador de peso molecular de 100 bp y septos y la abundancia), se determinaron a partir un control negativo (sin ADN). El fragmento a del crecimiento de los aislamientos en medio de amplificar tuvo un tamaño de 700 pb. cultivo PDA incubados en una cámara a tempe- ratura ambiente y en condiciones de oscuridad Secuenciación durante 15 días. El producto de PCR se purificó mediante A partir del crecimiento en el medio de la endonucleasa Exonuclease I (Fermentas), se cultivo Carnation Leaf-piece Agar (CLA), se llevó a una concentración de 50 ng.μL-1 determinó la presencia, la forma, la posición y la y, pos- abundancia de las clamidosporas; la forma de la teriormente, se envió a secuenciar a la empresa célula apical y la célula basal; la forma, la abun- Macrogen Inc, en Corea del Sur. dancia y el número de septos de los macroconi- Se obtuvieron secuencias en ambas direc- dios, así como el tipo de células conidiógenas, ciones para cada muestra generadas a partir de Para identificar y describir estas estruc- ciclos fluorescentes utilizando un secuenciador turas se utilizó un microscopio óptico y las modelo 3730XL (Applied Biosystems). claves taxonómicas de Booth (1971) y Leslie y Summerell (2006). Alineamiento de las secuencias La calidad de las secuencias se confirmó RESULTADOS con un alineamiento bidireccional y por compa- ración con los cromatogramas con el programa BioEdit, además, se cortaron las terminaciones Caracterización de los síntomas observados a 5’ y 3’ de las cadenas para facilitar el alinea- nivel de campo miento. Se utilizó la herramienta informática Los síntomas generales observados en las BLAST (Basic Local Alignment Search Tool del plantaciones muestreadas fueron una clorosis National Center for Biotechnology Information generalizada de las plantas, en algunos casos (NCBI), por sus siglas en inglés) a partir de la también se observó necrosis del follaje en la parte cual se comparó la secuencia generada frente a superior (Figura 1). Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 14 AGRONOMÍA COSTARRICENSE A B Figura 1. Síntomas en plantas enfermas de pimienta negra A) Clorosis generalizada en toda la planta y B) Necrosis parcial del follaje. En la parte interna del tallo, se obser- del tallo y la raíz, en ambos casos las plantas varon 2 síntomas diferentes: el primero, con- enfermas no producen olores desagradables. A sistió en áreas necróticas de color café o negro nivel de la base de la planta se da una descom- limitadas al sistema vascular (Figura 2A) y, posición del tejido con un aspecto “deshilacha- el segundo, una necrosis general de la base do” (Figura 2B). Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 15 A B Figura 2. Síntomas en plantas enfermas de pimienta negra A) Lesiones necróticas de color café o negro limitadas al sistema vascular y B) “Deshilachamiento” necrótico en la raíz. Los síntomas asociados a Fusarium oxys- del tejido avanza progresivamente en todo el porum fueron lesiones internas, que no tienden tallo, lo que causa una afectación completa del a estar limitadas alrededor de los haces vascu- tejido vascular. lares. Se observa en la Figura 3, que la necrosis Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 16 AGRONOMÍA COSTARRICENSE Figura 3. Daño vascular a nivel del tallo observada en plantas enfermas de pimienta negra asociadas a Fusarium oxysporum. En el caso de las muestras con síntomas En las muestras de Guatuso, además, del síntoma asociados a F. solani (Figura 4A) provenientes anterior se observó una necrosis generalizada en de Sarapiquí, se observaron lesiones internas el tejido vascular (Figura 5). restringidas al sistema vascular (Figura 4B). A B Figura 4. Sintomatología asociada a Fusarium solani observada en muestras de plantas enfermas de pimienta negra de Sarapiquí A) Clorosis aleatoria del follaje y B) Daño vascular localizado a nivel de tallo. Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 17 A B Figura 5. Sintomatología asociada a Fusarium solani en muestras de plantas enfermas de pimienta negra de Guatuso A) Clorosis aleatoria del follaje y B) Necrosis generalizada en el tallo. Los síntomas asociados a Fusarium “deshilachamiento” necrótico en la raíz o en concentricum (Figura 6) fueron lesio- la base de la planta. El follaje presentó una nes necróticas internas localizadas en los necrosis sin ninguna distribución clara y un haces vasculares, pero no se observó un leve amarillamiento de las hojas. Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 18 AGRONOMÍA COSTARRICENSE A B Figura 6. Sintomatología asociada a Fusarium concentricum en plantas enfermas de pimienta negra A) Síntomas a nivel de follaje y B) Daño vascular del sistema radical. Los síntomas asociados a Fusarium proli- necrótico del tejido e internamente, en la zona de feratum están relacionados a un amarillamiento avance, una necrosis de color café claro generali- generalizado de la parte área. En la raíz y la zada que abarca todo el tejido (Figura 7), además, base del tallo se observó un deshilachamiento es importante destacar que no se percibió mal olor. A B C D Figura 7. Sintomatología asociada Fusarium proliferatum en plantas enfermas de pimienta negra A) Crecimiento vegetativo reducido y clorosis del follaje, B) “Deshilachamiento” necrótico en la base del tallo, C) Daño vascular interno a nivel de tallo y D) “Deshilachamiento” necrótico en la raíz principal. Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 19 A partir de este estudio, se analizaron 30 micelio relacionado a Fusarium. Finalmente, para plantas enfermas y 34 síntomas asociados a Fusa- cada muestra se seleccionaron los aislamientos rium spp. localizadas en provenientes de Sarapi- tomando en cuenta los distintos colores presentes. quí y Guatuso. A partir de 170 fragmentos de la De esta selección se obtuvieron los 21 aislamien- zona de avance, se tuvieron 105 crecimientos de tos de Fusarium spp (Tabla 1). Tabla 1. Código de identificación, procedencia, coordenadas geográficas y área afectada de las plantas de pimenta negra (Piper nigrum) muestreadas. Código de identificación Procedencia Coordenadas geográficas Área afectada PV 1 La Virgen de Sarapiquí N 10.47268º W 084.10876º Base del tallo PV 2 La Virgen de Sarapiquí N 10.47268º W 084.10876º Base del tallo PV 3 La Virgen de Sarapiquí N 10.54769º W 084.12753º Base del tallo PV 4 La Virgen de Sarapiquí N 10.54769º W 084.12753º Base del tallo PV 5 La Virgen de Sarapiquí N 10.55591º W 084.15514º Base del tallo PV 6 La Virgen de Sarapiquí N 10.46852º W 084.21631º Raíz PV 7 La Virgen de Sarapiquí N 10.46937º W 084.21589º Base del tallo PV 8 La Virgen de Sarapiquí N 10.46450º W 084.20999º Base del tallo PV 9 La Virgen de Sarapiquí N 10.46450º W 084.20999º Raíz PV 10 La Virgen de Sarapiquí N 10.39518º W 083.9607º Raíz PV 11 La Virgen de Sarapiquí N 10.39518º W 083.9607º Base del tallo PV 12 La Virgen de Sarapiquí N 10.40121º W 084.16311º Base del tallo PV 13 La Virgen de Sarapiquí N 10.40121º W 084.16311º Raíz PV 14 La Virgen de Sarapiquí N 10.40237º W 084.15678 º Base del tallo PV 15 La Virgen de Sarapiquí N 10.39996 º W 084.15465º Raíz PV 16 La Virgen de Sarapiquí N 10.39996 º W 084.15465º Base del tallo PVS 17 La Virgen de Sarapiquí N 10.39996 º W 084.15465º Base del tallo PV 18 La Virgen de Sarapiquí N 10.39996 º W 084.15465º Base del tallo PSC 19 RA Guatuso de San Carlos N 09.53339º W 083.52349º Parte aérea PSC 19 R Guatuso de San Carlos N 09.53339º W 083.52349º Raíz PSC 20 Guatuso de San Carlos N 10.4942.2º W 0850030.3º Raíz PSC 21 Guatuso de San Carlos N 10.4942.2º W 0850030.3º Base del tallo PSC 22 T Guatuso de San Carlos N 10.4942.2º W085.0030.3º Tallo PSC 22 R Guatuso de San Carlos N 10.4942.2º W085.0030.3º Raíz PSC 23 Guatuso de San Carlos N 10.4608º W 084.54144º Raíz PSC 24 Guatuso de San Carlos N 10.46089º W 084.54144º Base del tallo PSC 25 Guatuso