UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO CARACTERIZACIÓN DE TRAMPAS EXTRACELULARES DE NEUTRÓFILOS (NETs) INDUCIDAS POR CLOSTRIDIUM PERFRINGENS EN NEUTRÓFILOS HUMANOS IN VITRO Y EN UN MODELO MURINO DE GANGRENA GASEOSA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología LISA STEPHANIE BADILLA VARGAS Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2024 ii DEDICATORIA Con mucho agradecimiento dedico esta tesis a Dios quien ha guiado cada paso de mi vida. Que este esfuerzo sea un testimonio de mi fe en su bondad y misericordia. A mi amado esposo por su apoyo incondicional, por su constante ánimo y por sus consejos, pero sobre todo por su amor y compañía durante este viaje académico. A mi querida mamá, quien con su gran amor, dedicación y sacrificios incansables, ha sido un ejemplo a seguir para mí. A mi hermano mayor porque sin su apoyo no hubiera podido llegar hasta acá y a mis otros hermanos por siempre estar ahí para apoyarme. iii AGRADECIMIENTOS Agradezco profundamente a mi tutora, la Dra. Marietta Flores, por su invaluable contribución no sólo a mi crecimiento académico y profesional sino también personal. Sus conocimientos, consejos, compromiso, apoyo y paciencia no sólo han sido fundamentales para el éxito de este trabajo, sino que también han dejado una huella perdurable en mi vida. Además, valoro mucho su bondad y su disposición para escuchar y comprender más allá de lo académico. Estoy verdaderamente agradecida por haber tenido la oportunidad de contar con su guía y amistad durante este periodo importante de mi vida. Al Dr. Alberto Alape por su excelente contribución a este trabajo. Agradezco el tiempo dedicado y su esfuerzo para brindarme orientación y apoyo durante el desarrollo de esta investigación. También valoro mucho la amistad brindada durante estos años. Al investigador Reynaldo Pereira por su valiosa ayuda en los análisis de microscopía electrónica que enriquecieron los resultados de esta investigación. Por su generoso apoyo y disposición para compartir su conocimiento. A la M.Sc. Mariel Zúñiga por sus comentarios de motivación, por sus consejos durante la realización del proyecto y por la ayuda brindada en la revisión de este documento. A todo el personal del Instituto Clodomiro Picado, que de una u otra manera me brindaron su colaboración y apoyo para llevar a cabo el proyecto. Al Dr. Carlos Chacón y a Doña Vicky Carmona por todo el apoyo que me proporcionaron, por siempre estar en la disposición de ayudar y resolver mis dudas con amabilidad, eficiencia y prontitud. A mi esposo y mejor amigo Josué Santamaría, por su amorosa compañía y por ser mi confidente. Su presencia en mi vida es un motivo constante de alegría. A mi familia por su apoyo y cariño incondicional en cada etapa de mi vida. iv v TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA ..................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... iii HOJA DE APROBACIÓN ................................................................................................... iv TABLA DE CONTENIDO .................................................................................................... v RESUMEN .......................................................................................................................... viii ABSTRACT ........................................................................................................................... ix LISTA DE CUADROS ........................................................................................................... x LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... xi LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................... xvii LISTA DE ANEXOS .......................................................................................................... xix CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................... 1 ANTECEDENTES ............................................................................................................ 1 1.1 Neutrófilos en la respuesta inmune innata ................................................................ 1 1.2 Trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) ......................................................... 4 1.2.1 Componentes estructurales de las NETs ............................................................ 4 1.2.2 Inductores de las NETs ...................................................................................... 5 1.2.3 NETosis ............................................................................................................. 6 1.2.4 Potencial patogénico de las NETs ................................................................... 10 1.3 Clostridium perfringens .......................................................................................... 11 1.3.1 CpPLC ............................................................................................................. 12 1.3.2 Gangrena gaseosa ............................................................................................ 13 1.4 C. perfringens y NETs ............................................................................................ 14 JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 15 HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 16 OBJETIVOS ................................................................................................................... 17 vi Objetivo general ............................................................................................................ 17 Objetivos específicos .................................................................................................... 17 CAPÍTULO 2 ....................................................................................................................... 18 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 18 2.1 Cultivo de C. perfringens ....................................................................................... 18 2.2 Obtención de proteínas secretadas por C. perfringens ........................................... 18 2.3 Análisis proteómico ................................................................................................ 18 2.4 Aislamiento de neutrófilos humanos ...................................................................... 20 2.5 Inducción de la formación de NETs ....................................................................... 21 2.6 Detección de NETs por inmunofluorescencia ........................................................ 21 2.7 Cuantificación semiautomática de la formación de NETs ...................................... 22 2.8 Análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) .......................................... 23 2.9 Identificación de la actividad nucleasa ................................................................... 23 2.10 Ensayo de la actividad bactericida de las NETs ................................................... 24 2.11 Determinación del tipo de NETosis ...................................................................... 24 2.12 Detección de ROS ................................................................................................. 24 2.13 Neutralización de la CpPLC ................................................................................. 25 2.14 Inhibición de la formación de NETs y la producción de ROS ............................. 25 2.15 Modelo murino de gangrena gaseosa .................................................................... 27 2.15.1 Análisis histológico ....................................................................................... 27 2.15.2 Inmunodetección de NETs ............................................................................. 27 2.15.3 Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) .......................... 28 2.16 Análisis estadístico ............................................................................................... 28 CAPÍTULO 3 ....................................................................................................................... 29 RESULTADOS ............................................................................................................... 29 3.1 Pureza del cultivo de C. perfringens ....................................................................... 29 3.2 Análisis proteómico de las proteínas secretadas por C. perfringens ...................... 29 3.3 Pureza y viabilidad del aislamiento de neutrófilos ................................................. 34 3.4 Las proteínas secretadas por C. perfringens inducen la formación de NETs en neutrófilos humanos in vitro ......................................................................................... 35 vii 3.5 Las NETs tienen un efecto microbicida sobre C. perfringens ................................ 39 3.6 C. perfringens puede evadir las NETs .................................................................... 43 3.7 La ADNasa Q8XKM6 está presente en el secretoma de C. perfringens ................ 46 3.8 La PLC de C. perfringens induce NETs ................................................................. 46 3.9 CpPLC induce NETosis suicida ............................................................................. 49 3.10 La CpPLC induce NETosis dependiente de ROS, de la salida de calcio de depósitos intracelulares y de la gasdermina D .............................................................. 50 3.11 Formación de NETs en un modelo murino de gangrena gaseosa inducido por una dosis subletal de C. perfringens .................................................................................... 57 CAPÍTULO 4 ....................................................................................................................... 64 DISCUSIÓN .................................................................................................................... 64 CONCLUSIONES ............................................................................................................... 76 PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................................................................. 78 REFERENCIAS .................................................................................................................. 79 ANEXOS .............................................................................................................................. 91 viii RESUMEN Los neutrófilos son la primera línea de defensa de la inmunidad innata del organismo. Estas células además de eliminar patógenos mediante fagocitosis y secreción de moléculas microbicidas pueden capturar y matar microorganismos a través de estructuras extracelulares compuestas por ADN y proteínas antimicrobianas denominadas trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Sin embargo, alteraciones en la regulación de la producción o la degradación de las NETs pueden exacerbar la inflamación y contribuir en la patogénesis de diversas enfermedades. Clostridium perfringens es un patógeno ampliamente distribuido en el ambiente, que se asocia con diferentes enfermedades en animales y humanos. Esta bacteria produce una fosfolipasa C (CpPLC), principal factor de virulencia de la gangrena gaseosa en humanos. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la formación de NETs inducida por proteínas secretadas por C. perfringens en neutrófilos humanos in vitro y en un modelo murino de gangrena gaseosa. Se determinó que la CpPLC induce NETosis suicida en neutrófilos humanos in vitro, las cuales tienen un efecto microbicida directo sobre C. perfringens. Mediante un análisis proteómico del secretoma de C. perfringens se identificaron una ADNasa y dos 5´-nucleotidasas, homólogas a factores de virulencia de varias especies de Streptococcus, que degradan las NETs in vitro y son relevantes para la evasión de las NETs en tejidos infectados por esas bacterias. La NETosis suicida inducida por la CpPLC involucra la activación de la proteína quinasa C y de la proteína quinasa activada por mitógeno/quinasa regulada por señales extracelulares, así como la liberación de calcio intracelular, la actividad de la gasdermina D y la producción de especies reactivas de oxígeno derivadas de la xantina oxidasa, de la mieloperoxidasa y del metabolismo del ácido araquidónico. Además, se evidenció en un modelo murino de gangrena gaseosa que la formación de NETs en el tejido infectado es mediada por NETosis vital, en la cual el neutrófilo permanece funcional por varias horas. Los mecanismos de NETosis activados in vitro e in vivo por la CpPLC difieren, por lo que sería relevante determinar la vía por la que se activa la NETosis vital. Esclarecer el papel de las NETs inducidas por la CpPLC en la patogénesis de la gangrena gaseosa podría ser relevante para comprender la fisiopatología de la enfermedad y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para reducir la mortalidad, mejorar la regeneración muscular y prevenir complicaciones en los pacientes. ix ABSTRACT Neutrophils are the first line of defense of the body's innate immunity. These cells - in addition to eliminating pathogens through phagocytosis and secretion of microbicidal molecules - can capture and kill microorganisms through extracellular structures composed of DNA and antimicrobial proteins called neutrophil extracellular traps (NETs). However, alterations in the regulation of NET production or degradation can exacerbate inflammation and contribute to the pathogenesis of various diseases. Clostridium perfringens is a widely distributed pathogen in the environment, associated with different diseases in animals and humans. This bacterium produces a phospholipase C (CpPLC), the main virulence factor of gas gangrene in humans. This study aimed to characterize the formation of NETs induced by C. perfringens secreted proteins in human neutrophils in vitro and in a murine gas gangrene model. It was determined that CpPLC induces suicidal NETosis in human neutrophils in vitro, which has a direct microbicidal effect on C. perfringens. Through proteomic analysis of the C. perfringens secretome, a DNase and two 5´-nucleotidases were identified, homologous to virulence factors of several species of Streptococcus, which degrade NETs in vitro and are relevant for NETs evasion in tissues infected by these bacteria. CpPLC-induced suicidal NETosis involves the activation of protein kinase C and mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase, as well as intracellular calcium release, gasdermin D activity, and the production of reactive oxygen species derived from xanthine oxidase, myeloperoxidase, and arachidonic acid metabolism. Additionally, it was evidenced in a murine model of gas gangrene that the formation of NETs in infected tissue is mediated by vital NETosis, in which the neutrophil remains functional for several hours. The mechanisms of NETosis activated in vitro and in vivo by CpPLC differ, so it would be relevant to determine the pathway through which vital NETosis is activated. Clarifying the role of CpPLC-induced NETs in the pathogenesis of gas gangrene could be relevant to understanding the disease physiopathology and developing new therapeutic strategies to reduce mortality and prevent complications in patients. x LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Inhibidores farmacológicos de ROS empleados en este estudio. ....................... 25 Cuadro 2. Análisis proteómico del secretoma de C. perfringens toxinotipo A. .................. 31 Cuadro 3. Efecto de diversos antioxidantes e inhibidores de las vías de transducción de señal en la formación de NETs y la producción de ROS inducida por la CpPLC en neutrófilos humanos in vitro. Los datos se presentan como promedio ± SE. ......................................... 57 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Principales mecanismos antimicrobianos de los neutrófilos (8). ........................... 2 Figura 2. Tipos de NETosis en respuesta a diversos estímulos (33). .................................... 7 Figura 3. Estructura de la CpPLC. (A) Representación gráfica de la estructura de la toxina, en color azul se muestran los residuos que se insertan en la membrana y en color rojo los residuos que se sitúan lejos de la membrana (58). (B) Modelo propuesto sobre el mecanismo de acción de la CpPLC (modificado de Monturiol et al. (56)). ............................................ 13 Figura 4. Separación de células sanguíneas por densidad utilizando un gradiente de Histopaque ®-1119. .............................................................................................................. 20 Figura 5. Técnica de inmunofluorescencia para la detección de NETs. .............................. 22 Figura 6. Pureza de C. perfringens cepa JIR325. (A) Actividad lecitinasa de la CpPLC y (B) Tinción de Gram. .................................................................................................................. 29 Figura 7. SDS-PAGE de proteínas secretadas por C. perfringens en la fase estacionaria. M: marcador de peso molecular Thermo Scientific, PageRulerTM Prestained Protein Ladder (#26616), 1: sobrenadante de 24 horas de C. perfringens (40 μg de proteína) y 2: medio de cultivo RCM ultrafiltrado. .................................................................................................... 30 Figura 8. (A) Neutrófilos teñidos con Wright. (B) Determinación de la viabilidad celular con el reactivo FluoroQuench™. En esta última, las células vivas se observan de color verde y las muertas de color rojo/naranja. Magnificación 100X y 40X, respectivamente. ............... 35 Figura 9. Las proteínas secretadas por C. perfringens inducen la formación de NETs en neutrófilos humanos in vitro. (A) Determinación de la formación de NETs mediante inmunofluorescencia (verde-NE y azul-ADN) a los 15, 30, 60 y 120 minutos utilizando como estímulo proteínas secretadas por C. perfringens. Se utilizaron medio de cultivo ultrafiltrado y PMA como controles negativo y positivo, respectivamente. (B) Análisis cuantitativo del porcentaje de neutrófilos NETóticos expuestos a proteínas secretadas por C. perfringens. Los resultados representan el promedio ± SE de tres experimentos independientes con tres repeticiones por tratamiento cada uno. Los tratamientos con diferencias estadísticamente significativas en comparación con el control se indican con ** (P < 0.01). ......................... 36 xii Figura 10. Micrografías electrónicas de barrido que demuestran la formación de NETs en neutrófilos humanos estimulados con las proteínas secretadas por C. perfringens (A y C) y sus respectivos controles negativos (B y D) a diferentes magnificaciones. ......................... 37 Figura 11. Micrografías electrónicas de barrido que muestran en detalle la formación de NETs inducidas por proteínas secretadas por C. perfringens en neutrófilos humanos a diferentes magnificaciones (A y C) y sus respectivos controles de células sin tratar (B y D). Las flechas blancas indican NETs. ....................................................................................... 38 Figura 12. Análisis SEM de la liberación de NETs inducida por proteínas secretadas por C. perfringens. (A-B) Estructuras tipo NETs delgadas. (C-D) Estructuras similares a NETs pero de mayor grosor. ................................................................................................................... 39 Figura 13. Las NETs capturan y lisan a C. perfringens. (A) Supervivencia de C. perfringens (~106 UFC/ml) incubada con neutrófilos humanos expuestos o no a proteínas secretadas por C. perfringens durante 30, 60 y 120 minutos. Los datos representan el promedio ± SE obtenido de tres series de experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones por tratamiento. Las diferencias significativas en las muestras en comparación con el control se indican con * (P < 0.05). (B y C) Micrografías electrónicas de barrido de C. perfringens siendo capturada por las NETs liberadas por neutrófilos humanos in vitro después de la exposición a proteínas secretadas por C. perfringens. Las flechas blancas indican NETs y las puntas de flecha blancas señalan bacterias parcialmente lisadas; el recuadro muestra una lesión directa en la membrana de las bacterias atrapadas en las NETs. ............................... 40 Figura 14. C. perfringens capturada por la liberación de NETs en neutrófilos humanos in vitro (verde-NE y azul-ADN de neutrófilos y de bacterias). Las flechas blancas señalan a las bacterias. ............................................................................................................................... 41 Figura 15. (A-C) Micrografías electrónicas de barrido que muestran a C. perfringens cubierta con componentes globulares y siendo capturada por las NETs que liberan los neutrófilos humanos in vitro. Las flechas blancas indican la presencia de estos elementos globulares. (D) Análisis SEM de alta resolución de los complejos globulares que se agregan en las fibras de ADN. ............................................................................................................ 42 Figura 16. Efecto directo de los componentes liberados por los neutrófilos sobre C. perfringens. Las flechas blancas señalan el daño causado en las bacterias. ......................... 43 xiii Figura 17. La ADNasa presente en las proteínas secretadas por C. perfringens degrada las NETs y el CuSO4 inhibe su actividad. Para esto se analizó el porcentaje de neutrófilos humanos NETóticos posterior al estímulo durante distintos intervalos de tiempo, tanto en ausencia como en presencia del inhibidor CuSO4. Se utilizó medio de cultivo ultrafiltrado como control negativo. Los datos representan el promedio ± SE obtenido de tres series de experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones por tratamiento. Las diferencias significativas entre las muestras se indican con ** (P < 0.01). ............................................ 44 Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa que muestra la capacidad de las proteínas secretadas por C. perfringens de degradar el ADN de timo de ternera. En los carriles 1, 3, 5, 7 y 9 se muestra el control de ADN de timo con cantidades de 1 µg, 0.5 µg, 0.250 µg, 0.125 µg y 0.0625 µg respectivamente. Por otro lado, los carriles 2, 4, 6, 8 y 10 exhiben el ADN de timo de ternera en las mismas concentraciones mencionadas anteriormente, pero expuestas a las proteínas secretadas por C. perfringens. M: marcador de peso molecular Thermo Fisher Mass Ruler High Range DNA Ladder (#SM0393). ............................................................. 45 Figura 19. El CuSO4 inhibe la degradación del ADN de timo de ternera mediada por las proteínas secretadas por C. perfringens de manera dependiente de la dosis. Los carriles 1, 4 y 7 muestran el ADN de timo utilizado como control, con cantidades de 0.250 µg, 0.125 µg y 0.0625 µg respectivamente. Los carriles 2, 5 y 8 corresponden al ADN de timo en las mismas cantidades, pero expuestos a las proteínas secretadas por C. perfringens. Los carriles 3, 6 y 9 representan el mismo conjunto de muestras mencionadas anteriormente, pero expuestas a CuSO4. M: Marcador de peso molecular Thermo Fisher Mass Ruler High Range DNA Ladder (#SM0393). ..................................................................................................... 