UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO EXPRESIÓN DE GENES QUE CODIFICAN POR PROTEÍNAS PROINFLAMATORIAS Y DE RESOLUCIÓN DE LA INFLAMACIÓN EN CASOS DE PERIODONTITIS Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología para optar al grado y título de Maestría Académica en Inmunología ALBERTO VEGA CHIN Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2022 Dedicatoria y agradecimientos: Este trabajo final de graduación se lo dedico a mi madre, Rebeca Chin Valderrama, que me mantuvo con vida en medio de la oscuridad. A Alejandro Odio Formoso, que me ha apoyado de mil maneras distintas a lo largo de estos años. A mi padre, Carlos Vega Antonini, cuya visión de vida es un faro que indica cuales pasos se pueden seguir y de qué manera. A Mónica Molina Corella, cuyas palabras han sido acertadas y generan un empujón adicional para no detenerme. A mi hermana, Rebeca Vega Chin, que no me ha dejado solo en ningún momento de nuestras vidas. Mi agradecimiento es para cada uno de los lectores. A la Dra. Gisella Rojas González le agradezco todo el cariño y sabiduría que me ha compartido, adicionalmente como me ha inculcado dar más por el crecimiento académico de la Facultad de Odontología de la Universidad de Costa Rica. Al Dr. Alfonso García Piñeres le agradezco su manera de ver la ciencia, y como me ha enseñado que la excelencia es difícil, pero se puede obtener estudiando todos los días. A la Dra. Sandra Silva de la Fuente le agradezco eternamente su confianza en mi cuando nadie más me conocía, todo lo que he logrado a lo largo de estos años ha sido gracias a ella. La única manera que voy a poder devolverles su apoyo y confianza es trabajando igual, y convertirme en un generador de oportunidades a otros estudiantes. ii “Esta Tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Inmunología ________________________________________________________ M.Sc. Norman Rojas Campos Representante de la Decana Sistema de Estudios de Posgrado ________________________________________________________ M.Sc. Sandra Silva de la Fuente Profesora Guía ________________________________________________________ PhD. Alfonso García Piñeres Lector ________________________________________________________ M.Sc. Gisella Rojas González Lectora ________________________________________________________ Dra. Tatiana Ramírez Mora Representante del Director Programa de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología ________________________________________________________ Alberto Vega Chin Sustentante iii Tabla de contenidos HOJA DE APROBACIÓN .......................................................................................................................... III RESUMEN .................................................................................................................................................... V SUMMARY ................................................................................................................................................. VI LISTA DE CUADROS ............................................................................................................................... VII LISTA DE TABLAS .................................................................................................................................. VIII LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................. IX LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................................................... X INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................................ 1 ENFERMEDADES PERIODONTALES ................................................................................................................ 1 DIAGNÓSTICO ............................................................................................................................................. 2 TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES ............................................................................. 4 PREVALENCIA ............................................................................................................................................. 5 RELACIÓN CON ENFERMEDADES SISTÉMICAS ............................................................................................... 6 INFLAMACIÓN E INMUNIDAD DE LAS MUCOSAS ............................................................................................ 6 ETIOLOGÍA, PATOGÉNESIS Y DESARROLLO DE LAS ENFERMEDADES PERIODONTALES .................................... 8 MEDIADORES MOLECULARES INMUNITARIOS ............................................................................................. 13 RECAPITULACIÓN ..................................................................................................................................... 31 DESARROLLO DEL TEMA..................................................................................................................... 31 JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................................... 31 PREGUNTA E HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 32 OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................................. 32 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................................ 33 MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................................................... 33 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS ..................................................................... 62 DISCUSIÓN ................................................................................................................................................ 83 CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 97 CRONOGRAMA........................................................................................................................................ 98 FUENTES DE FINANCIAMIENTO ......................................................................................................... 98 FACILIDADES .......................................................................................................................................... 98 CONDICIONES ÉTICAS .......................................................................................................................... 99 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................... 100 APÉNDICE ............................................................................................................................................... 133 ANEXOS ................................................................................................................................................... 140 iv RESUMEN La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica vinculada con biopelículas de la placa disbiótica y caracterizada por la destrucción progresiva del aparato de soporte dental. La biopelícula patogénica es un prerrequisito necesario de la periodontitis, pero no es suficiente para ocasionarla. La interacción compleja entre la biopelícula y la respuesta inmune inflamatoria lleva a la enfermedad. Se estima que un 80% del riesgo del daño tisular es debido a la respuesta inflamatoria. Se observan pacientes que reaccionan y ejecutan una respuesta inflamatoria destructiva mediante la biopelícula dental. La regulación alterada de moduladores inmunológicos, como las citoquinas, puede estimular o acelerar la periodontitis. Los niveles de reducción de la biopelícula, indispensables para recuperar la simbiosis, suelen ser distintos entre pacientes. La búsqueda de nuevos manejos terapéuticos integrales de las enfermedades periodontales beneficiaría a los pacientes, pero es necesario comprender los mecanismos del sistema inmune subyacentes de la enfermedad. Determinar el perfil de expresión de genes que codifican proteínas resolutivas de la inflamación tiene el potencial de ilustrar ciertos aspectos de estos mecanismos. Este proyecto de investigación evaluó el perfil de expresión de genes que codifican para proteínas involucradas con la periodontitis en muestras de tejido conectivo gingival provenientes de pacientes con periodontitis y de pacientes sin periodontitis. Además, determinó la asociación entre la expresión de genes que codifican proteínas involucradas con la periodontitis y la manifestación clínica de la enfermedad. El estudio se realizó en coordinación entre el Centro de Investigación de Biología Celular y Molecular (CIBCM) y la Clínica de Énfasis de Periodoncia de la Facultad de Odontología, ambas pertenecientes a la Universidad de Costa Rica (UCR). La población participante fueron pacientes tratados en la Clínica de Énfasis de Periodoncia de la Facultad de Odontología de la UCR entre el 25 de agosto del 2017 al 14 de febrero del 2020. Se tomaron muestras de tejido conectivo gingival de pacientes con periodontitis y de pacientes sin periodontitis. Se utilizó la técnica de una RT-qPCR y se cuantificaron los genes que codifican para las proteínas de interés: IL-1α, IL-1β, IL-17A, TNF-α, COX2, LTA, TLR2, TLR4, FPR1, CXCL8, TYRO3, AXL, MERTK, GAS6, PROS1, ANXA1, FPR2, IL-10, TGFBR1, IgG1, IgG3, MMP2, MMP3, MMP9, MMP12, TIMP1 y tPA. No se observaron diferencias significativas. Sin embargo, al realzar una clasificación mediante regresión logística, los genes que codifican por las proteínas proinflamatorias IL-1α, IL-1β, TNF-α, COX-2, LTA, el receptor FPR1, la quimiocina CXCL8, los receptores TYRO3, AXL, MERTK y el ligando GAS6, ANXA1 y el receptor FPR2, el receptor TGFBR1, las inmunoglobulinas IgG1e IgG3, y las MMP-2, MMP12 y TIMP-1 logran tener una sensibilidad para poder predecir un caso de periodontitis de 88.46 %. Este trabajo abre la posibilidad de aplicar herramientas moleculares en la práctica profesional para la detección de casos de periodontitis. v SUMMARY Periodontitis is a chronic inflammatory disease associated with dysbiotic plaque biofilms and characterized by progressive destruction of the dental support apparatus. Pathogenic biofilm is a prerequisite for periodontitis, but it is not sufficient to cause it. The complex interaction between the biofilm and the inflammatory immune response leads to disease. It is estimated that 80% of the risk of tissue damage is due to the inflammatory response. Patients generating a destructive inflammatory response to dental biofilm have been reported. Altered regulation of immune modulators, such as cytokines, can stimulate or accelerate periodontitis. The levels of biofilm reduction, essential to recover the symbiosis, are usually different between patients. A new comprehensive therapeutic management of periodontal diseases would benefit patients, but it is necessary to understand the immune mechanisms underlying the disease. Determining the genes profile expression of inflammation resolving proteins has the potential to elucidate certain aspects of these mechanisms. In this project, we evaluated the expression profile of genes encoding proteins associated with periodontitis in gingival connective tissue samples from patients with or without periodontitis. In addition, we determined the association between the expression level periodontitis associated proteins with periodontitis and the clinical manifestation of disease. The study was carried out in coordination between the Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM, by its acronym in Spanish) and the Clínica de Énfasis of the Facultad de Odontología, both belonging to the Universidad de Costa Rica (UCR). Participants were patients treated at the the Clínica de Énfasis of the Facultad de Odontología of the Facultad de Odontología of the UCR between August 25, 2017, and February 14, 2020. Gingival connective tissue samples were taken from patients with or without periodontitis. RT-qPCR was performed and the genes encoding the proteins of interest IL-1α, IL-1β, IL-17A, TNF-α, COX2, LTA, TLR2, TLR4, FPR1, CXCL8, TYRO3, AXL, MERTK, GAS6, PROS1, ANXA1, FPR2, IL-10, TGFBR1, IgG1, IgG3, MMP2, MMP3, MMP9, MMP12, TIMP1, and tPA were analyzed. No significant results were detected. However, patients were classified using logistic regression. The genes encoding the proinflammatory proteins IL-1α, IL-1β, TNF-α, LTA, COX-2, the FPR1 receptor, the chemokine CXCL8, the TAM receptors and the GAS6 ligand, ANXA1 and the FPR2 receptor, the receptor TGFBR1, IgG1 and IgG3 immunoglobulins, and MMP-2, MMP12 and TIMP-1 have an 88,46 % sensitivity to predict a periodontitis case. This work opens the possibility to apply molecular tools in the professional practice in the detection of periodontitis. vi Lista de cuadros Cuadro I. ________________________________________________________________página 39 Cuadro II. ________________________________________________________________página 43 Cuadro III. _______________________________________________________________página 44 Cuadro IV. _______________________________________________________________ página 45 Cuadro V. ________________________________________________________________página 62 Cuadro VI. _______________________________________________________________página 63 Cuadro VII. _______________________________________________________________página 63 Cuadro VIII. ______________________________________________________________página 64 Cuadro IX. _______________________________________________________________página 66 Cuadro X. ________________________________________________________________página 72 Cuadro XI. _______________________________________________________________página 80 Cuadro XII. _______________________________________________________________página 81 Cuadro XXII_______________________________________________________________página 83 vii Lista de tablas Tabla 1. __________________________________________________________página 69 Tabla 2. __________________________________________________________página 74 Tabla 3. __________________________________________________________página 76 Tabla 4. __________________________________________________________página 98 viii Lista de figuras Figura 1. __________________________________________________________página 1 Figura 2. __________________________________________________________página 3 Figura 3. __________________________________________________________página 5 Figura 4. __________________________________________________________página 78 Figura 5. __________________________________________________________página 82 ix Lista de abreviaturas Nivel de inserción clínico ________________________________________________CAL Sangrado al sondaje _____________________________________________________BOP Unión amelo-cemento___________________________________________________UAC Índice Periodontal Comunitario de Necesidades de Tratamiento ________________CPITN Caja Costarricense del Seguro Social _____________________________________CCSS Receptores tipo Toll ____________________________________________________TLRs Inmunoglobulina _________________________________________________________Ig Lámina propia __________________________________________________________LP Tejido linfoide asociado a mucosas ______________________________________MALT Líquido crevicular gingival _______________________________________________GCF Polimicrobiana sinérgica y disbiótica ______________________________________PSD Neutrófilos polimorfonucleares __________________________________________PMNs Ácido desoxirribonucleico _______________________________________________ADN Interleucina _____________________________________________________________IL Quimiocina motivo C-X-C ligando ______________________________________CXCL Quimiocina motivo C-C ligando ___________________________________________CCL Metaloproteinasas de matriz _____________________________________________MMPs Receptor activador del factor nuclear κ β ligando __________________________RANKL Osteoprotegerina _______________________________________________________OPG Receptor activador del factor nuclear κ β __________________________________RANK Factor de necrosis tumoral ________________________________________________TNF x Células presentadoras de antígenos ________________________________________APCs Células T cooperadoras ____________________________________________________TH Receptores de reconocimiento de patrones ___________________________________PRR Prostaglandina E2 ______________________________________________________PGE2 Patrones moleculares asociados a patógenos _______________________________PAMPs Lipopolisacáridos _______________________________________________________LPS Patrones moleculares asociados a daño ___________________________________DAMPs Diferenciación mieloide factor-88 ________________________________________Myd88 Quinasas asociadas a IL-1R ____________________________________________IRAKs Receptor del factor de necrosis tumoral asociado al factor 6 ___________________TRAF6 Factor nuclear-κβ _____________________________________________________NF-κβ Proteína activadora-1 ___________________________________________________AP-1 Quinasa N-terminal c-Jun _______________________________________________JNK Complejo multiproteico del receptor tipo NOD dominio pirina que contiene proteína 3 ___________________________________________________________________NLRP3 Proteína tipo mota asociada a apoptosis que contiene CARD ____________________ASC Células del ligamento periodontal ________________________________________HPDL Inhibidor tisular de metaloproteinasa ______________________________________TIMP Matriz extracelular _____________________________________________________ECM Linfotoxina alfa ________________________________________________________LTA Receptor de factor de necrosis tumoral _____________________________________TNFR Prostaglandinas _________________________________________________________PGs xi Ciclooxigenasas _______________________________________________________COX Receptores tipo dominio de oligomerización de nucleótidos (NOD) ______________NLRs, Receptores tipo gen-I inducible por ácido retinoico (RIG-I) _____________________RLRs Receptores lectina tipo C ________________________________________________CLRs Receptor tipo ausente en melanoma-2 (AIM2) _______________________________ALRs Dominio intracelular incluye un dominio Toll/IL-1R ___________________________TIR Células madre del ligamento periodontal ________________________________hPDLSCs Receptores del péptido formilo ___________________________________________FPRs N-Formilmetionina Leucil-Fenilalanina ____________________________________fMLP Quinasas reguladas de señalización extracelular ______________________________ERKs Fosfoinositol 3-cinasa ___________________________________________________PI3K Proteína cinasa B _______________________________________________________AKT Guanosina trifosfatasa ________________________________________________GTPasas Especies reactivas del oxígeno ____________________________________________ROS Receptor del fragmento cristalizable ________________________________________FcR Señal y activador de la transcripción ______________________________________STAT Proteína de unión a GATA 3 ___________________________________________GATA3 Interferón _____________________________________________________________IFN Janus quinasa __________________________________________________________JAK Tirosina quinasa 2 _____________________________________________________TYK2 Factor de crecimiento transformante-β1 __________________________________TGF-β1 xii Complejo receptor media la fosforilación de las proteínas madres contra el homólogo decapentapléjico 2/3 ________________________________________________SMAD2/3 Receptor proteína tirosina quinasa _______________________________________TYRO3 Receptor proteína tirosina quinasa AXL _____________________________________AXL Proteína tirosina quinasa protooncogén MER ______________________________MERTK Proteína de arresto de crecimiento específico-6 ______________________________GAS6 Proteína S __________________________________________________________PROS1 Anexina A1 ________________________________________________________ANXA1 N-formil péptido receptor 2 ______________________________________________FPR2 Complemento 1q _______________________________________________________C1q Fragmentos de anticuerpos _______________________________________________Fab Fragmento cristalizado ____________________________________________________Fc Trampas extracelulares de neutrófilos ______________________________________NETs Proteína 10 que contiene dominio de desintegrina y metaloproteinasa ________ADAM-10 Plasminógeno tipo uroquinasa _____________________________________________uPA Activador tisular del plasminógeno _________________________________________tPA Inhibidor de activación de plasminógeno _____________________________________PAI Centro de Investigación de Biología Celular y Molecular _____________________CIBCM Universidad de Costa Rica _______________________________________________UCR Reacción en cadena de la polimerasa tras transcripción inversa ________________RT-PCR Ciclos que superaron el umbral ______________________________________________Ct Ácido ribonucleico _____________________________________________________ARN xiii Ribonucleasas ______________________________________________________RNasas Enzimoinmunoanálisis de adsorción ______________________________________ELISA xiv xv 1 Introducción Enfermedades periodontales Las enfermedades periodontales comprenden condiciones crónicas inflamatorias de los tejidos de sostén (1). Los tejidos periodontales son los tejidos de soporte del órgano dentario: la gíngiva, el ligamento periodontal, el cemento radicular y el hueso alveolar (2). La gíngiva se puede identificar como encía libre, interdental y la encía adherida (2). El surco gingival histológicamente se encuentra perfilado por el epitelio sulcular, la sección coronal del epitelio de unión y la superficie dental (3). La unión dento-gingival comprende la unión celular a la superficie dental mediante hemidesmosomas, la unión entre células dentro del epitelio de unión por medio de desmosomas y la unión al tejido conectivo gingival mediante la membrana basal (3). Figura 1. Diagrama de sitios anatómicos de la gingiva. Imagen tomada de (4) Comúnmente las enfermedades periodontales tienen como inicio la gingivitis (1), que se clasifica en dos amplias categorías: gingivitis inducida por la biopelícula de la placa dental y enfermedades gingivales no inducidas por placa dental (5). La gingivitis inducida por la biopelícula de la placa dental es una lesión inflamatoria consecuencia de la interacción entre la biopelícula de la placa dental y la respuesta inmuno-inflamatoria del hospedero (5). Las enfermedades gingivales no inducidas por placa dental representan una diversidad de 2 condiciones que generalmente no se resuelven completamente al remover la placa dental y pueden ser parte de una manifestación sistémica (6). La gingivitis puede retornar a un estado de homeostasis al reducir los niveles de placa dental apical del margen gingival (5). Si la gingivitis persiste, es posible que la enfermedad progrese a la periodontitis (7). Con base en la patofisiología de la enfermedad se distinguen tres formas de la periodontitis: periodontitis necrotizante, periodontitis como una manifestación directa de enfermedades sistémicas y periodontitis (8). La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica vinculada con biopelícula de la placa disbiótica y caracterizada por la destrucción progresiva del aparato de soporte dental (9). Es una condición mediada por la inflamación del hospedero en respuesta a la presencia de microorganismos y lleva a la pérdida de la inserción periodontal (8). Se manifiesta clínicamente como la pérdida del nivel de inserción clínico (CAL, por sus siglas en inglés), la pérdida de hueso alveolar (evaluado radiográficamente), la presencia de la bolsa periodontal y el sangrado gingival (9). La bolsa periodontal es la profundización patológica del surco gingival alrededor de un diente a nivel del margen gingival caracterizada por la destrucción ósea (3). Histológicamente, el surco gingival se encuentra perfilado por el epitelio sulcular, la sección coronal del epitelio de unión y la superficie dental (3). Diagnóstico Clínicamente un paciente con periodonto intacto o reducido tiene gingivitis cuando su sangrado al sondaje (BOP, por sus siglas en inglés) es de al menos el 10 % de los sitios (considerando 6 sitios gingivales por pieza dental), y carece de una profundidad del sondaje periodontal superior a los 3 mm (5). La profundidad del sondaje es la distancia entre el margen gingival y el fondo del surco gingival, y se mide en milímetros por medio de una sonda periodontal (5). 