de San Carlos N 10.46089º W 084.54144º Base del tallo PSC 26 RH Guatuso de San Carlos N 10.46089º W 084.54144º Raíz PSC 26 RI Guatuso de San Carlos N 10.46089º W 084.54144º Raíz PSC 27 Guatuso de San Carlos N 10.46089ºW 084.54144º Tallo PV 28 H La Virgen de Sarapiquí N 10.54769º W 084.12753º Base del tallo PV 28 RL La Virgen de Sarapiquí N 10.54769º W 084.12753º Raíz PV 29 La Virgen de Sarapiquí N 10.46873º W 084.21891º Base del tallo PV 30 La Virgen de Sarapiquí N 10.46852º W 084.21631º Base del tallo Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 20 AGRONOMÍA COSTARRICENSE Identificación molecular presentaron un porcentaje de similitud de 99%, 99%, 98% y 98%, respectivamente, con la acce- Mediante la amplificación del ADN de sión KF255995 (Wang et al. 2014) las secuencias un fragmento del gen del Factor de Elongación de los aislamientos PV 12, PV 17, PSC 19 R, PV 1α (EF-1α) y la comparación entre las secuen- 23 y PSC 26 RI tuvieron un porcentaje de simi- cias obtenidas para los veintiún aislamientos litud que osciló entre 98 y 100% con la accesión con las secuencias almacenadas en la base de HQ731056 (Jiménez-Fernández et al. 2011). datos GenBank, procesados con la herramienta Los aislamientos de Fusarium prolifera- informática BLAST, que posibilitó determinar tum PSC 19 RA y PSC 22 R fueron similares en la presencia de 4 especies de Fusarium presen- un 99% y 100%, respectivamente, a la accesión tes en las plantaciones de pimienta negra de JX869017.1 (Hawa et al. 2013). Los aislamientos Costa Rica. identificados como Fusarium concentricum (PV Las secuencias de Fusarium oxysporum 8, PSC 28 HV, PSC 28 RL y PV 30 fueron 99% del aislamiento PV 1 tuvo un 99% de similitud similares a la accesión JF740760.1 (O΄Donnell et con la accesión MK172058.1 (Taylor et al. 2019), al. 2012). las secuencias de los aislamientos PV 5 y PV Identificación morfológica 10 fueron en un 100% y 99% similares, respec- tivamente, a la accesión MG018805.1 (Maldo- Las 4 especies de Fusarium spp., identi- nado-Bonilla et al. 2019) y la secuencia de los ficadas a partir de los 21 aislamientos, fueron aislamientos PSC 26 RH tuvo un porcentaje Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusa- de 99% similitud con la accesión MG018803.1 rium concentricum y Fusarium, proliferatum, (Maldonado-Bonilla et al. 2019). las características morfológicas de cada espe- Los aislamientos identificados como cie se describen en la Tabla 2 y las Figuras 8, Fusarium solani PV 2, PV 11, PSC 24 y PSC 25 9, 10 y 11. Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 21 Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 Tabla 2. Características morfológicas de los macroconidios, los micronidios, las células conidiógenas, las clamidosporas y la coloración de la colonia de las 4 especies de Fusarium asociadas a plantas enfermas de pimienta negra, según las claves taxonómicas de Booth (1971) y Leslie y Summerell (2006). Macroconidios Especie Forma Célula apical Célula basal Número de septos Abundancia Fusarium PV 1, PV 5, PV 26 RH: Forma redondeada, Forma de pie Septados con 3 a 5 septos, oxysporum Semicurvos. PV 10 casi rectos ligeramente encorvada (Figura 8C) pero predominaron con 3 Abundantes(Figura 8C) (Figura 8C) septos Fusarium Rectos y robustos. PV 2 y PV PV 2, PV 12: Aguda. PV 11, PV 2, PV 12 y PV 18: solani 12: ligeramente curvos PV 17 y PV 18: Ligeramente Forma de pie (Figura 9C) encorvada (Figura 9C) (Figura 9C) Septados con 3 a 7 septos Abundantes. PV 11 y PV 17: Escasos PSC 28 RL y PV 30: PSC 28 RL y PV 30 casi rectos Abundantes Fusarium Forma de pico ligeramente Forma de pie concentricum PV 8 y PV 28 HV: curvos encorvada (Figura 10C) (Figura 10C) Septados con 3 a 5 septos (Figura 10C) PV 8 y PSC 28 HV: Escasos Fusarium Delgados, casi rectos a Ligeramente proliferatum ligeramente curvos Curvada (Figura 11B) redonda Septados con 3 a 5 septos Abundantes(Figura 11B) (Figura 11B) 22 