Taller Milagro Granados Proyecto ED-3084 Vicerrectoría Acción Social Universidad de Costa Rica Principios básicos de diagnóstico fitopatológico Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 11 HONGOS FITOPATÓGENOS Los hongos son un gran grupo de organismos heterótrofos, omnipresentes y heterogéneos que pueden comportarse como saprófitos, parásitos o simbiontes de plantas o animales. Los hongos fitopatógenos causan más del 70% de las enfermedades de plantas, son organismos que pertenecen a grupos filogenéticamente diversos; pero que, por afectar cultivos agrícolas se estudian de manera conjunta. A este grupo pertenecen especímenes de tres reinos diferentes, a saber: el Reino Protista, el Reino Straminopila o Chromista y el Reino Fungi, siendo el último donde se encuentran los hongos verdaderos. Comparten tres características esenciales, son eucariotas, heterótrofos (organismos desprovistos de clorofila que obtiene sus nutrientes por absorción) y se reproducen por propágulos. El hecho de pertenecer a reinos diferentes además de hacer que tengan características estructurales diferentes, hace que se encuentren en diferentes hábitats y que agronómicamente se combatan de maneras distintas, por ejemplo, un fungicida para oomycetes no es tan eficiente para ascomicetes. La mayoría de las especies son mesófilas (20 -30 C), se desarrollan mejor en pH entre 4-7 y en presencia de humedades relativas por encima de 60%. Su cuerpo está compuesto de un talo vegetativo llamado micelio, el cual está formado por un conjunto de filamentos tubulares ramificados llamados hifas. El micelio puede o no tener tabiques transversales, esta es la primera característica útil para su identificación; así, si la hifa tiene tabiques (septos) el micelio es septado y si no los posee se denomina micelio cenocítico. Los especímenes pertenecientes al Reino Protista no presentan ningún tipo de talo. Estos organismos son capaces de producir alteraciones (síntomas) en el hospedero que infectan y colonizan; además tienen la habilidad de producir estructuras reproductivas o de dispersión sobre el tejido dañado, a los que se les denomina signos. Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 12 Entre los síntomas localizados frecuentemente relacionados con hongos se encuentran las clorosis, necrosis y llagas (chancros). Por otro lado, dentro de los síntomas sistémicos producidos por estos patógenos se encuentran las pudriciones, tanto suaves como secas, el mal del talluelo, la marchitez, la muerte descendente y los tizones. Se debe recordar que los signos son estructuras vegetativas, de reproducción o diseminación de los hongos, que se encuentran presentes en el síntoma y que, en el caso de las royas, los carbones y los mildiús permiten la identificación del agente. Para hongos verdaderos, el signo más simple que se puede hallar, después del micelio, son las esporas o conidios, que son estructuras microscópicas que tienen como función la dispersión del hongo hacia nuevos hospederos o tejido sano en el mismo hospedero. Figura 3. Micelio, conidióforos y conidios del hongo fitopatógeno Nigrospora oryzae (Berk. & Broome) Petch. Estos conidios se producen en estructuras denominadas conidióforos, los cuales pueden ser libres, si no se encuentran dentro de ninguna estructura; o bien, estar inmersos en estructuras reproductivas asexuales llamadas conidiomas. Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 13 También es posible encontrar estructuras de hongos en fase sexual, pueden estar desnudas o libremente en el tejido dañado, o formando cuerpos fructíferos, llamados ascomas o ascocarpos en el caso de los ascomicetes y basidiocarpos en el caso de los basidiomicetes. Figura 4. Ascocarpo tipo pseudotecio. Figura 5. Basidiocarpo de Agaricales. Todos los hongos fitopatógenos son capaces de producir estructuras de resistencia o sobrevivencia a condiciones adversas, las más frecuentes son las clamidosporas, que son celúlas de las hifas que se engruesan y separan del resto del micelio; esclerocios, que son masas compactas de micelio que se melanizan y pueden sobrevivir por años sin presencia del hospedero; oosporas, que son resultado de la reproducción sexual de los oomycetes y quistes que son estructuras producidas por plasmodioforomicetes. Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 14 Protocolo para el procesamiento de muestras vegetales con síntomas causados por hongos. *La concentración de hipoclorito y los tiempos de exposición dependen del tejido a desinfectar. ** Agar agua 2% + cloranfenicol, se puede usar también en mezcla con 0.03g/L de rosa de bengala.***El método de almacenamiento depende del género. Identificación Mantener rotulación por CÓDIGO DE PROYECTO Purificación Rotular cada plato como aislamiento individual con sufijo de 1 a 5 Asignar un CÓDIGO DE PROYECTO a cada aislamiento Aislamiento Cada plato puede generar 5 platos de purificación AACl** 5puntos/plato (9cm) 1plato/muestra AACl 1punto/plato(6cm) (para seguir proceso) Mantener 4℃ Monospórico PDA 1punto/plato (6cm) (para reconocer género) Desechar Morfológica Molecular Procesamiento Selección y lavado de tejido para desinfección en ROH 70% X 1 min y/o hipoclorito 0.5% * Descripción y categorización de síntomas y toma de fotografías Conidios/Ascosporas Punta de hifa Respaldos a 4℃ en AA *** Medio líquido Extracción de ADN y PCR Secuenciación Morfometría Apéndices Clamidosporas Conidios/Esporas Esclerocios Esporangios Etc. Caracterización cultural Tasa de crecimiento Pigmentación Conidioma CABI Training Course on Plant Pathology Techniques 5.3 MEDIA PREPARATION AND STERILISATION METHODS Correct