3 Figura 2. Medición de la profundidad de la bolsa periodontal. El sondaje periodontal es realizado mediante una sonda periodontal calibrada (generalmente con graduaciones de 1 mm, no se encuentra en la imagen). La sonda pasa con firmeza y gentilmente entre el diente y la encía. La profundidad de la bolsa periodontal puede disminuir posterior a un tratamiento exitoso. Imagen tomada de (1) Los pacientes con una periodontitis estable tratada exitosamente, son considerados clínicamente sanos cuando, a pesar de tener pérdida de inserción al sondaje y pérdida ósea radiográfica, tienen una profundidad del sondaje no mayor a los 4 mm y además el BOP no supera el 10 % de los sitios (5). Si el sondaje no supera los 3 mm, pero tienen un BOP en 10 % de los sitios o más, es considerado un paciente con gingivitis con una historia de periodontitis (5). Clínicamente, un paciente tiene periodontitis cuando no ha sido tratado previamente y tiene una pérdida del CAL interdental detectable en ≥ 2 piezas dentales no adyacentes o una CAL vestibular u oral de ≥ 3 mm con una bolsa periodontal > 3 mm detectable en ≥ 2 piezas dentales (8). La CAL se evalúa con una sonda periodontal estandarizada utilizando como referencia la unión amelo-cemento (UAC), y toma en cuenta los valores de la profundidad del surco gingival y el margen gingival en 3 sitios (mesial, medial y distal) vestibulares de la pieza dental y 3 sitios palatinos o linguales (10, 11). La UAC es el punto de unión entre el esmalte dental y el cemento radicular (2). La CAL observada no puede atribuirse a causas no relacionadas a periodontitis: recesión gingival de origen traumático, caries dentales con extensión cervical, la presencia de pérdida del NIC en segundos molares debido a malposición o la extracción de la tercera molar, lesión 4 endodóntica con drenaje marginal o fractura radicular vertical (8). El diagnóstico del estadio de la periodontitis requiere además la valoración radiográfica, la determinación de pérdida dental previa debido a periodontitis, la evaluación individual de cada pieza dental y la extensión y distribución de los sitios afectados (8). El grado de la periodontitis se determina por la evidencia de progresión de la pérdida ósea mediante estudios radiográficos y los factores de riesgo (fumado y diabetes) (9). Tratamiento de las enfermedades periodontales Posterior a un adecuado diagnóstico periodontal y la determinación de la prognosis integral, se continúa con la educación del individuo en aspectos de su estado de salud y se dan instrucciones de higiene personalizadas (4). El tratamiento periodontal se puede dividir generalmente en cuatro fases (2): • La fase sistémica (reducción de factores ambientales y sistémicos que afecten al individuo). • La fase higiénica (obtención de condiciones libres de infección mediante la remoción de la biopelícula gingival, el cálculo y factores retentivos). • La fase correctiva (abordaje de secuelas, incluye las medidas terapéuticas periodontales como la cirugía periodontal o la colocación de implantes, tratamiento endodóntico, tratamiento restaurativo, entre otros). • La fase de mantenimiento (prevención de la reinfección y la recurrencia de la enfermedad). 5 Figura 3. Esquema de decisión del tratamiento periodontal. Imagen tomada de (4). Prevalencia La periodontitis, junto con la caries dental, son las enfermedades orales más comunes y ocasionan la mayoría de las causas de pérdida dental. La periodontitis es la sexta enfermedad global más común (12). En el año 2010, la periodontitis severa (se definió periodontitis severa como aquella cuyo valor en el Índice Periodontal Comunitario de Necesidades de Tratamiento [CPITN] fue de 4, pérdida del NIC de 6 mm o una profundidad del sondaje mayor a 5 mm) afecta al 10.8% de la población mundial (743 millones de personas) (13). En la región latinoamericana, en el año 2010, la prevalencia de pacientes con profundidad del surco gingival superior a los 4 mm fue de un 19.4% (14). En Costa Rica, un estudio transversal del año 2017, indica una prevalencia de enfermedad periodontal del 35.36%, tomando en cuenta sitios con bolsa periodontal superior a los 4 mm. Los datos provienen de pacientes examinados en los Servicios de Odontología de las Áreas de Salud y Regiones de Salud de la Caja Costarricense del Seguro Social (CCSS). También se observó pérdida de una pieza dental en al menos un cuadrante debido a enfermedades periodontales en un 6.36% de los pacientes examinados (15). 6 Relación con enfermedades sistémicas Se ha propuesto que patobiontes periodontales tienen una relación causal en la iniciación o exacerbación de ciertas enfermedades (16). Esto porque la bacteremia transitoria puede ocasionar colonización en sitios extra orales, las toxinas de patógenos orales pueden generar daño sistémico o los antígenos solubles pueden causar inflamación sistémica (17). Se han reportado asociaciones entre el microbioma oral y la disbiosis del mismo con diabetes (18), enfermedades cardiovasculares (19), pulmonares (20), metabólicas (21), renales (22), enfermedad de Alzheimer (23), enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide (24) y bebes con bajo peso de nacimiento (25). Inflamación e inmunidad de las mucosas Los tejidos mucosos forman la división entre el interior y el exterior del organismo (26). Consisten de los tractos respiratorios, gastrointestinal y urogenital, la cavidad ocular, timpánica y oral (27). Su gran extensión y su exposición constante al ambiente externo la convierte en un sitio de contacto continuo con microorganismos, partículas de alimentos y sustancias externas consumidas a través de la cavidad oral (28). En las mucosas se da la invasión de la mayoría de los patógenos y el hospedero mantiene una inmunidad de protección flexible y dinámica, a esto se le suma las funciones fisiológicas de digestión e inhalación (27). La inmunidad de las mucosas desarrolla un equilibrio entre el reconocimiento, respuesta y adaptación de antígenos externos, evitando generar un daño a los tejidos (26). Entre los elementos de protección críticos podemos encontrar las barreras físicas (uniones estrechas ó tight junctions y capa de mucinas) y las barreras bioquímicas (péptidos antimicrobianos), componentes de la inmunidad innata (receptores tipo Toll [TLRs], por sus siglas en inglés) en células de la inmunidad innata (Células natural killer, mastocitos y eosinófilos), componentes de la inmunidad adaptativa (inmunoglobulina A [IgA] secretada antígeno- específica [SIgA, por sus siglas en inglés]) (27). El sistema inmunitario de la mucosa consiste de tres compartimientos principales: el epitelio, la lámina propia (LP) y el tejido linfoide asociado a mucosas (MALT, por sus siglas en inglés); se considera como una línea frontal 7 de defensa al epitelio y a la LP, mientras que en el MALT se inicia la respuesta inmunitaria innata (28). La mucosa oral es la membrana mucosa que se limita por la piel de los labios y por la mucosa faríngea y la mucosa del tracto digestivo, esto siendo un continuo (29). Sus órganos linfoides principales son las amígdalas y los adenoides (el anillo de Waldeyer) y existen varias glándulas linfoides que drenan la cabeza y el cuello para asistir a las funciones del sistema inmunitario oral (29). La interacción con microorganismos, antígenos y estímulos ambientales es permitido por la delimitación de un epitelio escamoso estratificado, principalmente no queratinizado (30). Los patógenos orales y bacterias comensales obtienen respuestas distintas, los mecanismos de cambio de clase de células B dependientes de linfocito T cooperador (célula TH) generan IgA de alta afinidad por microorganismos patogénicos y sus toxinas, a diferencia de los mecanismos de cambio de clase no dependientes de células TH que generan IgA de baja afinidad para bacterias comensales para regular su crecimiento (31). Los microorganismos orales comensales desencadenan una respuesta de los TLRs de células residentes de la gingiva saludable correspondiente a la homeostasis y el mantenimiento de la salud periodontal (31). Si los microorganismos superan la barrera epitelial e ingresan al tejido conectivo subyacente, se incrementa la activación de los TLRs incrementando la producción de citoquinas proinflamatorias (32). El estímulo puede desencadenar una respuesta inflamatoria aguda o crónica, la inflamación aguda de corta duración se considera como parte de la inmunidad innata, donde una de sus características principales es la infiltración de neutrófilos (29). La inflamación crónica es caracterizada por la infiltración de células mononucleares (macrófagos, linfocitos y células plasmáticas), puede seguir a la inflamación aguda o iniciar de novo y representa el fracaso de la resolución de la inflamación aguda generando fibrosis y destrucción tisular (29). El epitelio del surco gingival es característicamente vulnerable como barrera oral, donde su pared interna está delimitada por el epitelio del surco que reduce su grosor de forma gradual en dirección a la base apical (30). La base del surco es el sitio donde la mucosa contacta con la pieza dental, el epitelio del surco pasa a ser el epitelio de unión y este se 8 reduce a 3 – 5 capas de grosor (30). La unión con el diente es permeable y ocurre mediante hemidesmosomas, permite el paso del líquido tisular denominado líquido crevicular gingival (GCF, por sus siglas en inglés) (30). El GCF está compuesto de proteínas plasmáticas, citoquinas, inmunoglobulinas y células del sistema inmunitario, por esta vía es que los neutrófilos transmigran continuamente hacia la cavidad oral (30). Etiología, patogénesis y desarrollo de las enfermedades periodontales Etiología bacteriana La bolsa periodontal es un nicho anaeróbico, rico en proteínas, que promueve la colonización de bacterias anaerobias (16). Un grupo de microorganismos tiene la habilidad de acumularse en grandes masas (placa dental) y podría iniciar el proceso de enfermedades periodontales (33). Se describió una serie de cinco complejos microbianos en la placa subgingival (la infección con bacterias en cada complejo está altamente asociadas con los niveles de severidad de las enfermedades periodontales). De ellos, las bacterias del complejo rojo (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Tanerella forsythia) muestran una fuerte asociación con hallazgos clínicos de la enfermedad periodontal, particularmente la profundidad de la bolsa periodontal y el índice BOP (34). El modelo sobre la enfermedad periodontal ha ido modificándose en los últimos años. Los nuevos modelos se basan en la patogénesis que indica que el inicio de la periodontitis se debe a una comunidad polimicrobiana sinérgica y disbiótica (PSD); en vez de ser causada por un único o varios periodontopatógenos clásicos (35). En los hallazgos clínicos se observan patógenos claves, que con una abundancia relativamente menor logran influir a la comunidad bacteriana oral. Los patobiontes explotan la disrupción de la homeostasis para desarrollarse y promover la enfermedad inflamatoria. Los patógenos accesorios son inherentemente comensales en un microambiente específico, no obstante, aumentan la actividad colonizadora y metabólica de los patógenos. Esta clasificación se refiere a estructuras conceptuales de los miembros de la comunidad bacteriana, no necesariamente representa propiedades intrínsecas de cada especie individual (36). 9 Independientemente de la composición de la comunidad, ciertos patrones metabólicos muestran una fuerte asociación con la progresión de la enfermedad (transporte de hierro, actividades de secreción de proteínas, entre otras) (17). La comunidad completa es responsable de un aumento en la virulencia que genere la progresión de la enfermedad (incluyendo la presencia de arqueas metanógenas, hongos, protozoarios y virus) (17). En el ambiente natural del nicho periodontal, las bacterias compiten por su sobrevivencia debido a la escasez de nutrientes, como hierro y vitaminas, y el constante ataque del sistema inmunitario del hospedero (37). Bajo estas condiciones, se incrementa la expresión de genes que mejoran las condiciones para la sobrevivencia en un ambiente hostil (38). Patogénesis La periodontitis, es una enfermedad multifactorial. Algunas de sus bases son la genética del hospedero, la influencia epigenética y factores modificables. Se consideran como factores modificables los que se asocian con los estilos de vida de los pacientes, los medicamentos o factores ambientales. También existen características propias del sitio de la lesión, como lo son los factores anatómicos dentales, los cuales pueden exacerbar la periodontitis (7). La biopelícula patogénica es un prerrequisito necesario para el desarrollo de la periodontitis, pero no es suficiente para ocasionar la enfermedad. La interacción compleja entre la biopelícula y la respuesta inflamatoria da como resultado la enfermedad. Se estima que un 80% del riesgo del daño tisular es debido a la respuesta inflamatoria (7) donde la inestabilidad en este proceso genera el desarrollo de la enfermedad (39). La inflamación es resultado de la irritación, daño o infección del tejido; con cuatro signos cardinales: rubor, tumefacción, calor y dolor. La respuesta inflamatoria es vital para la sobrevivencia del organismo. Inicia como una respuesta protectora contra patógenos o cuerpos extraños, o al daño de tejidos del hospedero. Regula la defensa contra patógenos, estrés ambiental y controla la cicatrización. El proceso se caracteriza por la dilatación vascular, el incremento en la permeabilidad de capilares, un aumento en el flujo sanguíneo y el reclutamiento de leucocitos (39). Recientemente se han desarrollado nuevos conceptos alrededor de la salud periodontal y la periodontitis. La biopelícula dental homeostática promueve los estados de salud dentro de 10 una relación simbiótica entre hospedero y microrganismos. El hospedero provee nutrientes a través del GCF, y las proteínas y péptidos de la biopelícula pueden desatar una respuesta proporcionada y resolutiva. En cambio, un proceso de disbiosis incipiente se desarrolla cuando la biopelícula no se remueve y se acumula a nivel subgingival. Estas condiciones empiezan a favorecer a ciertas especies altamente asociadas a la periodontitis, por ejemplo, Fusubacterium nucleatum, la cual libera señales químicas que alteran el ambiente de la bolsa periodontal. Estos microrganismos con mecanismos de percepción de cuórum desencadenan un aumento en la respuesta del hospedero. Esto genera el desarrollo de la inflamación gingival y el incremento de los nutrientes, como el grupo prostético hemo, que promueven la proliferación de patógenos como la P. gingivalis (7). Desarrollo de la enfermedad gingival y periodontal En la lesión inicial hay un incremento de la permeabilidad microvascular (39). Esto como consecuencia de la respuesta de los leucocitos residentes y células endoteliales a la biopelícula, los cuales producen dilatación de la vascularidad, incremento de la presión hidrostática en la microcirculación y el aumento del espacio entre las células epiteliales y las células endoteliales de los capilares (39). Los neutrófilos son la primera línea de defensa y son esenciales en ejercer funciones fagocíticas y microbicidas (40). Los neutrófilos polimorfonucleares (PMNs por sus siglas en inglés) son los primeros leucocitos en atender y acumularse en el sitio de inflamación (39). Como consecuencia se da la secreción de interleucina (IL)-1β e IL-18 (7). Estas citoquinas activan a los leucocitos PMNs, que expresan distintos receptores quimiotácticos y pueden además iniciar una cascada proinflamatoria de señalización (41). Los neutrófilos son importantes para la defensa del hospedero ante comunidades microbianas, pero su activación crónica libera productos que conllevan al daño (42). La quimiotaxis es un proceso celular que permite que los neutrófilos y células no residentes se desplacen hacia el sito de lesión a través de una gradiente de quimiotrayentes (43). Los neutrófilos migran por diapédesis en el sitio de infección como consecuencia de la activación de moléculas de adhesión (39). Los capilares locales en el sitio de infección bacteriana liberan trasudado que contiene péptidos inflamatorios (anticuerpos, complemento, 11 entre otros), agrandan el tamaño gingival e incrementan el exudado del GCF (7). La acumulación mínima de restos bacterianos en la superficie dental no altera la inserción dentogingival (39). La expansión del contacto entre el tejido epitelial y el tejido conectivo y los cambios vasculares generan crestas epiteliales en el epitelio del surco (39). La lesión temprana posee características particulares como el aumento en la cantidad de neutrófilos en el tejido conectivo (44). Hay migración al sitio de inflamación de macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos (39) e inicia la activación de C3a y C5a (7). Las crestas epiteliales se vuelven más profundas e incrementa la capa celular basal del epitelio (39). Se intenta generar una mayor barrera física entre la biopelícula y el tejido conectivo (39). El surco empieza a profundizarse e inician los signos clínicos de inflamación, sin pérdida de la inserción dentogingival (39). Los macrófagos dirigen la respuesta inmunitaria, fagocitan bacterias y reclutan al sitio una mayor cantidad de neutrófilos y linfocitos (39). La producción de citoquinas: IL-1, IL-6 y factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y las quimiocinas: quimiocina motivo C-X-C ligando 8 (CXCL8 por sus siglas en inglés) y el motivo C-C ligando 5 (CCL5 por sus siglas en inglés) incrementan la respuesta inflamatoria en el sitio (43). También se observa la producción de citoquinas antiinflamatorias: IL-4, IL-10 e IL13 por parte de los macrófagos y los linfocitos T (45). La lesión establecida acontece luego de la transición completa entre la respuesta inmunitaria innata a la respuesta inmunitaria adaptativa (39). La inflamación aguda, al no ser resuelta, evoluciona a una inflamación crónica (39). Predominan, además de los macrófagos, células plasmáticas y linfocitos T y linfocitos B que secretan IgG1 e IgG3 (39). Hay un aumento de la actividad colagenolítica, que causa que células inflamatorias penetren en el tejido a mayor profundidad (39). Además, continúa la proliferación del epitelio dentogingival y aumenta la penetración de las crestas epiteliales en el tejido conectivo donde se mantiene la integridad epitelial y se genera una barrera contra la entrada de bacterias (39). El epitelio de unión es sustituido por el epitelio de la bolsa, que exhibe propiedades de una menor adhesión (3). Esto permite que la biopelícula migre a lo profundo de la bolsa periodontal (46). En el epitelio de la bolsa, se encuentran principalmente neutrófilos (39). El 12 epitelio de unión tiene una mayor permeabilidad en comparación con epitelio sulcular y permite el flujo de células y fluidos hacia la cavidad oral (3). Esto establece un mecanismo normal de defensa contra microrganismos y sus productos (39). Al carecer de una capa de queratina, es posible que los microrganismos y sus productos invadan al epitelio de unión (30, 37). La transmigración de neutrófilos al fondo del surco gingival es la primera línea de defensa de los tejidos periodontales (40, 47, 48). Existen diferencias entre el epitelio de unión y el epitelio de la bolsa (3). En el epitelio de la bolsa se forma una hendidura intraepitelial, hay un aumento de crestas epiteliales en el tejido conectivo inflamado y aparecen micro-ulceraciones a nivel de la superficie libre (3). También hay un mayor infiltrado de linfocitos (células T, células B y células plasmáticas), aumento de la migración de neutrófilos y un cambio en la dirección del exudado en dirección a la superficie radicular del diente (a diferencia de una dirección apico-coronal) (3). Clínicamente se observa una gingivitis moderada a severa, sangrado gingival y cambios en el color y el contorno (39). La biopelícula subgingival se expande y la inserción dentogingival continua intacta (39). En este punto, el hueso alveolar y el ligamento periodontal permanecen sin ser destruidos (39). La eliminación mecánica de la biopelícula puede recuperar la homeostasis. Al carecer de daño del hueso alveolar, cemento expuesto y destrucción del ligamento, la lesión puede revertirse (39). La lesión avanzada corresponde a la etapa en la que la destrucción periodontal inicia y es irreversible (39). El infiltrado celular inflamatorio, donde predominan las células plasmáticas, se extiende con mayor profundidad en el tejido conectivo, hay una degradación de las fibras de colágeno y continua la migración apical del epitelio de unión (7, 39). La bolsa se profundiza y la biopelícula crece apicalmente en un ambiente anaerobio, produciendo la pérdida de inserción del tejido conectivo y el hueso (39). En esta etapa se activan los mecanismos de resolución de la inflamación periodontal donde se producen citoquinas y quimiocinas antiinflamatorias e inhibidores de metaloproteinasas de matriz (MMPs por sus siglas en inglés) de tejidos (39). Las proteínas de resolución de la inflamación previenen el daño a los propios tejidos del hospedero y permiten la recuperación de la integridad de los tejidos de inserción (49). Si la resolución de 13 la inflamación es incompleta y no se logra el retorno a la homeostasis, se desencadena su destrucción por medio de la acción de los neutrófilos y de la inflamación crónica (39). El recambio óseo es regulado por el receptor activador del factor nuclear κ β ligando (RANKL por sus siglas en inglés) y la osteoprotegerina (OPG) (50). La diferenciación de osteoclastos tiene como señal primaria a RANKL. La OPG, que puede ser producida por osteoblastos (51), actúa como un receptor señuelo e interrumpe la unión entre RANKL y el receptor activador del factor nuclear κ β (RANK por sus siglas en inglés). La razón RANKL/OPG dirige la osteoclastogénesis y la activación osteoclástica (50). Las citoquinas proinflamatorias IL-1, IL-6 y el factor de necrosis tumoral-α (TNF- α) pueden generar un incremento en la expresión de genes que codifican por RANKL (50), promoviendo la osteoclastogénesis y la destrucción de tejidos periodontales (51). Dependiendo de la severidad y la duración de la enfermedad, se puede desarrollar un círculo vicioso a favor del ambiente de la bolsa periodontal (37, 52, 53). Este ciclo requiere un manejo terapéutico para ser detenido. Si no, existe la posibilidad de que la condición empeore (3). Si esta biopelícula no es removida, la disbiosis franca ocasiona una inflamación crónica, destructiva y no resolutiva (54). El equilibrio entre un estado de curación y un estado donde predomina la destrucción de tejidos depende del progreso de la inflamación aguda: si esta no se resuelve, avanza a la inflamación crónica (55). La cronicidad es un estado consecuencia de la incapacidad de la respuesta inflamatoria de eliminar o detener los efectos de los agentes provocadores (56). Los factores de virulencia inducen inflamación y los microrganismos se aprovechan de los mecanismos de defensa del hospedero para prolongar la enfermedad y expandir su colonización (39). Como consecuencia del fracaso de la resolución de la inflamación, se producen citoquinas, prostanoides, MMPs y estrés oxidativo (54). Mediadores moleculares inmunitarios La microbiota oral y la respuesta del hospedero representan factores etiológicos y de riesgo para el inicio y la progresión de la periodontitis (57). La labor de las citoquinas es importante en la progresión de la enfermedad, implicando la modulación de la homeostasis y el proceso inflamatorio en la respuesta contra patógenos y la estimulación de la barrera 14 mucosa y el tejido conectivo (58). Adicionalmente, se ha reportado que polimorfismos de un único nucleótido en los genes que codifican mediadores inmunológicos se relacionan con el riesgo y la severidad de la enfermedad (59–62). La regulación alterada de moduladores inmunológicos, como las citoquinas, puede estimular o acelerar la periodontitis (45). En un modelo experimental murino con periodontitis se ha reportado la relación entre las citoquinas y la pérdida ósea alveolar, demostrando cómo la expresión de las citoquinas tienen un papel en el proceso de la periodontitis (63). La colonización de patógenos claves lleva a la disbiosis, incrementando la patogenicidad de la comunidad bacteriana y trastornando la homeostasis del tejido (64). La respuesta inmunitaria hiperactiva conduce a la infiltración celular, la iniciación de la función osteoclástica y la destrucción de los tejidos de soporte (45). La respuesta inmunitaria patológica contra la disbiosis es un proceso de tres etapas: 1. El desafío inicial ocurre entre el microbioma y las células del hospedero (células del tejido periodontal, como las células epiteliales mucosas, los fibroblastos gingivales y otras células inmunológicas) (45). La estimulación continua y el daño generado por la disbiosis y los estímulos mecánicos (como la masticación), recluta células presentadoras de antígenos (APCs, por sus siglas en inglés) y subtipos específicos de células T (como las células T cooperadoras 17 [TH17]) (45). La interacción entre el microbioma y el hospedero conlleva a la activación de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR, por sus siglas en inglés) dirigiendo al primer pico de secreción de citoquinas (como las familias de las IL-1, IL-6 y el TNF) (45). Los efectos pleiotrópicos de estas citoquinas proinflamatorias se concentran en la generación de linfocitos y la destrucción tisular (45). 