45 Figura 20. La CpPLC recombinante induce la formación de NETs en neutrófilos humanos in vitro. (A) Análisis cuantitativo por inmunofluorescencia de las NETs inducidas por la CpPLC después de 60 minutos de exposición. Los resultados muestran el promedios ± SE de dos experimentos independientes con tres repeticiones por tratamiento cada uno (se analizaron ~6x104 células por tratamiento). Las diferencias significativas entre las muestras se indican con * (P < 0.05) y ** (P < 0.01). (B) El análisis por inmunofluorescencia revela la formación de NETs mediada por la CpPLC (NE en verde y ADN en azul). (C) Neutrófilos no estimulados (control negativo). (D y E) Micrografías electrónicas de barrido que muestran xiv la formación de NETs después de la exposición de neutrófilos a la CpPLC recombinante y control negativo, respectivamente. ....................................................................................... 47 Figura 21. Anticuerpos contra la CpPLC inhiben la NETosis inducida por las proteínas secretadas de C. perfringens y por la CpPLC recombinante. Neutrófilos no estimulados o expuestos a anticuerpos contra BSA se utilizaron como controles. Los datos representan el promedio ± SE obtenido de tres series de experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones por tratamiento. Las diferencias significativas entre tratamientos se indican con ** (P < 0.01). ........................................................................................................................ 48 Figura 22. La CpPLC induce NETosis suicida. (A) Se analizó la viabilidad de los neutrófilos después de la exposición a la CpPLC con DAPI (azul) permeable a la célula y con PI (rojo) que es impermeable a la célula. Se utilizó medio de cultivo ultrafiltrado y PMA como control negativo y positivo, respectivamente. (B) Análisis cuantitativo del porcentaje de neutrófilos que experimentaron NETosis suicida cuando fueron expuestos a la CpPLC. Los datos representan el promedio ± SE obtenido de tres series de experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones por tratamiento. Las diferencias significativas en el tratamiento con CpPLC en comparación con el control negativo se indican con ** (P < 0.01). ................... 50 Figura 23. La CpPLC induce ROS en neutrófilos humanos. (A) La producción de ROS en neutrófilos humanos expuestos a la CpPLC fue evaluada mediante microscopía de fluorescencia utilizando la sonda permeable a la célula DCFDA (verde) y el DAPI (azul) para la tinción de los núcleos. Se utilizó medio de cultivo ultrafiltrado como control negativo y PMA como control positivo. (B) Análisis cuantitativo de la producción de ROS en neutrófilos humanos expuestos a la CpPLC. Los datos representan el promedio ± SE de tres series de experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones por tratamiento. Las diferencias significativas del tratamiento con CpPLC en comparación con el control negativo se indican con ** (P < 0.01). ................................................................................................................. 51 Figura 24. Inhibición de la producción de ROS y la formación de NETs mediada por (A) NAC, (B) tirón, (C) pirocatecol y (D) luminol en neutrófilos humanos expuestos a la CpPLC. CN: control negativo. Los datos representan el promedio ± SE de tres experimentos independientes con tres repeticiones por tratamiento cada uno. Las diferencias significativas se indican con * (P < 0.05) y ** (P < 0.01). ......................................................................... 52 xv Figura 25. Los inhibidores del metabolismo del ácido araquidónico (A) AACOF3 y (B) ETYA y el inhibidor de la XO (C) alopurinol disminuyen la producción de ROS y la inducción de NETs en neutrófilos humanos expuestos a la CpPLC. CN: control negativo. Los datos representan el promedio ± SE de tres experimentos independientes con tres repeticiones por tratamiento cada uno. Las diferencias significativas se indican con ** (P < 0.01). ....... 53 Figura 26. Los inhibidores de PKC (A) GF109203x, (B) safingol e (C) hispidina y el inhibidor de la vía MEK/ERK (D) U126 disminuyen la producción de ROS y la inducción de NETs por la CpPLC. CN: control negativo. Los datos representan el promedio ± SE de tres experimentos independientes con tres repeticiones por tratamiento cada uno. Las diferencias significativas se indican con * (P < 0.05) y ** (P < 0.01). ................................ 54 Figura 27. Inhibición de la producción de ROS y la formación de NETs en neutrófilos humanos expuestos a la CpPLC por el disulfiram, un antagonista de la gasdermina D. CN: control negativo. Los datos representan el promedio ± SE de dos experimentos independientes con tres repeticiones por tratamiento cada uno. Las diferencias significativas se indican con ** (P < 0.01). ................................................................................................ 55 Figura 28. Inhibición de la producción de ROS y la formación de NETs en neutrófilos expuestos a la CpPLC mediada por 2-APB. CN: control negativo. Los datos representan el promedio ± SE de tres experimentos independientes con tres repeticiones por tratamiento cada uno. Las diferencias significativas se indican con ** (P < 0.01). ................................ 56 Figura 29. Músculo de ratón infectado con un inóculo subletal de C. perfringens durante 3 horas, teñido con HE (20X) (izquierda) y con marcadores específicos de NETs (DAPI y anticuerpos anti-NE) (derecha). Los asteriscos indican área de mionecrosis, las puntas de flecha el inóculo bacteriano y las flechas el infiltrado inflamatorio. .................................... 58 Figura 30. Adhesión de neutrófilos en las paredes de los vasos sanguíneos en muestras de tejido de un modelo murino de gangrena gaseosa inducido con un inóculo subletal de C. perfringens durante 5 horas (a la izquierda tinción con HE (40X) y a la derecha micrografía de inmunofluorescencia con DAPI y anticuerpos anti-NE). ................................................. 59 Figura 31. Formación de trombos en muestras de tejido de un modelo murino de gangrena gaseosa inducido con un inóculo subletal de C. perfringens después de 24 horas del reto. Las flechas señalan el vaso sanguíneo bloqueado por una acumulación de eritrocitos (a la xvi izquierda tinción con HE (40X) y a la derecha micrografía de inmunofluorescencia con DAPI y anticuerpos anti-NE). ......................................................................................................... 59 Figura 32. NETs en músculo de ratón infectado con un inóculo subletal de C. perfringens después de 5 horas del reto. Los recuadros muestran áreas de ADN extracelular (azul) que colocaliza con el marcador de NE de neutrófilos (verde). .................................................... 60 Figura 33. Micrografías del músculo gastrocnemio después de una hora de exposición a un inóculo subletal de C. perfringens (izquierda) y un control sano (derecha). Las flechas señalan áreas de mionecrosis y los asteriscos los núcleos de las células musculares. .......... 61 Figura 34. Micrografía electrónica de transmisión que muestra las alteraciones morfológicas en los neutrófilos reclutados al sitio de infección después de 5 horas de exposición al inóculo subletal de C. perfringens. Las flechas indican la separación de la membrana nuclear interna de la membrana nuclear externa y las puntas de flecha indican vesículas. .......................... 62 Figura 35. Micrografías de neutrófilos reclutados al sitio de infección después de 5 horas de la inoculación subletal de C. perfringens. En el citoplasma de estas células se observan vesículas que se presume contienen ADN y gránulos. Las flechas señalan vesículas que podrían contener ADN. ......................................................................................................... 63 Figura 36. Micrografías que muestran la liberación del contenido vesicular de los neutrófilos al espacio extracelular después de 5 horas de la inoculación subletal de C. perfringens. .... 63 xvii LISTA DE ABREVIATURAS 2-APB: Borato de 2-aminoetoxidifenilo AACOCF3: Araquidonil trifluorometilcetona ADNasa: Desoxirribonucleasa ATP: Nucleótido trifosfato de adenosina BPI: Proteína inductora de la permeabilidad bacteriana BSA: Albúmina de suero bovino Canal SK3: Canal de potasio de pequeña conductancia CPE: Enterotoxina CpPLC: Fosfolipasa C de Clostridium perfringens CuSO4: Sulfato de cobre (II) 2,4-DNP: 2,4-dinitrofenol DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol DCFDA: Diclorodihidrofluoresceína diacetato DFC: 2’,7’–diclorofluoresceína DPI: Cloruro de difenilenoyodonio ETYA: Ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico GF109203X: Bisindolilmaleimida I H2O2: Peróxido de hidrógeno HClO: Ácido hipocloroso HE: Hematoxilina y eosina IL: Interleucina LPS: Lipopolisacárido MPO: Mieloperoxidasa MS: Espectrometría de masas NAC: N-acetil-L-cisteína NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NE: Elastasa de neutrófilo NetB: Toxina B de enteritis necrótica NETs: Trampas extracelulares de neutrófilos xviii NF-κB: Factor nuclear κB PAD4: Peptidil arginina deiminasa tipo IV PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos PBS: Buffer fosfato salino PFO: Perfringolisina O PI: Yoduro de propidio PKC: Proteína quinasa C PMA: Forbol 12-miristato 13-acetato PMN: Polimorfonucleares RCM: Medio reforzado para clostridios Receptores IP3: Receptores de inositol trifosfato ROS: Especies reactivas de oxígeno RPMI: Medio Roswell Park Memorial Institute SE: Error estándar SEM: Microscopía electrónica de barrido TEM: Microscopía electrónica de transmisión Tirón: 4,5-dihidroxi-1,3-benceno disulfónico TLR: Receptor tipo Toll TNB: Buffer de bloqueo Tris-NaCl TNF-α: Factor necrótico tumoral alfa UFC: Unidades formadoras de colonias XO: Xantina oxidasa xix LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Aprobación del Comité Ético Científico de la Universidad de Costa Rica para la toma de muestra de sangre de investigadores o de estudiantes involucrados en el proyecto. .............................................................................................................................................. 91 Anexo 2. Alineación de secuencia de la metalofosfatasa/5'-nucleotidasa bifuncional C. perfringens Q8XIF9 con 5'-nucleotidasas estreptocócicas. Los códigos de acceso en la base de datos de Uniprot se encuentran a la izquierda. Los residuos conservados en todas las secuencias se indican con un asterisco y las posiciones estrictamente conservadas se indican con dos puntos. ..................................................................................................................... 92 Anexo 3. ADNasas de C. perfringens o Clostridium sp. en la base de datos Uniprot. ........ 94 Anexo 4. Secuencias peptídicas de la ADNasa Q8XKM6 detectadas en la digestión de las bandas 1-17 (Figura 7) de las proteínas secretadas por C. perfringens. .............................. 95 Anexo 5. Secuencia de aminoácidos de la ADNasa presente en el secretoma de C. perfringens. Se muestra la secuencia de aminoácidos de la ADNasa anclada a la pared celular (número de acceso Uniprot Q8XKM6). Los segmentos sombreados corresponden a los péptidos identificados mediante MS en tándem después de la digestión en gel de las proteínas secretadas por C. perfringens. ............................................................................................... 97 Anexo 6. Alineamiento de secuencia de la ADNasa Q8XKM6 de C. perfringens con nucleasas estreptocócicas. Los códigos de acceso en la base de datos de Uniprot se encuentran a la izquierda. Los residuos conservados en todas las secuencias se indican con un asterisco y las posiciones estrictamente conservadas se indican con dos puntos. ............................... 98 Anexo 7. Artículo científico: La fosfolipasa C de Clostridium perfringens, un factor de virulencia bacteriano arquetípico, induce la formación de trampas extracelulares por parte de neutrófilos humanos. ........................................................................................................... 