i UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO OPTIMIZACIÓN DE LA FERMENTACIÓN DE Trichoderma asperellum PARA LA PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PEPTAIBOLES CON POTENCIAL EFECTO ANTIMICROBIANO CONTRA PATÓGENOS ALIMENTARIOS Tesis sometido a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología ALISSON MELISSA BASTOS SALAS Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2022 ii Dedicatoria A mis padres, a mi hermana, a mi novio, y a mis tutores por todo su apoyo para culminar esta etapa, Alisson iii Agradecimientos A mis padres, a mi hermana y a mi novio Albin por su apoyo incondicional para cumplir mis metas y quienes siempre han estado a mi lado. A Aníbal Mora por su confianza, su apoyo y su guía como tutor de este proyecto, así como todas sus enseñanzas y experiencias que vivimos en este proceso. A Mauricio Redondo por su paciencia y dedicación para guiarme en el laboratorio, y por su apoyo y guía en la elaboración de este proyecto, así como su participación como asesor de tesis. A Julián Fernández por su orientación en el área de espectrometría de masas y su papel como asesor de esta tesis. A mis profesores y a la UCR a quienes debo parte de mi formación académica. A los colaboradores del Centro Nacional de Innovaciones Tecnológicas, especialmente a Jessica Montero, Pamela Alfaro, Camila Charpentier y Rodrigo Muñoz, por su apoyo en la realización de este proyecto. Al programa de becas CENAT quienes me dieron la oportunidad de elaborar este proyecto y el financiamiento requerido. Al Laboratorio de Investigación y Entrenamiento en Microbiología de Alimentos del Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales por proporcionar las cepas bacterianas utilizadas en este proyecto. iv “Esta Tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología” ____________________________________________ Ph.D. Carlos Chacón Díaz Representante de la Decana Sistema de Estudios de Posgrado ____________________________________________ Ph.D. José Aníbal Mora Villalobos Director de Tesis ____________________________________________ Ph.D. Mauricio Redondo Solano Asesor ____________________________________________ Ph.D. Julián Fernández Ulate Asesor ____________________________________________ M.Sc. Daniela Jaikel Víquez Representante del Director del Programa de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología ___________________________________________ Alisson Melissa Bastos Salas Sustentante v Tabla de contenidos Hoja de aprobación iv Resumen vii Abstract viii Lista de cuadros ix Lista de abreviaturas xi Marco teórico 1 1. Problemática en el uso de antimicrobianos 1 2. Péptidos antimicrobianos 2 2.1. Peptaibióticos 3 2.1.1. Peptaiboles 3 2.1.1.1. Características y estructura 3 2.1.1.2. Clasificación 5 2.1.1.2.1. Tricotoxinas 5 2.1.1.3. Biosíntesis 6 2.1.1.4. Regulación genética 8 2.1.1.5. Mecanismo de acción 9 2.1.1.6. Efecto antimicrobiano 12 2.1.1.6.1. Membranas celulares bacterianas 13 2.1.1.6.2. Mecanismos de resistencia ante péptidos antimicrobianos 14 2.1.1.6.3. Pruebas antimicrobianas 16 2.1.1.6.3.1. Bacterias subrogadas 16 3. Producción de peptaiboles 17 3.1. Organismo productor: Trichoderma asperellum 18 4. Modelado para optimización 19 5. Análisis de peptaiboles por espectrometría de masas 20 5.1. Aminoácidos en los peptaiboles 21 Justificación 24 Hipótesis 26 Objetivo general 26 1. Objetivos específicos 26 Materiales y métodos 27 1. Pruebas de optimización en matraz 27 vi 1.1. Formulación del inóculo 27 1.2. Preparación de aminoácidos 27 1.3. Preparación de elicitores 28 1.4. Fermentación 29 1.5. Procesamiento y análisis de muestras 30 1.5.1. Peso seco 31 1.5.2. Cromatografía líquida de alta resolución 31 1.5.3. Espectrometría de masas 32 1.6. Análisis estadístico 34 2. Modelado del proceso fermentativo 34 2.1. Planteamiento del modelo 34 2.2. Fermentación de modelado 35 2.3. Ejecución del modelo 35 2.4. Validación del modelo 36 3. Secuenciación de péptidos 36 4. Inhibición de crecimiento bacteriano 37 4.1. Análisis de datos 38 Resultados y discusión 39 1. Optimización de la producción de peptaiboles de T. asperellum 39 1.1. La fuente de carbono influye en la generación de