2. El microbioma activa a las APCs y linfocitos, provocando la secreción citoquinas relacionadas con la diferenciación de subtipos específicos de linfocitos (45). 3. Cada subtipo de los linfocitos secretan un cierto patrón de citoquinas, que pueden actuar como un mecanismo de retroalimentación positiva o como células efectoras directas (45). Entre los efectos que pueden generar (45): 15 a. Mejoramiento de la barrera mucosa. b. Control de los patobiontes. c. Inducción o supresión de la actividad osteoclástica. d. Inhibición de la retroalimentación de la respuesta inmunitaria hiperactiva. Mediadores moleculares proinflamatorios La inflamación crónica es dirigida por distintos mediadores, entre ellos las interacciones de las redes citoquinas (65). Las citoquinas proinflamatorias IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17 y TNF-α, (65) pueden contribuir a la inflamación y a la lesión tisular (66). Las proteínas proinflamatorias actúan como moléculas de señalización, estas pueden ser liberadas por los queratinocitos que responden a un estímulo bacteriano (7). Las principales citoquinas que estimulan la producción de MMP son la IL-1, la IL-6 y el TNF-α (67). Se han detectado niveles elevados de IL-1, IL-6 y TNF-α en el tejido gingival y el GCF de pacientes diagnosticados con periodontitis (68). Familia IL-1 IL-1 presenta varios efectos celulares, principalmente en la inmunidad innata (69). Entre la amplia de familia IL-1 (moléculas secretadas con actividad agonista [IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36α, IL-36β y IL-36γ], antagonistas [IL-1 antagonista de receptor, IL-36Ra] y citoquinas antiinflamatorias [IL-37 y IL-38]), resaltan los dos primeros miembros identificados IL-1α y IL-1β (70). Las dos citoquinas están codificadas por genes diferentes, y se sintetizan como proteínas precursoras, que se cortan a su forma madura (69). Ambas formas maduras se unen al receptor de membrana IL-1R1, conduciendo a respuestas inmunológicas semejantes (69). Miembros de la familia como IL-1, IL-18 e IL-33, se consideran conductores de la diferenciación y polarización de células mieloides y células linfoides IL-1α IL-1α se expresa de manera constitutiva en varias células en tejidos sanos, su expresión puede incrementar en repuesta a factores de crecimiento o estímulos proinflamatorios o de 16 estrés (71). Estímulos, como el generado por estrés oxidativo, ácidos grasos, citoquinas, hormonas o trauma, provocan la translocación de la pro-IL-1α a la membrana celular (69). La IL-1 y el TNF tienen una gran cantidad de funciones, entre las cuales estimulan la adhesión molecular y la expresión de quimiocinas, estimulan la producción de mediadores proinflamatorias como la prostaglandina E2 (PGE2), incrementa la actividad osteoclástica, induce la expresión de MMPs y estimulan la apoptosis de células productoras de matriz (72). La pro-IL-1α unida a la membrana celular activa la producción de citoquinas dependientes de IL-1R1 de células no hematopoyéticas y macrófagos residentes (70). Adicionalmente, la producción de quimiocinas mediante IL-1α resulta en el reclutamiento de células mieloides en el sitio de estrés y aumenta la producción de IL-1α y IL-1β, regulando y manteniendo un ciclo inflamatorio (71). La muerte celular debido a daños, estrés, infección o pérdida de la integridad, como en neutrófilos (73), permite la liberación pasiva de pro-IL-1α, activando una cascada inflamatoria en las células vecinas (69). La IL-1α, por lo tanto, tiene un papel en la iniciación y el sostenimiento de la inflamación (70). IL-1β IL-1β es una citoquina proinflamatoria secretada principalmente por monocitos, macrófagos y células dendríticas en respuesta a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs, por sus siglas en inglés) (como lipopolisacáridos [LPS]), patrones moleculares asociados a daño (DAMPs, por sus siglas en inglés), y otras citoquinas proinflamatorias (como TNF-α) (70). La IL-1β y la IL-6 están asociadas con la migración de células proinflamatorias y la osteoclastogénesis (67). La activación de IL-1R1 por IL-1β lleva al reclutamiento del adaptador proteico de diferenciación mieloide factor-88 (Myd88, por sus siglas en inglés) (45), y la activación de las quinasas asociadas a IL-1R (IRAKs, por sus siglas en inglés) (70) y el receptor del factor de necrosis tumoral asociado al factor 6 (TRAF6, por sus siglas en inglés) (45). La activación de IRAKs y TRAFs causa la activación de factores de transcripción inflamatorios: factor nuclear-κβ (NF-κβ, por sus siglas en inglés), proteína activadora-1 (AP-1, por sus siglas en inglés) y quinasa N-terminal c-Jun (JNK) (45). 17 El complejo multiproteico del receptor tipo NOD dominio pirina que contiene proteína 3 (NLRP3, por sus siglas en ingles) y la proteína tipo partícula asociada a apoptosis que contiene CARD (ASC, por sus siglas en ingles), también conocido como el inflamasoma, activa la pro-caspasa I localizada en el citoplasma (74). La caspasa I genera un corte proteolítico necesario para que Pro-IL-1β se convierta en IL-1β, se secrete y mantenga la inflamación (69). IL-1β tiene un papel en procesos como vasodilatación, incremento de la quimiotaxis, degradación de colágeno mediante las MMPs y la reabsorción ósea mediante el incremento de osteoclastogénesis (70). La IL-1β ha sido considerada como un biomarcador asociado a la severidad y la progresión de la periodontitis (72). IL-6 La IL-6 es una citoquina secretada por células dendríticas, macrófagos, células B, células T, fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales (45). IL-6 se considera un amplificador inflamatorio inducido por PAMPs y citoquinas proinflamatorias (45). Está involucrada en el desarrollo de células plasmáticas (75), la producción de inmunoglobulinas (76). Adicionalmente, inhibe la diferenciación de células Treg (77). El polimorfismo 174G/C de IL-6 se ha asociado con la susceptibilidad hacia periodontitis (78). Se ha reportado un aumento de IL-6 en GCF de pacientes con periodontitis, pero no se ha visto una reducción en sus niveles posterior al tratamiento periodontal (79). Esto sugirie un papel importante en la lesión inicial y temprana de la periodontitis (45). IL-6 interviene en la homeostasis ósea, generando un aumento RANK en osteoblastos, conduciendo a la diferenciación de osteoclastos y la reabsorción ósea (80). IL-17A La IL-17 es una citoquina asociada con inmunidad innata, inflamación y osteoclastogénesis (81). Su rol en la periodontitis puede llevar a la progresión de la enfermedad (82). Los linfocitos T cooperadores 17 (TH17) producen la IL-17 (81), que al carecer de proteína homóloga se clasifica como una familia aparte (83). La citoquina consiste de 6 ligandos, IL-17A a IL-17F, los cuales comparten estructuras similares y pueden ser homodímeros o heterodímeros (81). IL-17A se puede hallar en forma de homodímero o 18 heterodímero junto con IL-17F, se enlaza al receptor de IL-17A (IL-17RA) o al IL-17RC en células CD4+, osteocitos, células epiteliales, y células tipos macrófagos, células epiteliales alrededor de vasos sanguíneos, entre otras células (84). Entre las funciones de IL-17A se encuentra resguardar la homeostasis del periodonto al mantener la integridad de la barrera epitelial, promover la producción de factores antimicrobianos y regular el reclutamiento de neutrófilos para contener la microbiota comensal (85). IL-17A aumenta la concentración de mediadores proinflamatorios, al regular la expresión de IL-6,IL-10, IL-12, TNF-α, estromelisina o PGE2 en macrófagos y células del ligamento periodontal (HPDL, por sus siglas en inglés) (86). Además, induce las MMP-1, MMP-3, MMP-9 y MMP-13, e inhibe la expresión del inhibidor tisular de metaloproteinasa (TIMP, por sus siglas en inglés)-1 (87–89). TNF TNF-α TNF-α es una citoquina pleiotrópica primordial de la respuesta inflamatoria a una infección (90). Puede generar respuestas de activación, muerte celular, sobrevivencia, diferenciación y proliferación en un número diverso de células (91). Se han reportado polimorfismos asociados con la región promotora de TNF-α en la patogénesis de la periodontitis, favoreciendo a la susceptibilidad de la enfermedad (61). TNF- α se ha asociado con la exacerbación de la reabsorción ósea aumentan la actividad osteoclástica y disminuyen la actividad osteoblástica (45), proceso característico de la periodontitis. Es posible que TNF-α esté involucrado en el daño de la barrera de la mucosa oral generando el inicio de la periodontitis (45), incrementando la expresión de RANKL en células epiteliales gingivales (92), activando la apoptosis de fibroblastos gingivales y células epiteliales e inhibiendo la generación de matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) por fibroblastos (93). LTA (previamente conocido como TNF-β) Linfotoxina alfa (LTA) es otro mediador inflamatorio con similitud a TNF-α (94). Ambas citoquinas se enlazan con alta afinidad al receptor de factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1, por sus siglas en inglés) y TNFR2 (95). LTA participa en las respuestas 19 inflamatorias e inmunitarias involucradas en la destrucción tisular y reabsorción ósea en tejidos periodontales (96). COX2 Las prostaglandinas (PGs) son mediadores, entre otras funciones, claves de la respuesta inmunitaria a la infección (97). Entre ellas, la PGE2 participa en las reacciones inflamatorias en los tejidos periodontales, y es parte de los procesos de reabsorción del hueso alveolar (98). PGE2 se deriva de PGH2, la cual es convertida a partir del ácido araquidónico por las ciclooxigenasas (COX), COX1 y COX2 (99). La regulación de la producción de las PGs es limitada por las enzimas fosfolipasa A2 y las COX (100). La expresión de COX2 es inducida por citoquinas (101). Además, se ha reportado la expresión de COX2 en tejido gingival en periodontitis (100, 102). Se han visto implicados polimorfismos dentro del gen de COX2 y alteración en los niveles de metilación en el promotor de COX2 en la patogénesis de la periodontitis (97, 103). Receptores de reconocimiento de patrones La primera línea de defensa contra microorganismos es la inmunidad innata, la cual se puede considerar que se divide en dos niveles (104). El primer nivel se basa en la piel, el tejido mucoso, la barrera hematoencefálica y las barreras químicas como el los ácidos grasos, el pH, enzimas, y el complemento, pueden asistir en la resistencia de invasión de microorganismos patológicos (105). El segundo nivel de protección es a través de la vigilancia y defensa inespecífica por células del sistema inmunitario innato, principalmente monocitos, neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células NK (del inglés Natural Killer), mastocitos, eosinófilos y basófilos (106). En contraste con la alta especificidad de los linfocitos T y B, las células del sistema inmunitario innato no expresan receptores específicos de reconocimiento de antígenos (104). El reconocimiento de PRR induce efectos inmunoprotectores, y participa en la iniciación de la respuesta inmunitaria específica a través del reconocimiento y enlace de moléculas comunes localizadas en la superficie de los patógenos, células apoptóticas del hospedero y células senescentes dañadas (104). 20 Receptores tipo Toll Los PRR se pueden dividir según la homología del dominio proteico en, TLRs, receptores tipo dominio de oligomerización de nucleótidos (NOD) (NLRs, por sus siglas en inglés), receptores tipo gen-I inducible por ácido retinoico (RIG-I) (RLRs, por sus siglas en inglés), receptores lectina tipo C (CLRs, por sus siglas en inglés) y los receptor tipo ausente en melanoma-2 (AIM2) (ALRs, por sus siglas en inglés) (104). Los TLRs fueron uno de los primeros PRRs en ser descubiertos (104), y tienen un papel fundamental en las respuestas inflamatorias (107). Los TLRs son receptores transmembrana que se enlazan a un ligando y transmiten una señal intracelular (108). La señal de transducción amplifica la respuesta contra una infección, activando células del sistema inmunitario mediante la transcripción de genes, produciendo y liberando factores proinflamatorios y antivirales (109). Se han descrito 10 TLRs funcionales en humanos, (TLR1 – TLR10) (109). Los TLRs reconocen los PAMPs de distintas subestructuras moleculares asociadas a patógenos (104). Algunos TLRs son receptores transmembrana tipo I compuestos por una región extracelular, una región transmembrana y una región intracelular (104, 110). El dominio intracelular incluye un dominio Toll/IL-1R (TIR), el cual cuando receptor enlaza un PAMP, dirige la señalización mediante proteínas adaptadoras en la región citoplasmática (111). En la periodontitis, los TLRs están involucrados en los procesos de inflamación, reabsorción de hueso alveolar y tolerancia de endotoxinas (112) TLR2 TLR1 y TLR6 pueden formar junto con el TLR2 los heterodímeros TLR1/TLR2 y TLR6/TLR2 (108). El heterodímero se encuentra localizado en la membrana plasmática (109). TLR1/TLR2 reconoce lipopéptidos diacilados, mientras TLR6/TLR2 reconoce lipopéptidos triacilados (104). Se han reportado lipoproteínas de patógenos periodontales como ligandos para TLR2 (113, 114). Actinomyces viscosas, una bacteria oral gram-positiva aislada en la biopelícula supragingival y asociada a la periodontitis, genera una respuesta inflamatoria mediante la activación de TLR2 (114). P. gingivalis puede estimular la señalización del heterodímero 21 TLR1/TLR2 mediante una lipoproteína lipasa-sensitiva (113). Se ha reportado, en modelo in vitro murino, la activación de TLR2 por LPS de P. gingivalis (115). TNF-α incrementa la expresión del gen de TLR2 en fibroblastos gingivales humanos a través de las vías JNK y NF-κβ, (116). TLR4 TLR4 es un PRR localizado en la membrana plasmática y endolisosomal que reconoce LPS microbianos (109). Sus vías de señalización conducen a la producción de citoquinas proinflamatorias (112). El LPS puede impedir la diferenciación a osteoblastos de células madre del ligamento periodontal (hPDLSCs, por sus siglas en inglés) por medio de la vía de NF-κβ de TLR4 (117). Las fimbrias de P. gingivalis pueden dirigir la producción de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas en monocitos al activar las vías de TLR2 y TLR4 (118). FPR1 Los receptores del péptido formilo (FPRs, por sus siglas en inglés) son PRR que reconocen péptidos formilados, además pueden identificar un amplio espectro moléculas endógenas, desde péptidos formilados mitocondriales hasta mediadores lipídicos (119, 120). Hay tres tipos de FPR en humanos: FPR1, FPR2 y FPR3 (120). FPR1 fue el primero en ser descubierto, liga con alta afinidad péptidos formilados (120). Los FPRs se expresan en células del sistema inmunitario innato cómo neutrófilos, monocitos y macrófagos, además se han detectado en células epiteliales, endoteliales, neuronas y hepatocitos (119). Se ha reportado que neutrófilos de pacientes con periodontitis grado C tienen una señalización de FPR1 defectuosa, reduciendo la movilidad de células inmunitarias hacia la quimiocina N-Formilmetionina Leucil-Fenilalanina (fMLP, por sus siglas en inglés) (121). Variaciones genéticas en el gen de FPR1 pueden afectar la expresión del receptor en la superficie, o también pueden modificar la estructura de la proteína, reduciendo la afinidad hacia el ligando (122, 123). Quimiocinas Las quimiocinas son polipéptidos secretados categorizados en cuatro subfamilias basado en la posición de residuos de cisteína dentro de polipéptido: C, CC, CXC y CX3C (124). 22 Cuando el ligando de quimiocina se une al receptor, inicia vías de señalización intracelular que involucra quinasas reguladas de señalización extracelular (ERKs, por sus siglas en inglés), fosfoinositol 3-cinasa (PI3K, por sus siglas en inglés), proteína cinasa B (AKT), guanosina trifosfatasa (GTPasas) pequeñas (Rac, Rho, cdc42) y miembros de la familia de NF-κβ, generando un potencial de comunicación cruzada molecular con vías de señalización de factores de crecimiento (124). Las quimiocinas CC principalmente son quimiotrayentes para monocitos, macrófagos o linfocitos, y tienen un papel en la polarización de clase de macrófagos M1 a M2 durante la transición de inflamación aguda a inflamación crónica (124). Las quimiocinas CXC trabajan primariamente en el reclutamiento de neutrófilos (124). Los PAMPs, DAMPs, mediadores inflamatorios, factores del hospedero y estrés mecánico desencadenan la expresión de quimiocinas (124). Las quimiocinas son sintetizadas por distintos tipos de células, células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, mastocitos, células óseas y leucocitos (125). CXCL8 CXCL8 es la quimiocina más abundante en la cavidad oral. Es secretada principalmente por keratinocitos gingivales, fibroblastos, células endoteliales y macrófagos en respuesta a patógenos periodontales (124). Funciona principalmente generando una gradiente para la migración de neutrófilos hacia el sitio de infección, reclutando células inflamatorias, lo cual aumenta la concentración de citoquinas, consecuentemente favoreciendo a la periodontitis (124). CXCL8 está involucrado en el metabolismo óseo, y afecta directamente la diferenciación de osteoclastos (126). Sus variantes genéticas pueden estar asociadas al riesgo de cáncer oral (127, 128). P. gingivalis exhibe la capacidad de incrementar o suprimir la producción de CXCL8 (129). Esta manipulación puede contribuir al ambiente disbiótico y a un escape de la vigilancia inmunológica (130). Mediadores antiinflamatorios En individuos susceptibles, la disbiosis incipiente puede desencadenar una respuesta del hospedero inadecuada y excesiva. Esto puede ser consecuencia de la producción de citoquinas, especies reactivas del oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) y MMPs. Altas 23 concentraciones de estas sobrepasan a sus respectivos antagonistas, resultando en la afectación colateral de los tejidos periodontales. Se liberan DAMPs, los cuales extienden la respuesta inflamatoria. El fracaso de los mecanismos de resolución del sistema inmunitario innato lleva a la cronicidad de la inflamación (7). Se ha propuesto que los neutrófilos periféricos de pacientes con periodontitis carecen de una precisión quimiotáctica correcta, lo cual incrementaría la duración del tránsito tisular y aumentaría la posibilidad de daños colaterales al tejido (7). Además, los neutrófilos generan niveles más altos de ROS luego de la estimulación del receptor del fragmento cristalizable γ (FcγR por sus siglas en inglés). Tanto las ROS como las enzimas proteolíticas interactúan con la biopelícula, pero también pueden ocasionar daños a los tejidos periodontales (41). La inflamación crónica es dirigida por distintos mediadores, entre ellos las interacciones de las redes citoquinas (65). Las citoquinas proinflamatorias Il-1α, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL- 17 (65) pueden contribuir a la inflamación y a la lesión tisular (66). Las citoquinas antiinflamatorias, como la IL-4, IL-10 e IL-13 (39) ejecutan roles protectores en la destrucción de tejidos (66). IL-4 La IL-4 es una citoquina reguladora secretada principalmente por mastocitos, células TH2, eosinófilos y basófilos (131). IL-4 tiene un rol en la sobrevivencia de leucocitos (132), inmunidad de células TH2 (133), cambio de clase de IgE en células B (134) y reparación tisular y homeostasis mediante la activación alternativa de macrófagos (135). La diferenciación de células TH2 y células B mediante la activación del transductor de señal y activador de la transcripción 6 (STAT6, por sus siglas en inglés) y la proteína de unión a GATA 3 (GATA3) inicia la inmunidad tipo 2 (45). Las células TH2 activadas secretan IL-4, IL-5 e IL-13 para mediar la respuesta inmunitaria mucosa y de barrera (45). Se ha reportado la reducción de IL-4 en individuos con periodontitis y un aumento posterior al tratamiento (79), dando sustento a la conjetura de un rol protector contra la periodontitis (45). La IL-4 suprime las respuestas celulares (136) y reduce la producción de IL-1β, TNF-α e IL-6 de monocitos periféricos células TH1 (67). Inhibe la generación de MMP y RANKL e incrementa la producción de inhibidores de MMP y OPG (137, 138). Se 24 ha reportado que polimorfismos en el gen de IL-4 afectan la producción de IL-4 y adicionalmente afectan la producción de otras citoquinas: IL-10, interferón γ (IFNγ), IL-1β, IL-6 y TNFα, afectando a su vez la enfermedad periodontal (139). IL-10 IL-10 es un citoquina que se une al receptor heterodimérico IL-10RA e IL-10RB, recluta las proteínas janus quinasa 1 (JAK1) y tirosina quinasa 2 (TYK2, por sus siglas en inglés), activando la señalización de STAT3 (140). IL-10 es una citoquina antiinflamatoria que suprime la proliferación inmunitaria y la respuesta inflamatoria (141). Es producida por células TH2 e impide la producción de citoquinas por parte de células TH1 (142). IL-10 también es producida, en menor medida, por células B, mastocitos, eosinófilos, macrófagos, células dendríticas, células T CD8+ y células T CD4+ (143). IL-10 se considera un regulador de la homeostasis ósea, tanto en condiciones homeostáticas e inflamatorias (144). IL-10 reduce la síntesis de IL-1, IL-6 y TNFα (145). Además, suprime el efecto de monocitos (146), células TH2 (147) y células TH17 (148), reduce la producción de citoquinas proinflamatorias y estimula el efecto de células Treg (45). Se ha reportado que IL-10 puede disminuir el desarrollo de lesiones periapicales (149). En el modelo murino, los ratones sin el gen de IL-10 tienen una reducción de la expresión de osteoblastos (150). Distintos polimorfismos en el promotor del gen de IL-10 pueden incrementar la respuesta inflamatoria o generar un aumento en la detección de patógenos periodontales (151). TGF-β1 y TGF-βR1 El factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1 por sus siglas en inglés) es una citoquina antiinflamatoria que puede inducir apoptosis en neutrófilos, inhibir la proliferación de células T e inducir la diferenciación de monocitos a macrófagos; además de suprimir la activación proinflamatoria de monocitos (152). TGF-β1 es secretada como una prohormona y requiere ser cortada por proteasas intercelulares y extracelulares (153). Junto con la IL-2, suscitan la expresión en células T CD4+ de la proteína caja de horquilla P3 (FOXP3, por sus siglas en inglés), conduciendo a la diferenciación de células Treg (154). Las células Treg secretan TGF-β1 y IL-10 creando un ciclo positivo de regulación (45). 