101 1 CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES 1.1 Neutrófilos en la respuesta inmune innata Los neutrófilos o polimorfonucleares (PMN) son los glóbulos blancos más abundantes en la circulación sanguínea, tienen un núcleo multilobulado altamente condensado y poseen una gran variedad de gránulos citoplasmáticos que contienen moléculas antimicrobianas (1, 2). Estas células desempeñan un papel fundamental en la inmunidad innata al proveer una defensa inmediata e inespecífica contra agentes extraños al organismo (3, 4). Los patógenos que logran atravesar el epitelio estimulan y reclutan a los neutrófilos desde la circulación periférica hacia los sitios de infección a través de señales de citoquinas y quimiocinas liberadas por las células que se encuentran en la zona de infección o daño (5). Moléculas como el lipopolisacárido (LPS) y la formil metionil leucil fenilalanina (fMLP) presentes en los microorganismos también son reconocidas por los neutrófilos (6). Las interleucinas 6, 8 y 17 (IL-6, IL-8 e IL-17), los leucotrienos, el factor necrótico tumoral alfa (TNF-α) y el componente C5a del complemento estimulan a las células endoteliales para producir moléculas de adhesión celular como las P-selectinas, E-selectinas y miembros de la superfamilia de las integrinas, que favorecen la diapédesis y la migración de los neutrófilos al sitio de infección (2, 3, 7). Entre los mecanismos efectores que pueden ser utilizados por los neutrófilos para combatir a los patógenos se encuentra la liberación de citoquinas para reclutar otras células inmunes, la producción de especies reactivas de oxígenos (ROS), la fagocitosis, la degranulación y la formación de trampas extracelulares (3, 7) (Figura 1). 2 Figura 1. Principales mecanismos antimicrobianos de los neutrófilos (8). - Producción de ROS En los neutrófilos, la principal fuente de ROS es el complejo nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa que consiste en un grupo de enzimas multiproteicas. Este complejo cataliza la reducción no mitocondrial del oxígeno, conocida como estallido respiratorio, utilizando NADPH como donante de electrones y generando el radical superóxido (O2•-). Posteriormente, ya sea espontáneamente o por reacción con otras moléculas se forman ROS como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el oxígeno singulete (‘O2) y el radical hidroxilo (OH•) (3, 9). Otra enzima productora de oxidantes es la mieloperoxidasa (MPO) que se encarga de la producción de ácido hipocloroso (HClO) a partir de H2O2 (10). Estos ROS son capaces de eliminar a los microorganismos al oxidar proteínas y lípidos pero al mismo tiempo pueden dañar potencialmente los tejidos del huésped por lo que su liberación debe estar estrictamente regulada (3, 9). - Fagocitosis La activación de la fagocitosis en los neutrófilos puede ser directa a través del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) por los receptores de 3 reconocimiento de patrones, o indirecta cuando los microorganismos son marcados por moléculas llamadas opsoninas las cuales son reconocidas por receptores presentes en los fagocitos. Seguidamente, el patógeno es engullido y transportado al interior de la célula en una vacuola especializada denominada fagosoma. Este proceso activa vías de señalización en los neutrófilos que permiten el ensamblaje del complejo NADPH oxidasa a la membrana del fagosoma y la fusión de este con gránulos que contienen moléculas microbicidas que eliminan a los patógenos (8, 11). - Degranulación Los neutrófilos pueden liberar al medio extracelular gránulos que contienen moléculas antimicrobianas y enzimas líticas. Los gránulos primarios o azurófilos contienen grandes cantidades de proteínas catiónicas que son extremadamente tóxicas para el patógeno como la elastasa de neutrófilo (NE), la MPO, la catepsina G, la proteinasa 3, la proteína inductora de la permeabilidad bacteriana (BPI) y las α-defensinas. En los gránulos secundarios o específicos se encuentra la lisozima que degrada el peptidoglicano de las bacterias y la lactoferrina que secuestra elementos esenciales para el crecimiento bacteriano como el hierro y el cobre. Los gránulos terciarios contienen moléculas con actividad proteolítica que pueden dañar las paredes celulares bacterianas y la gelatinasa que degrada las proteínas de la matriz extracelular facilitando la migración de los neutrófilos (9, 12, 13). La degranulación es altamente regulada y ocurre de forma gradual, siguiendo un orden específico que incluye la liberación secuencial de gránulos secretorios, terciarios, secundarios y primarios. El contenido de estos gránulos actúa directamente sobre los patógenos, contribuyendo así a la defensa del organismo. Además, esta secuencia ordenada ayuda a limitar la exposición de las células huésped a los componentes citotóxicos, protegiendo así los tejidos sanos durante la respuesta inmune (8). - Trampas extracelulares La estrategia recientemente descrita de los neutrófilos para controlar la infección por patógenos comprende la liberación de estructuras en red, compuestas por ADN y proteínas microbicidas, al espacio extracelular (14). 4 1.2 Trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) Las NETs se describieron por primera vez en el año 2004 por Brinkmann y colaboradores (14). Estas estructuras están compuestas de cromatina descondensada en forma de red que captura a los microorganismos exponiéndolos a una alta concentración localizada de agentes antimicrobianos con el objetivo de controlar y eliminar a los patógenos fuera del entorno celular. Entre las moléculas antimicrobianas que componen a las NETs se encuentran las proteínas granulares de todos los tipos de gránulos presentes en un neutrófilo maduro así como diversas proteínas citoplasmáticas (8). La formación de NETs es requerida para la eliminación de patógenos que son demasiado grandes como para ser fagocitados (15) y en condiciones de flujo sanguíneo la liberación de NETs aumenta la capacidad de captura de los patógenos circulantes en comparación con la fagocitosis (3). Por otro lado, las NETs pueden ocupar un área entre 10-15 veces mayor que el volumen de las células de las que se originan, por lo que actúan como una barrera de contención física para la destrucción extracelular de los agentes patógenos previniendo así su diseminación. Además, al mantener una alta concentración de microbicidas en las NETs, se minimiza la difusión de estas moléculas que podrían dañar los tejidos circundantes (16, 17). Estas estructuras en red están presentes en una gran diversidad de vertebrados como humanos, ratones, aves, peces, caballos, perros, ovejas, entre otros. Incluso se han descrito células capaces de formar estructuras similares a las NETs, como mecanismo de defensa, en invertebrados y en diversas especies de plantas (18). 1.2.1 Componentes estructurales de las NETs El ADN nuclear constituye el principal componente estructural de las NETs, dado que el tratamiento con desoxirribonucleasas (ADNasas), pero no con proteasas, resulta en la degradación de estas estructuras. El ADN forma las fibras sobre las cuales se encuentran adheridas las diferentes moléculas antimicrobianas y además tiene un fuerte potencial 5 bactericida debido a su capacidad para secuestrar cationes unidos a la superficie del patógeno, lo que provoca la ruptura de su membrana y posteriormente su muerte (14, 19). Además, se ha reportado que se pueden formar NETs compuestas por ADN mitocondrial, no obstante, los neutrófilos al tener un número limitado de mitocondrias el contenido de ADN es relativamente más bajo si se compara con el ADN nuclear (20, 21). Entre los componentes proteicos de las NETs se encuentran diversas proteínas nucleares, granulares y citoplasmáticas. Las histonas modificadas representan el 70% del total de las proteínas asociadas a estas estructuras, siendo H2A y H2B las que se encuentran en mayor proporción. Estas proteínas son extremadamente citotóxicas y muy eficientes en promover la lisis bacteriana. La NE, una proteasa catiónica, es la segunda proteína más abundante, comprendiendo el 6% del total (22–24). Otras proteínas presentes en las NETs que pueden alterar las paredes y membranas celulares microbianas o inhibir el crecimiento microbiano son la MPO, la proteinasa 3, la catepsina G, la gelatinasa, la lactoferrina, la lisozima, la catalasa, la calprotectina, la LL37, la BPI, las α-defensinas y proteínas del citoesqueleto, entre otras (22, 25). 1.2.2 Inductores de las NETs La formación de NETs se activa en respuesta a diversos estímulos químicos y biológicos. Entre los primeros se encuentran el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), los cristales de urato monosódico, los ionóforos de calcio, el H2O2, el factor activador de plaquetas, autoanticuerpos, el óxido nítrico y diversas citoquinas proinflamatorias como el TNF-α y la IL-8 (21, 26). Entre los agentes biológicos que inducen la liberación de NETs se han reportado las plaquetas activadas, diversas bacterias (Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Mannheimia haemolytica, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, entre otros), hongos (Aspergillus nidulans, Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum y Aspergillus fumigatus), parásitos (Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, Leishmania amazonensis, Eimeria bovis, Naegleria fowleri, Cryptosporidium https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/neisseria-gonorrhoeae 6 parvum, Trypanosoma cruzi y Toxoplasma gondii) e inclusive virus (el virus de la influenza tipo A, el virus respiratorio sincitial, el virus del dengue, el virus chikungunya, el virus de la hepatitis B y recientemente el SARS-CoV2) (27, 28). Además, se ha descrito que moléculas purificadas de algunos microorganismos pueden inducir eficientemente la formación de NETs, como por ejemplo el LPS de E. coli, el lipofosfoglicano de L. amazonensis y la proteína M1 de S. pyogenes (29). Para los estudios in vitro de la formación de NETs se utiliza con mucha frecuencia el PMA, el ionóforo de calcio A23187, el H2O2, el LPS o las citoquinas antes mencionadas (16). 1.2.3 NETosis La liberación de NETs se encuentra asociada a un programa de muerte celular denominada NETosis, la cual es distinta de la apoptosis y de la necrosis en términos de cambios morfológicos y de las moléculas que participan en la inducción (30). Entre los cambios morfológicos que se observan en los neutrófilos cuando liberan NETs se encuentran el aplanamiento de la célula, la pérdida de la forma lobular del núcleo, la activación de la proteína quinasa C (PKC), la desintegración de las membranas nucleares y granulares, la migración de la MPO y la NE de los gránulos hacia la periferia del núcleo y la descondensación de la cromatina (30, 31). Dependiendo del estímulo se puede inducir la formación de NETs a través de diferentes mecanismos, con diferencias en cinética y en eficiencia y con características morfológicas aparentemente diferentes de las estructuras en red que se generan. Pero también un mismo estímulo puede conducir a la liberación de NETs por diferentes vías. La inducción fisiológica de las NETs se genera a través de diferentes vías mecánicas después del reconocimiento por parte de receptores tipo Toll (TLRs), receptores Fc, receptores de citoquinas o receptores del complemento (32, 33). Aunque en un principio se pensó que la formación de NETs siempre involucraba la muerte del neutrófilo, en el 2012 se describió que en ciertas condiciones los neutrófilos realizan un tipo de NETosis que no implica la muerte celular. Por lo tanto, hasta ahora se han descrito 7 dos tipos de NETosis, la NETosis convencional o suicida y la NETosis vital (34, 35) (Figura 2). Figura 2. Tipos de NETosis en respuesta a diversos estímulos (33). -NETosis convencional o suicida En el proceso de NETosis suicida están implicados los cambios morfológicos de los neutrófilos activados, los cuales adquieren una forma más extendida debido a su firme adhesión al sustrato. Durante este proceso, el reconocimiento del estímulo desencadenante por un receptor de la superficie del neutrófilo produce la liberación de calcio del retículo endoplasmático. Seguidamente, el