preparation of agar media is a basic but necessary skill, incorrectly prepared media will lead to waste of time, expensive chemicals and inaccurate results. The normal precautions outlined in previously in this document relating to use of clean glassware, handling and mixing of chemicals should always be observed when making agar growth media. Dispense molten media when sufficiently cool into suitable screw cap bottles. If filled with chemically defined media these may also need to be acid/distilled water washed, the screw caps should either be metal without rubber liners or plastic so that they too can be thoroughly washed and distilled water rinsed before use. Do not fill bottles more than two-thirds full, especially important with thick vegetable-based decoctions as the agar bubbles up during sterilising and may overflow. Most media can be sterilised by heating at 115-120°C (pressure of 0.7-1 bar) for 15min in an autoclave or domestic pressure cooker. Units used on the dials of these vessels vary according to type, source, age, etc. The relative pressures (at sea level), in commonly used units, needed to reach particular temperatures in pressure vessels are as follows: Pressure equivalents Temperature (°C) bar kg/cm2lbs/in2 (p.s.i.) 107 0.34 0.35 5 110 0.48 0.49 7 115 0.68 0.7 10 121 1.02 1.05 15 126 1.36 1.4 20 Autoclaves and domestic pressure cookers must be operated with care, incorrectly used they can ruin media and worse still cause severe burns and scalding. Seek instruction on their correct use from a competent operator. After sterilising, the pressure should be allowed to return to zero by normal cooling, the lid opened and the contents left to cool for about 5min. This reduces the chances of super-heated steam causing scalding and agar bubbling out from the bottles when removed from the autoclave. Once the agar has cooled and set, tighten screw caps and store in a cool dark cupboard until required. Some constituents, such as antibiotics, should only be added to 'hand-hot' media (about 40°C) immediately before use. Most antibiotics are denatured by heat and must be filter sterilised. Others such as copper sulphate, which can be sterilised separately, also need to be added after sterilising as the setting power of the agar is compromised if these are autoclaved when mixed together. Most mycological growth media use agar as the setting agent; always use a reliably pure CABI Training Course on Plant Pathology Techniques proprietary brand to avoid problems with contaminants or poor setting (Oxoid is used at CABI Bioscience). Melting and pouring media should be carried out in a 'clean room' or laminar flow cabinet and on a surface cleaned with industrial alcohol or 4% bleach to avoid contamination of newly poured media. Melt previously prepared media by immersion in boiling water or heating under gentle pressure. Always ensure that the bottle lids are loosened to avoid build-up of pressure. Allow the media to cool to 'hand-hot', about 50°C, remove the bottle lid, pass the neck through the flame of a gas or spirit burner to surface sterilise and carefully pour the media into sterile Petri dishes. Lift the dish lids just enough to allow the introduction of the bottle-neck. Work methodically and carefully to avoid agar dripping onto the outsides of the dishes; 15-20ml/dish is sufficient. Allow the agar to solidify and store poured plates upside-down in a dust free cupboard to avoid contamination and condensation. Storing media in a refrigerator is not recommended as this leads to condensation. Media can be poured into bottles for growing cultures on a long term basis; wide necked vessels such as 30ml (1oz) Universal bottles allow easier introduction of molten media and when culturing easier manipulation of inoculating instruments. Bottles can be placed at an angle onto racks that allow the media to set as either long or short slopes. When set, screw the lids down firmly and store in a dust free cupboard. DRY HEAT STERILISATION Dry heat may be used for glass and other materials, death of even the most resistant bacterial spores takes place within an hour in a hot air oven at 160°C. Glass dishes must be thoroughly washed and should be individually wrapped in aluminium foil and placed in a container suitable for use in an oven. Avoid wrapping dishes in paper as it either becomes very brittle or burns during sterilising. Glass Petri dishes can be sterilised in a hot air oven, a domestic one can be used, the apparatus should not be too closely packed to facilitate circulation of hot air, and heat must penetrate all contaminated parts to be effective. Large biscuit tins are very useful, as they are easy to obtain reusable and are suitable for long-term storage to retain sterility after treatment. Sterilisation should be complete after the times and temperatures shown below. Temperature °C Time 120 8 hours 140 3 hours 160 1 hour 180 20 minutes Refer to chemical list for all substances marked with an asterisk (*). CABI Training Course on Plant Pathology Techniques 5.4 MEDIA FOR ISOLATION AND CULTURE OF MICROFUNGI Copper sulphate gelatine Used for sealing bottles and tubes.. Copper sulphate* 5g Gelatine 25g Distilled water 250ml Boil water, add gelatine and copper sulphate and stir well. When gelatine has dissolved dispense into bottles. Sterilising is not required. When gel is required for use, melt by standing in a saucepan of boiling water, dispense into a Petri dish. Do not leave too long in the boiling water as excessive heat hydrolyses the gelatine and it will not set when cool. If laboratory temperatures are high, store in