25 La subunidad de receptor, TGF-βR1, es una quinasa serina/treonina y es un regulador importante en la vía de TGF-β1 (155). El complejo receptor media la fosforilación de las proteínas madres contra el homólogo decapentapléjico 2/3 (SMAD2/3, por sus siglas en inglés) siguiendo un complejo transcripcional heterotrimérico que consta de SMAD2, SMAD3 y SMAD4 fosforilados y afecta procesos corriente abajo al interactuar con otros de factores de transcripción (156). El incremento de células T FOXP3+ ha sido detectado en el tejido periodontal inflamado (157). Se estima que células FOXP3+ no tienen un papel regulador en la patogénesis de la periodontitis al reducir la síntesis de TGF-β, lo cual conduce al incremento en la expresión de RANKL y IL-17 (158). Mediadores de resolución de la inflamación La resolución de la inflamación es un proceso bioquímico y metabólico activo, mediado principalmente por mediadores pro-resolución (159). El inicio de la inflamación lleva a la liberación y activación de mediadores solubles como el complemento, aminas vasoactivas, citoquinas y lípidos (160). El proceso de resolución de la inflamación fue considerado inicialmente como un proceso pasivo (160). Sin embargo, es un proceso organizado ue implica la eliminación de los agentes agravantes, entre otros (160). El fracaso de los mecanismos de resolución conlleva al paso de una inflamación aguda a una inflamación crónica (152). Un mecanismo importante en la resolución de la inflamación es la eferocitosis, o la endocitosis de neutrófilos apoptóticos. Esto previene una necrosis secundaria y el posterior daño tisular. Consecuencia de este proceso es el cambio de macrófagos M1 proinflamatorios por macrófagos M2 antiinflamatorios. Los macrófagos M2 modifican su metabolismo lipídico hacia la producción de mediadores pro-resolutivos: lipoxinas, resolvinas, protectinas y maresinas (152). Estos mediadores limitan el reclutamiento de neutrófilos e incrementan el reclutamiento de monocitos, los cuales asisten en el aclaramiento de células apoptóticas (152). Además, son importantes en etapas tempranas de la inflamación; ya que reducen el componente celular de la inflamación al inhibir la producción y el transporte a sitios de inflamación de células inflamatorias (39). 26 Receptores TAM y agonistas PROS1 y GAS6 Los receptores TYRO3, AXL y MERTK (TAM) son una familia cuyos miembros son receptores tirosina quinasas: receptor proteína tirosina quinasa (TYRO3), receptor proteína tirosina quinasa AXL (AXL) y proteína tirosina quinasa protooncogén MER (MERTK) y tienen un papel en la resolución de la inflamación (161). Entre las funciones de sus ligandos, la proteína de arresto de crecimiento específico-6 (GAS6 por sus siglas en inglés) y la proteína S (PROS1), está la unión a la fosfatidilserina que se encuentra enriquecida en la cara extracelular de la membrana plasmática de una célula apoptótica. Estos receptores median la fagocitosis de células apoptóticas (162). También son reguladores negativos del IFN tipo I. Si hay una disminución de la señal de los receptores TAM, puede suceder un aumento en la expresión de genes que codifican del IFN tipo I. En un modelo murino, estos receptores bloquean la función inmunológica de la gingiva, elevan los niveles de expresión de genes que codifican RANKL y posteriormente se pierde altura del hueso alveolar (163). ANXA1 y FPR2 La anexina A1 es un mediador pro-resolutivo. Entre sus funciones se encuentra la inhibición de la actividad de la fosfolipasa A2, lo cual evita la generación de mediadores lipídicos proinflamatorios (164). Además, ANXA1 contribuye a detener la migración leucocítica, promueve el aclaramiento bacteriano y la eferocitosis. La activación de su receptor, N-formil péptido receptor 2 (FPR2/ALX), puede activar en respuestas proinflamatorias o antiinflamatorias (165). Este también actúa como receptor de las lipoxinas, las cuales frenan la migración de leucocitos, promueven el aclaramiento bacteriano, promueven la producción de IL-10 y la eferocitosis, entre otras funciones (152). Inmunoglobulinas Los receptores, generalmente, se enlazan a un grupo definido y limitado de ligandos (166). En cambio, la población de inmunoglobulinas o anticuerpos es altamente específica y pueden enlazarse potencialmente una cantidad de antígenos ilimitada con poca o ninguna similitud (166). Las inmunoglobulinas pueden actuar como receptores de membrana y generar la señalización y activación de células B o como moléculas solubles efectoras que se enlazan y neutralizan antígenos (167). 27 Las inmunoglobulinas pertenecen a la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF, por sus siglas en inglés) (168). Las inmunoglobulinas consisten en dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas, y las cadenas livianas se pueden dividir en cadena liviana κ y cadena liviana λ (166). Cada cadena tiene una región variable y una región constante (169). Mediante la región variable las inmunoglobulinas pueden reconocer a un número virtualmente ilimitado de antígenos (166). En cambio, la región constante define la función efectora de la inmunoglobulina (170). Determinantes comunes, denominado isotipos, son propios de la porción constante y permiten agrupar a las inmunoglobulinas en clases (166). En el desarrollo temprano de las células B se generan los rearreglos de los dominios variables de las cadenas liviana o pesada y se asocian con la cadena pesada µ para producir el isotipo IgM, el isotipo IgD se obtiene por ayuste alternativo (166). La estimulación antigénica y la regulación por citoquinas genera la asociación de los dominios variables con otros isotipos, IgG, IgA e IgE, en un proceso denominado recombinación cambio de clase (166). Las clases IgG e IgA se pueden dividir asimismo en subclases (171). Las subclases de IgG son IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y se clasificaron en este orden según los niveles séricos en un individuo sano en un ambiente de Europa occidental (166). IgG1 e IgG3 IgG es la inmunoglobulina de mayor concentración en el cuerpo. Adicionalmente, entre todas las inmunoglobulinas, IgG tiene la vida media más larga (166). Las diferencias en la región constante de las cadenas pesadas influyen en la flexibilidad y afinidad funcional de la inmunoglobulina (166). El dominio constante 1 de la cadena pesada y la región de bisagra son los principales responsables de la flexibilidad de la inmunoglobulina (166). IgG3 presenta una mayor flexibilidad y accesibilidad a moléculas efectoras, debido a una mayor longitud de su región de bisagra (171). Las subclases de la IgG exhiben distintas funciones, entre ellas su asociación a la cascada del complemento (166). El complemento es una red de proteínas solubles y de membrana que conducen a una variedad de respuestas biológicas: fagocitosis, adhesión inmunitaria y remoción de complejos inmunitarios, migración celular, regeneración tisular, activación 28 celular y modulación de la respuesta de PRRs (172). Entre las distintas subclases de IgG, IgG3 e IgG1 generan la activación más eficiente del complemento (171), siendo IgG3 la que presenta una mayor afinidad por el componente del complemento 1q (C1q) (166). Los anticuerpos, además de neutralizar patógenos, pueden provocar funciones efectoras en células del sistema inmunitario innato y adaptativo (171). Fagocitosis, dreganulación y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos inician por medio de la función efectora del fragmento Fc al unirse al FcR (171). IgG1 e IgG3 se enlazan al receptor FcγRI de monocitos, FcγRIIA y FcγRIIIB de neutrófilos y FcγRIIIA de células NK (171). Los niveles de IgG séricos en respuesta a periodontopatógenos se han asociado con un incremento en el riesgo de desarrollar enfermedad de Alzheimer (173) y como factor de riesgo de un estado protrombótico (174). Se han reportado características demográficas, de comportamiento y de salud oral y en general son determinantes de la respuesta sistémica de anticuerpos a patógenos periodontales (175). Los niveles séricos de IgG son elevados independientemente del grado de progresión de periodontitis (176). El factor de virulencia gingipaína K de P. gingivalis funciona como una proteasa de IgG1 e IgG3, comprometiendo la función de opsonización del anticuerpo (177). Se ha postulado que esta actividad es responsable de la reducción en el efecto protector de la respuesta humoral contra antígenos de P. gingivalis en periodontitis (177). Se han identificado patrones en las respuestas de las subclases de IgG a bacterias orales y se han reportado efectos sustanciales de la enfermedad que afectan el nivel y la distribución de subclases de anticuerpos contra una variedad de bacterias orales (178). Metaloproteinasas de matriz e inhibidores de metaloproteinasas El rompimiento inflamatorio de tejidos suaves acontece por cuatro vías: vía dependiente de plasminógeno, vía fagocítica, vía osteoclástica y vía dependiente de MMPs (179). Las MMPs son las enzimas implicadas en la degradación de la ECM (180). Su transcripción es controlada por citoquinas, factores de crecimiento, hormonas e interacción células-células y células-matriz (181). La activación de zimógenos regula las actividades de las MMPs, en 29 cambio su inhibición ocurre mediante inhibidores endógenos, α2-macroglobulina y los TIMPs (180). El rol fisiológico de las MMPs incluye la migración celular, remodelación tisular durante la organogénesis y el crecimiento, cicatrización de heridas, angiogénesis, formación del esmalte y el procesamiento y presentación de antígenos (179). La degradación significativa de ECM acontece como respuesta a la inflamación y otros procesos celulares representados por el desbalance entre la activación de MMP e inhibidores de MMP endógenos (182, 183). Las células inflamatorias: monocitos, macrófagos, linfocitos, células polimorfonucleares; y células residentes: fibroblastos, células epiteliales y células endoteliales, provocan parcialmente la degradación de tejido gingival durante la periodontitis cuando expresan MMPs (179). Se ha reportado que el tratamiento periodontal, en pacientes con periodontitis con un grado de progresión elevado, puede reducir los niveles locales de MMPs (184). Las MMPs son capaces de participar en cascadas de activación cruzada y de activación automática, así como de regular la disponibilidad de muchas moléculas de señalización inflamatorias, actuando en sitios periodontalmente inflamados (185). MMP-2 y MMP-9 La MMP-2 y MMP-9, también conocidos como gelatinasa A y gelatinasa B, respectivamente, digieren gelatina con asistencia de fibronectina tipo II (180). Además, digieren las moléculas de la ECM como los colágenos tipo IV, V XI, laminina y agrecano (180). Se ha sugerido que MMP2 y MMP-9 participan en la destrucción tisular en periodontitis (186). La MMP-9 es esencial para el reclutamiento de osteoclastos (187) P. gingivalis puede activar MMP-2 en HPDL (188). MMP-3 La MMP-3, denominado cómo estromelisina 1, tiene la capacidad de digerir moléculas de la ECM y participar en la activación de proMMPs (180). Su eficiencia proteolítica es superior al de MMP-10 (estromelisina 2) (179). Polimorfismos en el gen de MMP-3 se han 30 asociado con la progresión de la periodontitis en poblaciones de Estados Unidos y Brasil (189). MMP-12 La MMP-12, conocida como metaloelastasa o elastasa de macrófagos, se expresa principalmente en macrófagos, condrocitos hipertróficos y osteoclastos (180, 190, 191). Digiere elastina y moléculas de la ECM, asimismo es indispensable para la migración de macrófagos (192). La MMP-12, a diferencia de otras MMPs, redujo la activación del complemento al inhibir a C3 en un modelo murino de peritonitis (193). La MMP12 exhibie un rol protector al eliminar trampas extracelulares de neutrófilos (NETs por sus siglas en inglés) y disminuye vías inflamatorias mediante la inactivación de C3a y C5a, limitando actividad quimioatrayente (193). TIMP-1 Los TIMPs tienen la capacidad de inhibir todas las MMPs (180). Sin embargo la inhibición ocurre con diferentes eficiencias: TIMP-1 inhibe pobremente a MMP-14, MMP- 16, MMP-19 y MMP-24 (180) e inhibe eficazmente a la proteína 10 que contiene dominio de desintegrina y metaloproteinasa (ADAM-10, por sus siglas en inglés) (180). Polimorfismos en el gen de TIMP-1 en una población brasileña se han asociado con un incremento en la progresión de la periodontitis (189). Sistema de activación del plasminógeno El sistema de activación del plasminógeno es una cascada enzimática compleja, cuyo propósito es la transformación de plasminógeno a plasmina (194). El proceso de transformación inicia mediante dos activadores, el activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA, por sus siglas en inglés) y activador tisular del plasminógeno (tPA, por sus siglas en inglés) (195). El inhibidor de activación de plasminógeno tipo 1 (PAI-1, por sus siglas en inglés) y tipo 2 (PAI-2, por sus siglas en inglés) y la proteína nexina controlan a los activadores (195). 31 La plasmina degrada la fibrina para formar péptidos solubles, generando la eliminación excesiva del sistema circulatorio y los tejidos (194). Asimismo, hidroliza la estructuras moleculares de la ECM y la membrana vascular basal como la laminina y el colágeno tipo IV (194). tPA El tPA activa al plasminógeno en medio del proceso de disolución de fibrina en la región de daño tisular (194). Se ha reportado la presencia de ambos PAs y sus inhibidores en el GCF (196), con una concentración elevada de tPA y PAI-2 en el surco gingival (194). En un modelo canino se ha observado un incremento en los niveles de activación de plasminógeno y tPA en gingiva inflamada (197). Recapitulación El proceso inflamatorio consiste en las siguientes etapas: 1. cronicidad y extensión del daño inflamatorio, 2. formación de fibrosis y cicatrización y 3. resolución y recuperación de la homeostasis (39). El manejo de la periodontitis en un estado activo se basa en la eliminación de la biopelícula para que se restituyan especies microbianas que promuevan la salud. Este manejo contribuye al proceso de reducción de la inflamación, ya que no fue activado de manera natural por mecanismos pro-resolutivos. La terapia clínica parece ser capaz de impulsar la recuperación de la estructura y función del tejido. Los niveles de reducción de la biopelícula, indispensables para recuperar la simbiosis, suelen ser distintos entre pacientes. En los extremos se observan pacientes resistentes a la enfermedad y pacientes que reaccionan y ejecutan una respuesta destructiva ante la formación leve de biopelícula (7). Desarrollo del tema Justificación El tratamiento de la periodontitis no ha sido modificado significativamente en los últimos 30 años. Su objetivo principal se centra en la eliminación de la bolsa periodontal. Al reducir la biopelícula dental se promueve un ambiente gingival homeostático con el fin de obtener la resolución del proceso inflamatorio (3, 198, 199). 32 En las pasadas dos décadas, la prevalencia y la incidencia de la periodontitis se ha mantenido invariable (12). La carga global de la periodontitis no ha disminuido de manera relevante en los últimos años, esto debido al crecimiento de la población y la reducción de la pérdida dental (13). Es importante resaltar que existe cierta población de pacientes que no logran responder de manera adecuada a la terapia convencional (67). Al ser la periodontitis una enfermedad inflamatoria crónica, podría existir cierta deficiencia en los niveles de expresión de genes que codifican por proteínas de resolución inflamatoria (200). La búsqueda de nuevos manejos terapéuticos integrales de las enfermedades periodontales beneficiaría a los pacientes, pero es necesario comprender los mecanismos del sistema inmunitario subyacentes de la enfermedad. Determinar el perfil de expresión de genes que codifican por proteínas involucradas en la inflamación tiene el potencial de elucidar ciertos aspectos subyacentes de la patogénesis de la periodontitis. Pregunta e hipótesis Pregunta ¿Existe diferencia en el perfil de expresión de genes que codifican por proteínas proinflamatorias y proteínas que contrarrestan la inflamación entre pacientes con periodontitis y pacientes sin periodontitis? Hipótesis El perfil de expresión de genes que codifican proteínas proinflamatorias y de resolución de la inflamación es diferente en pacientes con periodontitis comparado con pacientes sin periodontitis. Objetivo general • Evaluar el perfil de expresión de proteínas involucradas con la patogénesis de la periodontitis en muestras de tejido conectivo gingival provenientes de pacientes con periodontitis y de pacientes sin periodontitis. 33 Objetivos específicos 1. Comparar los niveles de transcripción de IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A, TNF-α, LTA, COX2, TLR2, TLR4, FPR1, CXCL8, IgG1 e IgG3, MMP2, MMP3, MMP9, MMP12, TIMP1 y el activador tisular del plasminógeno en muestras de tejido conectivo gingival para diferenciar si la expresión de estos genes que codifican por proteínas proinflamatorias, receptores de reconocimiento de patrones, quimiocina, inmunoglobulinas, proteínas relacionadas con la degradación de proteínas de la matriz extracelular y la proteína del sistema de activación del plasminógeno tiene asociación con la periodontitis. 2. Comparar la expresión de genes que codifican por los receptores TAM y los ligandos GAS6, PROS1, TGF-β1, la subunidad TGF-βR1, el mediador pro-resolutivo anexina A1, el receptor FPR2/ALX, las citoquinas IL-4 e IL-10 en muestras de tejido conectivo gingival de pacientes con periodontitis y pacientes sin periodontitis para comprobar si existe asociación entre los niveles de expresión de dichos genes que codifican por proteínas pro-resolutivas, citoquinas antiinflamatorias con la periodontitis. 3. Determinar la asociación entre la expresión de genes que codifican citoquinas proinflamatorias, proteínas pro-resolutivas, proteínas de receptores de reconocimiento de patrones, citoquinas antiinflamatorias, inmunoglobulinas, metaloproteinasas, proteína del sistema de activación de plasminógeno y la manifestación clínica de la periodontitis para comprender el rol entre ambos procesos y la enfermedad. Materiales y métodos Estudio descriptivo El estudio se realizó en coordinación entre el Centro de Investigación de Biología Celular y Molecular (CIBCM) y la Clínica de Énfasis de Periodoncia de la Facultad de Odontología, ambas pertenecientes a la Universidad de Costa Rica (UCR). Las cirugías periodontales, como lo es el alargamiento de corona y el raspado y alisado radicular a campo abierto, se encuentran entre los procedimientos clínicos realizados en el Énfasis de Periodoncia. Un aspecto común de la cirugía periodontal es la remoción de tejido conectivo 34 gingival, este es desechado en el contenedor de material infectocontagioso. Se aprovechó el procedimiento de cirugía periodontal para la obtención de la muestra de tejido conectivo gingival para su análisis. Selección de población La población participante fueron pacientes tratados en la Clínica de Énfasis de Periodoncia de la Facultad de Odontología de la UCR entre el 25 de agosto del 2017 al 14 de febrero del 2020. Se les realizó un expediente clínico, el cual consiste en la historia clínica, la sección de periodoncia, el análisis radiográfico y el periodontograma, entre otras secciones. La muestra poblacional (n) inicial fue de 40 pacientes afectados con periodontitis y 30 pacientes no afectados con periodontitis. Los participantes del grupo con periodontitis fueron diagnosticados con periodontitis con bolsa periodontal en al menos 2 piezas dentales distintas no adyacentes. Los participantes del grupo de no afectados con periodontitis presentaron una profundidad del surco gingival de 3 mm o menos en todas sus piezas dentales, además carecieron de cualquier perdida de NIC de origen periodontal, tampoco refirieron haber recibido un tratamiento periodontal previo. El diagnostico periodontal fue realizado por estudiantes de la clínica de Énfasis de Periodoncia y corroborado por su instructor especialista en periodoncia. En la clínica se utilizó la sonda periodontal de la Organización Internacional de Estandarización (ISO por sus siglas en inglés) 21672, cumplió las siguientes características: estructura cilíndrica fina, una punta con un diámetro de 0.5 mm, redondeada a 1.75° y que presente una escala marcada de 15 mm (5). La población investigada cumplió los siguientes criterios de inclusión: tener entre 18 y 65 años y más de 20 piezas dentales en la cavidad oral. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: padecer de diabetes mellitus (tipo I o II), hipertensión arterial, enfermedades autoinmunes (esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso, entre otras), fumador, tener al menos una prótesis dental removible, tener aparatología de ortodoncia, tener al menos un piercing oral, haber consumido antibióticos en los últimos 3 meses, haber consumido drogas antiinflamatorias de uso crónico (indicado por un médico de 35 cabecera), uso de drogas antiinflamatorias por más de 3 meses, tener un cuadro viral clínico oral activo (herpes labial, entre otros), estomatitis aftosa recurrente o patologías orales que afecten la periodontitis (liquen plano, pénfigo vulgar, entre otros) (201). Las participantes femeninas en periodo de gestación o en periodo de lactancia, fueron excluidas. Se valoraron caso por caso distintos métodos anticonceptivos para determinar si inducían alteración en la gingiva. También se evaluaron casos específicos de consumo de distintos medicamentos para decidir si provocan efectos proinflamatorios o antiinflamatorios, ante esta posibilidad, se excluyó la muestra del estudio. Consentimiento informado Para la toma de muestras se procedió a hablar con el paciente antes de que a este se le inicie la cirugía periodontal. Se comunicó verbalmente y por escrito el consentimiento informado aprobado por el Comité Ético Científico de Vicerrectoría de Investigación del proyecto VI-801-B9-364, aprobado en la sesión número 65. Se solicitó la colaboración. Si el paciente accedió voluntariamente a participar y firmó el consentimiento informado, se continuó con la obtención de la muestra. Cirugía Periodontal y obtención de la muestra gingival Se realizó la cirugía en los pacientes que lo requirieron. Durante la cirugía se obtuvo la muestra de tejido conectivo gingival. Las muestras presentaron un diámetro de 5 a 10 mm. Las muestras fueron colocadas en un microtubo (1.5 mL) con solución estabilizadora RNAlater® (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Estados Unidos), la solución estabilizadora tiene 5 a 10 veces el volumen de la muestra. Esta solución permitió conservar las muestras de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y ácido desoxirribonucleico (ADN) a -80° C. Se tomaron muestras de pacientes con periodontitis (clasificadas con la letra ‘E’) y de pacientes sin periodontitis (clasificados con la letra ‘C’). Los participantes del grupo control de los que se obtuvo una muestra fueron pacientes que requieren una cirugía periodontal por motivos restaurativos. 36 Extracción y verificación de la pureza de ARN Se utilizó el kit de purificación ARN/ADN, número de catálogo 48700 (Norgen Biotek). Este sistema separa el ADN genómico del ARN total. La muestra fue transferida a una gasa estéril para eliminar el exceso de RNAlater® (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Estados Unidos). Inmediatamente se pasó a un mortero con pistilo. La muestra fue molida y se le agregó 300 µL de Buffer SKP. Se continúo moliendo hasta que la muestra se lisó y homogenizó. Con una pipeta, se transfirió el lisado a un tubo de microcentrífuga libre de ribonucleasas (RNasas). Se agregaron 300 µL de agua libre de RNasas y se mezcló mediante mezclador de vórtice. Seguidamente se adicionaron 20 µL de proteinasa K a una concentración de 20 mg/mL. Se incubó a 55° C en baño maría por 15 minutos. Durante los 15 minutos en baño maría, la muestra se mezcló cada 5 minutos en mezclador de vórtice por 10 segundos. Se trasladó el tubo a la Centrífuga 5424 (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), dicha centrífuga se utilizó a lo largo del procedimiento de purificación de ADN y ARN. Se utilizaron tubos de microcentrífuga libre de RNasas a lo largo del procedimiento. Se centrifugó el lisado durante 2 minutos a una referencia de 5200 xg (veces la fuerza de la gravedad) para sedimentar cualquier residuo celular. Se transfirió el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga. Se anotó el volumen del sobrenadante. Se ensambló la columna de purificación de ADN genómico (gDNA, por sus siglas en inglés) con un tubo de recolección. Se agregaron hasta 600 µL del sobrenadante a la columna y se centrifugó por 2 minutos a 5200 xg. Se aseguró que el volumen completo del sobrenadante haya pasado a través de la columna al tubo de recolección. En las ocasiones que el sobrenadante no haya pasado completamente, la columna se centrifugó por un minuto adicional a 14000 xg. Se transfirió el flujo del tubo de recolección a un tubo de microcentrífuga y se dejó semisumergido en hielo para ser utilizado posteriormente en la purificación de ARN. Se volvió a ensamblar la columna con el tubo de recolección. Se agregaron 400 µL de solución de lavado A a la columna y se centrifugó a 3500 xg por un minuto. Se descartó el flujo del tubo de recolección. Se volvieron a agregar 400 µL 37 de la solución de lavado A a la columna y se centrifugó a 3500 xg por un minuto. Se volvió a descartar el flujo del tubo de recolección. Se centrifugó la columna a 14000 xg por 2 minutos para secar completamente la resina de la columna. Se colocó la columna en un tubo de elución de 1.7 mL. Se agregaron 100 µL de amortiguador de elución F a la columna y se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 minutos. Se centrifugó por 2 minutos a 200 xg, seguido por 1 minuto a 14000 xg. En las ocasiones que no pasó por la columna el volumen completo se centrifugó a 14000 xg por un minuto adicional. Por cada 100 µL de flujo recuperado en el tubo semisumergido en la hielera se agregaron 60 µL de etanol absoluto. Se mezcló en mezcladora de vórtice. Se ensambló la columna de purificación de ARN con el tubo de recolección. Se agregaron hasta 600 µL del lisado con etanol a la columna y se centrifugó a 3500 xg por 2 minutos. En las ocasiones en que el lisado no pasó completamente a través de la columna, se centrifugó a 14000 xg por un minuto adicional. Se descartó el flujo y se ensambló la columna con el tubo de recolección nuevamente. Se agregaron 400 µL de solución de lavado A a la columna y se centrifugó a 3500 xg por 1 minuto. Se descartó el flujo y se ensambló nuevamente la columna con el tubo de recolección. Se lavó la columna una segunda ocasión agregando 400 µL de la solución de lavado A y se centrifugó a 3500 xg por un minuto. Se volvió a descartar el flujo y se reensambló la columna con el tubo de recolección. Se lavó la columna por tercera ocasión agregando 400 µL de solución de lavado A y se centrifugó a 3500 xg por un minuto. Se descartó el flujo y se reensambló la columna con el tubo de recolección. Se centrifugó a 14000 xg por 2 minutos para secar completamente la resina. Se descartó el tubo de recolección. Se ensambló la columna de purificación de ARN con un tubo de elución de 1.7 mL. Se agregó la solución de elución A a la columna. Se centrifugó por 2 minutos a 200 xg, inmediatamente después se centrifugó a 14000 xg por un minuto. Se repitió el proceso de elución de ARN con un nuevo tubo de elución de 1.7 mL. 38 Se realizó la cuantificación de la primera y segunda elución de ARN utilizando el espectrómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). La razón de absorción 260/280 fue superior a 1.90 en todas las muestras de la primera elución, excepto las muestras E16, C10, C14 y C16. Estas muestras fueron descartadas debido al bajo volumen en el tamaño de la biopsia obtenida. La absorción de la segunda elución en las muestras fue superior a 1.70, excepto las muestra E13 (absorción 260/280 = 1.43) y la muestra C28 (tasa 260/280 = 1.54). La muestra C28 fue utilizada para los ensayos posteriores, la muestra E13 fue descartada. La concentración de ARN total de la muestra E12 fue de 35 ng/µL, por lo cual fue descartada. Adicionalmente, la muestra E11 presento problemas en el almacenamiento, por lo cual también fue descartada. Tratamiento con desoxirribonucleasa y transcripción inversa Las muestras de ARN total purificado se diluyeron a una concentración de 125 ng/µL, excepto las muestras E9 (concentración posterior a la purificación de ARN total de 92.5 ng/µL), E21 (concentración de 29.2 ng/µL), E23 (concentración de 50 ng/µL), E24 (concentración de 43.5 ng/µL), C11 (concentración de 52.8 ng/µL), C13 (concentración de 111.7 ng/µL), C21 (concentración de 119.3 ng/µL), C23 (concentración de 96.3 ng/µL), C27 (concentración de 65.2 ng/µL) y C28 (concentración de 98.1 ng/µL). Se utilizó el kit Deoxyribonuclease I, Amplification Grade (Invitrogen, Massachusetts, Estados Unidos). Se agregaron 48 µL de ARN purificado de una muestra a una concentración de 125 ng/µL a un tubo de 0.2 mL. Con respecto a muestras E19, E21, E23, E24, C11, C13, C21, C23, C27 y C28, se utilizó 48 µL sin diluir. Se agregaron 6 µL de amortiguador de reacción de desoxirribonucleasa (DNasa) I (10X) y 6 µL de DNasa I, grado de amplificación (1 U/µL) a cada tubo. Se dejó reposar a temperatura ambiente por 15 minutos. Posteriormente se agregaron 6 µL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés) a cada tubo. Se transfirieron los tubos al termociclador de 96 pozos Veriti (Applied Biosystems, Massachusetts, Estados Unidos). Se llevaron a una temperatura de 65° C por 10 minutos. Seguidamente, se utilizó el kit RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific, Massachusetts, Estados Unidos). A cada tubo se agregaron 6 µL de Oligo(dT)18 39 Primer. Los tubos se llevaron nuevamente a 65° C por 5 minutos. Seguidamente se agregaron 168 µL de amortiguador de reacción (5X), 36 µL de ribolock, 84 µL de dNTP y 36 µL de RevertAid H Minus M-MuLV transcriptasa inversa a cada tubo. Los tubos se incubaron a 42° C por 60 minutos y 72° C por 5 minutos. Elección de gen de referencia Se montó reacción en cadena de la polimerasa después de la transcripción inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) utilizando el termociclador QuantStudio3 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Estados Unidos) y se determinó el ciclo al que la señal supera el umbral (Ct, por sus siglas en inglés) de tres genes constitutivos: ARNr 18S, GAPDH y RPLP0 (Cuadro I). Cuadro I. Secuencias de cebadores utilizados en este trabajo. Categoría Gen Secuencias del cebador Dirección Tm Ta Tamaño Tamaño Referencia (°C) (°C) del amplicon (bp) Genes GAPDH 5'–GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG– Delantero 64.0 60.0 22mer 130 (202) constitutivos 3’ 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3' Reverso 64.0 60.0 22mer ARNr 5'-CGATTGGATGGTTTAGTGAGG -3' Delantero 64.0 60.0 21mer 87 (203) 18S 5'–AGTTCGACCGTCTTCTCAGC-3’ Reverso 64.0 60.0 20mer RPLP0* 5’–TGGTCATCCAGCAGGTGTTCGA– Delantero 62.5 60 22mer 119 (204) 3’ 5’–ACAGACACTGGCAACATTGCGG– Reverso 62.5 60 22mer 3’ Receptores de TLR2 5’ – CTTCACTCAGGAGCAGCAAGCA Delantero 63.5 60 22mer 146 (205) patrones de – 3’ patógenos 5’ – ACACCAGTGCTGTCCTGTGACA Reverso 64.9 60 22mer – 3’ TLR4 5’ – Delantero 66 60 23mer 300 (206) ATATTGACAGGAAACCCCATCCA – 3’ 5’ – Reverso 66 60 23mer AGAGAGATTGAGTAGGGGCATTT – 3’ FPR1 5’ – CCAAACCAGTGACACAGCTACC Delantero 62 60 22mer 131 (207) – 3’ 5’ – CAGCCTAACTCAAGGTGAGACG Reverso 62.7 60 22mer – 3’ 40 Mediadores con IL-1α 5’– Delantero 63.5 59.0 24mer 96 (208) tendencia TGTATGTGACTGCCCAAGATGAA–3’ proinflamatoria 5’–AGAGGAGGTTGGTCTCACTACC– Reverso 64.0 59.0 22mer 3’ IL-1β 5’ – Delantero 64.0 60.0 22mer 131 (209) CCACAGACCTTCCAGGAGAATG–3’ 5’–GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG Reverso 64.7 60.0 23mer –3’ IL-6 5’–AGACAGCCACTCACCTCTTCAG– Delantero 64.0 60.0 22mer 132 (210) 3 ' 5’– TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG– Reverso 64.0 60.0 22mer 3' IL-17A 5’-CGGACTGTGATGGTCAACCTGA- Delantero 64.0 60.0 22mer 156 (210) 3' 5’–GCACTTTGCCTCCCAGATCACA- Reverso 64.0 60.0 22mer 3' TNF-α 5'-TGCTGCACTTTGGAGTGATCG-3' Delantero 62.1 59 21mer 142 Modificado (211) 5'-TGAGGGTTTGCTACAACATGGG-3' Reverso 62.2 59 22mer LTA 5’- AGCCCTAGTACTGTCTTCTTTGG Delantero 60.3 60 23mer 122 Elaboración – 3’ propia 5’ – ACCCCTGAAATGGTCAGAATGG Reverso 62.3 60 22mer – 3’ COX2 5’ – CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG Delantero 62 60 22mer 156 (212) – 3’ 5’ – GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA Reverso 63.8 60 22mer – 3’ Quimiocina CXCL8 5 – Delantero 62 60 23mer 112 (213) GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC – 3’ 5 – CACAACCCTCTGCACCCAGTTT – Reverso 64.7 60 22mer 3’ Mediadores con IL-4 5’ – Delantero 62.7 60 23mer 108 (210) tendencia CCGTAACAGACATCTTTGCTGCC – antiinflamatoria 3’ 5’ – GAGTGTCCTTCTCATGGTGGCT – Reverso 63.5 60 22mer 3’ IL-10 5’ – TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA Delantero 64.5 60 22mer 126 (214) – 3’ 5’ – TCAGACAAGGCTTGGCAACCCA Reverso 66 60 22mer – 3’ TGFB1 5’ – AGAAGCGGTACCTGAACC – 3’ Delantero 58.1 55.0 18mer 121 Modificado (215) 5’ – CAAGCATAACACCAGTGCC – 3’ Reverso 58.8 55.0 20mer TGFBR1 5’ – Delantero 57.8 55.0 22mer 119 Elaboración CCACAGAGTGGGAACAAAAAGG – propia 3’ 5’ – CCCAGAATACTAAGCCCATTGC Reverso 57.6 55.0 22mer – 3’ 41 Mediadores con TYRO3 5’– Delantero 63.2 59 23mer 88 Modificado tendencia de GCAAGCCTTTGACAGTGTCATGG– (216) resolución de la 3’ inflamación 5’– Reverso 62.6 59 23mer GGGCATCAGCGATGAACTAAAGG– 3’ AXL 5’ – TTTGGAGCTGTGATGGAAGG – Delantero 60 55 20mer 120 Modificado 3’ (217) 5’ – GCTTCACTCAGGAAATCCTCC – Reverso 64 59 21mer 3’ MERTK 5’ – TTAAGCAGGAAGATGGGACC – Delantero 60 55.0 20mer 119 Modificado 3’ (218) 5’ – CTGAAGTCTTTCATGCACGC – 3’ Reverso 60 55.0 20mer GAS6 5’ – ACCTCGTGCAGCCTATAAACC – Delantero 64 59 21mer 104 Elaboración 3’ propia 5’ – CGTGTTCACTTTCACCGTTTCC – Reverso 66 59 22mer 3’ PROS1 5’ – CTCCTACTATCCTGGTTCTGG – Delantero 64 59 21mer 130 (219) 3’ 5’ – CAAGCATAACACCAGTGCC – 3’ Reverso 58 55 19mer ANXA1 5’ –AGCCCCTATCCTACCTTCAATCC Delantero 62.9 59 23mer 127 Elaboración – 3’ propia 5’ – GTTGACGCTGTGCATTGTTTCG – Reverso 62.6 59 22mer 3’ FPR2 5’ – GCAGCCAAGATCCACAAAAAGG Delantero 66 60 22mer 116 Elaboración – 3’ propia 5’– Reverso 66 60 22mer AGAAGGGCAACCAGTTGAAAGG–3’ Inmunoglobulinas IgG1 5’ – Delantero 62.3 59 24mer 76 Elaboración CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC propia – 3’ 5’ – Reverso 63.1 59 25mer CTTTGGAGATGGTTTTCTCGATGGG – 3’ 42 IgG3 5’ – Delantero 62.8 59 25mer 93 Elaboración CATGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTG propia – 3’ 5’ – Reverso 62.4 59 25mer CTACACCTGCAACGTGAATCACAAG – 3’ Metaloproteinasas MMP2 5’ – AGCGAGTGGATGCCGCCTTTAA Delantero 65.2 60 22mer 138 (220) e inhibidor de – 3’ metaloproteinasas 5’ – CATTCCAGGCATCTGCGATGAG Reverso 62.6 60 22mer – 3’ MMP3 5’ – CACTCACAGACCTGACTCGGTT Delantero 63.5 59 22mer 156 (221) – 3’ 5’ – AAGCAGGATCACAGTTGGCTGG Reverso 64 59 22mer – 3’ MMP9 5’ – GCCACTACTGTGCCTTTGAGTC – Delantero 62.4 59 22mer 125 (222) 3’ 5’ – CCCTCAGAGAATCGCCAGTACT Reverso 62,7 59 22mer – 3’ MMP12 5’–TTGGAGGGGATGCACATTTCG–3’ Delantero 62.9 59 21mer 132 Elaboración propia 5’– Reverso 62.6 59 23mer CGGCCTTTGGATCACTAGAATGG–3’ TIMP1 5’ – GGAGAGTGTCTGCGGATACTTC Delantero 68 60 22mer 100 (223) – 3’ 5’ – Reverso 70 60 23mer GCAGGTAGTGATGTGCAAGAGTC – 3’ Activador tisular tPA 5’ – TGGTGCTACGTCTTTAAGGCGG Delantero 63.8 59 22mer 101 (224) del plasminógeno – 3’ 5’ – GCTGACCCATTCCCAAAGTAGC Reverso 62.8 59 22mer – 3’ Tm: Temperatura de fusión donde la mitad del dúplex de ADN se disocia para convertirse en monocatenario e indica la estabilidad del dúplex (225). Ta: temperatura de hibridación (225). *Gen de referencia Se montó un RT-PCR (Cuadro II.) de los genes ARNr 18S, GAPDH y RPLP0 con las muestras C5, C6, C7, C8, C9, C11, C12, C15, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10 y E14. Se utilizaron 5 µL de PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (Applied Biosystems, 43 Massachusetts, Estados Unidos), 2 µL de agua libre de nucleasas, 1.5 µL del cebador correspondiente [10 µM] y 1.5 µL de ADNc. Además, se realizaron los controles de no amplificación y el control sin molde de ADN. El control de no amplificación consistió en utilizar 5 µL PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix, 3.5 µL de agua libre de nucleasas y 1.5 µL de ADN complementario (ADNc) de muestra. El control de sin molde de ADN consistió en utilizar 5 µL PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix, 3.5 µL de agua libre de nucleasas y 1.5 µL del cebador correspondiente. Se analizaron las muestras cuyos controles dieron negativos. Cuadro II. Programa de amplificación para elección de gen de referencia. Etapa de choque térmico Etapa de PCR Etapa de curva de disociación Activación Activación de la de Dual- uracil- Lock™ Desnaturalización Hibridación Extensión Desnaturalización Hibridación Disociación ADN polimerasa glicosilasa de ADN 50° C 95° C 95° C 59° C 72° C 95° C 60° C 95° C 2 minutos 1 minuto 1 minuto 1 minuto 1 segundo 15 segundos (1.6° 15 segundos (1.6° 2 minutos (1.6° (1.6° (1.6° (1.6° (0.15° C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) 1 ciclo 50 ciclos 1 ciclo Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para el análisis de los genes de interés Se montó una RT-qPCR (Cuadro III.) utilizando el termociclador QuantStudio3 con PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix para cada uno de los genes de interés (Cuadro I.). Se incluyó el gen de expresión constitutiva, RPLP0, con el fin de normalizar los resultados de todas las muestras y de todos los genes a analizar. Además, se realizó la etapa de curva de disociación para el análisis de las características de disociación del ADN durante el 44 calentamiento. Se observó un único pico en la curva de disociación de las muestras analizadas. Se realizaron las pruebas por duplicado. Cuadro III. Programa de amplificación para los genes de interés Etapa de choque térmico Etapa de PCR Etapa de curva de disociación Activación Activación de la de Dual- uracil- Lock™ Desnaturalización Hibridación Extensión Desnaturalización Hibridación Disociación ADN polimerasa glicosilasa de ADN 50° C 95° C 95° C 59° C 72° C 95° C 60° C 95° C 2 minutos 1 minuto 1 minuto 1 minuto 1 segundo 15 segundos (1.6° 15 segundos (1.6° 2 minutos (1.6° (1.6° (1.6° (1.6° (0.15° C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) C/segundo) 1 ciclo 40 ciclos 1 ciclo Se utilizaron 5 µL de PowerUp™ SYBR™ Green Master, 2 µL de agua libre de nucleasas, 1.5 µL del cebador correspondiente [10 µM] y 1.5 µL de ADNc de muestra. Además, se realizaron los controles de no amplificación y no molde. Se excluyeron del estudio los resultados de los ensayos cuyo Ct superó el ciclo 35, los resultados cuyo control negativo dio positivo, cuando se presentó una doble curva de disociación, o cuando la diferencia de Ct entre replicas fue mayor a 1.5 (Cuadro IV.). 45 Cuadro IV. Ensayo de muestras excluidas de los análisis estadísticos Criterio de exclusión Muestra Gen de interés Ct superó el ciclo 35 C1 IL-1α IL-1β TNF-α AXL MERTK IL-6 C2 IL-1α IL-1β TNF-α AXL MERTK PROS1 MMP12 TGFR1 IL-10 LTA MMP2 IL-4 IL-6 C3 IL-1α 46 IL-1β TNF-α AXL MERTK GAS6 PROS1 MMP12 TGFBR1 IL-10 CXCL8 TLR2 MMP2 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 C5 TGFβ1 C6 TGFβ1 C7 IL-17A TGFβ1 C8 TYRO3 MMP9 47 IL-6 C9 IL-17A TYRO3 PROS1 IL-10 FPR1 MMP9 IL-4 IL-6 TGFβ1 C11 IL-10 FPR1 IL-4 IL-6 TGFβ1 C12 IL-4 IL-6 TGFβ1 C13 IL-4 IL-6 C15 IL-4 IL-6 48 C19 IL-10 C20 IL-10 C21 IL-10 IL-4 TGFβ1 C22 IL-10 TGFβ1 C23 IL-10 C24 IL-10 C27 IL-10 C29 IL-10 TLR2 LTA TLR4 E1 IL-1α IL-1β TNF-α AXL MERTK MMP12 IL-10 CXCL8 49 TLR2 COX2 MMP2 MMP9 TLR4 IL-4 IL-6 E2 IL-1β AXL PROS1 IL-6 E3 IL-1α IL-1β TNF-α TYRO3 AXL MERTK GAS6 PROS1 MMP12 TGFBR1 IL-10 50 CXCL8 MMP2 TIMP1 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 E4 TYRO3 E5 TGFβ1 E6 TGFβ1 E7 TYRO3 FPR1 TLR4 IL-4 E9 IL-17A FPR1 MMP9 TLR4 IL-4 IL-6 TGFβ1 E21 IL-17A 51 IL-10 TLR4 E23 IL-10 E24 TYRO3 IL-10 E27 IL-10 TLR2 TLR4 E30 IL-10 E33 IL-17A E34 TLR2 LTA TLR4 E37 IL-17A IL-10 TLR2 LTA TLR4 E39 TLR2 E40 IL-17A TNF-α TYRO3 52 IL-10 Diferencia entre Ct de las réplicas mayor a 1.5 C1 ANXA1 C2 CXCL8 COX2 C3 TYRO3 C4 IL-1α IL-1β TNF-α TYRO3 MMP12 TGFBR1 IL-10 CXCL8 C8 IL-10 C9 TLR2 TLR4 C11 TLR2 PLAT C21 IL-17A C22 IL-4 C23 GAS6 53 E3 TLR4 E5 TIMP1 E6 IL-17A AXL MMP12 TLR4 E7 PROS1 E8 GAS6 E15 TYRO3 E24 MMP3 Doble curva de disociación C2 IgG3 MMP3 TIMP1 PLAT C3 IgG3 MMP3 C11 MMP9 C17 MMP3 MMP9 C18 MMP9 C25 TNF-α E1 MMP3 54 PLAT E3 IgG3 MMP3 E9 TYRO3 E23 AXL Control negativo dio positivo C3 COX2 C4 IL-17A C20 COX2 C22 TLR2 COX2 C23 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 C24 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 C25 IL-4 TGFβ1 C26 IL-4 TGFβ1 55 C27 IL-4 IL-6 TGFβ1 C28 IL-4 IL-6 TGFβ1 C29 MMP3 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 C30 IL-4 IL-6 TGFβ1 E2 PLAT IL-4 E4 IL-1β AXL PROS1 MMP12 TGFBR1 FPR1 56 CXCL8 IgG1 IgG3 COX2 MMP2 MMP3 MMP9 TIMP1 PLAT TLR4 E7 IL-6 TGFβ1 E8 IL-6 TGFβ1 E9 PLAT E10 IL-17A PROS1 TLR2 COX2 MMP2 MMP3 PLAT 57 E14 IL-6 TGFβ1 E15 IL-4 IL-6 TGFβ1 E17 IL-4 IL-6 TGFβ1 E18 IL-4 IL-6 TGFβ1 E19 IL-4 IL-6 TGFβ1 E20 MMP9 IL-4 IL-6 TGFβ1 E21 MMP9 IL-4 IL-6 TGFβ1 58 E22 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 E23 MMP3 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 E24 IL-4 IL-6 TGFβ1 E25 IL-4 IL-6 TGFβ1 E26 PROS1 IL-4 IL-6 TGFβ1 E27 IL-17A PROS1 IL-4 59 IL-6 TGFβ1 E28 MMP3 IL-4 IL-6 TGFβ1 E29 IL-4 IL-6 TGFβ1 E30 PLAT IL-4 IL-6 TGFβ1 E31 IL-4 IL-6 TGFβ1 E32 IL-4 IL-6 TGFβ1 E33 PROS1 TGFBR1 IL-10 60 MMP3 IL-4 IL-6 TGFβ1 E34 IL-17A PROS1 TGFBR1 IL-10 MMP3 E35 IL-17A IL-10 IL-4 TGFβ1 E36 IL-4 IL-6 TGFβ1 E37 IL-4 IL-6 TGFβ1 E38 IL-4 IL-6 TGFβ1 61 E39 PROS1 MMP3 IL-4 IL-6 TGFβ1 E40 AXL PROS1 MMP12 TLR2 LTA COX2 MMP2 MMP3 MMP9 PLAT TLR4 IL-4 IL-6 TGFβ1 62 Análisis estadístico y evaluación de los resultados Elección de gen de referencia Se realizó el análisis estadístico para la elección del gen de referencia utilizando RStudio versión 3.6.1. Se calculó el promedio y la desviación estándar entre las réplicas. Además, se obtuvo la normalidad de cada variable. Se realizó la comparación de promedio desviación estándar por status de cada variable (Cuadro V.). Cuadro V. Medias y desviación estándar de Ct de genes constitutivos según estatus del participante. Gen Medias (Ct) Desviación estándar constitutivo Sanos Periodontitis Sanos Periodontitis 18S 17.92061 17.03517 1.480802 3.000267 GAPDH 20.91244 22.05967 1.299426 3.695532 RPLP0 19.42772 19.44789 1.463668 3.304913 Se realizó el cálculo de las variables normalizadas con los diferentes genes de referencia. Se compararon los promedios y la desviación estándar para cada variable normalizada (Cuadro VI.). 