aumento en la concentración de calcio intracelular genera la activación de la PKC que es esencial para que a través de reacciones de fosforilación por las MAP quinasas se active el complejo de la NADPH oxidasa que genera la producción de ROS. Se ha descrito que las ROS desintegran las membranas de los gránulos, por lo que inducen la liberación de la MPO y de la NE de los gránulos azurófilos. La NE se transloca al núcleo, donde media la degradación de las histonas nucleosomales, mientras que la MPO colabora con la NE en las etapas finales del proceso de descondensación del ADN a través 8 de un mecanismo que no involucra su actividad enzimática. Sinérgicamente, la enzima peptidil arginina deiminasa tipo IV (PAD4), ante un aumento en la concentración del calcio citoplasmático, se transloca al núcleo para reemplazar en las histonas los residuos de arginina cargados positivamente por residuos neutros de citrulina (citrulinación). Esto reduce la interacción electrostática entre las histonas y el ADN favoreciendo la descondensación de la cromatina. Posteriormente, el núcleo pierde su morfología multilobulada, la eucromatina y la heterocromatina se homogenizan y la envoltura nuclear se desintegra promoviendo que el material nuclear entre en contacto directo y se mezcle con los componentes granulares. Por último, la membrana celular se rompe, las NETs son liberadas al espacio extracelular y el neutrófilo muere (33, 35). Después de la estimulación del neutrófilo, la MPO liberada también produce HClO a partir de H2O2 y cloruro. El HClO exhibe una elevada actividad microbicida al oxidar lípidos y proteínas microbianas, por lo que se considera una ROS clave en esta vía de formación de NETs. Por su parte, la NE también se encarga de degradar el citoesqueleto de actina que debilita la membrana plasmática, y activa la proteína formadora de poros gasdermina D que permite una mayor liberación de la NE al permeabilizar los gránulos. Además, la gasdermina D puede causar lisis celular para mediar la liberación de las NETs (3, 35). Un estudio reciente demostró que el aumento en la concentración de calcio también activa a la serina proteasa calpaína, la cual facilita la descondensación de la cromatina en presencia de PAD4 (32). Entre los mecanismos moleculares involucrados en la NETosis suicida se ha demostrado que la generación de ROS por el complejo NADPH oxidasa desempeña un papel central. No obstante, algunos estudios sugieren que este proceso puede tener lugar independientemente de la producción de ROS y ser mediada sólo por la enzima PAD4 que se activa por niveles elevados de calcio en el interior de la célula cuando se utilizan por ejemplo los ionóforos de calcio. De esta manera, esta vía de formación de NETs puede clasificarse en términos generales en dos grupos, según la dependencia o no de la producción de ROS mediada por la actividad de la NADPH oxidasa (36, 37). 9 Esta vía es lenta y puede tardar entre tres y cuatro horas en completarse después de la estimulación por el PMA que es un potente activador de la PKC, por las plaquetas activadas, por algunos microorganismos patógenos (S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, C. albicans, A. fumigatus, etc.) y por estímulos inflamatorios no infecciosos como patrones moleculares asociados a daño (DAMPs) y complejos inmunes (30, 35). -NETosis vital Se ha reportado que la liberación de NETs no siempre induce la muerte del neutrófilo, sino que en algunos casos las células permanecen viables durante un periodo de tiempo ya que mantienen su membrana plasmática intacta. De esta manera, los neutrófilos aunque pierdan parte de su material genético conservan otras propiedades de defensa como la quimiotaxis y la fagocitosis (3, 34). Esta vía de inducción de NETs es independiente de la actividad de la NADPH oxidasa pero incluye la citrulinación de las histonas mediada por PAD4 que se activa por la entrada de iones de calcio al citosol a través del miembro tres del canal de potasio de pequeña conductancia (SK3). Además de esto, la NETosis vital emplea el tráfico vesicular del ADN hacia el exterior de la célula y la degranulación (3, 35). Durante este proceso, el ADN es empaquetado en vesículas que se derivan de la membrana nuclear interna y externa. Estas vesículas transitan intracelularmente y se fusionan con la membrana citoplasmática liberando su contenido al exterior o son exocitadas y se lisan en el medio extracelular donde los componentes de las vesículas y de los gránulos se combinan. El ADN liberado colocaliza con la MPO y con la NE, pero se ha reportado que la actividad de la NE es mucho menor en comparación con la actividad detectada en las NETs que son liberadas por la vía lítica. Finalmente, la membrana nuclear se desintegra y el neutrófilo permanece sin núcleo pero viable (21, 35, 38). Este tipo de NETosis se ha descrito en respuesta al reconocimiento de PAMPs, ya sea por bacterias como por ejemplo S. aureus o por componentes bacterianos como el LPS que son reconocidos por los TLR (TLR4 y TLR2) de las células inmunitarias (17). Es un proceso que 10 ocurre rápidamente, en cuestión de minutos, lo que permite atrapar rápidamente a los patógenos y no comprometer al huésped (30, 32). Además, se ha descrito una NETosis vital a partir de ADN mitocondrial mediada por el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y una estimulación posterior con LPS. Para llevar a cabo este proceso, las mitocondrias se trasladan a la superficie celular antes de desintegrarse y liberan el ADN mitocondrial oxidado al espacio extracelular donde el ADN se une a las enzimas granulares como la MPO y la NE. Estas estructuras difieren notablemente de las NETs convencionales porque están ausentes las histonas pero están presentes péptidos formilados y el ADN mitocondrial oxidado, que parecen funcionar como señales proinflamatorias. Se sugiere que este proceso requiere de la producción de ROS por la NADPH oxidasa o por complejos de fosforilación oxidativa mitocondrial (20, 30, 35). 1.2.4 Potencial patogénico de las NETs A pesar de las funciones inmunoprotectoras conocidas de las NETs, estas están siendo cada vez más reconocidas por su papel fisiopatológico central en diferentes enfermedades. Investigaciones en modelos animales están proporcionando evidencia, cada vez mayor, de que las NETs pueden contribuir en la morbilidad y mortalidad de diversas patologías (39, 40). Alteraciones en el control de la producción o la degradación de las NETs puede generar que estas estructuras actúen como un arma de doble filo ya que no solo contribuyen a la eliminación de patógenos sino que también puede causar daño a las células circundantes del huésped. Las histonas son altamente citotóxicas para las células endoteliales y epiteliales debido a sus propiedades catiónicas que comprometen la integridad de la membrana celular. La NE presente en estas estructuras es potencialmente dañina para los tejidos. Además, la liberación de las NETs en la vasculatura proporciona un andamiaje que promueve la formación de trombos lo que conlleva a la oclusión vascular y también constituyen un estímulo protrombótico para la unión y agregación plaquetaria. El ADN libre fuera de las 11 células y las histonas extracelulares son importantes mediadores que inician un proceso hiperinflamatorio y si este proceso no se regula con precisión puede llevar a la falla multiorgánica y a la muerte (3, 41, 42). En enfermedades infecciosas, autoinmunes, neurodegenerativas, inflamatorias, metabólicas, pulmonares, cardiovasculares, hepáticas, trombóticas, así como en diabetes, cáncer y trastornos de fertilidad, se ha descrito que las NETs juegan un papel controversial al generar efectos negativos en el huésped y favorecer la patología (39, 43). 1.3 Clostridium perfringens C. perfringens es un bacilo Gram positivo, anaerobio, esporulado y no móvil que se encuentra ampliamente distribuido en el medio ambiente. Esta bacteria puede estar presente en suelos, alimentos, aguas residuales, así como en el tracto gastrointestinal de humanos y diversos animales. Sin embargo, si el ambiente es adecuado esta bacteria puede proliferar y producir factores de virulencia causando enfermedades en humanos y en animales de producción avícola, caprina, ovina y bovina (44, 45). Entre las enfermedades causadas por C. perfringens se encuentran la enteritis necrótica, la enterotoxemia, la intoxicación alimentaria, la celulitis anaeróbica y la gangrena gaseosa (46). Según las estadísticas proporcionadas por el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en Estados Unidos, se estima que aproximadamente el 5% de los brotes y el 4% de las hospitalizaciones anuales están vinculadas a C. perfringens. Así también, se estima que la enteritis necrótica causada por este patógeno supone un costo anual de dos a seis mil millones de dólares estadounidenses para la industria avícola a nivel mundial (47). C. perfringens fue la primera bacteria Gram positiva cuyo genoma completo fue elucidado (48). La patogenicidad de C. perfringens se asocia a su capacidad para producir al menos 17 toxinas y diferentes enzimas extracelulares. Entre estos se encuentran las toxinas α, β, ε, ι, δ, θ, κ, λ, μ, ν; una enterotoxina (CPE), la toxina B de enteritis necrótica (NetB), una hemolisina y una neuraminidasa (49, 50). Sin embargo, ninguna cepa es capaz de producir todas las toxinas y enzimas mencionadas, por lo tanto, los aislamientos de esta bacteria se clasifican 12 en siete toxinotipos que van de la A a la G, en función de su capacidad para producir o no las siguientes toxinas: α, β, ε, ι, CPE y NetB (51). El gen que codifica para la toxina α o fosfolipasa C (CpPLC), está presente en el genoma de todas las cepas de C. perfringens (52). El toxinotipo A, que se asocia con gangrena gaseosa en humanos, es el que produce la mayor cantidad de CpPLC (49, 52). JIR325 es una cepa virulenta del toxinotipo A de C. perfringens resistente al ácido nalidíxico y a la rifampicina. Esta cepa, derivada por mutación espontánea de la cepa silvestre 13 (53, 54), fue la que se utilizó en este estudio. 1.3.1 CpPLC La CpPLC es una proteína de 43 kDa, que degrada las membranas celulares provocando la muerte celular. Esta toxina es una metaloenzima dependiente de zinc que consta de 370 aminoácidos y su estructura tridimensional comprende dos dominios. El dominio N-terminal de unión a zinc, α- helicoidal, tiene actividad lecitinasa y esfingomielinasa; mientras que el dominio C-terminal de unión a calcio, de tipo β sándwich, es el responsable de la interacción de la toxina con las membranas celulares. A concentraciones nanomolares, la CpPLC induce una hidrólisis moderada de los fosfolípidos, generando segundos mensajeros que activan diversas vías de transducción de señal, lo que ocasiona una producción descontrolada de varios mediadores intercelulares (46, 55). Entre las vías de señalización activadas por estos segundos mensajeros se encuentran la PKC, la proteína quinasa activada por mitógeno/quinasa regulada por señales extracelulares (MEK/ERK) y el factor nuclear κB (NF-κB), dando como resultado la producción de ROS e IL-8 (46, 56) (Figura 3). Se ha demostrado que la CpPLC es el principal factor de virulencia de C. perfringens en la gangrena gaseosa (57). 13 Figura 3. Estructura de la CpPLC. (A) Representación gráfica de la estructura de la toxina, en color azul se muestran los residuos que se insertan en la membrana y en color rojo los residuos que se sitúan lejos de la membrana (58). (B) Modelo propuesto sobre el mecanismo de acción de la CpPLC (modificado de Monturiol et al. (56)). 