refrigerator to prevent liquefaction. Corn Meal Agar (CMA) Maize 30g Agar 20g Distilled water 1000ml Boil maize in 200ml distilled water for 1h, stirring occasionally. Filter through muslin bag; make up to 1000ml. Add agar and dissolve. Autoclave 120ºC for 20min. Ready prepared corn meal agar powder is also available commercially. Limabean Agar (LBA) Lima beans (butter beans) 100g Agar 10g Soak beans overnight in 500ml distilled water. Steam for 30 min, then strain beans and retain liquor. Add agar to 500ml distilled water and dissolve. Add bean liquor and make up to 1000ml. Autoclave at 120°C for 20 min. Ready prepared lima bean agar powder is also available commercially. Nutr ient Agar (NA) Beef extract 3g Bacteriological peptone or gelysate pancreatic digest of gelatine 5g Agar 15g Distilled water 1000ml Mix and dissolve ingredients, dispense into bottles, autoclave 121ºC for 15min. Oxoid and Difco both produce readily available commercial formulations of nutrient agar. There are differences between the two formulations, and it is advisable to consult the relevant literature to ensure that the medium is suitable for the organisms being cultured. CABI Training Course on Plant Pathology Techniques Oat Agar (OA) Powdered oatmeal 30g Agar 20g Distilled water 1000ml Boil oatmeal in 200ml distilled water for 1hr, stirring occasionally. Squeeze through a muslin bag and make up to 1000ml. Add agar and dissolve. Autoclave at 120°C for 20 min. Potato Carrot Agar (PCA) Washed, peeled, grated potato 20g Washed, peeled, grated carrot 20g Agar 20g Tap water 1000ml Boil vegetables for 1hr in the tap water, strain through a fine sieve and push through muslin. Add agar and dissolve. Autoclave at 115ºC for 20min. Similar vegetable or cereal decoction agars can be made from locally available commodities using equivalent concentrations of ingredients to those used above. If a weak vegetable decoction medium such as PCA is not available, commercial potato dextrose agar can be modified so that the sugar content is reduced to a minimum and can therefore be used as a substitute. For example to make 25% strength PDA use the quantity of PDA powder recommended but add an extra 75% of the quantity of the equivalent brand of plain agar used for making water agar, i.e.: 25% strength Potato Dextrose Agar Potato dextrose agar powder 9g Plain agar 11.25g Distilled water 1000ml Dissolve and sterilise as original instructions. Media for culture and identification of Fusarium species SNA is suitable for good spore production without encouraging excessive mycelial growth. PSA is suitable for expression of pigment production in Fusarium, this can be an important diagnostic character within some species. These media are exclusively used at CABI Bioscience and predominate within the ‘fusarium working community’ as the preferred media for identification and subsequent culturing. Spezieller -Nährstoffarmer Agar (SNA) Potassium di- hydrogen phosphate (KH2PO4) 1.0g Potassium nitrate (KNO3) 1.0g Magnesium sulphate (MgSO4.7H2O) 0.5g Potassium chloride (KCl) 0.5g Glucose (Analar) 0.2g Sucrose (Analar) 0.2g Oxoid Agar no. 3 20.2g Distilled water 1000ml Dissolve all ingredients except agar in the distilled water, adjust pH to 6 - 6.5. Add agar and dissolve. Autoclave 121°C for 15 minutes. Strips of filter paper (approximately 1cm2) sterilised by autoclaving or by dry heat CABI Training Course on Plant Pathology Techniques (oven) can be aseptically placed onto the agar surface when set. The addition of filter paper aids sporulation with some species. Potato Sucrose Agar (PSA) Sucrose 20gm Agar 20gm Distilled water 500ml Potato water 500ml Dissolve sucrose and agar, dispense and autoclave 121ºC for 20min. If necessary adjust pH to 6.5 with Calcium carbonate before sterilising. Potato water: Peel and dice 1800gm of potatoes. Suspend in a double cheesecloth bag and boil in 4500mls of water until potatoes are almost cooked. Discard potatoes. Tap Water Agar (TWA) Agar 150g Tap water 1000ml Dissolve agar in water, dispense into bottles. Autoclave at 120ºC for 15 min. CABI Training Course on Plant Pathology Techniques 5.5 MODIFICATIONS TO CULTURE MEDIA TO INDUCE SPORULATION Sporulation of fungi is essential for their identification and is also needed for the production of inoculum, e.g. for pathogenicity tests. Sporulation is greatly affected by the environment in which the fungus is growing. For the majority of fungi, spore production is the main method of reproduction and dispersal in their natural habitat; consequently 'unnatural' environments such as nutrient-rich agar media and warm dark incubators are not optimal for sporulation of plant pathogenic fungi. The following procedures may induce sporulation of vegetative mycelium. use media such as PCA (potato carrot agar) or OA, or similar vegetable decoction with no added sugars add: sterilised filter paper or a similar source of cellulose-containing material (i.e. wheat straw), these may work best when added to molten TWA small pieces of host leaf material sterilised by steaming for 0.5 h or autoclave at 107°C for 5min incubation in daylight or with additional near UV irradiation diurnal temperature fluctuations particularly cool nights Induction of Sporulation by Near UV L ight Some fungi require irradiation by near UV light (‘black’ light) for production of sporulating structures. The fungi are grown in plastic Petri dishes or plastic universal bottles for 3-4 days before irradiation (Pyrex glass is not permeable to near UV). The edges of the dishes are sealed with adhesive PVC tape to prevent rapid drying and mite infestation. Fungi