AGRONOMÍA COSTARRICENSE Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 Continuación de la Tabla 2. Microconidios Especie Célula conidiógena Forma Número de septos Abundancia Ovalados Sin septos Abundantes PV 10 y PV 5: Monofiálides cortas y simples (Figura 8B) Fusarium oxysporum PV 1: Esporodoquios ramificados (Figura 8D) Ovalados, algunos Sin septos Abundantes Predominaron monofiálides simples y cortas (Figura 9B) Fusarium solani ovoides truncados en todos los PV 17 y PV 18: Esporodoquios cortos(Figura 9B) aislamientos PV 12: Escasos Ovalados Sin septos Abundantes PV28 RL y PV 28 HV: Monofiálides simples y cortas (Figura 10B) (Figura 10E) Fusarium concentricum PV 8 y PV 30: Esporodoquios ramificados y simples (Figura 10D) Piriformes Sin septos o con un sólo septo Escasos Polifiálides y monofiálidas, con menor frecuencia Fusarium proliferatum (Figura 11E) en falsas cabezas (Figura 11C y Figura 11D) Ningún aislamiento Fusarium proliferatum produjo Micelio aéreo blanco con leves tonalidades rosadas clamidosporas (Figura 11A) Clamidosporas Especie Coloración de la colonia Posición Forma Abundancia Fusarium oxysporum PV 1 y PV 5: Terminales Esférica de paredes lisas Abundantes Micelio aéreo: Blanco (Figura 8A)PV 10: Intercalares (Figura 8D) PV 12: Intercalares Esférica de paredes rugosas Sólo los aislamientos Micelio aéreo: PV 2, PV 8, PV 11, PSC 24 y PV 17: Terminales PV 12 y PV 17 Fusarium solani PSC 25 T: Tonalidades beige a café (Figura 9E) PV 12 y PSC 26 RI: Rojo. PV 17 y PV18: Blanco (Figura 9A) Fusarium concentricum Ningún aislamiento produjo clamidosporas Micelio aéreo blanco posteriormente se torna gris-violeta (Figura 10A) Fusarium proliferatum Ningún aislamiento produjo clamidosporas Micelio aéreo blanco con leves tonalidades rosadas (Figura 11A) CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 23 A B C D Figura 8. Características morfológicas de los aislamientos Fusarium oxysporum A) Color de la colonia en PDA, B) Monofiálide corta, C) Macroconidios, C. apical: célula apical, C. basal: célula basal. D) Esporodoquio ramifica- do y clamidosporas terminales en medio de cultivo CLA. (40X). A B D C E Figura 9. Características morfológicas de los aislamientos de Fusarium solani A) Color de la colonia en PDA B) Microconidios, C) Macroconidios C. apical: célula apical, C. basal: célula basal, D) Monofiálides cortas y E) Clamidospora intercalar en medio de cultivo CLA (40X). Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 24 AGRONOMÍA COSTARRICENSE A B C D E Figura 10. Características morfológicas de los aislamientos de Fusarium concentricum A) Color de la colonia en PDA B) Microconidios en el micelio aéreo (en PDA) C) Macroconidios, C. apical: célula apical, C. basal: célula basal, D) Esporodoquio ramificado y E) Conidióforos simples y cortos en medio de cultivo CLA (40X). A D B C E Figura 11. Características morfológicas de los aislamientos de Fusarium proliferatum A) Color de la colonia (PDA), B) Macroconidios, C. apical: célula apical, C. basal: célula basal, S: septos, C) Conidióforos simples y cortos D) Conidióforos en falsas cabezas y E) Microconidios en el micelio aéreo en medio de cultivo CLA (40X). Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 25 DISCUSIÓN Al observar los síntomas asociados a esta especie en las plantas de pimienta negra analiza- El género Fusarium comprende especies das (Figura 3), se identificó que no concuerdan endófitas, saprófitas y patógenas de plantas, precisamente con lo descrito por Duarte et al. humanas y animales (Leslie y Summerell 2006, 2001 y Sarma et al. 2013, quienes indican que Chandra et al. 2011). Para definir una especie este patógeno invade las raíces de las plantas existen varias clasificaciones, unas basadas en de pimienta a través de heridas o durante la la morfología (especies morfológicas), otras en aparición de nuevas raíces. Posteriormente, se experimentos cruzados (especies