1.3.2 Gangrena gaseosa La gangrena gaseosa, causada en la mayoría de los casos (>85%) por C. perfringens, es una infección de los tejidos blandos caracterizada por mionecrosis severa, acumulación de gas en el sitio de la infección y edema. Usualmente, esta infección se asocia al ingreso de formas vegetativas o esporas de C. perfringens en heridas traumáticas o quirúrgicas, aunque en algunos casos también se produce espontáneamente en pacientes con neoplasias o diabetes (46). Las bacterias penetran en tejidos profundos, como el músculo, lo que puede desencadenar una rápida propagación de la infección resultando en sepsis y muerte de los pacientes afectados (50). En Estados Unidos, se registran aproximadamente 1.000 casos de gangrena gaseosa cada año. En países menos desarrollados, donde el acceso a la atención médica y a los antibióticos es limitado, es probable que la incidencia sea mayor, aunque el número exacto no se conoce. Con una atención adecuada que incluya detección temprana, intervención quirúrgica, administración de antibióticos y terapia con oxígeno hiperbárico, la tasa de mortalidad 14 general oscila entre el 20% y el 30%. En pacientes inmunocomprometidos o diabéticos, la tasa de mortalidad puede aumentar a un 67% o más. Sin embargo, la falta de tratamiento lleva a una mortalidad del 100% (50, 59). El papel de la CpPLC como el principal factor de virulencia en la gangrena gaseosa fue establecido en 1995. En este estudio se determinó que bacterias modificadas genéticamente que no producen la PLC son incapaces de inducir gangrena gaseosa (46, 57). Además, se ha evidenciado que la θ-toxina o perfringolisina O (PFO) también está implicada en el establecimiento de la infección (46, 60). Una vez que la infección se establece, la CpPLC provoca una mionecrosis rápida y extensa que induce la liberación de creatina quinasa (CK) a la circulación (61). Esta toxina también induce la producción de IL-8, que es un potente quimioatrayente de neutrófilos (62). Asimismo, la CpPLC desregula las vías de transducción de señales en células endoteliales, lo que provoca la sobreexpresión de moléculas de adhesión en estas células. Esto a su vez altera el tráfico de neutrófilos al tejido infectado. Aunado a lo anterior, la toxina induce la agregación de plaquetas y de neutrófilos activados por trombina que causan la oclusión vascular, promoviendo las condiciones de hipoxia que permiten el acelerado crecimiento de la bacteria (62, 63). 1.4 C. perfringens y NETs Recientemente, se describió que la incubación de neutrófilos murinos con C. perfringens induce la formación de NETs. También se reportó que en un modelo murino de gangrena gaseosa, el pretratamiento intravenoso de los ratones con ADNasa I, inmediatamente antes del reto con 107 o 108 unidades formadoras de colonias (UFC) de C. perfringens, aumenta la mortalidad y la severidad de la gangrena gaseosa. Este hallazgo sugiere que las NETs desempeñan un papel protector en la infección (64). Además, se demostró que la inducción de NETs por C. perfringens en neutrófilos murinos requiere de la proteína MLKL (proteína similar a quinasa de linaje mixto) (65, 66). Sin embargo, aún no se ha identificado el estímulo específico de C. perfringens que desencadena la formación de NETs, ni se ha determinado la vía de transducción de señal involucrada en este proceso de inducción. 15 JUSTIFICACIÓN C. perfringens es uno de los patógenos bacterianos más ampliamente distribuido en el ambiente. Esta bacteria cuenta con un arsenal de proteínas tóxicas asociadas con enfermedades gastrointestinales en animales y humanos (45, 60). Una de las principales enfermedades que esta bacteria produce en humanos es la gangrena gaseosa, una infección aguda y fulminante caracterizada por mionecrosis severa (45, 67). La CpPLC y la PFO son las principales toxinas responsables de desencadenar la agregación plaquetaria, la acumulación intravascular de leucocitos, la trombosis y la oclusión vascular e hipoxia que ocurren durante la gangrena gaseosa (63). Investigaciones recientes han demostrado que C. perfringens induce NETs en neutrófilos murinos (64, 65). Paralelamente, en nuestro grupo de investigación hemos descubierto que las proteínas secretadas por esta bacteria tienen la capacidad de inducir la formación de NETs en neutrófilos humanos in vitro. En este estudio se planteó determinar cuáles proteínas secretadas por C. perfringens están involucradas en la formación de NETs y comprender el mecanismo por el cual se producen. Además, utilizando un modelo murino de gangrena gaseosa, se buscó determinar si la respuesta inmune, mediada por las NETs, desempeña un papel en la defensa del huésped o en la fisiopatología de la enfermedad. 16 HIPÓTESIS Proteínas secretadas por C. perfringens inducen NETosis en neutrófilos humanos in vitro y en un modelo murino de gangrena gaseosa. 17 OBJETIVOS Objetivo general Caracterizar la formación de NETs inducida por proteínas secretadas por C. perfringens en neutrófilos humanos in vitro y en un modelo murino de gangrena gaseosa. Objetivos específicos v Identificar y cuantificar la formación de NETs en neutrófilos humanos in vitro utilizando como estímulo proteínas secretadas por C. perfringens. v Determinar los componentes proteicos de sobrenadantes de C. perfringens que generan la formación de NETs en neutrófilos humanos in vitro y caracterizar la vía de inducción. v Determinar y caracterizar la formación de NETs en un modelo murino de gangrena gaseosa inducido por C. perfringens. 18 CAPÍTULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Cultivo de C. perfringens Se trabajó con la cepa JIR325 de C. perfringens, la cual está muy bien caracterizada y se utiliza en el modelo murino de gangrena gaseosa. La bacteria se cultivó en medio reforzado para clostridios (RCM) hasta que se alcanzó una densidad óptica a 600 nm entre 0.4 - 0.5. Luego, a partir de este cultivo se inocularon con 1 ml varios tubos con 40 ml de medio RCM. Los tubos se incubaron durante 24 horas a 37°C en anaerobiosis. Para verificar la pureza del cultivo se creció la bacteria en placas con agar RCM suplementado con yema de huevo y se realizó tinción de Gram. 2.2 Obtención de proteínas secretadas por C. perfringens Para la obtención de las proteínas secretadas por C. perfringens en fase estacionaria, se centrifugaron los cultivos obtenidos a las 24 horas de incubación a 7000 rpm durante 7 minutos. Se recuperó el sobrenadante y se filtró con una membrana de 0.22 μm. Posteriormente, las proteínas se concentraron en un volumen final de 5 ml mediante la ultrafiltración de los sobrenadantes utilizando una membrana con un poro de exclusión de 10 kDa. Para esto, se realizaron 5 lavados con 50 ml de buffer fosfato salino (PBS) estéril hasta alcanzar una apariencia clara del sobrenadante. Se obtuvo una concentración final de proteína de 6.3 mg/ml haciendo uso del espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific). Las proteínas secretadas se almacenaron en alícuotas de 500 μl a -70°C hasta su posterior uso. 2.3 Análisis proteómico Las proteínas secretadas por C. perfringens se separaron con base en su peso molecular mediante una electroforesis SDS-PAGE al 12% en condiciones reductoras. Se cargaron 40 μg de las proteínas, se corrió el gel a 150 V por 20 minutos y luego a 180 V durante 1 hora y 19 se tiñó con azul de Coomasie para visualizar las bandas obtenidas. Las bandas seleccionadas se cortaron cuidadosamente con un bisturí, se redujeron los enlaces disulfuro de las proteínas con ditiotreitol 10 mM y se realizó la alquilación con yodoacetamida 50 mM. Durante la noche, se efectuó la digestión en gel de las proteínas con tripsina bovina de grado de secuenciación (en bicarbonato de amonio 25 mM) mediante el uso de una estación de trabajo automatizada (Intavis). Los péptidos obtenidos se secaron, se redisolvieron con agua y ácido fórmico al 0.1% y se sometieron a nESI-MS/MS en un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus® (Thermo Fisher). Luego, se cargaron 10 μl de cada digesto tríptico en una columna trampa C18 (75 mm x 2 cm, partícula de 3 mm; PepMap®, Thermo). Se lavó con ácido fórmico al 0.1% y se separó a 200 nl/min con una columna analítica C18 Easy-spray® de 3 µm de partícula, 15 cm × 75 μm, utilizando un cromatógrafo nano-Easy® 1200 (Thermo Fisher). Se elaboró un gradiente de ácido fórmico al 0.1% (solución A) a acetronitrilo al 80% con ácido fórmico al 0.1% (solución B): 1 – 5% B en 1 minuto, 5 – 26% B en 25 minutos, 26 – 79% B en 4 minutos, 79 – 99% B en 1 minuto y 99% B en 4 minutos, para un período de 35 minutos en total. Los espectros de espectrometría de masas (MS) se adquirieron en modo positivo a 1.9 kV, con una temperatura capilar de 200°C, utilizando 1 μscan a 400 – 1600 m/z, tiempo máximo de inyección de 100 ms, objetivo de AGC de 3×106 y resolución orbitrap de 70,000. Los 10 iones principales con 2 a 5 cargas positivas se fragmentaron con un objetivo de AGC de 1×105, un tiempo de inyección máximo de 110 ms, una resolución de 17,500, un recuento de bucles de 10, una ventana de aislamiento de 1.4 m/z y un tiempo de exclusión dinámica de 5 segundos. Los espectros MS/MS que se obtuvieron se procesaron para comparar péptidos con secuencias de proteínas de C. perfringens contenidas en la base de datos UniProt utilizando Peaks X® (Bioinformatics Solutions). La carbamidometilación de cisteína se estableció como una modificación fija, mientras que la desamidación de asparagina o glutamina y la oxidación de metionina se establecieron como modificaciones variables, permitiendo hasta 3 escisiones perdidas por tripsina. Los parámetros para la aceptación de coincidencias se establecieron en una tasa de descubrimiento falso <1% y un puntaje de proteína -10lgP 30 (68, 69). 20 2.4 Aislamiento de neutrófilos humanos Se siguió el protocolo descrito por Brinkmann et al. (70) con las siguientes modificaciones. Con el aval del Comité Ético Científico de la Universidad de Costa Rica (Anexo 1), se realizó la extracción de sangre periférica de donantes voluntarios involucrados en el proyecto y se mezcló con el anticoagulante citrato de sodio. Luego se añadió cuidadosamente 6 ml de sangre sobre 6 ml de Histopaque ®-1119 (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Después de centrifugar el tubo durante 20 minutos a 3000 rpm, se recuperó la capa que contenía los neutrófilos y se lavó con 10 ml de PBS estéril (Figura 4). Posteriormente, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 3000 rpm y se descartó el sobrenadante. Para eliminar los restos de eritrocitos, el sedimento celular se resuspendió en 5 ml de tampón de lisis (NH4Cl 0.155 M, KHCO3 10 mM, EDTA al 5% y agua desionizada) y se agitó suavemente durante 25 segundos. Luego se agregaron 10 ml de PBS estéril para detener la lisis y la suspensión celular se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos. El sedimento celular obtenido se resuspendió en 1 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Sigma-Aldrich) estéril, suplementado con suero fetal bovino al 10% (inactivado a 56°C) y penicilina-estreptomicina al 1%. Todos los pasos de centrifugación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Figura 4. Separación de células sanguíneas por densidad utilizando un gradiente de Histopaque ®-1119. 21 Posteriormente, se contaron las células aisladas en una cámara de Neubauer y se realizó tinción de Wright para determinar la pureza del aislamiento. Además, las células se tiñeron con el reactivo FluoroQuench™ (OneLambda, EE. UU.) para determinar la viabilidad celular. 2.5 Inducción de la formación de NETs La inducción de NETs en neutrófilos humanos cultivados in vitro se llevó a cabo con base en la metodología propuesta por Brinkmann et al. (70). Se preparó una placa de 24 pozos con cubreobjetos de vidrio estériles (10 mm de diámetro) previamente recubiertos con poli-L- lisina al 0.001% durante una hora. Posteriormente, se sembraron 4x105 neutrófilos recién aislados en cada pozo con 500 μl de medio RPMI y la placa se incubó durante una hora a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 para permitir la adhesión de las células. Luego las células se trataron con las proteínas secretadas por C. perfringens (1.05 μg/μl), se añadió PMA (100 nM) como control positivo y se utilizaron neutrófilos no tratados como control negativo en cada uno de los experimentos. También se utilizó como tratamiento CpPLC recombinante (25.12 ng/ml) de la cepa 8-6 que se expresó previamente en E.coli en nuestro grupo de investigación. En las pruebas donde se evaluó el sulfato de cobre (II) (CuSO4) 0.01 M como inhibidor de ADNasa, las proteínas secretadas por C. perfringens se preincubaron con el inhibidor durante una hora antes de la estimulación de los neutrófilos. Las células se incubaron a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 por 15 minutos, 30 minutos, 1 hora y 2 horas para determinar una cinética en el tiempo de la formación de NETs. Después de cada incubación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%. 