are best grown on weak vegetable decoction media such as PCA or OA prior to stimulation under the near UV. Mites check cultures regularly, depending on growth rate, for sporulation and equally important for any possible infestation. The illuminators comprise three 1.22m fluorescent lamps 130mm apart. A black light tube (Phillips TL 40 W/08) is held in the centre and cool white tubes (Phillips MCFE 40W/33) are supported on each side. The lamps are controlled by a time switch that gives a 12hr on/off cycle. The Petri dishes or bottles are supported on a shelf 320 mm below the light source and are illuminated until sporulation is induced. Care must be exercised when placing and removing cultures from the UV unit. Do not look at the light as it can damage the eyes. A screen must shield the illuminated tubes so that the light does not shine onto the bodies of personnel working in the room. CABI Training Course on Plant Pathology Techniques 5.6 SELECTIVE MEDIA FOR MICROFUNGI Some fungi are difficult to isolate using conventional methods because they may be slow growing, poor saprophytic competitors and easily overgrown by other fungi or bacteria on the isolation plate. Where disease samples are not freshly collected or the lesions are old, isolation of some fungi may be particularly difficult. Antibiotics and fungicides have been used by researchers in developing selective media for isolating particular fungi such as Pythium and Phytophthora species and for preventing overgrowth of bacteria. Antibiotics Antibiotics should always be kept in a refrigerator; stock solutions are prepared for use in agar media and may be sterilised by passing through a bacterial filter (e.g. Millipore) although this is not usually necessary if aseptic techniques are employed during stock preparation. Chloramphenicol (Chloromycetin) Used at about 200ppm. Stock solution prepared in 95% alcohol and can be added to media before autoclaving, Active against gram +ve and gram -ve bacteria, but also tends to inhibit Pythium and some Phytophthora species. Penicillin G Used at 50-500ppm. Stock solution: 1g dissolved in 100ml of sterile distilled water (1%). Addition of 1ml of stock solution to 100ml of medium gives 100ppm. Add to media after autoclaving. Active against gram +ve bacteria. May be used as a mixture with streptomycin sulphate Polymixin B sulphate Used at 50-100ppm. Stock solution: 0.5g in 100ml distilled water (0.5%). Addition of 1ml of stock solution to 100ml of medium gives a final concentration of 50ppm. Add to media after autoclaving. Active against gram -ve bacteria. Pimaricin, Nystatin (polyene antibiotics) Antifungal antibiotics which do not effect Pythium and Phytophthora species. Used at 10-100ppm and added after autoclaving. Stock suspension: 4ml of 2.5% trade suspension in 10ml of sterile distilled water (1%). Addition of 0.1ml of this solution to 100ml of medium gives a final concentration of 10ppm. Usually combined with a broad-spectrum antibacterial, e.g. Vancomycin. Streptomycin sulphate Used at about 200ppm. Add to media after autoclaving. Stock solution: 1g dissolved in 100ml of sterile distilled water to give a 1% solution. Addition of 1ml of stock solution to 100ml of medium gives final concentration of 100ppm. Broad-spectrum antibacterial but may also inhibit Pythium and some Phytophthora species. May be used as a mixture with penicillin. Tetracycline antibiotics Used at about 200ppm. Add after autoclaving. Broad-spectrum antibacterial but inhibits some fungi. Vancomycin Broad-spectrum antibacterial with little effect on fungi. Used at 100ppm and added CABI Training Course on Plant Pathology Techniques after autoclaving. Stock solution: 2g in 100ml of distilled water. Addition of 1ml of stock solution to 100ml of medium gives a final concentration of 200ppm. A more recent substitute for penicillin (active against gram +ve bacteria) and Polymixin B sulphate (active against gram -ve bacteria) in selective media. Rose Bengal A stain which is effective against many bacteria and reduces rate of spread of fast growing fungi. Used at about 50ppm and can be added before autoclaving. Selective Fungicides Pentachloronitrobenzene (PCNB-quitozene) A fungicide with little effect against Pythium, Phytophthora and Fusarium species at low dilutions. Used at about 100ppm and added before autoclaving. Will also reduce colony growth of bacteria. Methyl benzimidazole carbamate (MBC) (benomyl) Can be used at 10-25ppm in selective media for Oomycota and Basidiomycota. Benomyl stock suspension; 1g of commercial preparation (Benlate 50wp) in 500ml of distilled water (0.1%); autoclave 10lbs for 5 min. Use 2.5ml of stock suspension to 100ml of medium to give 25ppm. This and other fungicides can be used in media to isolate strains of fungi which are tolerant of (resistant to) the particular fungicide. Cupric sulphate Can be used at up to 5% in selective media for Dematiaceous fungi. Added after autoclaving as cupric sulphate denatures the setting power of the agar if autoclaved together. Ethanol Used at 0.5-2% in selective media for Verticillium species and Basidiomycota. Added after autoclaving. Phytophthora Isolation Media Antibiotics should be added to 'hand-hot' media, excessive heat denatures most antibiotics. OA, Cornmeal Agar or Limabean Agar is suitable as base media. 