biológicas), y da la colonización y la necrosis de los haces también en marcadores moleculares (especies vasculares, que evitan así, la absorción de agua filogenéticas) (Chandra et al. 2011) y según la y nutrientes. Externamente, las plantas enfermas especificidad del huésped (Coleman 2016). muestran coloración amarillenta cuando se infec- En la práctica, es difícil distinguir las especies de Fusarium que se encuentran dentro tan varias raíces, la planta se colapsa y el follaje de los complejos de especies, porque están estre- se mantiene adherido a las ramas. chamente relacionadas y tienden a tener ninguna Según Rana et al. (2017) y Dean et al. o pocas diferencias morfológicas entre sí. Para (2014), Fusarium oxysporum es el hongo más estos casos la identificación molecular permite abundante y ubicuo del suelo; se han encontrado distinguir con mayor precisión estas especies en diversos ecosistemas, incluidos pastizales, (Chandra et al. 2011). bosques, desiertos, que van desde los trópicos La identificación molecular se basa en la hasta el Ártico. Aunque son comúnmente cono- extracción de ADN y la secuenciación de genes cidos como fitopatógenos, también pueden informativos que permiten separar las especies sobrevivir como saprófitos, como colonizadores (Summerell 2019). Las secuencias más común- endófitos de plantas asintomáticas (se han encon- mente utilizadas para distinguir especies de trado Fusarium oxysporum endófito en casi 100 Fusarium son porciones de las secuencias genó- especies de plantas), incluso como inductores micas que codifican el factor de elongación1-α de resistencia. Según estas personas autoras la (EF-1α), β-tubulina (tub2), calmodulina, regio- mayoría de los aislamientos Fusarium oxyspo- nes espaciadoras transcritas internamente en la rum se presume que no son patógenos. región de repetición ribosómica (ITS1 e ITS2) y Aunado a lo anterior, la capacidad de la región espaciadora intergénica (IGS) (Chandra degradar la lignina y los hidratos de carbono et al. 2011). complejos, asociados con los desechos del suelo, En esta investigación, se utilizó el gen que poseen las especies saprofíticas de Fusarium EF-1α, el cual es el más aceptado porque tiende oxysporum (Rana et al. 2017 y Dean et al. 2014), a evolucionar a nivel de esta especie a una velo- podrían explicar los síntomas asociados a F. cidad superior en comparación con otros genes oxysporum observados en las muestras analiza- de uso común (Choi et al. 2018). Además, otros das (Figura 3). marcadores tienen algunas limitantes, por ejem- Además, dada la baja frecuencia de apari- plo, las regiones ITS no funcionan bien dentro ción de esta especie en este estudio (4 muestras de la sección Liseola y ß-tub2 no funciona bien de un total de 34), podría sugerir que los aisla- dentro del complejo de especies Fusarium solani mientos obtenidos F. oxysporum corresponden (Chandra et al. 2011). a saprófitos. Otro dato para tomar en cuenta, es Respecto a la identificación molecular y el que hasta el momento no se ha reportado una análisis morfológico, se confirmó la presencia de forma especial para pimienta negra dentro del la especie Fusarium oxysporum en los aislamien- complejo Fusarium oxysporum (FOSC). tos provenientes de plantas enfermas de pimienta En esta investigación también se confir- negra en las 2 localidades muestreadas. mó la presencia de la especie F. solani en las 2 Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 26 AGRONOMÍA COSTARRICENSE localidades muestreadas. Además, fue la especie generales, se sabe poco de su ecología y biología que se presentó en mayor frecuencia. Este resul- reproductiva (Leslie y Summerell 2006). tado coincide con los múltiples reportes naciona- Según Paparu et al. (2003) y Barrios les e internacionales que la señalan como uno de (2006), Fusarium concentricum puede encon- los patógenos más importante en el cultivo de la trarse de forma endófita en algunas