63 Cuadro VI. Comparación de los promedios y la desviación estándar para cada gen constitutivo normalizado. Gen Gen de Medias Desviación estándar constitutivo referencia evaluado 18S GAPDH 4.0 2.4 RPLP0 2.0 2.5 GAPDH 18S -4.0 2.4 RPLP0 -2.0 1.2 RPLP0 18S -2.0 2.5 GAPDH 2.0 1.2 Se realizó la comparación del promedio y la desviación estándar por casos de salud gingival y periodontitis para cada variable normalizada (Cuadro VII.) Cuadro VII. Comparación de los promedios y la desviación estándar por casos sanos y de periodontitis para cada variable normalizada. Gen constitutivo Medias (ΔCt) Desviación estándar Sanos Periodontitis Sanos Periodontitis 18S GAPDH 2.991833 5.024500 0.9149745 2.9427502 RPLP0 1.507111 2.412722 1.332532 3.329818 64 GAPDH 18S -2.991833 -5.024500 0.9149745 2.9427502 RPLP0 -1.484722 -2.611778 0.7812949 1.2604315 RPLP0 18S -1.507111 -2.412722 1.332532 3.329818 GAPDH 1.484722 2.611778 0.7812949 1.2604315 Por último, se generaron los intervalos de confianza para cada gen 18S, GAPDH y RPLP0 (Cuadro VIII.) Cuadro VIII. Intervalos de confianza para cada gen 18S, GAPDH y RPLP0. Gen constitutivo Diferencia (estimado del Intervalo ΔCt) 18S GAPDH 2.03 0.944 – 3.12 RPLP0 0.906 -0.362 – 2.17 GAPDH 18S -2.03 -3.12 – -0.944 RPLP0 -1.13 -1.65 – -0.603 RPLP0 18S -0.906 -2.17 – 0.362 GAPDH 1.13 0.637 – 1.62 Cuando se comparan casos y controles para el gen GAPDH usando el gen 18S como gen constitutivo, hay una diferencia de un ΔΔCt de 2.03 con un intervalo de confianza de 0.944 – 3.12. Cuando se comparan casos y controles para el gen RPLP0 usando el gen 18S como gen constitutivo, entre casos y controles hay una diferencia de un ΔΔCt de 0.906 con 65 un intervalo de confianza de -0.362 – 2.17. Cuando se comparan casos y controles para el gen 18S usando el gen GAPDH como gen constitutivo, entre casos y controles hay una diferencia de un ΔΔCt de -2.03 con un intervalo de confianza de -3.12 – -0.944. Cuando se comparan casos y controles para el gen RPLP0 usando el gen GAPDH como gen constitutivo, entre casos y controles hay una diferencia de un ΔΔCt de -1.13 con un intervalo de confianza de -1.65 – -0.603. Cuando se comparan casos y controles para el gen 18S usando el gen RPLP0 como gen constitutivo, entre casos y controles hay una diferencia de un ΔΔCt de - 0.906 con un intervalo de confianza de -2.17 – 0.362. Cuando se comparan casos y controles para el gen GAPDH usando el gen RPLP0 como gen constitutivo, entre casos y controles hay una diferencia de un ΔΔCt de1.13 con un intervalo de confianza de 0.637 – 1.62. Cuando un intervalo de confianza incluye al cero, significa que no es significativamente distinto al cero. Cuando se utiliza el gen 18S como gen constitutivo para el gen GAPDH, hay una diferencia significativa para casos y controles. Y cuando se utiliza el gen 18S como gen constitutivo para el gen RPLP0, no hay una diferencia significativa para casos y controles, porque el intervalo de confianza incluye al cero. Cuando se utiliza el gen GAPDH como gen constitutivo, en los dos genes las diferencias son estadísticamente significativas. Cuando se utiliza RPLP0 como gen constitutivo, en el caso del gen 18S incluye al cero, y cuando se utiliza el gen GAPDH no incluye al cero. Se excluye el gen GAPDH ya que con ninguno de los 2 genes cumple. Cuando se analizan los Ct, el Ct de RPLP0 fue el menor, lo cual indica que en las muestras tiene una mayor concentración. Análisis de genes de interés Análisis de las variables Se cuantificó el nivel de expresión de los genes que codifican las proteínas de interés IL-1α, IL-1β, IL-17A, TNF-α, COX2, LTA, TLR2, TLR4, FPR1, CXCL8, TYRO3, AXL, MERTK, GAS6, PROS1, ANXA1, FPR2, IL-10, TGFBR1, IgG1, IgG3, MMP2, MMP3, MMP9, MMP12, TIMP1 y tPA y se compararon los valores obtenidos para casos y controles usando RStudio versión 3.6.1. Los resultados de los ensayos de los genes de interés IL-4, IL- 66 6 y TGF-β1 fueron excluidos del análisis estadístico ya que los controles negativos de estos genes de interés dieron positivos en más de un 80 % de las muestras (Cuadro IV.). Se analizaron las muestras E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E14, E15, E17, E18, E19, E20, E21, E22, E23, E24, E25, E26, E27, E28, E29, E30, E31, E32, E33, E34, E35, E36, E37, E38, E39, E40, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C11, C12, C13, C15, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29 y C30. El nivel de expresión de cada gen se normalizó con el promedio del Ct para RPLP0, de acuerdo con la siguiente formula: [(promedio de las réplicas del gen que codifica la proteína de interés) - (promedio de las réplicas de RPLP0)]. Se obtuvo las medias de cada participante. Los niveles de expresión de casos/controles se compararon usando la prueba t de Welch (Cuadro IX.). Cuadro IX. Comparación de los niveles de expresión casos/controles mediante prueba t de Welch. Marcador ΔCt Valor – p Periodontitis Salud gingival IL-1α 6.681706 7.217818 0.6344 IL-1β 7.032892 6.094952 0.4377 IL-17A 9.619197 9.346288 0.8262 TNF-α 8.832296 8.628984 0.8444 COX2 8.135182 8.077885 0.9604 LTA 8.970187 9.537498 0.6536 TLR2 10.341262 9.621767 0.5391 TLR4 9.159261 9.310318 0.9085 67 FPR1 5.86956 5.39579 0.6501 CXCL8 5.713152 4.766530 0.3829 TYRO3 7.848596 8.220000 0.7242 AXL 7.936251 7.470625 0.6455 MERTK 9.440501 9.523544 0.9305 GAS6 7.160340 6.849294 0.7451 PROS1 5.69943 5.24008 0.7065 ANXA1 -0.06180687 0.59983333 0.5936 FPR2 8.549464 8.115333 0.6873 IL-10 13.94031 11.82076 0.1185 TGFBR1 6.766892 6.753016 0.9888 IgG1 -0.790500 -2.196797 0.2817 IgG3 4.422740 3.000105 0.2622 MMP2 5.734563 6.023942 0.8274 MMP3 7.103947 7.173623 0.9615 MMP9 9.590118 9.532798 0.9621 MMP12 5.290022 4.857500 0.7276 TIMP1 4.262136 4.187832 0.9563 tPA 5.010559 4.393998 0.6283 68 No se observaron diferencias significativas. Análisis multivariado de los patrones de expresión No se observaron diferencias significativas en el análisis univariado. Se realizó un análisis multivariado para determinar si algún patrón de marcadores está asociado al estatus clínico. Al inspeccionar la matriz de datos, se constata que hay datos faltantes, lo cual no permite realizar el análisis multivariado. Por lo tanto, se decide eliminar las filas/columnas incompletas para obtener un set de datos con el mínimo de faltantes posible. Se determinó la cantidad de celdas de resultados que había en total y cuántas de estas celdas tenían datos de ΔΔCt. Se excluyeron del análisis las muestras E1, E3, E4, E5, E6, E7, E9, E10, E34, E40, C1, C2, C3, C4, C7, C9 con 19, 21, 23, 10, 17, 6, 9, 13, 16, 18, 19, 20, 21, 18, 14 y 11 datos faltantes, respectivamente. Se imputaron los datos faltantes remanente utilizando solo aquellos casos en los que no hay datos faltantes. 69 Tabla 1. Datos ΔCt para 61 participantes (26 controles y 36 experimentales) y para 30 genes que codifican proteínas involucradas con la periodontitis Mues IL17 TYR MER PROS ANX MMP TGFB CXC COX MMP MMP MMP TIMP IL TGF tra IL1a IL1b A TNFα O3 AXL TK GAS6 1 A1 FPR2 12 R1 IL10 FPR1 L8 TLR2 LTA IgG1 IgG3 2 2 3 9 1 PLAT TLR4 4 IL6 B1 1.15 10.5 1.86 12.0 2.86 4.39 1.23 - 3.32 2.40 1.52 0 33 7 78 4 5 5 1.802 6 0 3 C1 1.96 10.7 0.624 2.33 3.51 7.08 - 5.72 5.32 2.78 9 39 5 7 0 0.686 3 0 4 C2 4.60 11.13 11.9 13.2 11.8 7.438 13.0 14.7 6.06 7 9 40 90 02 18 76 2 C3 10.2 12.5 9.36 10.5 4.225 12.8 8.54 - 4.48 10.6 7.19 7.88 91 14 4 09 99 6 1.316 6 95 4 4 C5 7.74 9.20 9.88 4.66 8.12 8.67 7.87 6.57 - 13.0 10.8 7.22 17.0 9.20 9.64 13.8 12.2 - 2.59 9.73 6.75 12.9 11.6 6.20 8.83 11.9 9 9 7 4 2 6 7 8 1.296 82 22 8 22 4 8 02 01 1.140 2 2 3 04 99 5 5 75 C6 6.25 6.33 8.49 7.55 6.09 8.15 5.71 - 8.91 4.28 5.88 12.4 5.48 4.41 11.5 10.9 - 0.03 8.38 4.56 6.12 9.54 2.55 9.50 8.50 7 4 1 9 7 1 3 3.251 9 1 0 74 0 7 46 48 5.172 6 0 7 0 4 5 1 6 C7 9.93 8.58 10.3 9.23 8.64 8.64 1.822 9.73 8.00 7.59 5.71 9.99 - 6.37 6.36 13.3 9 6 95 5 9 9 3 7 4 4 2 0.132 5 0 77 C8 9.70 8.64 4.86 12.0 8.70 10.7 8.08 4.32 - 11.5 6.45 8.01 6.90 8.94 11.2 14.1 1.472 6.69 11.8 8.69 7.74 4.38 6.22 13.1 8 3 4 91 4 28 6 2 0.651 74 9 6 2 5 84 40 0 77 7 5 9 1 01 C9 13.3 11.1 7.70 11.0 13.4 10.1 3.859 12.8 10.5 10.3 9.02 14.7 - 4.30 5.20 2.20 4.49 4.17 9.54 16 36 8 02 35 95 07 80 08 3 73 2.730 3 3 4 8 6 3 C11 4.54 11.9 11.3 11.0 12.0 6.48 2.52 0.18 1.923 3.42 - 3.36 1.47 1.03 - 0.35 6.21 1.11 1.80 - 6.02 4 47 71 17 24 9 4 8 4 2.46 9 6 3 6.604 7 8 4 9 2.72 9 C12 2 5 9.50 8.73 6.80 11.8 5.59 8.67 10.8 8.20 6.37 - 6.20 5.04 7.09 7.45 7.11 6.43 10.8 5.89 - 5.71 9.03 9.02 7.65 7.38 0 8 7 54 5 1 34 6 7 0.593 9 0 2 1 4 9 18 3 0.685 5 2 0 3 4 C13 5.35 2.02 11.0 5.15 12.1 4.49 8.47 3.91 3.05 - 3.53 0.67 3.91 11.5 8.74 2.55 11.0 2.84 - 4.35 8.22 6.74 11.1 5.40 8.56 13.6 8 6 04 2 52 1 5 9 2 4.692 5 1 3 34 7 1 19 4 1.945 2 4 5 21 4 4 02 C15 9.24 9.92 7.17 9.28 7.08 6.05 9.49 7.93 7.83 2.277 9.24 8.41 8.14 16.9 7.68 11.9 12.1 8.26 0.333 7.82 10.0 5.14 6.67 7.80 4.37 6.95 6.99 7 8 8 8 0 0 0 6 5 4 2 4 08 2 93 04 5 1 08 9 1 3 8 8 1 C17 5.88 6.46 6.90 8.88 7.33 6.59 8.08 7.37 4.61 - 6.65 4.61 6.36 14.4 3.54 4.14 7.95 4.67 - 0.00 5.27 2.30 1.00 2.43 7.72 5 5 6 5 5 8 5 2 1 0.184 5 2 5 46 5 3 3 3 5.319 7 4 7 9 5 1 C18 2.31 1.10 5.58 5.20 6.04 4.51 6.23 4.17 2.95 - 4.51 - 5.21 12.2 2.18 1.63 9.22 5.47 - - 5.92 2.69 2.62 2.06 1.69 7 7 9 4 5 4 1 7 8 3.455 0 0.10 1 98 8 0 3 1 5.611 1.49 9 2 3 3 6 C19 9 7 12.4 12.8 9.44 11.1 11.1 11.0 14.3 12.1 10.0 3.917 9.83 10.3 11.9 4.32 4.32 10.0 5.06 - 4.64 6.55 7.71 7.32 4.36 7.76 3.50 54 11 2 26 78 89 01 52 55 5 64 59 7 5 41 9 0.539 7 1 0 5 7 7 7 C20 - 8.28 14.2 10.0 8.27 7.37 11.3 7.40 5.42 - 11.5 4.44 6.83 - - 6.33 5.53 - - - 2.15 4.13 2.65 - 4.02 0.00 1 40 66 6 6 70 3 2 0.998 02 5 2 0.68 1.37 6 8 5.586 1.14 2.10 3 0 4 1.46 9 C21 6 8 8 1 6 4 - - 1.09 - 3.51 1.35 - - - 3.41 - - 2.36 2.56 4.64 6.87 - 1.73 4.06 0.07 5.49 6.14 - - 6.51 3.18 1.71 2.67 9 0.36 1 2 2.39 3.44 8.853 5 3.06 1.95 2 5 1 1 4.419 9 7 9 8 5 2.10 0.14 9 1 C22 3 7 6 3 1 2 8 6 6 3.13 2.85 6.49 5.10 3.93 4.97 7.06 2.27 3.80 - 6.46 1.35 3.14 6.87 5.11 13.4 3.597 7.50 9.24 11.3 11.6 6.06 5.48 14.8 10.6 1 9 8 0 9 4 8 1 9 4.776 1 2 6 9 1 70 1 9 40 88 4 8 18 19 C23 5.60 3.81 12.6 9.08 6.87 8.52 8.63 5.21 - 6.79 6.96 6.91 8.63 8.07 16.2 16.2 5.431 11.4 12.6 9.77 11.1 15.6 8.88 15.4 8 3 52 7 9 4 3 7 1.900 4 6 8 6 6 34 03 07 03 9 25 94 0 88 C24 7.99 7.65 15.2 11.3 8.98 10.4 12.0 9.28 8.00 0.808 11.4 5.94 9.28 6.03 6.71 13.7 12.2 1.296 7.31 11.0 6.47 9.75 11.4 5.96 12.9 2 9 94 14 8 22 18 7 1 92 5 7 2 8 26 33 9 19 8 1 08 5 24 C25 3.04 0.89 7.81 3.30 2.75 4.38 2.55 1.20 - 4.99 - 1.96 6.53 2.24 2.30 7.73 7.24 - - 3.56 1.76 2.72 6.57 0.60 1.53 6.92 8.07 3 6 2 9 0 9 0 3 5.573 9 0.23 2 1 3 2 8 8 5.971 2.35 5 0 6 7 1 6 7 2 C26 1 3 7.57 7.95 12.8 11.1 8.65 7.55 10.2 8.16 6.42 0.129 10.3 4.90 7.48 16.1 7.28 5.65 13.7 12.8 - 5.56 9.47 5.79 9.85 10.4 5.57 4.85 10.7 4.42 0 8 73 63 6 4 46 5 2 55 6 5 47 2 0 56 58 0.610 8 5 8 7 92 2 1 48 7 C27 10.6 9.95 17.3 12.3 12.9 12.6 12.8 10.8 9.85 3.565 14.1 9.47 11.4 8.72 9.94 13.4 14.4 3.847 10.7 12.0 8.06 9.01 13.0 5.66 6.51 15.0 64 4 30 11 03 40 69 07 1 80 7 89 7 8 20 44 16 55 7 5 97 3 5 35 C28 11.1 10.0 14.6 12.6 10.1 10.8 14.3 11.0 10.2 2.576 12.4 8.52 9.76 17.1 7.56 8.09 14.9 14.4 7.562 11.8 11.4 8.23 7.43 11.7 5.91 6.30 14.0 96 70 81 28 91 50 09 34 23 90 4 5 23 5 2 14 44 95 34 7 4 79 6 2 98 C29 9.34 4.58 10.6 13.4 11.1 10.1 12.3 8.22 11.5 3.636 13.3 8.79 10.3 6.97 6.09 7.75 3.60 1.903 6.71 11.9 11.0 11.3 7.79 7 7 50 34 43 68 62 8 86 08 7 27 2 6 2 6 6 18 89 39 3 C30 70 3.83 10.0 5.90 6.05 6.81 4.81 5.90 4.22 4.91 - 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8.25 4.83 4.88 3.74 11.1 15.7 13.2 2.595 8.54 12.7 7.50 12.7 6.50 14.8 1 1 2 6 9 7 3 5 1.076 3 8 6 9 15 11 23 6 87 7 18 9 15 E25 8.93 1.85 12.6 8.35 9.87 10.3 9.86 11.3 5.390 4.92 8.06 10.6 0.72 - 5.79 6.90 - - - 2.97 3.02 - 4.37 4.22 4 9 97 1 1 90 5 91 8 5 22 2 2.23 6 3 8.572 3.12 0.38 1 4 0.78 6 7 E26 9 7 1 5 4.13 - 5.98 4.00 7.13 3.27 5.61 5.27 5.25 - 2.18 0.19 4.85 9.58 0.09 - 5.27 6.75 - - 0.01 - - 2.99 - - 3.63 2 1.11 2 6 0 2 3 7 5 2.451 8 7 1 7 5 3.06 7 8 9.902 6.05 2 0.58 2.08 9 2.24 1.26 7 E27 7 6 9 6 1 5 5 9.56 10.2 16.2 13.4 10.9 10.5 11.6 8.96 1.810 12.6 7.31 8.33 15.0 7.16 9.75 15.3 16.6 - 3.90 12.9 11.1 13.1 15.2 7.94 11.3 15.4 1 69 07 87 37 55 70 6 57 7 4 95 9 5 38 84 1.104 2 60 78 27 10 2 38 91 E28 12.2 12.8 14.6 13.3 10.3 13.8 9.30 4.325 14.4 9.51 10.3 8.51 10.1 16.8 4.449 11.1 16.6 14.3 14.9 14.6 12.3 5.18 26 43 87 23 88 16 9 56 5 31 6 50 15 64 37 10 57 07 17 7 E29 5.65 7.25 8.05 8.52 5.21 6.22 6.93 3.12 3.80 - 7.28 2.13 4.07 12.1 4.01 5.18 12.9 12.3 2.658 7.51 9.29 8.20 11.2 5.89 5.17 11.6 9 4 0 3 3 1 1 9 7 3.838 7 5 5 77 4 4 50 79 7 4 3 41 1 2 33 E30 4.51 4.78 11.5 8.79 5.04 5.81 8.10 4.01 4.01 - 8.19 0.91 4.27 11.4 4.01 0.50 9.94 9.34 - - 6.39 3.80 6.49 6.36 1.24 0.21 8.36 6 9 78 4 4 6 9 3 4 2.960 3 3 4 25 8 5 1 1 4.189 0.06 3 7 4 3 7 7 7 E31 2 3.10 2.43 8.82 4.38 2.34 2.52 6.18 2.05 1.40 - 5.50 5.14 2.41 1.96 - 3.19 2.78 - - 0.07 - 1.62 1.37 - 2.36 2 2 0 7 0 1 2 2 7 5.362 9 3 1 5 0.36 5 0 7.016 1.79 8 1.91 3 8 4.93 7 E32 5 1 2 1 71 - - 2.73 0.02 0.53 - - - 15.5 - - - - 2.92 - 8.01 15.7 15.2 - 4.20 15.0 11.1 12.6 9.65 7.97 9.09 14.8 0.34 1.57 7 7 8 0.73 0.64 1.20 56 7.796 1.67 2.10 0.31 0 5.34 6 22 93 0.046 8 05 82 47 1 2 5 73 E33 2 3 3 4 7 4 4 0 5 4.11 4.25 9.93 8.12 6.24 5.91 6.96 4.44 3.75 - 8.71 2.61 12.3 10.3 1.20 1.22 10.4 9.75 - - 5.61 2.96 6.81 7.99 1.03 2.86 7.05 3 9 6 1 6 9 5 0 8 2.667 4 9 09 02 4 2 73 5 7.438 1.24 6 7 0 6 4 5 4 E34 6 13.6 14.3 13.9 16.0 13.4 14.1 11.1 7.203 7.25 13.3 14.0 9.81 11.0 6.68 5.248 10.9 15.3 16.3 16.3 15.0 11.2 9.05 98 48 95 42 14 77 90 7 45 49 1 47 4 39 92 05 28 26 40 6 E35 13.2 14.5 16.0 9.59 12.2 15.3 10.2 8.376 14.4 9.28 15.6 7.189 13.5 14.7 16.4 18.4 13.5 13.7 64 29 17 2 17 63 11 32 0 27 07 83 03 55 64 28 E36 6.26 4.87 9.90 8.57 8.06 10.6 8.89 6.98 0.767 7.95 5.05 8.17 5.76 4.48 12.7 12.9 0.467 5.78 6.94 8.33 8.96 11.4 5.32 4.74 10.6 9.96 9 4 1 7 3 75 1 8 5 2 9 7 8 88 79 0 9 0 3 75 8 9 10 0 E37 8.02 7.03 13.2 11.9 11.0 11.2 9.29 8.24 9.12 2.197 10.0 6.51 9.94 14.9 5.69 0.41 7.46 7.94 - - 3.12 2.09 3.82 4.86 0.03 0.47 5.58 7 7 70 55 36 27 8 7 3 82 1 5 94 7 0 1 9 9.378 4.26 2 4 3 4 8 8 1 E38 1 8.13 8.08 13.0 11.1 11.4 10.8 8.22 11.3 1.891 11.8 8.92 9.55 7.02 9.18 2.873 7.43 14.2 15.0 15.1 14.4 12.0 8.86 4 7 46 99 00 39 3 88 74 9 4 4 6 6 83 92 73 20 02 3 E39 9.31 11.1 13.0 11.1 9.76 8.33 10.5 8.95 11.0 3.098 13.2 6.03 9.05 16.2 7.89 6.93 15.3 14.0 1.365 6.73 11.7 9.44 16.5 12.5 7.06 7.68 14.1 7 06 95 25 5 3 08 1 51 72 1 2 98 1 9 40 02 5 39 1 41 02 4 6 91 E40 72 Posterior a la eliminación de las muestras con resultados faltantes se eliminaron también los genes que codifican por las siguientes proteínas de interés: IL17A, PROS1, IL- 10, TLR2, TLR4, MMP3, MMP9, tPA con 11, 8, 20, 7, 7, 10, 10 y 10 datos faltantes, respectivamente. Luego de la eliminación de filas o columnas con datos faltantes, se obtiene una matriz con datos para 49 participantes (26 casos, 21 controles) y 19 marcadores (IL-1α, IL-1β, TNF- α, TYRO3, AXL, MERTK, GAS6, ANXA1, FPR2, MMP12, TGFBR1, FPR1, CXCL8, LTA, IgG1, IgG3, COX2, MMP2 y TIMP1). En esta matriz aún se observan 18 datos faltantes, que se imputaron como se describe a continuación. Con el fin de imputar datos utilizando regresión lineal, se analizó la correlación entre los niveles de expresión para genes que codifican las proteínas de interés y se observó una correlación elevada (Cuadro X.). Por lo tanto, se realizó la imputación de datos faltantes utilizando la regresión lineal por componentes principales. Cuadro X. Correlación entre covariables IL1a MERTK ANXA1 FPR2 MMP12 CXCL8 IgG1 IgG3 MMP2 IL1a 1 0.759023 0.763356 0.620966 0.766947 0.469401 0.429353 0.457311 0.49211 MERTK 0.759023 1 0.592163 0.696595 0.562945 0.277596 0.322001 0.358345 0.313799 ANXA1 0.763356 0.592163 1 0.659165 0.81661 0.312108 0.397021 0.378872 0.39179 FPR2 0.620966 0.696595 0.659165 1 0.620336 0.400568 0.41472 0.408168 0.29653 MMP12 0.766947 0.562945 0.81661 0.620336 1 0.462174 0.511006 0.457193 0.478831 CXCL8 0.469401 0.277596 0.312108 0.400568 0.462174 1 0.814369 0.854209 0.796754 IgG1 0.429353 0.322001 0.397021 0.41472 0.511006 0.814369 1 0.970161 0.873004 IgG3 0.457311 0.358345 0.378872 0.408168 0.457193 0.854209 0.970161 1 0.852002 MMP2 0.49211 0.313799 0.39179 0.29653 0.478831 0.796754 0.873004 0.852002 1 Se imputaron valores faltantes para la muestra E2 (IL-1β y AXL), E8 (GAS6), E15 (TYRO3 y FPR1), E23 (AXL), E24 (TYRO3), E33 (TGFBR1), E37 (LTA), C11 (TYRO3 y FPR1), C12 y C19 (TIMP1). C20 y C22 (COX2), C23 (GAS6) y C25 (TNF-α). En total se imputaron 18 datos en una matriz de 960 celdas, representando un 1.875 % de las celdas de la matriz. Se imputaron los valores utilizando regresión lineal con componentes principales. Se calculó el modelo de regresión únicamente con las variables no tenían datos faltantes. La 73 matriz completa que se obtuvo de esta manera se utilizó en los cálculos que se describen a continuación. 74 Tabla 2. Datos Δ Ct posterior a la eliminación de filas y columnas con datos faltantes Muestr MERT ANXA MMP1 TGFBR CXCL TIMP a IL1a IL1b TNFa TYRO3 AXL K GAS6 1 FPR2 2 1 FPR1 8 LTA IgG1 IgG3 COX2 MMP2 1 11.424 11.432 E2 5.9525 11.0675 8.142 2.3445 5 6.3915 4.093 17.7265 7.988 6.072 4.8485 8.8785 4.3975 5.679 5 10.072 9.7205 7.028 - E8 2.1285 1.824 -1.0865 12.9525 1.312 3.759 -8.725 2.038 -3.149 -0.405 5 1.3825 4.0065 -8.955 -1.8605 5.017 -1.599 -1.031 1.849 E14 4.8975 4.2735 7.727 5.8635 4.908 7.4555 6.4585 -1.6825 6.399 2.7395 5.4215 5 3.214 5.2945 -8.4545 -0.3325 3.2665 0.8745 -1.767 - - 10.029 E15 8.8355 7.0235 11.03 7.852 10.1725 2.0055 5 -1.8665 2.517 -1.584 4.6525 5.7665 -7.343 -0.497 5.0295 5.0295 2.069 - 7.644 8.2187 1.2257 E17 4.075 1.329 6.5655 11.8245 2.8515 5.1445 4.659 -3.0995 2.4025 0.2455 6.1345 5 3.174 3.6645 5 -1.498 4.2665 5 5.4365 4.084 E18 3.972 4.1115 8.1055 7.381 5.956 7.47 5.3285 -2.1755 6.1695 1.531 5.695 5 3.2925 5.9795 -3.5105 2.3305 7.094 2.9225 2.334 - 3.820 15.029 - E19 5.6515 3.623 6.2325 8.114 5.9705 7.2945 5.0715 -0.0435 7.567 4.085 6.436 5 -1.323 2.5725 5 -7.193 0.1855 6.8495 -6.56 - - 2.736 - - E20 -0.783 -1.734 1.9485 -0.1075 0.042 11.7025 0.7235 -8.2605 3.1195 -1.616 0.059 5 -2.288 1.6985 -12.123 -7.2155 1.437 4.3985 5.4675 10.327 14.612 10.418 E21 -0.3115 -1.166 4.4485 6.85 18.106 6.792 4.054 -6.5705 2.0705 -1.5975 4.6405 -2.891 8.4395 17.068 3.625 5 15.96 5 5 E22 8.2645 8.4395 10.461 11.49 9.7575 12.2785 9.189 1.4945 13.4415 7.0355 8.4185 6.915 3.9645 8.128 -2.618 2.6265 9.034 2.1735 1.2885 11.114 13.222 E23 4.9605 3.021 6.256 4.599 7.377 4.5825 -1.0755 8.2525 4.838 4.886 3.749 5 5 2.595 8.5455 12.787 7.507 6.509 0.721 - E24 8.934 1.8585 8.3505 9.871 10.39 9.8645 5.39 4.9275 8.0645 10.6215 5 2.2385 6.9025 -8.572 -3.1265 -0.381 2.9705 -0.785 - E25 4.132 -1.117 4.0055 7.1295 3.272 5.613 5.277 -2.451 2.1875 0.1965 4.8505 0.095 3.0655 6.7575 -9.9015 -6.059 0.0115 -0.586 -2.245 7.168 16.683 12.959 11.177 E26 9.5605 10.2685 13.487 10.937 10.5545 11.67 8.966 1.8095 12.6565 7.3165 8.3335 5 9.7545 5 -1.104 3.902 5 5 7.942 14.309 E27 12.226 12.8425 14.6865 13.323 10.3875 13.8155 9.3085 4.3245 14.4555 9.515 10.331 8.516 10.15 16.815 4.4485 11.164 16.637 5 12.317 4.013 12.378 E28 5.6585 7.254 8.5225 5.2125 6.2205 6.9305 3.1285 -3.8375 7.287 2.1345 4.075 5 5.1835 5 2.6575 7.5165 9.294 8.2025 5.8905 4.017 E29 4.516 4.789 8.7935 5.044 5.8155 8.109 4.0125 -2.9595 8.193 0.9125 4.274 5 0.5045 9.3405 -4.1885 -0.062 6.3925 3.807 1.247 1.964 - - E30 3.1015 2.432 4.3865 2.34 2.5205 6.1815 2.052 -5.362 5.5085 5.1425 2.411 5 0.3645 2.7795 -7.0155 -1.7905 0.078 -1.912 4.9305 - - 5.344 11.181 E31 -0.342 -1.573 0.0265 0.5375 -0.733 -0.6435 1.2065 -7.796 -1.674 -2.1035 -0.31 5 8.016 15.293 -0.0455 4.2075 15.005 5 7.9715 - - 1.2224 9.7549 7.4375 1.2455 5.6159 2.9674 1.0339 E32 4.1125 4.2585 8.121 6.2455 5.9185 6.965 4.4395 -2.667 8.7135 2.619 12.309 1.204 5 5 5 5 5 5 5 11.189 14.04 15.025 E33 13.6975 14.3475 13.9945 16.0415 13.4135 14.1765 5 7.2025 7.257 13.3445 9 9.811 6.684 5.2475 10.939 15.392 16.305 5 12.978 E35 6.269 4.874 9.9005 8.5765 8.063 10.6745 8.891 0.7665 7.9545 5.0515 8.1785 5.767 4.488 5 0.467 5.7795 6.9485 8.3295 5.328 75 5.696 E36 8.0265 7.0365 11.9545 11.0355 11.2265 9.2975 8.2465 2.197 10.082 6.511 9.9445 5 0.41 7.949 -9.3775 -4.2605 3.122 2.0935 0.0375 7.023 15.091 E37 8.1335 8.087 13.046 11.199 11.4 10.8385 8.2225 1.891 11.874 8.929 9.554 5 9.1855 2.873 7.4355 14.283 5 12.002 7.890 E38 9.317 11.106 11.1245 9.765 8.3325 10.508 8.9505 3.0975 13.2715 6.031 9.052 5 6.939 14.002 1.3645 6.735 11.739 9.441 7.064 8.873 12.390 E39 12.3995 10.5885 14.646 12.719 11.2935 15.129 10.641 4.319 13.264 8.697 11.3215 5 2.69 5 -0.3045 4.374 9.08 8.106 4.8245 12.200 C5 7.749 9.209 9.887 4.6635 8.1215 8.676 7.8765 -1.296 13.0815 10.8215 7.228 9.204 9.6475 5 -1.14 2.5915 9.732 6.753 6.205 5.479 10.947 C6 6.2565 6.334 8.4905 7.5585 6.0965 8.151 5.713 -3.251 8.919 4.2805 5.88 5 4.4165 5 -5.1715 0.0355 8.3795 4.5665 2.5545 6.901 14.139 11.876 C8 9.7075 8.643 4.8635 12.0905 8.7035 10.728 8.086 -0.6505 11.5735 6.459 8.0155 5 8.9445 5 1.4715 6.69 5 8.6965 4.3885 C11 4.544 11.9465 11.0165 12.0235 6.489 2.5235 1.923 3.424 -2.4615 3.369 1.4755 1.033 -6.604 0.3565 6.218 1.1135 -2.725 7.113 C12 9.5 8.738 11.854 5.595 8.671 10.8335 8.2055 -0.5925 6.2085 5.0395 7.092 5 6.4385 5.8925 -0.685 5.715 9.0315 9.0195 8.746 C13 5.358 2.026 5.1515 12.1515 4.4905 8.4745 3.919 -4.692 3.5345 0.6705 3.913 5 2.5505 2.8435 -1.945 4.352 8.2235 6.7445 5.4035 7.681 10.007 C15 9.247 9.928 9.2875 7.0795 6.0495 9.4895 7.936 2.277 9.244 8.4115 8.144 5 11.993 8.265 0.333 7.8205 5 5.1485 4.3775 C17 5.885 6.4645 8.8845 7.3345 6.598 8.0845 7.3715 -0.1835 6.6545 4.612 6.3645 3.545 4.143 4.673 -5.3185 0.007 5.274 2.307 1.009 2.187 C18 2.3165 1.1065 5.204 6.0445 4.5135 6.231 4.177 -3.4545 4.51 -0.109 5.211 5 1.63 5.4705 -5.611 -1.497 5.929 2.6915 2.063 C19 12.4535 12.811 11.126 11.1775 11.089 14.3005 12.152 3.917 9.835 10.3635 11.9585 4.327 4.325 5.0685 -0.5385 4.6465 6.5505 7.7095 - 0.687 - C20 -0.0055 8.281 10.0655 8.2755 7.376 11.37 7.403 -0.998 11.5015 4.445 6.8315 5 -1.378 5.5375 -5.586 -1.1405 2.1055 2.6535 2.361 C21 -1.713 -2.677 1.0985 -0.366 3.5105 1.3515 -2.393 -8.8525 3.415 -3.0615 -1.9575 5 2.5645 6.8705 -4.4185 1.7385 4.0665 0.079 -2.106 C22 3.131 2.8585 5.0995 3.9385 4.974 7.068 2.2705 -4.776 6.461 1.3515 3.146 6.879 5.111 13.47 3.5965 7.5005 9.249 6.0635 - 5.60752 3.81252 9.08652 6.87902 8.52352 8.63302 1.8999 6.79402 6.96602 6.91752 11.406 C23 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1 8.636 8.0755 16.203 5.431 5 12.603 9.779 8.8795 6.031 11.018 C24 7.9915 7.659 11.3135 8.988 10.4215 12.018 9.2865 0.8075 11.492 5.9445 9.2865 5 6.7175 12.233 1.296 7.3185 5 6.4775 5.965 C25 3.043 0.8955 3.309 2.75 4.389 2.5495 -5.5725 4.9985 -0.2305 1.962 2.243 2.3015 7.248 -5.971 -2.3525 3.5645 1.76 0.601 7.281 12.857 C26 7.5695 7.958 11.1625 8.6555 7.554 10.2455 8.1645 0.1285 10.3545 4.906 7.485 5 5.65 5 -0.6095 5.5675 9.4745 5.7975 5.5715 8.726 10.715 12.054 C27 10.664 9.9535 12.311 12.9025 12.64 12.869 10.807 3.565 14.1795 9.477 11.4885 5 9.948 14.444 3.847 5 5 8.067 5.663 7.564 11.894 11.433 C28 11.1955 10.0695 12.628 10.1905 10.8495 14.3085 11.034 2.5755 12.49 8.5235 9.765 5 8.092 14.444 7.5615 5 5 8.2365 5.916 11.917 C29 9.347 4.587 13.434 11.1425 10.168 12.362 8.2275 3.6355 13.3075 8.7965 10.327 6.972 6.0955 3.606 1.9025 6.716 5 11.089 7.793 1.614 10.028 C30 3.8345 10.0785 6.0525 6.8155 4.819 5.903 4.2205 -2.038 7.2775 1.0915 5.31 5 3.646 5 -3.958 1.9975 8.294 5.1925 2.653 76 Tabla 3. Matriz con datos ΔCt completos posterior a la regresión lineal por componentes principales. Los datos imputados se muestran en negrita. Muestr TYRO MERT ANXA MMP1 TGFBR CXCL MMP a IL1a IL1b TNFa 3 AXL K GAS6 1 FPR2 2 1 FPR1 8 LTA IgG1 IgG3 COX2 2 TIMP1 E2 5.953 -0.396 11.068 8.142 4.707 2.345 11.425 6.392 4.093 17.727 7.988 6.072 4.849 8.879 4.398 5.679 11.433 10.072 9.721 E8 2.129 1.824 -1.087 12.953 1.312 3.759 -0.756 -8.725 2.038 -3.149 -0.405 7.029 -1.383 4.007 -8.955 -1.861 5.017 -1.599 -1.031 E14 4.898 4.274 7.727 5.864 4.908 7.456 6.459 -1.683 6.399 2.740 5.422 1.850 3.214 5.295 -8.455 -0.333 3.267 0.875 -1.767 - 8.836 7.024 11.030 6.277 7.852 10.173 -2.006 -1.867 2.517 -1.584 8.802 4.653 5.767 -7.343 -0.497 5.030 5.030 2.069 E15 10.030 4.075 1.329 6.566 11.825 2.852 5.145 4.659 -3.100 2.403 0.246 6.135 7.645 3.174 3.665 -8.219 -1.498 4.267 1.226 5.437 E17 3.972 4.112 8.106 7.381 5.956 7.470 5.329 -2.176 6.170 1.531 5.695 4.085 3.293 5.980 -3.511 2.331 7.094 2.923 2.334 E18 - 5.652 3.623 6.233 8.114 5.971 7.295 5.072 -0.044 7.567 4.085 6.436 3.821 -1.323 2.573 -7.193 0.186 -6.850 -6.560 E19 15.030 - -0.783 -1.734 1.949 -0.108 0.042 11.703 -0.724 -8.261 3.120 -1.616 0.059 -2.737 -2.288 1.699 -7.216 1.437 -4.399 -5.468 E20 12.123 -0.312 -1.166 4.449 6.850 18.106 6.792 4.054 -6.571 2.071 -1.598 