3P Medium -quantities of stock solutions to add to 100ml of base medium 1.0ml Pimaricin = 100ppm 1.0ml Polymixin = 50ppm 0.5ml Penicillin G = 50ppm VP Medium -quantities of stock solution to add to 100ml base medium 1.0ml Vancomycin = 20 ppm 0.1ml Pimaricin = 10ppm BSPP Medium -quantities to add to 100ml of base medium 2.5ml Benomyl = 25ppm 0.5ml Streptomycin = 50ppm 1.0ml Polymixin = 50ppm 0.6ml Penicillin G = 60ppm Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 16 BACTERIAS FITOPATÓGENAS Las bacterias son microorganismos procariotas que pertenecen al Reino Bacteria, son omnipresentes y la mayoría saprófitas. En el ambiente tienen un papel muy importante en la descomposición de la materia orgánica y en el reciclaje de nutrientes en la biosfera. Otras, viven en el filoplano así como en la rizosfera; algunas establecen una asociación simbiótica en raíces de plantas leguminosas, mientras que un poco más de 100 especies son patógenos a plantas cultivadas. Además de las bacterias, existen otros procariotas fitopatógenos, como los fitoplasmas y espiroplasmas, estos son biotrófos obligados que carecen de pared celular, están limitados al floema y generalmente son trasmitidos por saltahojas. Debido a estas características no serán estudiados en esta práctica. Por otro lado, las bacterias poseen paredes celulares bastantes rígidas, que les permite adoptar diferentes formas (coco, bacilo, vibrio, espirilo y espiroqueta). Además de su forma poseen diferencias estructurales en la pared, que permite separarlas en dos grandes grupos por medio de la tinción de Gram, positivas (G+) o negativas (G-). Así, la mayoría de bacterias fitopatógenas son bacilos Gram negativos, aunque también hay algunos cocos G+ que pueden afectar las plantas. Muchas poseen flagelos y son capaces de desplazarse, otras carecen de él y por lo tanto son estáticas, pero a pesar de esto, pueden mostrar un movimiento sobre su propio eje denominado movimiento “browniano”. Se reproducen por fisión, por lo que se alcanzan grandes poblaciones en poco tiempo. Los síntomas provocados por bacterias pueden ser iguales a los causados por hongos o nematodos, inclusive pueden ser confundidos con enfermedades virales cuando se trata de enfermedades causadas por bacterias fastidiosas (limitadas por el floema). Las bacterias pueden ser diseminadas por agua (escorrentía o salpique), movimiento de suelo o material de siembra, así como por vectores, trabajadores e instrumentos; raras veces por viento. Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 17 Pueden sobrevivir y ser transmitidas vía semilla por lo que el uso de semilla certificada es una estrategia de manejo muy útil. Las bacterias fitopatógenas pueden causar diversos síntomas, desde lesiones muy secas hasta pudriciones acuosas acompañadas de olores fuertes o desagradables. No se deben asociar las pudriciones húmedas a causas bacterianas en todos los casos. Aunque, en algunas veces se notan lesiones con bordes más húmedos que las producidas por hongos, estos también son capaces de producir enzimas pectolíticas que provocan maceración de tejidos y síntomas similares. Síntomas Entre los síntomas más comunes están: 13. Manchas foliares y en frutos 14. Tizones 15. Pudriciones suaves 16. Marchitez 17. Sarna 18. Chancros 19. Agallas 20. Sobre crecimiento (fasciación) 21. Necrosis de venas Signos La aparición de signos en enfermedades bacterianas no es frecuente. En plantas muy infectadas, las poblaciones bacterianas en hojas o lesiones pueden alcanzar hasta 109 UFC/gramo de tejido vegetal, en estos casos pueden verse salir masas de colonias denominadas zoogleas. Métodos sencillos de detección Una forma simple de determinar si una enfermedad es causada por una bacteria es por medio de la observación de la zooglea, aunque, como se mencionó antes, no siempre está presente. Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 18 Para una determinación más precisa a partir de plantas con síntomas se pueden realizar aislamientos en medios nutritivos líquidos y/o sólidos para recuperar la bacteria asociada, una vez purificada se le realiza la Tinción de Gram para determinar su morfología. Existen diferentes medios de cultivo sólidos, algunos de ellos se conocen como ricos, pues permiten el crecimiento de un gran número de especies, otros favorecen el crecimiento de unos e inhibe el de otros, son los medios selectivos. A otros medios se les incorpora una sustancia usada por el microorganismo de interés y un indicador apropiado que permita evidenciar su utilización, a éstos se les conoce como diferenciales. Una vez realizado el aislamiento, se debe separar cada cepa bacteriana por medio de la técnica de aislamiento por rayado, el cual permite separar colonias individuales en la zona de más dilución, permitiendo así la observación de la morfología colonial. De esta forma se puede trabajar cada colonia o cepa individualmente, es posible obtener entre 30 y 50 colonias separadas. A partir de cultivos individuales y jóvenes (para algunas bacterias se requieren solo de 24 horas; mientras que otras tardan hasta 5-7 días), se puede iniciar la identificación; primero se realiza una descripción de la morfología de la colonia, luego se procede a realizar la tinción de Gram y finalmente una batería de pruebas bioquímicas y moleculares. Esta tinción es diferencial y se basa en las diferencias estructurales de las paredes de las células bacterianas. El fundamento de la tinción es la formación de un complejo insoluble cristal-violeta y yodo, el cual al ser expuesto al alcohol es extraído en el caso de las G (-) pero permanece en la pared celular de las bacterias G (+). Así, al finalizar el procedimiento las bacterias Gram (+) aparecen de color morado; mientras que las Gram (-) de color rojo. Esto es posible ya que, las paredes de las bacterias Gram (-) están constituidas solo de alrededor de 10% de peptidoglicano; mientras que, en las Gram (+) hay alrededor de 90% de este polisacárido. Una vez determinado el tipo de pared de la bacteria, se procede a realizar pruebas bioquímicas, ya sea individualmente o mediante sistemas miniaturizados que Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 19 involucran desde 20 hasta 96 pruebas, las cuales se montan a partir de suspensiones bacterianas y se incuban un determinado periodo de tiempo, posteriormente se comparan los resultados con una base de datos que permite determinar el género y la especie bacteriana. Observación de zooglea 1) De tallo: i) Corte un trozo de tallo con síntomas bacterianos. ii) Sumerja una parte en un recipiente con agua. iii) Anote sus observaciones. 