musáceas, pimienta, específicamente, en la forma especial incluso puede presentar una actividad benéfica piperis (Sitepu y Mustika 2006, Andújar y Moya (inductor de resistencia), ya que según estudios 2009, Villalobos et al. 2009, Shahnazi et al. realizados en Uganda en el 2000, se observó un 2012, Vaz et al. 2012, Sarma et al. 2013, Shahna- incremento significativo de la biomasa de plantas zi et al. 2014 y Salgado et al. (2016). de banano cultivadas en campo e inoculadas con Fusarium solani f. sp. piperis (teleomorfo: esta especie de Fusarium. Nectria haematococca f. sp. piperis) causa gra- Con base en las investigaciones que repor- ves pérdidas en la mayoría de los países produc- tan la presencia de esta especie en varios cultivos tores de pimienta negra, incluidos India, Malasia, en nuestro país y tomando la necrosis de los haces Indonesia, Brasil y Tailandia. Se informa que vasculares observadas en las plantas de pimienta la infección por Fusarium en una plantación de enfermas (Figura 6), es necesario investigar aún pimienta negra reduce la vida económica de la más su ecología y biología (capacidad patogénica plantación de 20 años a 6 -8 años (Shahnazi et o actividad benéfica). al. 2012). La última especie identificada en este Los daños asociados a Fusarium solani estudio fue Fusarium proliferatum. Esta se observados en las fincas muestreadas fueron 2; reportó por primera vez en 1387 como una lesiones del sistema vascular y el daño necrótico especie de Cephalosporium y fue descrita como de la base del tallo y la raíz (Figuras 4 y 5). Estos una especie de Fusarium hasta 1566 (Leslie y resultados concuerdan con las investigaciones Summerell 2006). En el cultivo de la pimienta solo se ha reportado aislado de la rizósfera de realizadas en Brasil, que describen 2 enfermeda- plantaciones de pimienta en Malasia y, según las des causadas por Fusarium solani; la primera de pruebas de patogenicidad realizadas, no presentó ellas se conoce como como fusariosis y corres- actividad patogénica (Shahnazi et al. 2012). En ponde a la infección de las raíces de la pimienta Costa Rica, no existe registro de su presencia en negra (Piper nigrum L.) y la segunda es un daño el cultivo de pimienta negra. conocido como tizón del tallo, que como su nom- Sin embargo, en otros cultivos como soya bre lo sugiere, es una enfermedad que afecta los y espárragos, se reporta como causante de pudri- tallos (Da Costa 2019). ción de la raíz (Costa et al. 2016), también La tercera especie presente en cultivo de se reporta como patógeno en banano, mango pimienta, en Costa Rica, es la especie F. con- (Campos 2013), arroz, tomate, ajo, piña y cebolla centricum; la misma no ha sido reportada en el (Stępien et al. 2015). Además, produce diferentes cultivo de pimienta negra hasta el momento, por micotoxinas, entre ellas están moniliformina, lo que este es el primer reporte de esta especie beauvericina, ácido fusárico, fusaroproliferina y asociada al daño vascular y a la posterior muerte fumonisinas (Saha 2002, Fanelli et al. 2012, De de las plantas de pimienta negra. la Torre et al. 2014). También produce enzimas Esta especie fue descrita por primera vez relacionadas con la degradación de lignina y por Nirenberg y O’Donnell en 1998, a partir de xileno (Saha 2002, Leslie y Summerell 2006). aislamientos provenientes de Musa sapientum Las especies F. concentricum y Fusarium (ex T) de Costa Rica y Guatemala. Además, en proliferatum también están reportadas como el 2009 fue identificada en piña de Costa Rica endófitas en cultivos como gramíneas, trigo, (Waśkiewicz y Stepień 2012). Pero, en términos orquídeas y arroz (Leslie y Summerell 2006). Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. ISSN:0377-9424 / 2020 CHINCHILLA-SALAZAR et al.: Identificación de Fusarium spp., asociada al cultivo de pimienta negra (Piper nigrum) 27 La información anterior resulta relevante si se la susceptibilidad del huésped, debido a la dis- toma en cuenta que se ha demostrado que las minución de la producción de fenol oxidasas, la plantas de P. barbatum y P. nigrum son hospe- producción reducida de fitoalexina, la supresión dantes de múltiples microorganismos endófitos, de las micorrizas y la reducción de la fijación de como por ejemplo los hongos Colletotrichum nitrógeno (Ravidra 2005). spp., Bipolaris spp., Lasiodiplodia spp., Phoma La eliminación de plantas infectadas redu- spp., Phomopsis spp., (Orlandelli et al. 2012), ce el nivel de inóculo y la propagación del hongo Alternaria spp., Colletotrichum gloeosporioides y el manejo de la sombra en la temporada de (Chithra et al. 2014) y bacterias promotoras del lluvias es esencial para facilitar la penetración crecimiento (Jasim et al. 2013). de la luz solar y la reducción de la alta hume- En Costa Rica, se reportó Colletotrichum dad. Agregar materia orgánica para aumentar la gloeosporioides como endófito en plantas de diversidad de los suelos, proporcionar una nutri- Piper nigrum (González 2017) y, al considerar ción adecuada y realizar un manejo integrado de que se han logrado aislar Fusarium spp. de teji- Radopholus similis y Meloidogyne incognita son dos asintomáticos de plantas de Piper silvestres, prácticas que se deben incluir en manejo integra- es posible que alguna de las especies identifi- do de la enfermedad (Ravidra 2005, Shahnazi et cadas en este estudio pueda encontrarse como al. 2012). endófitas en las plantaciones nacionales. En futuras investigaciones se realizará Es importante señalar que en una misma el análisis filogenético de los aislamientos des- planta fue posible confirmar la presencia de 2 critos en este artículo, esto para contribuir al especies distintas de Fusarium (muestras PSC diseño de los programas manejo integrado de la 19 y PSC 22), en ambos casos se aisló F. solani enfermedad. y F. proliferatum en distintos estratos enfermos de la planta (parte aérea y raíz, respectivamente). AGRADECIMIENTOS Debido a que se desconoce la capacidad infectiva de los aislamientos, tampoco se debe descartar Un agradecimiento especial a los Labora- que al menos alguna de las especies sea un orga- torios de Fitopatología y Técnicas Moleculares nismo endófito. del Centro de Investigaciones en Protección de Conocer la biología de las especies de Cultivos (CIPROC) de la Universidad de Costa Fusarium identificadas, en este estudio, es esen- Rica por el financiamiento para realizar el estu- cial para comprender la enfermedad que se dio en el marco del proyecto: Evaluación del observa en las plantaciones. En aquellas especies complejo de enfermedades de suelo del cultivo patogénicas es necesario investigar su dinámica de pimienta (Piper nigrum) y generación de un epidemiológica, el grado de especialización y los paquete de manejo integral del problema, en La cambios en la capacidad patogénica. Toda esta Virgen de Sarapiquí, Costa Rica. información podrían ser la base para investigar Y un especial agradecimiento al Ing. nuevas estrategias de manejo integrado, incluso Jairo Araya y a la Agencia de Extensión Agro- como lo sugiere Chandra et al. (2011) para iniciar pecuaria de La Virgen de Sarapiquí del Minis- proyectos de mejoramiento genético. terio de Agricultura y Ganadería por su gran Las medidas de control que recomiendan colaboración. las personas autoras, para el manejo de las enfer- medades vasculares en pimienta, son un diseño LITERATURA CITADA adecuado de un drenaje sobre todo en épocas con altas precipitaciones, porque la acumulación de Abd-Elsalm, K; Aly, I; Abdel-Satar, M; Khalil, M; Verreet, J. 2003. PCR identification of Fusarium genus based agua promueve las condiciones anaeróbicas, las on nuclear ribosoma DNA sequence data. African cuales reducen el nivel de oxígeno y aumentan Journal of Biotechnology 2(4):82-85. Agronomía Costarricense 44(2): 9-30. 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