2.6 Detección de NETs por inmunofluorescencia Luego de la activación de los neutrófilos con las proteínas del sobrenadante de C. perfringens, las células en los cubreobjetos se lavaron 3 veces durante 5 minutos con PBS. Seguidamente, se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.5% durante un minuto a temperatura ambiente. Después de 3 lavados con PBS durante 5 minutos cada uno, se agregó un bloqueador de proteínas libre de suero (Dako, Denmark), durante 30 minutos a 37°C en 22 cámara húmeda. Posteriormente, los neutrófilos se incubaron con el anticuerpo policlonal anti-NE de neutrófilos producidos en conejo (n.º de catálogo 138 481001; EMD Millipore) diluido 1:100 en buffer de bloqueo Tris-NaCl (TNB), durante una hora en cámara húmeda a 37°C. Se realizaron 3 lavados de 5 minutos cada uno con PBS y las células se incubaron con el conjugado de cabra anti-IgG de conejo (H+L) (FITC) (n.º de catálogo ab6717; Abcam, EE. UU.), diluido 1:50 en buffer TNB, durante una hora en cámara húmeda a 37°C. Por último, los cubreobjetos se lavaron 3 veces con PBS durante 5 minutos cada uno y se colocaron en portaobjetos de vidrio utilizando el medio de montaje acuoso con 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI) FluoroshieldTM (Cat. No. ab104139; Abcam, EE. UU.) que tiñe el ADN de color azul (Figura 5). Figura 5. Técnica de inmunofluorescencia para la detección de NETs. 2.7 Cuantificación semiautomática de la formación de NETs La captura de imágenes se llevó a cabo utilizando el microscopio automatizado LionheartTM LX (BioTek Instruments, Vermont, USA). Se generaron imágenes que abarcaron un 85% del cubreobjeto haciendo uso de un objetivo de 20X. Se analizaron los canales de fluorescencia GFP y DAPI simultáneamente para visualizar la enzima NE y el ADN, respectivamente. Luego, para analizar las imágenes de microscopía de fluorescencia se implementó un protocolo automático en el programa CellProfiler (https://cellprofiler.org/). Este protocolo incluyó dos pasos principales basados en los canales de fluorescencia, primero la identificación de neutrófilos totales (canal azul, DAPI) y segundo, la identificación de NETs (canal verde, GFP). Con la identificación del número de células totales como objetos https://cellprofiler.org/ 23 primarios (tamaño de 10 a 40 píxeles), se creó un filtro para preservar sólo las células que estaban liberando NETs (tamaño de 50 a 2000 píxeles) o neutrófilos NETóticos, utilizando la función de máscara de objetos en el programa. El protocolo se estandarizó y se validó mediante el análisis de 10 conjuntos de imágenes y luego se aplicó automáticamente a todas las imágenes junto con un paso de cuantificación. El rendimiento se verificó manualmente utilizando las imágenes generadas a partir del análisis. Se analizaron aproximadamente 9x104 células por tratamiento. 2.8 Análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) Los neutrófilos se sembraron en cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina y se incubaron con las proteínas secretadas de la bacteria (1.05 μg/μl) o con estas proteínas más un inóculo de C. perfringens de 4x105 o sólo con la CpPLC recombinante (25.12 ng/ml) durante 60 minutos a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2. Las células se fijaron en glutaraldehído al 2% y formaldehído al 2% en buffer fosfato 0.05 M y se mantuvieron a 4°C. Luego se lavaron los cubreobjetos 3 veces con buffer fosfato 0.05 M durante 10 minutos cada uno. Las células se post-fijaron en tetraóxido de osmio al 2% en buffer fosfato 0.05 M durante dos horas a temperatura ambiente y seguidamente se realizaron otros 3 lavados con buffer fosfato durante 10 minutos cada uno. Posteriormente, las muestras se deshidrataron con una serie graduada de etanol, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% y 95% durante 15 minutos cada uno y luego tres recambios de etanol al 100% durante 20 minutos cada uno. Las muestras se secaron en la estufa a 40°C durante 48 horas y se recubrieron con oro en un cobertor iónico Denton Vacuum Desk V. Todas las muestras fueron visualizadas y analizadas con un microscopio electrónico de barrido JEOL, modelo JSM6390LV. 2.9 Identificación de la actividad nucleasa Para medir actividad nucleasa presente en los sobrenadantes, se incubaron las proteínas secretadas por C. perfringens (1.05 μg/μl) con diferentes concentraciones de ADN de timo de ternera (1 μg, 0.5 μg, 0.250 μg, 0.125 μg y 0.0625 μg) y buffer ADNasa 10X (Tris-HCL 100 mM, MgCl2 25 mM y CaCl2 1 mM, pH 7.5) durante 60 minutos a 37°C. Además, se 24 llevaron a cabo experimentos en donde se incluyó la incubación del sobrenadante y del ADN de timo junto con el inhibidor de ADNasa CuSO4 (0.01 M). La reacción se detuvo añadiendo EDTA (50 mM) a 65°C durante 10 minutos. Se utilizó RCM estéril como control negativo. Para visualizar el ADN, se corrieron 20 µl de cada muestra en un gel de agarosa al 1.5%. 2.10 Ensayo de la actividad bactericida de las NETs Se incubó un cultivo de C. perfringens, con una densidad óptica de 0.6 a 600 nm, con neutrófilos humanos recién aislados (4x105 células) expuestos a proteínas secretadas por C. perfringens (1.05 μg/μl) o RCM estéril (control negativo) durante 30, 60 y 120 minutos a 37°C en condiciones anaerobias en una atmósfera con 5% de CO2. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se realizaron diluciones seriadas de cada tratamiento en 3 placas de agar RCM con yema de huevo. Las placas se incubaron en atmósfera anaeróbica durante 48 - 72 horas y se contaron las UFC. 2.11 Determinación del tipo de NETosis En placas de 96 pocillos, previamente recubiertos con poli-L-lisina, se sembraron 7x104 neutrófilos aislados y se estimularon con CpPLC recombinante (25.12 ng/ml) durante 30 minutos a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Se determinó la viabilidad celular utilizando la solución de tinción de ácido nucleico Höechst 33342 (31.25 µg/ml) (azul) que es permeable a la membrana de las células y yoduro de propidio (PI) (2 µg/ml) (rojo) como colorante impermeable a las células. Después de 10 minutos de incubación se realizaron 3 lavados con PBS y las células se analizaron mediante inmunofluorescencia utilizando un microscopio automatizado LionheartTM y se cuantificaron haciendo uso del protocolo automatizado del CellProfiler. 2.12 Detección de ROS La generación de ROS en neutrófilos aislados se determinó incubando las células en placas de 96 pocillos con la CpPLC recombinante (25.12 ng/ml) durante una hora a 37°C en una 25 atmósfera húmeda con 5% de CO2. La sonda sensible a ROS diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFDA) (5 mM) se añadió 30 minutos antes de completar la hora de incubación y el Höechst (31.25 µg/ml) se adicionó 10 minutos antes de completar el período de incubación. Seguidamente, se realizaron 3 lavados con PBS. Se capturaron imágenes con un microscopio automatizado LionheartTM y se determinó el porcentaje de células fluorescentes haciendo uso del protocolo automatizado del CellProfiler. 2.13 Neutralización de la CpPLC Se utilizaron anticuerpos policlonales anti-CpPLC (38.6 mg/ml) y anti-albúmina de suero bovino (BSA) (6.2 mg/ml) (control negativo) preparados en conejos, purificados mediante precipitación con ácido caprílico y concentrados mediante ultrafiltración, con el fin de determinar su capacidad para neutralizar el efecto inductor de NETosis generado por las proteínas secretadas por C. perfringens o por la CpPLC recombinante. Las proteínas secretadas o la CpPLC recombinante se incubaron con diluciones seriadas de los anticuerpos (concentración inicial 1 mg/ml) durante una hora a 37°C. Luego, los neutrófilos aislados fueron expuestos a estos tratamientos durante una hora a 37°C, se fijaron con paraformaldehído al 4% y se realizó el respectivo análisis de la formación de NETs por inmunofluorescencia. 2.14 Inhibición de la formación de NETs y la producción de ROS Se utilizaron diversos inhibidores farmacológicos de ROS para determinar si la vía de inducción de NETs mediada por la CpPLC depende de radicales libres (Cuadro 1). Cuadro 1. Inhibidores farmacológicos de ROS empleados en este estudio. Inhibidor Mecanismo/Diana Concentración N-acetil-L-cisteína (NAC) Precursor del glutatión 1-6 mg/ml 4,5-dihidroxi-1,3-benceno disulfónico (Tirón) Radicales libres 1-4 mg/ml Pirocatecol Radicales libres 50-200 µM Luminol HClO derivado de MPO 50-200 µM 26 MitoTEMPO ROS mitocondrial 100-400 μM 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP) Desacoplador mitocondrial 200-800 μM Cloruro de difenilenoyodonio (DPI) NADPH oxidasa 25-100 µM Acetovanillona NADPH oxidasa 0.1-0.4 mg/ml Araquidonil trifluorometilcetona (AACOCF3) Metabolismo del ácido araquidónico 2.5-10 μM Ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ETYA) Metabolismo del ácido araquidónico 12.5-50 μM Alopurinol Xantina oxidasa (XO) 4-16 mM Bisindolilmaleimida I (GF109203X) Vía PKC 5-20 µM Safingol Vía PKC 7.5-30 µM Hispidina Vía PKC 0.5-2 µM U0126 Vía MEK/ERK 1.5-6 μg/ml Disulfiram Gasdermina D 0.56-70 µM Borato de 2-aminoetoxidifenilo (2-APB) Bombas de Ca2+ del RE 50-400 µM Estos fármacos fueron titulados previamente para determinar su rango de uso a concentraciones no citotóxicas. Se recubrió una placa de 96 pocillos con poli-L-lisina al 0.001% durante una hora. Se sembraron neutrófilos humanos recién aislados a una concentración de 7x104 por pocillo y se incubaron durante una hora con cada inhibidor a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2. Luego, las células se estimularon con la CpPLC recombinante (25.12 ng/ml) durante una hora como se describió anteriormente y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Las células se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.5% durante un minuto a temperatura ambiente. Después de 2 minutos de lavado con PBS, las células se tiñeron con Höechst (31.25 μg/ml) durante 10 minutos y se lavaron dos veces con PBS durante un minuto cada uno. En paralelo, en otra placa de 96 pocillos, los mismos tratamientos se expusieron a la sonda DCFDA sensible a ROS 30 minutos antes de terminar la hora de incubación y faltando 10 minutos se tiñeron con Höechst, tal como se mencionó previamente. Finalmente, la cuantificación de neutrófilos NETóticos y el porcentaje de inducción de ROS se realizó mediante el protocolo automático implementado en el programa CellProfiler. 27 2.15 Modelo murino de gangrena gaseosa Se analizaron bloques de parafina del músculo gastrocnemio de un modelo murino de gangrena gaseosa inducido por la cepa JIR323 de C. perfringens que corresponden a la fase aguda de la infección (1 hora, 3 horas, 5 horas, 6 horas y 24 horas) y sus respectivos controles. Las muestras fueron previamente obtenidas en otro proyecto de nuestro grupo de investigación (N° 741-B8-135). Para estos experimentos se siguieron los protocolos establecidos por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUA-098-17) de la Universidad de Costa Rica. 2.15.1 Análisis histológico Se hicieron cortes, en forma consecutiva, de 4 μm de espesor del tejido incluido en parafina y se colocaron en un portaobjeto. Luego las secciones de tejido se desparafinaron con xilol (3 recambios durante 2 minutos cada uno), se hidrataron con concentraciones decrecientes de etanol (3 recambios de etanol 100% y luego etanol 90%, etanol 70% y agua, durante 2 minutos cada uno) y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Se capturaron imágenes de la región afectada haciendo uso del microscopio automatizado LionheartTM. 