2) De follaje: i) Corte una sección de la zona de avance de la lesión. ii) Colóquelo en una gota de agua en un portaobjetos. iii) Observe en un aumento de 400-1000x. iv) Anote sus observaciones. Tinción de Gram 1) Preparar un extendido de los cultivos y fijarlo a la llama. 2) Cubrir con cristal violeta por un minuto. 3) Lavar con agua de tubo y agregar lugol y dejarla en reposo durante dos minutos. 4) Lavar con agua, escurrir y decolorar con alcohol acetona; lavar inmediatamente con agua, repetir hasta que casi no se libere cristal violeta. 5) Escurrir el exceso de agua y aplicar safranina por un minuto. Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 20 6) Lavar con agua, escurrir, dejar secar y observar al microscopio. Se debe usar el objetivo de inmersión (100X), por lo tanto, debe utilizar una gota de aceite de inmersión, y posteriormente debe limpiarlo para que no se deteriore. Figura 6. Esquema Tinción de Gram. Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 21 MATERIAL COMPLEMENTARIO 3 Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 22 CABI Training Course on Plant Pathology Techniques 5.8 BACTERIOLOGICAL MEDIA AND METHODS General Methods for Culture Inoculation When the source of inocula is an agar culture, or a small volume of a liquid suspension, a loop or straight wire should be used. These are sterilised by holding vertically in a Bunsen flame, ensuring that the length of wire goes red-hot. Before use, cool the wire, either by stabbing into an uninoculated area of agar, or holding for a minute or two in air. When cool remove a part of a well-separated colony or a loopful of suspension and inoculate. When inoculating onto a surface such as an agar plate or an agar slant a loop should be used, alternately the straight wire can be used to stab the inocula into the medium. To "plate out" a bacterial culture for single colonies a primary swab is made onto the agar surface at the edge of the plate. The plate is rotated 45° and 3-4 parallel streaks are made from the outside of the plate in, the plate is rotated a further 45° and the process repeated. Ensure the final streaks do not touch the primary swab. It is generally not necessary to flame the loop at each rotation, however, this may be required if single colonies are not recovered with the first attempt. In certain cases, the inocula may need to be diluted prior to test inoculation. This is achieved by suspending a loopful of culture in sterile distilled water. The suspension should be just-visibly-cloudy. A loopful of the suspension can then be used to inoculate the test. General Isolation and Maintenance Media Nutr ient Agar (NA) The constituents of this medium can be purchased singly or premixed, i.e., Oxoid; CM3 or Difco; Bacto NA. Lab-Lemco Powder (Oxoid; L29) 1.0g Yeast extract (Oxoid; L21) 2.0g Peptone Bacteriological (Oxoid; L34) 5.0g NaCl 5.0g Agar No 3 (Oxoid; L13) 15.0g Distilled H2O 1000ml pH 7.2-7.4 Suspend 28g of CM3, or the above ingredients mixed, in 1 litre of distilled water. Heat to dissolve and autoclave at 121°C for 15 minutes. It maybe convenient to dispense the melted and mixed medium into small medical flats in approximately 50ml quantities before autoclaving. Each flat pours two plates. For slopes dispense about 12-15ml of melted mixed medium into each Universal bottle, autoclave and rest bottles at an angle during cooling. Always screw down slopes after cooling. Note: most plant pathogenic bacteria prefer a neutral or slightly alkaline pH and will grow sufficiently well on this medium. The following organisms do not grow on nutrient agar; or make unsatisfactory growth: sugar cane pathogens, Xanthomonas albilineans, Xanthomonas populi", some Clavibacter spp., Erwinia spp. some of the E. amylovora group. For these organisms one or more of the following media should be tried: GP, YDC, SNA or KB. Glucose Peptone Agar (GP) Peptone Bacteriological (Oxoid; L34) 5.0g Glucose 20.0g CABI Training Course on Plant Pathology Techniques K2HPO4 (anhydrous) 0.5g MgSO4.7H2O 0.25g Agar No 3 (Oxoid; L13) 15.0g Distilled H2O 1000ml pH 7.2-7.4 Suspend ingredients in water, heat to dissolve, dispense into bottles and sterilise at 121°C for 15 minutes. If pH adjustment is required use KOH (40%, w/v). Note: Suitable for the growth of Xanthomonas albi lineans has also been used successfully to grow Xanthomonas populi , although a more specialised media is recommended. Yeast Dextrose Chalk Agar (YDC) Yeast extract (Oxoid; L21) 10.0g D-Glucose 20.0g CaCO3 20.0g Agar No 3 (Oxoid; L13) 12.0g Distilled H2O 1000ml pH 7.2 Mix all the ingredients except the calcium carbonate and heat to dissolve. Add the calcium carbonate and adjust pH to 7.2, if required. Autoclave at 121°C for 15 minutes. Mix well before pouring plates. Note: Suitable for maintenance and isolation of Xanthomonas spp. Calcium carbonate buffers the medium and ensures the pH does not become acidic. Xanthomonas spp. are not tolerant of acid pH. Lelliott, R.A. & Stead, D.E. (1987). In: Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. p. 183. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Nutr ient Dextrose Agar (NDA) Nutrient agar (Oxoid; CM3) 28.0g D-Glucose 10.0g Distilled H2O 1000ml pH 7.2 Suspend ingredients, heat to dissolve, dispense into bottles and sterilise at 121°C for 15 minutes. Note: good for the isolation of Agrobacterium tumefaciens, Rhodococcus spp., some Clavibacter spp. and some non-soft-rotting species of the genus Erwinia. Sucrose Nutr ient Agar (SNA) or Levan medium (LEV) Nutrient agar (Oxoid; CM3) 28.0g Sucrose 50.0g Distilled H2O 1000ml pH 7.2 Suspend ingredients in distilled water, heat to dissolve, dispense and sterilise at 121°C for 15 minutes. Note: Suitable for green-fluorescent pseudomonads and Erwinia amylovora CABI Training Course on Plant Pathology Techniques King's Medium B (KB) Proteose peptone 20.0g (Difco No.3/ Oxoid; L46) Glycerol 10.0g K2HP04 (anhydrous) 1.5g MgSO4.7H2O 1.5g Agar 15.0g Distilled H2O 1000ml pH 7.2 Suspend ingredients, heat to dissolve, dispense into bottles and sterilise at 121°C for 15 minutes. Note: good for fluorescent pseudomonads and Erwinia spp. King, E.O., Ward, M.K. & Raney, D.E. (1954). Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 44, 301-307. Media and Methods Used to Character ise Plant Pathogenic Bacter ia Alternative Methods for the Determination of Fluorescent Pigment Production Pseudomonas Agar F (PsF) Bacto tryptone (Difco) 10g Bacto Proteose peptone (Difco) 10g K2HPO4 (anhydrous) 1.5g MgSO4.7H2O 1.5g Agar 15 g Distilled H2O 1000ml pH 7.0 Suspend 38g of the medium (Difco; 0448-01), or the constituents, in 1 litre of distilled water and add 10g glycerol. Dissolve completely, dispensed and autoclave at 121°C for 15 minutes. Note: This medium is a pre-mixed equivalent of KB Medium and can be used as an alternative, for the Determination of fluorescent pigment production. When checking for fluorescence it is important to use ultraviolet light as some non-fluorescent species of Pseudomonas may produce yellowish diffusible pigments which should not be confused with fluorescence. This can be misleading when viewed only in ordinary light, but the difference is plain when UV is used. Nutr itional Tests Oxidation and Fermentation of Carbohydrates –the O/F tests (NH4)H2PO4 1.0g KCl 0.2g MgSO4.7H2O 0.2g Peptone Bacteriological (Oxoid; L34) 1.0g Bromothymol Blue 0.03g Agar No. 3 (Oxoid; L13) 3.0g Distilled H2O 1000ml pH 7.0-7.2 CABI Training Course on Plant Pathology Techniques Suspend ingredients, with the exception of the Bromothymol Blue and the agar, in water and, if required, adjust pH to 7-7.2 with NaOH (40% aq., w/v). Add the agar and indicator, heat to dissolve, dispense aliquots (45ml) into medical flats and sterilise at 121°C for 15 minutes. The final colour of the medium should be green to green-blue. Aliquots (5ml) of 10% solutions (w/v) of each carbohydrate are added to the cooled (ca. 50°C), molten, basal medium immediately before dispensing into test tubes. The letters in parentheses are the codes used: Glucose (Glc), mannitol (Man), sorbitol (Sor), cellobiose (Cel), sucrose (Suc), lactose (Lac), fructose (Fru), arabinose (Ara), galactose (Gal), maltose (Mal), raffinose (Raf), glycerol (Gly), and trehalose (Tre). The first three may be heat sterilised, but the remainder should always be filter sterilised. Dulcitol (Dul) and salicin (Sal) are only sparingly soluble, but may be added to the medium at a final concentration of 1% (w/v) prior sterilisation. Â-methyl-D-glucoside (ÂMG), meso-inositol (Min) and inulin (Inu) are sparingly soluble and heat labile. They are prepared as 10ml lots of 2% (w/v) solutions, filter sterilised and added to 10ml portions of double strength basal medium. Filter Ster ilisation: can be performed using a membrane filter with a 0.45µm or a 0.2µm pore size. These can be purchased as prepacked disposable units or self- assembled and autoclaved. Ensure that the carbohydrate has dissolved, fill a hypodermic syringe with the solution and attach the syringe to the filtration unit. Place over an opened sterile Universal bottle and apply an even pressure to the plunger of the syringe, throughout. To check that the membrane was intact during filtration, pull back on the syringe plunger, if there is no resistance the membrane has been perforated, and the exercise should be repeated. Inoculation and Incubation: Using a cooled sterile straight wire, remove a part of a single, well-separated colony from an agar culture and stab inoculate to the base of the tube. Keep back uninoculated tubes as controls. If anaerobic conditions are required add 1-2cm of sterile mineral oil into the tubes. Incubate at 28°C for up to 3 weeks. Note: This test can be used to determine the ability of an organism to produce acid and gas from a variety of carbohydrates, sugar alcohols and similar compounds. It also determines whether the organism is obligately aerobic or facultatively anaerobic. The test is very useful for diagnostic purposes, but many different methods have been used and this must be taken into account when comparisons of published results are made. Production of acid is determined by the colour change of Bromothymol Blue from blue to yellow as acidification proceeds. Control tubes should be examined to ensure a colour change has occurred. If gas is produced bubbles may be observed in the semi- solid medium. In the case of negative results ensure that some slight growth has taken place. This should be sufficient to indicate that the inoculum was