4.641 -2.891 8.440 17.068 3.625 10.328 15.960 14.613 10.419 E21 8.265 8.440 10.461 11.490 9.758 12.279 9.189 1.495 13.442 7.036 8.419 6.915 3.965 8.128 -2.618 2.627 9.034 2.174 1.289 E22 4.961 3.021 6.256 4.599 7.410 7.377 4.583 -1.076 8.253 4.838 4.886 3.749 11.115 13.223 2.595 8.546 12.787 7.507 6.509 E23 8.934 1.859 8.351 13.887 9.871 10.390 9.865 5.390 4.928 8.065 10.622 0.722 -2.239 6.903 -8.572 -3.127 -0.381 2.971 -0.785 E24 4.132 -1.117 4.006 7.130 3.272 5.613 5.277 -2.451 2.188 0.197 4.851 0.095 -3.066 6.758 -9.902 -6.059 0.012 -0.586 -2.245 E25 9.561 10.269 13.487 10.937 10.555 11.670 8.966 1.810 12.657 7.317 8.334 7.169 9.755 16.684 -1.104 3.902 12.960 11.178 7.942 E26 12.226 12.843 14.687 13.323 10.388 13.816 9.309 4.325 14.456 9.515 10.331 8.516 10.150 16.815 4.449 11.164 16.637 14.310 12.317 E27 5.659 7.254 8.523 5.213 6.221 6.931 3.129 -3.838 7.287 2.135 4.075 4.014 5.184 12.379 2.658 7.517 9.294 8.203 5.891 E28 4.516 4.789 8.794 5.044 5.816 8.109 4.013 -2.960 8.193 0.913 4.274 4.018 0.505 9.341 -4.189 -0.062 6.393 3.807 1.247 E29 3.102 2.432 4.387 2.340 2.521 6.182 2.052 -5.362 5.509 5.143 2.411 1.965 -0.365 2.780 -7.016 -1.791 0.078 -1.912 -4.931 E30 -0.342 -1.573 0.027 0.538 -0.733 -0.644 -1.207 -7.796 -1.674 -2.104 -0.310 -5.345 8.016 15.293 -0.046 4.208 15.005 11.182 7.972 E31 4.113 4.259 8.121 6.246 5.919 6.965 4.440 -2.667 8.714 2.619 12.309 1.204 1.222 9.755 -7.438 -1.246 5.616 2.967 1.034 E32 13.698 14.348 13.995 16.042 13.414 14.177 11.190 7.203 7.257 13.345 12.267 14.049 9.811 6.684 5.248 10.939 15.392 16.305 15.026 E33 6.269 4.874 9.901 8.577 8.063 10.675 8.891 0.767 7.955 5.052 8.179 5.767 4.488 12.979 0.467 5.780 6.949 8.330 5.328 E35 8.027 7.037 11.955 11.036 11.227 9.298 8.247 2.197 10.082 6.511 9.945 5.697 0.410 7.949 -9.378 -4.261 3.122 2.094 0.038 E36 8.134 8.087 13.046 11.199 11.400 10.839 8.223 1.891 11.874 8.929 9.554 7.024 9.186 16.310 2.873 7.436 14.283 15.092 12.002 E37 9.317 11.106 11.125 9.765 8.333 10.508 8.951 3.098 13.272 6.031 9.052 7.891 6.939 14.002 1.365 6.735 11.739 9.441 7.064 E38 12.400 10.589 14.646 12.719 11.294 15.129 10.641 4.319 13.264 8.697 11.322 8.874 2.690 12.391 -0.305 4.374 9.080 8.106 4.825 E39 C5 7.749 9.209 9.887 4.664 8.122 8.676 7.877 -1.296 13.082 10.822 7.228 9.204 9.648 12.201 -1.140 2.592 9.732 6.753 6.205 77 6.257 6.334 8.491 7.559 6.097 8.151 5.713 -3.251 8.919 4.281 5.880 5.480 4.417 10.948 -5.172 0.036 8.380 4.567 2.555 C6 9.708 8.643 4.864 12.091 8.704 10.728 8.086 -0.651 11.574 6.459 8.016 6.902 8.945 14.140 1.472 6.690 11.877 8.697 4.389 C8 4.544 11.947 11.017 10.546 12.024 6.489 2.524 1.923 3.424 -2.462 3.369 0.461 1.476 1.033 -6.604 0.357 6.218 1.114 -2.725 C11 9.500 8.738 11.854 5.595 8.671 10.834 8.206 -0.593 6.209 5.040 7.092 7.114 6.439 5.893 -0.685 5.715 9.032 9.020 6.173 C12 5.358 2.026 5.152 12.152 4.491 8.475 3.919 -4.692 3.535 0.671 3.913 8.747 2.551 2.844 -1.945 4.352 8.224 6.745 5.404 C13 9.247 9.928 9.288 7.080 6.050 9.490 7.936 2.277 9.244 8.412 8.144 7.682 11.993 8.265 0.333 7.821 10.008 5.149 4.378 C15 C17 5.885 6.465 8.885 7.335 6.598 8.085 7.372 -0.184 6.655 4.612 6.365 3.545 4.143 4.673 -5.319 0.007 5.274 2.307 1.009 C18 2.317 1.107 5.204 6.045 4.514 6.231 4.177 -3.455 4.510 -0.109 5.211 2.188 1.630 5.471 -5.611 -1.497 5.929 2.692 2.063 C19 12.454 12.811 11.126 11.178 11.089 14.301 12.152 3.917 9.835 10.364 11.959 4.327 4.325 5.069 -0.539 4.647 6.551 7.710 5.409 C20 -0.006 8.281 10.066 8.276 7.376 11.370 7.403 -0.998 11.502 4.445 6.832 -0.688 -1.378 5.538 -5.586 -1.141 3.254 -2.106 2.654 C21 -1.713 -2.677 1.099 -0.366 3.511 1.352 -2.393 -8.853 3.415 -3.062 -1.958 2.362 2.565 6.871 -4.419 1.739 4.067 0.079 -2.106 C22 3.131 2.859 5.100 3.939 4.974 7.068 2.271 -4.776 6.461 1.352 3.146 6.879 5.111 13.470 3.597 7.501 11.600 9.249 6.064 C23 5.608 3.813 9.087 6.879 8.524 8.633 6.052 -1.900 6.794 6.966 6.918 8.636 8.076 16.203 5.431 11.407 12.603 9.779 8.880 C24 7.992 7.659 11.314 8.988 10.422 12.018 9.287 0.808 11.492 5.945 9.287 6.032 6.718 12.233 1.296 7.319 11.019 6.478 5.965 C25 3.043 0.896 4.320 3.309 2.750 4.389 2.550 -5.573 4.999 -0.231 1.962 2.243 2.302 7.248 -5.971 -2.353 3.565 1.760 0.601 C26 7.570 7.958 11.163 8.656 7.554 10.246 8.165 0.129 10.355 4.906 7.485 7.282 5.650 12.858 -0.610 5.568 9.475 5.798 5.572 C27 10.664 9.954 12.311 12.903 12.640 12.869 10.807 3.565 14.180 9.477 11.489 8.727 9.948 14.444 3.847 10.716 12.055 8.067 5.663 C28 11.196 10.070 12.628 10.191 10.850 14.309 11.034 2.576 12.490 8.524 9.765 7.565 8.092 14.444 7.562 11.895 11.434 8.237 5.916 C29 9.347 4.587 13.434 11.143 10.168 12.362 8.228 3.636 13.308 8.797 10.327 6.972 6.096 3.606 1.903 6.716 11.918 11.089 7.793 C30 3.835 10.079 6.053 6.816 4.819 5.903 4.221 -2.038 7.278 1.092 5.310 1.615 3.646 10.029 -3.958 1.998 8.294 5.193 2.653 0 78 Análisis multivariado Se realizó un análisis de agrupamiento (Figura 4.), normalizando para los valores de las columnas. Se observó que, aunque no se encontraron diferencias significativas en los análisis univariados, los participantes se pueden dividir en dos grupos, con una expresión mayor o menor de todos los genes que codifican proteínas involucradas con periodontitis. En general, los pacientes con periodontitis tienden a exhibir un mayor nivel de expresión de los genes que codifican proteínas asociadas a la inflamación. Figura 4. Mapa de calor por casos contra controles por análisis de agrupamiento. 79 El análisis multivariado facilita distinguir entre controles y pacientes utilizando todo el conjunto de datos, a pesar de que no se observaron diferencias significativas. Clasificación usando regresión logística Se construyó un modelo lineal generalizado utilizando los niveles de expresión para todos los marcadores y la edad de los participantes (Cuadro XI.). Seguidamente se calculó la curva ROC (acrónimo de Receiver Operating Characteristic) y a partir de esta el AUC (acrónimo de Area Under the Curve) (Figura 5.). El análisis de la curva ROC es una herramienta estadística para describir la exactitud de un modelo de predicción (226), como por el ejemplo el modelo de regresión logística. La AUC se utiliza para evaluar la habilidad de discriminación de modelos predictivos (227). Con todo el modelo de regresión completo, el AUC es de 0.9231, con una exactitud 0.8936. El modelo con las variables AXL, edad, TYRO3, MMP2, FPR2, MERTK, TNFα, TGFBR1 obtuvo un AUC de 0.9102 y una exactitud de 0.8085. El modelo con las variables IgG1, MMP2, LTA, FPR1 obtuvo un AUC de 0.7656 y una exactitud de 0.7234. El modelo con las variables IgG1 y MMP2 obtuvo un AUC de 0.7472 y una exactitud de 0.6383. El modelo con las variables IL-1β, GAS6, ANXA1, MMP12, CXCL8, LTA, IgG1, IgG3 y MMP2 obtuvo un AUC de 0.8956 y una exactitud de 0.8085. Por último, se evaluó el modelo eliminando la variable de la edad y manteniendo las variables de los 19 genes que codifican proteínas involucradas en la periodontitis. El AUC de este modelo fue de 0.9212 y la exactitud fue de 0.88936 (Cuadro XII). Se ejecutó una selección de variables utilizando el criterio de información de Akaike. 80 Cuadro XI. Resumen de modelo lineal generalizado Coeficientes: Estimado Error estándar Valor z Pr (>|z|) (Intercepto) -1.919291 5.750392 -0.334 0.7386 Edad 0.004583 0.083503 0.055 0.9562 IL-1α 1.202047 0.863671 1.392 0.1640 IL-1β -0.737294 0.385757 -1.911 0.0560 TNF-α -0.347029 0.669675 -0.518 0.6043 TYRO3 0.122450 0.456778 0.268 0.7886 AXL -0.012499 0.476080 -0.026 0.9791 MERTK 0.467177 0.893010 0.523 0.6009 GAS6 -1.460755 0.945943 -1.544 0.1225 ANXA1 1.426791 0.772874 1.846 0.0649 FPR2 -0.154423 0.428721 -0.360 0.7187 MMP12 0.646134 0.492030 1.313 0.1891 TGFBR1 -0.696723 0.605083 -1.151 0.2495 FPR1 -0.636633 0.520213 -1.224 0.2210 CXCL8 -1.121807 0.818018 -1.371 0.1703 LTA 0.886821 0.393681 2.253 0.0243* 81 IgG1 -1.895451 1.020447 -1.857 0.0632 IgG3 1.223585 0.845246 1.448 0.1477 COX2 0.072653 0.845970 0.086 0.9316 MMP2 -0.260079 0.531601 -0.489 0.6247 TIMP1 0.912571 0.661241 1.380 0.1676 Significado de código ‘*’ 0.05 Cuadro XII. Comparación de distintos modelos de regresión logística con diferentes sets de datos. Modelos AUC Exactitud Modelo con 19 genes 0.9231 0.8936 codificantes y la edad Modelo con las variables 0.9102 0.8085 AXL, edad, TYRO3, MMP2, FPR2, MERTK, TNFα, TGFBR1 Modelo con las variables 0.7656 0.7234 IgG1, MMP2, LTA, FPR1 Modelo con las variables 0.7472 0.6383 IgG1 y MMP2 Modelo con las variables IL- 0.8956 0.8085 1β, GAS6, ANXA1, MMP12, CXCL8, LTA, IgG1, IgG3 y MMP2 Modelo eliminando la 0.9212 0.88936 variable de la edad y manteniendo las variables de los 19 genes 82 Figura 5. Gráfico de la curva ROC con el set completo de datos El modelo completo (con los 19 genes que codifican por proteínas involucradas en la periodontitis y la edad) es el mejor. Como se usan todas las variables, no es posible incluir un set de validación porque tienen muchos valores faltantes queda entonces pendiente la validación para trabajos futuros. Se confecciona una tabla de confusión de casos contra controles (Cuadro XIII.). Y se obtuvieron las siguientes métricas, exactitud: 0.8936, tasa de error: 0.1063, tasa de falsos positivos: 0.0952, tasa de verdaderos positivos (sensibilidad): 0.8846, tasa de falsos negativos: 0.1154, tasa de verdaderos negativos (especificidad): 0.92, valor predictivo verdadero (precisión): 0.92, valor predictivo negativo: 0.8636. 83 Cuadro XIII. Tabla de confusión casos contra controles Observación Casos (periodontitis) Controles (salud gingival) Casos (periodontitis) 23 (Verdaderos 2 (Falsos positivos) positivos) Controles (salud 3 (Falsos negativos) 19 (Verdaderos negativos) gingival) Los genes que codifican por las proteínas proinflamatorias IL-1α, IL-1β, TNF-α, LTA, COX-2, el receptor FPR1, la quimiocina CXCL8, los receptores TAM y el ligando GAS6, ANXA1 y el receptor FPR2, el receptor TGFBR1, las inmunoglobulinas IgG1e IgG3, y las MMP-2, MMP12 y TIMP-1 y la edad logran tener una sensibilidad para poder identificar un caso de periodontitis de 88.46 % y una especificidad para identificar un caso sin periodontitis de 90.47 %. Discusión Expresión de genes que codifican proteínas involucradas en la patogénesis de la periodontitis La periodontitis es una enfermedad inflamatoria multifactorial (228) y crónica (56) que involucra interacciones dinámicas y complejas entre patógenos periodontales, una respuesta inmunitaria destructiva del hospedero y factores ambientales (229). A diferencia de otras enfermedades infecciosas, en las cuales un único microorganismo genera la enfermedad, la periodontitis es afectada por la comunidad microbiana oral bajo la influencia de distintos microorganismos que conducen el paso de homeostasis a la disbiosis (37). Aún más relevante en la enfermedad es la respuesta inmunitaria del hospedero (53). El Predicción 84 desequilibrio de la respuesta incrementa la disbiosis oral y genera el daño tisular (53). El modelo clásico de la enfermedad generó un marco inicial sobre la interdependencia entre la biopelícula y la respuesta del hospedero, pero en la actualidad las investigaciones en el campo de la microbiología y la inmunología se han centrado en los aspectos moleculares (7). El RT-qPCR es uno de los métodos más utilizados de cuantificación génica debido a su gran rango dinámico, sensibilidad y alta especificidad de las secuencias (230). Se estima que la cuantificación mediante PCR puede detectar una variación en el nivel de expresión de genes que codifican proteínas de interés tan bajas como un 23 % (230). Los coeficientes de variación pueden ser aún menores, el coeficiente de variación utilizando SYBR® Green es de 14.2 %, en comparación con los ensayos de punto final como la densitometría de masas con un coeficiente de variación de un 44.9 %, o la hibridación de sondas con un coeficiente de variación de un 45.1 % (230). En comparación con múltiples estudios, las muestras de tejido conectivo gingival no exhibieron diferencia significativa en la expresión de genes que codifican proteínas involucradas en la patogénesis de la periodontitis entre participantes con salud periodontal y participantes con periodontitis. La IL-α e IL-1β, son citoquinas proinflamatorias con múltiples funciones, tanto nucleares como de membrana (69). Sus actividades biológicas están asociadas con la pérdida del nivel de inserción clínico (231). Se ha reportado un incremento de los niveles de las proteínas IL-1α e IL-1β en el GCF de pacientes con periodontitis (231). Los niveles de expresión génica son el resultado de la transcripción y los niveles de expresión de proteínas son el resultado de eventos postranscripcionales. Los niveles de transcritos por si solos no son suficientes para predecir los niveles de proteínas (232). Aunque en el pasado estudio reportan un incremento de los niveles de las citoquinas IL-1α e IL-1β en el GCF de pacientes con periodontitis (231), no necesariamente representa un aumento en la expresión de los genes de estas citoquinas. Al revisar los reportes en la detección de ARNm, un estudio publicó la detección de ARNm de IL-1α y IL-1β en muestras de tejido gingival de 17 muestras de pacientes con periodontitis (233). Sin embargo, otro estudio, con muestras de tejido gingival de 37 participantes, 32 participantes con periodontitis y 5 participantes sanos, 85 reportó niveles más elevados de IL-1α e IL-1β en los participantes sanos (234). Nuestro proyecto no observó diferencias significativas entre casos y controles en los niveles de expresión de genes que codifican por las citoquinas IL-1α e IL-1β en muestras de tejido gingival. Similar a los reportes anteriores en relación con los niveles de expresión de los transcritos, es posible que los niveles de las proteínas sean distintos y existan modificaciones postranscripcionales influyendo en los niveles de la síntesis proteica. Las proteínas IL-1α e IL-1β son expresadas como proformas que requieren un procesamiento proteolítico (235). Entre los procesos regulatorios de pro-IL-1α, se ha reportado que granzima B genera su proteólisis en condiciones pulmonares inflamatorias persistentes (236). La actividad de granzima B ha sido implicada en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas, como lo es la afectación en la cicatrización en lesiones dérmicas en la población adulta mayor (237). Curiosamente, la edad fue una de las variables en el set completo de nuestro modelo de regresión logística que identificó correctamente los casos de periodontitis. Se ha estudiado la presencia de granzima B como un potencial biomarcador salival de obesidad y periodontitis (238). Adicionalmente, un estudio determinó genes diferencialmente expresados, relacionados con la piroptosis en periodontitis, en el que se obtuvieron tres agrupamientos y el gen de granzima B (entre otros genes) estaba desregulado en los tres agrupamientos (239). Sería interesante evaluar la actividad biológica de granzima B en modelos de periodontitis y su relación con la activación de IL-1α. En relación con el nivel de la citoquina IL-1β, la activación de la citoquina ocurre principalmente mediante las vías canónica y no-canónica del inflamasoma (235). El inflamasoma está involucrado en procesos de infección y enfermedad, siendo activado tanto por PAMPs como DAMPs (240). Posterior a la formación del inflamasoma, mediante la vía canónica, la caspasa-1 escinde y activa la IL-1β (235). La vía no-canónica por lo general requiere procesos de dos pasos (235). Como primer paso, el enlace de LPS a TLR4 en un macrófago conduce al incremento de los componentes del inflamasoma (235). En el segundo paso, las caspasas no-canónicas se unen a LPS intracelular, generando la formación de poros que lleva la piroptosis y la activación de NLRP3 (235). Es posible que la expresión del gen que codifica IL-1β no necesariamente represente los niveles de la citoquina IL-1β. 86 La IL-6 es una citoquina pleiotrópica con distintas funciones, entre las cuales está el metabolismo óseo, hematopoyesis y respuesta inmunitaria (45). A nivel de periodontitis, un estudio con 2 participantes masculinos y 3 participantes femeninas, de buena salud, sin referir uso de antibióticos en los últimos 3 meses o cirugía periodontal en el último año previo a la investigación, se les tomo muestras de GCF cada 3 meses por 6 meses (241). Mediante una prueba de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA, por sus siglas en inglés), ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, reportaron alta correlación entre el índice de sangrado y la profundidad de la bolsa periodontal y los niveles de IL-6, pero no entre el índice de biopelícula e IL-6 (241). Los niveles de IL-6 en saliva y en GCF de participantes con periodontitis se encontró reducido en comparación a participantes sin periodontitis (241). Otro estudio notó altos niveles (~30 a 97 en la escala gris relativa) de ARNm específico de IL-6 en células mononucleares gingivales, aisladas de pacientes con periodontitis de rápida progresión (242). Este estudio realizó hibridación dot-blot con sondas de ADNc específicas para IL-6 (242). Para confirmar la presencia, debido al tipo de muestra, realizaron un PCR punto final (242). Takahashi y colaboradores, investigó, en 1994, los niveles de ARNm de IL-6 en tejido gingival, reportó la presencia del producto de amplificación de IL-6 en sus 17 muestras de participantes con periodontitis, y 2 de 4 muestras de participantes sanos (243). Una investigación de expresión de ARNm mediante hibridación in situ en muestras de tejido gingival de 19 participantes (27 sitios) con periodontitis reportó la presencia de ARNm de IL-6 en macrófagos, linfocitos T, fibroblastos, células endoteliales y linfocitos B (244). A diferencia de IL-1α, IL-1β, CXCL8 y TNFα donde se reportó una mayor presencia solo en macrófagos y células T (244). Otro estudio reportó una reducción del ARNm de IL-6, tanto en tejido conectivo como epitelio de muestras de tejido gingival con periodontitis en comparación con tejido gingival con gingivitis (245). En este estudio participaron 19 pacientes con periodontitis y 5 participantes con gingivitis, a los que se les tomó biopsia de tejido gingival (245). Se estudiaron mediante inmunohistoquímica e hibridación in situ (245). En nuestro estudio no fue posible estudiar los niveles de expresión de IL-6 debido a problemas del control negativo, el cual dio positivo en más de un 80 % de los ensayos. Por qué, es posible que los primers utilizados se encontraron contaminados. 87 La IL-17A es una citoquina regulada positivamente en enfermedades inflamatorias y autoinmunes (45). IL-17A es secretada por distintas células del sistema inmunitario y puede activar cascadas de respuesta inflamatoria asociadas al desarrollo de la periodontitis (246). Una investigación determinó la presencia de IL-17 en muestras de GCF de pacientes con periodontitis mediante el método de ELISA (247). Otra investigación trabajó con muestras de tejido gingival de 23 pacientes con gingivitis y 24 participantes con periodontitis (248). Entre los resultados, encontraron una diferencia significativa en los niveles de expresión del gen que codifica IL-17A entre las muestras de periodontitis y gingivitis (248). Los niveles de IL-17 en GCF y en tejido gingival de participantes con periodontitis fueron significativamente más elevados en comparación con participantes sin periodontitis (249). Los niveles de IL-17 en GCF fueron de aproximadamente 25 pg/µL, comparados con, aproximadamente, 8 pg/µL en participantes sanos (249). Los niveles de expresión de IL-17 en muestras gingivales de participantes con periodontitis (n: 10) presentó una expresión relativa de aproximadamente 2500, mientras que la expresión de IL-17 de participantes sanos (n: 10) presentó una expresión relativa de aproximadamente 100 (249). Nuestro estudio no observó diferencia significativa en la expresión del gen que codifica IL-17A entre casos de periodontitis (n: 25) y participantes sanos (n: 23), pero se observó una ligera tendencia de incremento en los niveles de expresión del gen que codifica IL-17A en el grupo de participantes con periodontitis. TNF-α, es una citoquina con múltiples efectos biológicos, está involucrada en la patogénesis de enfermedades inflamatorias autoinmunes (250). Se ha estudiado la presencia de ARNm de TNF-α, IL-1α e IL-1β en tejido gingival, y se reportó la presencia de TNF-α en más de la mitad de las muestras de participantes con periodontitis (n: 5) en comparación las muestras del grupo de pacientes sin periodontitis (n: 3) donde no se encontró en ninguna de las muestras (234). Este estudio realizó la técnica de PCR punto final (234), a diferencia de nuestro estudio el cual utilizó RT-qPCR, dicha técnica, amplifica la señal de expresión. Otro estudio utilizó muestras de 125 participantes con periodontitis mediante el inmunoensayo de multiplex y RT-qPCR (251). El estudio reportó que la frecuencia relativa de la proteína de TNF-α fue más elevada en suero (100 %), tejido gingival (96.8 %) y GCF 88 (94.4 %) en comparación a presencia de ARNm en tejido gingival (86.4 %) (251). A diferencia de nuestra investigación, este estudio analizó únicamente muestras de participantes con periodontitis (251). Según nuestros análisis, no observamos diferencia significativa en los niveles de expresión del gen que codifica por TNF-α entre el grupo de participantes con periodontitis y los participantes con salud gingival. Sería interesante evaluar las diferencias entre los niveles de la proteína de TNF-α y los niveles de los transcritos de TNF-α entre casos y controles. El miembro de la familia de TNF, LTA, tiene roles de desarrollo y función del sistema inmunitario, principalmente en desarrollo de órganos linfoides, organización y mantenimiento de microambientes linfoides, defensa del hospedero e inflamación (252). Un estudio analizó la expresión diferencial de trascritos de LTA con dos grupos de casos: pacientes con bronquiectasia (n: 30) y periodontitis (n: 30) y dos grupos controles: participantes con salud gingival (n: 3) y participantes únicamente con bronquiectasia (n: 3) (253). Este estudio, al igual que el nuestro, no observó diferencia significativa entre la expresión del gen que codifica por LTA entre el grupo de participantes con periodontitis (1.9±1.02) y participantes con salud gingival (1.02±0.20) (p = 0.106) (253). Este estudio se reportó diferencia significativa en la expresión diferencial del gen que codifica por LTA entre el grupo de participantes con bronquiectasia y periodontitis (2.76±1.42) y el grupo con periodontitis (0.96±0.49) (p = <0.0001) (253). Es posible que el rol de LTA dentro de la patogénesis de la periodontitis no sea tan predominante como otras citoquinas proinflamatorias. La COX-2 es responsable de la producción de prostanoides como PGE2 (254). En un modelo de línea celular de fibroblastos gingivales humanos y monocitos, el estímulo de Filifactor alocis y TNF-α incrementaron la expresión de COX2 (255). Otro estudio tuvo la participación de 10 pacientes con periodontitis y 6 pacientes con salud gingival, los cuales no utilizaron antibióticos ni antiinflamatorios no esteroideos, un mes previo a la obtención de la muestra (103). Este estudio, al igual que el nuestro, no observó diferencia significativa en la expresión diferencial del gen que codifica por COX2 entre las biopsias de tejido gingival de participantes con periodontitis y participantes con salud gingival (p = 0.36) (103). Vale 89 mencionar que este estudio reportó que en