2.15.2 Inmunodetección de NETs Para la inmunodetección de NETs en estas secciones de tejido, se generaron cortes con 4 μm de grosor y se colocaron en portaobjetos. Seguidamente, se desparafinaron las muestras como se detalló anteriormente y se sometieron a recuperación de antígeno con buffer citrato (pH 6) hasta alcanzar una temperatura de 90°C durante 20 minutos. Se lavaron 2 veces con PBS durante un minuto y se colocaron en Tritón 0.5% durante 5 minutos. Luego se aplicó un bloqueador de proteínas libre de suero durante 15 minutos seguido de un lavado con PBS durante un minuto. Los tejidos se incubaron durante la noche a 4°C con el anticuerpo primario anti-NE de neutrófilos producido en conejo, diluido 1:100 en TNB, y luego se lavaron 3 veces en PBS con Tween 20 0.5% durante 5 minutos cada uno. Posteriormente, las muestras se incubaron con el conjugado de cabra anti-IgG de conejo (H+L) (FITC) diluido 28 1:50 en buffer TNB durante una hora a temperatura ambiente en cámara húmeda. Después de 3 lavados en PBS con Tween 20 0.5% durante 5 minutos cada uno, se añadió medio de montaje con DAPI y se colocó el cubreobjeto. Se capturaron imágenes con el microscopio automatizado LionheartTM y se determinó la presencia de NETs con la colocalización de la fluorescencia verde y azul en el medio extracelular. 2.15.3 Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) El análisis TEM se llevó a cabo en muestras de tejido de un modelo murino de gangrena gaseosa que ya se habían preparado previamente por el grupo de investigación. Para esto los tejidos se fijaron con glutaraldehído al 2% y formaldehído al 2% en buffer fosfato 0.05 M y luego se post-fijaron en tetraóxido de osmio al 2% durante dos horas seguido de un lavado en buffer fosfato 0.1 M, pH 7.4. Los tejidos se infiltraron en resina Spurr y posteriormente se polimerizó a 60°C durante 48 horas. Con estas muestras, se realizaron cortes de tejido de 90 nm de grosor con una cuchilla de diamante (Diatome) en un ultramicrótomo marca Leica, modelo EM UC7. Los cortes obtenidos se recogieron en rejillas de enmallado de 150 mesh. Luego, las muestras se contratiñeron con acetato de uranilo al 4% en alcohol al 50% y con citrato de plomo al 0.3%. Se realizaron 3 lavados de 30 segundos cada uno en agua desionizada, se secó el exceso de agua y se analizaron las muestras con un microscopio electrónico de transmisión marca JEOL, modelo JEM 2011. 2.16 Análisis estadístico Primeramente se evaluó la normalidad de los datos con la prueba de Shapiro Wilks y la heterogeneidad de varianzas con la prueba de Levene. Luego el análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía para la comparación de múltiples medias e identificar la presencia de diferencias significativas en la inducción de la formación de NETs o en la producción de ROS entre los diferentes tratamientos. Posteriormente, se realizó una prueba post hoc de Tukey para determinar entre cuáles tratamientos se encontraban las diferencias significativas. Los resultados se expresan como media ± error estándar (SE) y los valores de p <0.01 y <0.05 se consideraron estadísticamente significativos. 29 CAPÍTULO 3 RESULTADOS 3.1 Pureza del cultivo de C. perfringens La formación de un halo alrededor de todas las colonias que crecieron en la placa de agar RCM con yema de huevo evidenció la actividad lecitinasa de la CpPLC. Además, la tinción de Gram corrobora la presencia exclusiva de bacterias Gram positivas en el cultivo. Estos resultados confirmaron la pureza del cultivo de la cepa JIR325 de C. perfringens (Figura 6). Figura 6. Pureza de C. perfringens cepa JIR325. (A) Actividad lecitinasa de la CpPLC y (B) Tinción de Gram. 3.2 Análisis proteómico de las proteínas secretadas por C. perfringens Las proteínas de los sobrenadantes de C. perfringens se separaron mediante un gel SDS- PAGE al 12% y se identificaron 17 bandas (Figura 7). Cada una de estas bandas se analizó mediante MS en tándem para la secuenciación de péptidos. 30 Figura 7. SDS-PAGE de proteínas secretadas por C. perfringens en la fase estacionaria. M: marcador de peso molecular Thermo Scientific, PageRulerTM Prestained Protein Ladder (#26616), 1: sobrenadante de 24 horas de C. perfringens (40 μg de proteína) y 2: medio de cultivo RCM ultrafiltrado. Se compararon 14,915 espectros, equivalentes a 4,159 secuencias peptídicas (datos accesibles en el repositorio público https://hdl.handle.net/10669/89483), con las secuencias de proteínas de C. perfringens en la base de datos UniProt. Este análisis permitió la identificación de 39 proteínas de la cepa parental 13, las cuales se detallan en el Cuadro 2. Mediante la base de datos CDD/SPARCLE del NCBI (Cuadro 2) (71), se localizaron los dominios conservados de las proteínas del secretoma. Además, se predijo su función biológica y la localización subcelular con Gene Ontology en UniProtKB (Cuadro 2) (72). Las proteínas secretadas por C. perfringens se clasificaron en citosólicas, transmembrana o extracelulares. https://hdl.handle.net/10669/89483 31 Cuadro 2. Análisis proteómico del secretoma de C. perfringens toxinotipo A. Masa promedio (Da) Adhesión (Uniprot) Péptidos (#) Cobertura (%) -10lgP Descripción Gen/Locus (Genbank) Dominios (Adhesión) 189 894 Q8XKW1 77 39 353.05 Proteína que contiene el dominio peptidasa M60 CPE1281 Dominio F5/8 tipo C (pfam00754, 2 copias); Peptidasa M60 (cl24257); DUF5011, (cl03620, 2 copias); Unión de carbohidratos (NPCBM; smart00776, 2 copias) 152 411 Q93M90 21 14 239.47 Probable adhesina de colágeno can (plasmídico codificado) Dominio similar a una prealbúmina (pfam17802, 2 copias); Dominio tioéster (pfam08341) 133 260 Q8XJ10 34 25 300.07 2',3'- nucleótido cíclico 2'- fosfodiesterasa cpdA; CPE1951 2',3'-nucleótido cíclico multifuncional 2'- fosfodiesterasa/3'-nucleotidasa/5'- nucleotidasa (cl35825) 125 936 P43153 37 60 376.18 Colagenasa colA colA; CPE0173 Familia de peptidasas M9 (pfam08453); colagenasa G (cl39822); Dominio PKD (pfam18911) 125 992 Q8XNP3 17 17 249.12 Endo-beta-N- acetil glucosaminida sa CPE0289 Endo-beta-N- acetilglucosaminidasa D (cl44115): dominio F5/8 tipo C (pfam00754); repetición de PKD (COG3291); Dominio de fibronectina tipo 3 (cd00063); dominio de anclaje de pared celular con motivo LPXTG (TIGR01167) 123 045 Q8XIL2 19 11 231.21 Proteína que contiene el dominio DUF1533 CPE2107 DUF1533 (cl06539) 122 462 Q8XL11 23 23 277.28 N-acetil glucosaminida sa CPE1231 Dominio SH3 bacteriano (pfam08239, 3 copias); YgiM (cl34551; 4 copias); Beta-N-acetil glucosaminidasa (cl27490) 96 690 Q8XNF8 30 34 277.50 Endo-beta- galactosidasa C CPE0375 F5/8 tipo C (2 copias; pfam00754);GH16_laminarinasa_l ike (cd08023) 92 203 Q8XMR4 15 18 203.05 Proteína que contiene el dominio LYZ2 CPE0624 Beta-N-acetil glucosaminidasa (cl27490); Proteína de superficie neumocócica PspC, forma de unión a colina (cl41462) 90 512 Q8XNK4 16 20 219.90 Proteína que contiene dominio NPCBM CPE0329 Módulo de unión a carbohidratos NPCBM (smart00776); Familia de glicosilhidrolasas 98M (cl07061) 81 511 Q8XIF9 6 7 151.86 Metalofosfatas a bifuncional/5'- nucleotidasa cpdC; CPE2162 2',3'-nucleótido cíclico multifuncional 2'- fosfodiesterasa/3'-nucleotidasa/5'- nucleotidasa (cl35825); Anclaje de pared celular con motivo LPXTG (TIGR01167) https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q8XNP3/entry https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q8XIL2/entry https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?ascbin=8&maxaln=10&seltype=2&uid=cl06539 32 Masa promedio (Da) Adhesión (Uniprot) Péptidos (#) Cobertura (%) -10lgP Descripción Gen/Locus (Genbank) Dominios (Adhesión) 77 314 Q8XMG4 43 43 343.87 Exo-alfa- sialidasa nanI; CPE0725 Sialidasa no viral (cd15482) 66 482 P26823 20 30 234.94 Chaperona DnaK dnaK; CPE0248 Acompañante molecular DnaK (PRK00290) 63 368 Q8XMR3 18 28 254.26 Carboxipeptid asa de zinc/proteína que contiene repeticiones de unión a la pared celular CPE0625 Superfamilia de unión a glucano COG5263 (cl34963); familia M14 de metalocarboxipeptidasas (cl11393); Proteína de superficie neumocócica PspC, forma de unión a colina (cl41462) 59 275 Q8XM44 26 29 328.14 Alfa- clostripaína cloSI; CPE0846 Cisteína proteasa Clostripaína (TIGR02806) 58 688 Q8XKP0 8 14 192.07 Dominio SH3/NlpC/pro teína de la familia P60 CPE1354 Dominio SH3 bacteriano (4 copias; pfam08239); hidrolasa asociada a la pared celular, familia NlpC (COG0791) 57 367 P26821 7 25 158.70 Chaperonina de 60 kDa groEL; CPE2289 Chaperonina GroEL (PRK00013) 55 830 P0C2E9 31 49 336.87 Citolisina activada por tiol (perfingolisina ) pfoA; CPE0163 Citolisina activada por tiol (pfam01289); Dominio de citolisina beta 2lucosa2 activada por tiol (pfam17440) 54 346 Q8XIN7 12 22 198.17 Proteína que contiene el dominio DUF3502 CPE2078 Dominio de unión periplásmico tipo 2 (cl21456); DUF3502 (pfam12010) 54 258 Q8XLL1 14 24 219.30 Proteína que contiene el dominio DUF3502 CPE1030 Dominio de unión periplásmico tipo 2 (cl21456); DUF3502 (pfam12010) 53 324 Q8XMR2 5 13 154.88 Proteína que contiene el dominio YkuD CPE0626 Proteína de superficie neumocócica PspC, forma de unión a colina (cl41462); L,D- peptidoglicano transpeptidasa YkuD (cl43946) 51 940 Q8XLN5 10 18 181.49 Aminopeptida sa de la familia M18 CPE1006 Aminopeptidasa de zinc 1 (PRK02256) 49 771 Q8XI54 9 16 188.89 Glucosa-6- fosfato isomerasa pgi; CPE2267 Glucosa-6-fosfato isomerasa (PRK14097) 49 471 Q8XNH1 5 12 170.99 Piruvato quinasa pykA; CPE2149 Piruvato quinasa (cl35470) 47 721 Q8XHF5 10 19 154.57 Probable X- pro aminopeptidas a CPE2530 Aminopeptidasa P (smart01011); Prolidasa (cd01087) https://www.uniprot.org/uniprotkb/P0C2E9/entry https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q8XIN7/entry 33 Masa promedio (Da) Adhesión (Uniprot) Péptidos (#) Cobertura (%) -10lgP Descripción Gen/Locus (Genbank) Dominios (Adhesión) 47 217 P0C2E1 7 15 166.89 Arginina deiminasa arcA; CPE0168 Arginina deiminasa (PRK01388) 46 949 Q8XKU4 9 17 153.84 Enolasa eno; CPE1249 Enolasa (PRK00077) 46 186 Q8XJF2 9 17 154.88 Pirimidina- nucleósido fosforilasa deoA; CPE1807 Pirimidina-nucleósido fosforilasa (cl42907) 45 530 P0C216 30 23 296.23 Fosfolipasa C (toxina alfa) CPE0036 Fosfolipasa C dependiente de zinc (smart00770); PLATO (cd00113) 43 980 Q8XHY1 18 33 242.22 Probable transportador ABC de maltosa CPE2343 Componente de unión periplásmico de los sistemas de transporte ABC específicos de maltosa (cd13586) 42 555 Q8XNZ9 7 16 159.70 Cistationina beta-sintasa metB; CPE0176 Aspartato aminotransferasa I (cl18945) 38 741 Q8XNA0 10 27 175.08 Probable transportador ABC de absorción de iones CPE0438 Dominio de unión al sustrato de la proteína de unión al hierro férrico (cd13542) 37 153 P0C2E4 18 35 163.83 Ornitina carbamoil- transferasa arcB; CPE0169 Ornitina carbamoiltransferasa (PRK04284) 38 422 Q8XHK0 6 17 157.38 Enzima de plegamiento PrsA prsA; CPE2483 Peptidilprolil isomerasa (PRK00059) 36 700 Q8XKB3 6 16 150.76 Proteína de unión a sustrato del transportador ABC CPE1487 Transportador tipo ABC de nitrato/sulfonato/ bicarbonato(cl43248) 36 632 Q8XIW4 9 24 205.19 Proteína que contiene dominio NAGPA CPE1999 Fosfodiéster glicosidasa (NAGPA; cl42026) 36 629 Q8XK52 6 22 171.18 Probable endo- 1,4-beta- xilanasa CPE1551 Homología NodB de polisacárido desacetilasa PgdA de Streptococcus.mutans (cd10944) 34 503 Q8XP50 9 22 184.08 Proteína que contiene dominio N- acetilmuramoil -L-alanina amidasa CPE0115 N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa (pfam01520) 29 991 Q8XN18 20 6 175.46 SGNH_proteín a que contiene dominio hidrolasa CPE0520 SGNH_hidrolasa (cd00229) 34 Entre las proteínas identificadas se encuentran dos exotoxinas principales: la CpPLC (número de acceso de Uniprot P0C216.1) cruci