alive. This may be very slight, especially with the anaerobic tube. Records are taken at 1, 3, 7, 14 and 21 days, when production of acid (yellow colour), gas (bubbles) and reduction of dye (loss of colour) are noted. Hayward, A.C. (1964). Journal of Applied Bacteriology, 27, 265-277. COLECTA DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS FITOPATOLÓGICO Actualización en fitopatología § § v Tome varias plantas del área afectada con diferentes grados de avance de la enfermedad. v Lo más recomendable es que se tome la planta entera (incluyendo la mayor cantidad de raíces posible). v Rotule cada planta, trate de anotar la mayor cantidad de información posible: síntoma de interés, género, sp., edad, ddt, tipo de sustrato. v Envuélvala en papel SECO, póngala en una bolsa DE PAPEL PREFERIBLEMENTE, sino en una plástica y en una hielera preferiblemente. v Envíela cuanto antes al laboratorio o manténgala en refrigeración. ¿Cómo recolectar una muestra adecuadamente? Información importante en las muestras Fecha de aparición de los síntomas Distribución de síntomas, velocidad de avance Agroquímicos aplicados en los últimos 7 días Tipo y frecuencia de riego, intemperie, invernadero, Vegetación acompañante, etc. Síntoma de la enfermedad Paisaje Síntomas en la plantación § Monitoreo § Estudios epidemiológicos § ¿Como se realiza? ¿Para qué se realiza la toma de muestras? Muestreo aleatorio Muestreo estratificado Muestreo sistemático (W, Z, I) Muestreo por conglomerados No es solamente identificar un agente patógeno. Es determinar la causa y la interacción de factores que hacen que un sistema productivo limite su desarrollo y establecer recomendaciones de manejo integrales. 1. Observe en detalle: partes afectadas, tipos de síntomas, cambios de color, forma, crecimiento, signos de insectos, ácaros, algo anormal. 2. Observe la planta completa: parte aérea y radical, fenología, severidad, órgano afectado. 3. Observe grupos de plantas: distribución en la plantación, incidencia, variedades. 4. Hable con productores, encargados y técnicos: cuándo apareció el problema, con qué velocidad, en qué variedades, cuánta pérdida. Visitas de campo Distribución espacial de la enfermedad Diagnóstico Prólogo Bienvenidos al Taller “Principios básicos de diagnóstico fitopatológico” Este taller fue creado para acercar al participante a los conceptos básicos necesarios para entender la importancia de un adecuado diagnóstico, tomando en consideración aspectos desde el historial de campo y los principales síntomas relacionados tanto a enfermedades bióticas como abióticas, hasta las técnicas más comúnmente usadas en los laboratorios de diagnóstico fitopatológico. El taller pretende ayudar a que el participante mejore sus habilidades en el reconocimiento de síntomas causados por factores no infecciosos, así como por hongos y bacterias. No es necesario que el participante tenga conocimientos previos de fitopatología, pero sí que esté familiarizado con el área agrícola y sobretodo que esté dispuesto a aprender durante la actividad. Se realizarán una serie de prácticas de laboratorio sencillas que permitan el acercamiento con las técnicas de diagnóstico convencionales básicas. El presente documento se muestra como un primer intento de recopilar información útil para diagnóstico básico, como una guía en la búsqueda de información que cada uno de ustedes deberá profundizar de acuerdo a sus necesidades. Espero disfruten del taller! Yo lo haré! Dra. María del Milagro Granados Montero Facilitadora maria.granadosmontero@ucr.ac.cr Principios básicos de diagnóstico fitopatológico | Milagro Granados Proyecto ED-3084 1 Tabla de contenido TIPOS DE ENFERMEDADES ............................................................................................................. 2 SÍNTOMAS Y SIGNOS DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS ...................................................................... 5 Síntomas localizados ......................................................................................................... 6 Síntomas sistémicos........................................................................................................... 7 SIGNOS ................................................................................................................................ 7 Tipos de signo .................................................................................................................. 8 MATERIAL COMPLEMENTARIO 1 ............................................................................................ 9 MATERIAL COMPLEMENTARIO 2 –ENFERMEDADES ABIÓTICAS ......................................... 10 HONGOS FITOPATÓGENOS .......................................................................................................... 11 Protocolo para el procesamiento de muestras vegetales con síntomas causados por hongos. .............................................................................................................................. 14 MATERIAL COMPLEMENTARIO 3 .......................................................................................... 15 BACTERIAS FITOPATÓGENAS........................................................................................................ 16 Métodos sencillos de detección ...................................................................................... 17 MATERIAL COMPLEMENTARIO 3 .......................................................................................... 21 MATERIAL COMPLEMENTARIO 4 .......................................................................................... 45