casos de inflamación crónica, la hipermetilación de la región promotora de PTGS2 es 5.06 veces mayor en biopsias gingivales inflamadas (4.3 %) en comparación a las biopsias gingivales no inflamadas (0.85 %) (p = 0.03) (103). Los niveles de metilación fueron inversamente proporcionales a los niveles de expresión del gen que codifica por COX-2 en las biopsias de participantes con periodontitis (p = 0.01) (103). La metilación de regiones promotoras puede ser un parámetro por evaluar con respecto a los niveles de expresión de distintos genes que codifican por proteínas involucradas en la patogénesis de la periodontitis. Los PRR, TLR-2 y TLR-4 están implicados en la respuesta inmunitaria innata a patógenos periodontales y la activación del sistema inmune adaptativo (112). Un estudio comparativo de pacientes con gingivitis y periodontitis concluyó que las formas solubles de TLR2 (sTLR2) y sTLR4 en saliva, junto con la expresión de TLR2 y TLR4 en células epiteliales, pueden proveer marcadores clínicos relevantes de la progresión de la enfermedad (256). Otra investigación con muestras de tejido gingival de 30 participantes sanos y 30 participantes con periodontitis realizó RT-PCR (257). Esta investigación observó una diferencia significativa en la asociación de TLR-4 (p = 0.004) entre los grupos estudiados (257). Solo el 10 % de las muestras del grupo control dieron positivo a TLR4, a diferencia del 43.3 % de las muestras del grupo experimental que dieron positivo a TLR4 (257). Con respecto a TLR2, dieron positivo a TLR2 el 3.3 % y 16.7 %, del grupo control y el grupo experimental respectivamente (257). Similar a nuestros resultados, no observaron diferencia significativa (p = 0.085) (257). El receptor FPR1 puede reconocer péptidos formilados bacterianos (258). Un estudio en modelo murino reportó al gen de FPR1 como uno de los genes asociados a la susceptibilidad para periodontitis (259). Otro estudio con muestras de neutrófilos polimorfonucleares de sangre periférica de 37 participantes con periodontitis de rápida progresión y 38 casos control, indicó que no había diferencia significativa en la expresión de distintos polimorfismos de nucleótido único entre los participantes (260). CXCL8 es un quimioatrayente con funciones importantes en la biología de los leucocitos, al controlar el reclutamiento celular (261). Con respecto al gen de CXCL8, se ha 90 publicado que sus niveles de expresión en tejido gingival son más elevados en participantes con periodontitis en comparación a participantes sanos (262). Otro estudio con muestras de biopsias de encías, 6 participantes con periodontitis y 6 participantes sanos, concluyó que la expresión diferencial de CXCL8 fue más elevada en las muestras de participantes con periodontitis (expresión diferencial de 16) en comparación a las muestras del grupo control (expresión diferencial de 2) (p = < 0.05) (263). A diferencia de nuestro estudio, no se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de CXCL8, pero se observó una ligera tendencia de mayor expresión en los participantes con periodontitis. Esto puede tener que ver con el momento de la toma de la muestra. Porque puede ser que el tiempo de reclutamiento de PMNs ya haya pasado. Las citoquinas antiinflamatorias IL-4 e IL-10 son moléculas inmunoreguladoras que controlan la respuesta proinflamatoria (264). Un estudio con biopsias gingivales de 6 participantes (5 participantes fueron diagnosticados con periodontitis refractaria un participante fue diagnosticado con periodontitis) observó una tendencia de incremento en la concentración de ARNm de IL-4 según la progresión de la lesión gingival (265). Otra investigación evaluó la expresión de IL-4 de muestras de linfocitos T cooperadores de sangre periférica de participantes con periodontitis de progresión rápida (n = 20) y participantes sanos (n= 20) mediante RT-qPCR (266). El estudio concluyó que se observó una diferencia significativa en la expresión relativa de IL-4 en células CD4+ inactivadas, siendo mayor en los controles sanos (41 %) en comparación a las muestras del grupo experimental (17 %) (p = < 0.05) (266). A diferencia de otro estudio con muestras de tejido gingival de 27 pacientes con periodontitis y 26 pacientes sanos, que reportó un incremento en los niveles de expresión del gen que codifica por IL-4 en casos de periodontitis (36.74 (± 2.63)) en comparación al grupo control (2.65 (± 1.90) (p = < 0.001) (267). Nuestro estudio no observó diferencia significativa entre casos y controles, con una tendencia de un mayor nivel de expresión del gen que codifica por IL-4 en el grupo de participantes con periodontitis. Con respecto a IL-10, un estudio de células madre de ligamento periodontal provenientes de tejidos periodontales de participantes con periodontitis (n = 8) y participantes con salud gingival (n = 8) analizó la expresión normalizada del ARNm de IL-10 (268). El estudio 91 observó una diferencia significativa en la expresión normalizada del ARNm de IL-10 de participantes con salud gingival (>2) en comparación al grupo de participantes con periodontitis (<1) (p = < 0.05) (268). Adicionalmente, un estudio con muestras de fibroblastos primarios de 10 participantes sanos y 10 participantes con periodontitis no exhibieron diferencia significativa en la expresión de IL-10 entre ambos grupos (269). Los fibroblastos gingivales son el principal constituyente en el tejido gingival (270). Esta puede ser una posible explicación de que no se haya observado diferencias significativas en los niveles de expresión del gen que codifica por IL-10 en las muestras de tejido conectivo provenientes de participantes con periodontitis y participantes con salud gingival en nuestras muestras. En el caso del TGF-β, molécula que estimula la cicatrización de heridas, la angiogénesis y la producción de matriz extracelular (271). Se ha observado que puede mediar la apoptosis de células epiteliales (155). En una investigación con 7 participantes sin periodontitis y 14 con periodontitis, se tomaron muestras de tejido gingival (271). El estudio encontró un incremento en la expresión del gen que codifica por TGF-β en los participantes con periodontitis (promedio de la razón TGF-β/GAPDH de 2.84) en comparación al grupo sin periodontitis (promedio de la razón TGF-β/GAPDH de 1.03) (p = 0.004) (271). Los receptores TAM y los ligandos GAS6 y PROS1 son moléculas con función de resolución de la inflamación facilitando el proceso de eferocitosis (162). Un estudio con 7 muestras de tejido gingival de pacientes con periodontitis y 7 muestras de controles sanos reportó un incremento en la expresión del gen que codifica por PROS1 en los participantes con periodontitis en comparación a los participantes sanos (p = < 0.05) (163) . Adicionalmente, reportó un incremento del gen que codifica por TYRO3 en los pacientes sanos en comparación al grupo de participantes con periodontitis (p = < 0.05) (163). La proteína GAS6 es expresada en la capa externa del epitelio de la mucosa oral e inducido por la microbiota (161). En un modelo murino puede ser esencial para la regulación de la microbiota de la mucosa oral (272). La mucosa oral de un ratón GAS6-/- tiene una regulación positiva de la actividad proinflamatoria y un aumento de la población de bacterias anaerobias (272). Un estudio murino sobre expresión de genes del epitelio de unión, exhibió un 92 incremento diferencial de 50 veces la expresión del gen de anexina A1 (273), en cambio en este estudio no se observó diferencia significativa entre participantes con periodontitis en comparación a participantes sanos. Con respecto al receptor FPR2, un estudio evaluó la correlación de mediadores lipídicos de resolución de la inflamación, receptores de dichos mediadores lipídicos y el microbioma subgingival (274). El estudio incluyó 33 participantes periodontalmente sanos, y 15 pacientes con periodontitis, se les tomo muestras de tejido gingival antes y 8 semanas posterior del tratamiento no quirúrgico, al grupo sano solo se les tomo una muestra (274). Un estudio más detallado, evaluó muestras de tejido gingival de 13 participantes sanos y 15 participantes con periodontitis (275). El estudio no reportó diferencia significativa en la expresión de FPR2 entre ambos grupos (275). Las MMPs son enzimas que requieren iones de zinc, vitales para el mantenimiento de alostasis tisular (182). Los TIMPs inhiben las MMPs (180), y su desequilibrio puede contribuir a la destrucción de tejidos periodontales (276). Respecto a MMP-2, se ha reportado que T. denticola induce la expresión y actividad de MMP-2 en HPDL mediante modificaciones epigenéticas (277) y regulando positivamente la expresión de RASA4 (278). Una investigación evaluó la expresión del gen que codifica por MMP-3 y TIMP1 en biopsias de tejido gingival de 128 pacientes con periodontitis y 63 muestras de pacientes con salud gingival (189). El estudio observó un incremento en la expresión de MMP-3 y TIMP1 en los pacientes con periodontitis (189). Un estudio con 5 muestras gingivales de participantes jóvenes y 5 participantes adultos mayores, ambos grupos con salud gingival, reportó que la expresión de MMP-3 y MMP12 (p = 0.05) fue más elevada en tejido gingival de adulto mayor en comparación a participante joven (279). El estudio no observó diferencia significativa en los niveles de expresión de MMP9 entre ambos grupos (279). Los niveles de proteasa tPA, involucrada en la patogénesis de la periodontitis (280), han sido evaluados en el GCF de pacientes con salud gingival, gingivitis y periodontitis (281). Él estudió no observó diferencia significativa entre las muestras provenientes de participantes con gingivitis (~ 11 ng/ml) y participantes con periodontitis (~ 15 ng/ml) (281). Adicionalmente, se ha evaluado los niveles de expresión del gen que codifica por tPA en 93 PDLs estimulados por P. intermedia y por las fuerzas de estrés ocasionado por trauma oclusal (282). Las células HDL con una concentración de P. intermedia ATCC 25611 al 5 % incrementaron la expresión diferencial del gen que codifica por tPA a partir de las 18 horas (p = < 0.001) (282). Hasta el mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que evalúa los niveles de expresión de los genes que codifican por las proteínas FPR1, IL-10, IGFR1, ANXA1, IgG1, IgG3, MMP-2, MMP-9, MMP-12 y tPA en muestras de tejido conectivo gingival de participantes con periodontitis y participantes sin periodontitis mediante RT-qPCR. El tejido conectivo gingival es un tejido altamente fibroso, desarrollado a partir del folículo dental (283). Los fibroblastos son las células principales para su desarrollo, mantenimiento y reparación (283). La función principal del tejido conectivo es la protección de la superficie radicular y el hueso alveolar del ambiente externo (283). La respuesta de defensa del hospedero, entre ellas la respuesta inflamatoria, ocurre tanto en salud como en enfermedad (67). La heterogeneidad molecular y tisular del tejido conectivo gingival es consecuencia de la constante interacción entre patógenos periodontales y células inmunitarias (neutrófilos, macrófagos y linfocitos principalmente) (284). No necesariamente toda condición proinflamatoria dentro del surco gingival progresa a periodontitis (285). Se ha visualizado una alta variabilidad en los reportes de los niveles de expresión de distintos genes que codifican por proteínas involucradas en el proceso de la periodontitis. Se ha publicado que la expresión de genes que codifican proteínas proinflamatorias como IL-1α y IL-1β está más bien disminuida en muestras de tejido gingival en casos de periodontitis (234). Muchos estudios analizaron muestras pequeñas. Aunque se ha investigado la relevancia de ciertas proteínas en la patogénesis de la enfermedad periodontal, debido a la heterogeneidad tisular de la muestra obtenida no necesariamente se pueden obtener datos en cada una de ellas. En nuestro trabajo no se detectó IL-6, IL-17A, TLR2, TLR4, IL-4, IL-10, TGFβ1, PROS1, MMP3, MMP9 y tPA en más del 50% de las muestras, imposibilitando el análisis de estos genes para las pruebas de regresión lineal y análisis multivariado. Este fenómeno pudo haber ocurrido en el momento de obtención de la muestra mediante el procedimiento quirúrgico. La muestra de tejido conectivo gingival pudo haber sido solo 94 parcial, esto quiere decir que se pudo haber obtenido heterogeneidad en las células y moléculas de la muestra. Previo al ensayo de regresión lineal se eligió analizar las proteínas proinflamatorias IL-1α, IL-β, TNFα, LTA y COX2. Se incluyó el PRR, FPR1 y la quimiocina CXCL8. También fue posible analizar el receptor TGFBR1 y las proteínas asociadas con mecanismos de resolución de la inflamación TYRO3, AXL, MERTK, GAS6, ANXA1 y FPR2. Se analizaron las inmunoglobulinas IgG1 e IgG3 y las MMPs y TIMP, MMP-2, MMP-12 y TIMP1. Se analizaron estos transcritos ya que fueron los que proporcionaron suficientes datos para el análisis. Genes que codifican proteínas involucradas con la patología de la periodontitis seleccionados para el análisis multivariado En periodontitis, la lesión inicial se basa en la respuesta de leucocitos residentes y células endoteliales a la biopelícula bacteriana (39). Debido a la interacción constante con las bacterias orales, las células inmunitarias ya se encuentran presentes en el periodonto (284). Los neutrófilos polimorfonucleares y las células dendríticas son atraídos al sitio de infección por el quimioatrayente bacteriano fMLP, mediante el receptor FPR1 (123, 258). P. gingivalis induce la producción de la quimiocina CXCL8 (286). CXCL8, secretado por células endoteliales asiste en el reclutamiento de neutrófilos al surco gingival (263, 287). CXCL8 igualmente favorece el reclutamiento de precursores de osteoclastos y osteoblastos, células protagonistas en mecanismos de remodelación ósea (67). En la lesión temprana, los niveles de neutrófilos en el tejido conectivo se incrementan, junto con macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos (39). Las funciones de los macrófagos proinflamatorios se centran en el reclutamiento de un mayor número de neutrófilos y linfocitos, así como de fagocitar y eliminar a las bacterias (39). La producción de IL-1 aumenta (288). Los queratinocitos orales expresan distintas citoquinas, entre ellas IL-1α e IL-1β (289). IL-1β está asociada con la migración de células inflamatorias y osteoclastogénesis (67). Además, los miembros de familia de IL-1 conducen la diferenciación y polarización de células mieloides y linfoides (45). 95 TNF-α es secretada por monocitos/macrófagos, neutrófilos, fibroblastos, células epiteliales (72). También, los linfocitos T cooperadores 1 y 2 producen TNF-α, la cual facilita la activación de linfocitos B (67). LTA, junto con TNF-α, estimulan la proliferación de precursores de osteoclastos y estimulan la reabsorción ósea mediante osteoclastos (290). La PGE2 es un potente estimulador de la reabsorción del hueso alveolar (67). Tanto células tipo macrófago como el ligamento periodontal secretan PGE2 (291). COX-2 cataliza la conversión de ácido araquidónico en prostaglandinas (67). Para contener las acciones biológicas de las citoquinas proinflamatorias, se generan mecanismos antiinflamatorios (39). El rol del receptor TGFBR1 en la periodontitis es poco estudiado. Se detectaron secuencias de TGFBR1 en muestras de tejido conectivo gingival de participantes con periodontitis y participantes con salud gingival. TGFR1 es fundamental para la señalización intracelular de TGFβ, él cual es fosforilado en múltiples sitios y puede fosforilar SMAD2/3 o quinasas de la vía no-canónica (292). Es posible que mecanismos de fosforilación de TGFBR1 se den en medio de la regulación de la patogénesis de la periodontitis. Los receptores TAM, TYRO3, AXL y MERT junto con los ligandos GAS6 y PROS1 juegan un papel fundamental en la resolución de la inflamación (161). El eje de PROS1/TYRO3 protege contra la periodontitis modulando la señalización STAT/SOCS (293). Mecanismos de resolución de la inflamación y su función protectora contra la periodontitis apoyan la hipótesis de sinergia y disbiosis polimicrobiana, la cual indica que la hiperactividad proinflamatoria incrementa la disbiosis, eventualmente creando un ciclo vicioso que conduce a la destrucción de los tejidos periodontales (294). El rol de ANXA1 en la periodontitis no está bien caracterizado. Se ha reportado su incremento en mujeres embarazadas con gingivitis (295). La presencia del receptor FPR2 se ha detectado en tejido gingival, pero es desconocida su función en la periodontitis. El eje entre ANXA y FPR2 regula la función plaquetaria promoviendo la resolución de la inflamación (296). La periodontitis está asociada con la activación plaquetaria (297). En la lesión establecida, la inflamación aguda no se puede resolver y se vuelve crónica (39). La producción de IgG1 e IgG3 se vuelve dominante (39). El epitelio de la bolsa 96 periodontal es infiltrado por neutrófilos (39). La generación de especies reactivas de oxígeno y MMPs por parte de los neutrófilos genera daño al tejido conectivo (47). Además dirigen parte de la producción de RANKL por parte de los linfocitos B, promoviendo la reabsorción ósea (47). La lesión avanzada conduce al proceso irreversible entre la gingivitis y la periodontitis (39). Las MMPs se vuelven más abundantes y están asociadas con la degradación tisular (39). Los fibroblastos secretan la MMP-2 (298), mientras que los macrófagos secretan la MMP-12 (299). Como contraparte TIMP1esta involucrado en el control local de las actividades de las MMPs (300). Correlación con la presencia de la enfermedad periodontal El diagnóstico periodontal se basa en una serie de pruebas clínicas, como el uso de la sonda periodontal y las radiografías intraorales (9). El diagnóstico apropiado facilita un abordaje más eficiente para la eventual rehabilitación oral del paciente (8). En la actualidad se busca como generar un enfoque más personalizado en el tratamiento periodontal (301). La clasificación más reciente de la periodontitis abre la posibilidad de incluir biomarcadores como factores modificantes en la velocidad de progresión de la enfermedad (8). Los biomarcadores pueden contribuir a mejorar el diagnóstico en la detección temprana de la periodontitis (8). Sin embargo, con dificultad se mide la presión arterial y se indaga sobre uso de anticoagulantes o niveles de azúcar en sangre, generando más información en el estado de salud sistémico de los pacientes. Si bien los resultados de esta investigación no van a ser utilizados como biomarcadores diagnósticos, este procedimiento permitió encontrar una serie de genes con una mayor correlación con la presencia de la enfermedad periodontal. El modelo logró identificar de manera exitosa (con una sensibilidad de un 88.46 %) los casos de periodontitis. Por una parte, refuerza la importancia en la comprensión de las complejas redes e interacciones entre proteínas del sistema inmunitario innato y adquirido, además del balance entre mecanismos proinflamatorios y de resolución de la inflamación. 97 La aplicación de este trabajo en la práctica profesional habilita la importancia del uso de las herramientas moleculares para la detección de casos de periodontitis. Es importante recalcar el tipo de muestra debe de ser de fácil recolección tanto para el paciente como para el operador (302). Poder realizar este tipo de investigaciones y análisis con muestras de saliva puede generar un acercamiento mayor, para su uso dentro de la clínica odontológica. Conclusiones 1. Los niveles de los transcritos de IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A, TNF-α, LTA, COX2, TLR2, TLR4, FPR1, CXCL8, IgG1 e IgG3, MMP2, MMP3, MMP9, MMP12, TIMP1 y el activador tisular del plasminógeno en muestras de tejido conectivo gingival no presentaron diferencia significativa asociados con la periodontitis. 2. La expresión de genes que codifican por los receptores TAM y los ligandos GAS6, PROS1, TGF-β1, la subunidad TGF-βR1, el mediador pro-resolutivo anexina A1, el receptor FPR2/ALX, las citoquinas IL-4 e IL-10 en muestras de tejido conectivo gingival de pacientes con periodontitis y pacientes sin periodontitis no presentaron diferencia significativa en la asociación entre los niveles de expresión de dichos genes que codifican por proteínas pro-resolutivas, citoquinas antiinflamatorias con la periodontitis. 3. La asociación entre la expresión de genes que codifican citoquinas proinflamatorias, proteínas pro-resolutivas, proteínas de receptores de reconocimiento de patrones, citoquinas antiinflamatorias, inmunoglobulinas, metaloproteinasas y la manifestación clínica de la periodontitis generan un modelo estadístico que puede casos de periodontitis con una sensibilidad de 88.46 %. Un sistema fisiológico e inmunitario de un ser vivo genera una conexión compleja entre múltiples moléculas y células. La respuesta de cada individuo es única e individual. Y este trabajo abre más interrogantes que respuestas. Es posible que estos marcadores biológicos siguen siendo insuficientes ante una enfermedad cómo la periodontitis. En la actualidad se busca cómo generar un enfoque más personalizado en el tratamiento periodontal. La 98 clasificación más reciente de la periodontitis abre la posibilidad de incluir biomarcadores como factores modificantes en la velocidad de progresión de la enfermedad. Los biomarcadores pueden contribuir a mejorar el diagnóstico en la detección temprana de la periodontitis. Cronograma Tabla 4. Cronograma de actividades Actividad Julio – Octubre - Enero – Abril – Julio – Octubre - Setiembre diciembre marzo 2021 junio 2021 Setiembre diciembre 2019 2020 2021 2021 Toma de X X X X muestras Extracción X X X X X de ARNm Obtención X X X de resultados del qPCR Análisis de X los resultados Fuentes de financiamiento El proyecto se apoyó de fondos del proyecto VI-801-B7-364, el cual fue financiado por Vicerrectoría de Investigación de la UCR. Facilidades Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular de la Universidad de Costa Rica. Dra. Sandra Silva de la Fuente. Clínica de Énfasis de Periodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad de Costa Rica. Dr. Francisco Jiménez Bolaños, Dra. Gisella Rojas González, Dra. Marisol 99 Palma Fernández, estudiantes de último año de Licenciatura de Odontología matriculados en el la Clínica de Énfasis de Periodoncia. Condiciones éticas El proyecto se aprobó en la sesión No. 67 del Comité Ético Científico (CEC) de la UCR bajo el acuerdo N°8 del 14 de julio de 2017. 100 Bibliografía 1. Kinane DF, Stathopoulou PG, Papapanou PN. 2017. Periodontal diseases. Nat Rev Dis Prim 3:1–14. 2. Lang NP, Lindhe J. 2015. Clinical Periodontology and Implant Dentistry, 2 Volume Set, 6th Edition, 6th ed. Wiley Blackwell. 3. Bosshardt DD. 2018. The periodontal pocket: pathogenesis, histopathology and consequences. Periodontol 2000 76:43–50. 4. Newman MG, Takei HH, Klokkevold PR, Carranza FA. 2019. Newman and Carranza’s Clinical Periodontology, 13th EditionSaunders, 13th ed. Elsevier, Inc., Philadelphia, PA. 5. 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Análisis y deliberación del Comité Ético Científico de la Universidad de Costa Rica para el proyecto de investigación Expresión de marcadores inflamatorios con enfermedad periodontal. 141 Anexo 2. Formula de consentimiento informado para el proyecto de investigación Expresión de marcadores inflamatorios con enfermedad periodontal. 142 143 144