peptaiboles 39 1.2. Los elicitores fúngicos inducen la producción de peptaiboles 42 1.3. La adición de aminoácidos mejora la producción de peptaiboles 44 2. Modelo central compuesto para la producción de peptaiboles de T. asperellum 47 3. Peptaiboles producidos por T. asperellum 51 4. Actividad antimicrobiana de los peptaiboles producidos por T. asperellum 55 Conclusiones 61 Recomendaciones 62 Referencias 63 Anexo 1: Artículo publicado con los resultados del proyecto 74 vii Resumen Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) son causadas por microorganismos y sustancias químicas en diversas matrices alimenticias. Estas enfermedades son una problemática a nivel mundial, ya que afectan la salud de la población y el desarrollo socioeconómico. En la búsqueda de nuevas estrategias para la prevención de las ETAs, Trichoderma asperellum surge como productor de un grupo de péptidos bioactivos llamados peptaiboles. Estos poseen actividad antimicrobiana contra hongos y bacterias de diversos géneros. No obstante, una de las limitaciones para su producción es el bajo rendimiento y el escalamiento del proceso fermentativo. Por esta razón, se realizaron pruebas en matraz para determinar el efecto de la adición de aminoácidos, elicitores fúngicos y azúcares sobre la producción de peptaiboles. Luego, se optimizaron las concentraciones mediante un modelo central compuesto. Finalmente, se caracterizó la secuencia de los peptaiboles obtenidos por medio de espectrometría de masas y su actividad antimicrobiana. Se determinó que la adición de sacarosa, Aib y restos celulares de Fusarium oxysporum generaron más peptaiboles, y se obtuvo la concentración óptima de los últimos. Se evidenció la producción de las tricotoxinas T5D2, 1690, 1703A, A-40 y 1717A. Finalmente, se determinó la actividad antimicrobiana ante las bacterias Escherichia coli ATCC 25922 y Lactobacillus paracasei G714. Los resultados obtenidos demuestran que este proceso se puede optimizar y que estos metabolitos bioactivos son una potencial herramienta para el control de microorganismos bacterianos de importancia para la industria alimentaria. viii Abstract Foodborne Diseases are caused by microorganisms and chemical substances in various food matrices. These diseases are a problem worldwide, as they affect the health of the population and socioeconomic development. In the search for new strategies for the prevention of Foodborne Diseases, Trichoderma asperellum emerges as a producer of a group of bioactive peptides called peptaibols. These possess antimicrobial activity against fungi and bacteria of various genera. However, one of the limitations for its production is the low yield and the scaling of the fermentation process. For this reason, flask tests were performed to determine the effect of adding amino acids, fungal elicitors, and sugars on peptaibol production. Concentrations were then optimized using a central composite model. Finally, the sequence of the peptaibols obtained was characterized by mass spectrometry and their antimicrobial activity was obtained. The addition of sucrose, Aib and Fusarium oxysporum cell debris generated more peptaibols, and the optimal concentration of the latter was obtained. The production of trichotoxins T5D2, 1690, 1703A, A-40 and 1717A was evidenced. Finally, the antimicrobial activity against Escherichia coli ATCC 25922 and Lactobacillus paracasei G714 bacteria was determined. The results obtained show that this process can be optimized and that these bioactive metabolites are a potential tool for the control of bacterial microorganisms important to the food industry. ix Lista de cuadros Cuadro 1. Abundancia absoluta y relativa de los aminoácidos más comunes en la secuencia de los peptaiboles producidos por hongos del género Trichoderma. Cuadro 2. Datos para la formulación de las soluciones madre de los aminoácidos. Cuadro 3. Gradiente utilizado en HPLC para el análisis de las muestras. Cuadro 4. Valores utilizados en el diseño central compuesto del experimento. Cuadro 5. Valores observados y predichos para la producción de peptaiboles para cada experimento del modelo central compuesto que evalúa las concentraciones de Aib y Fusarium. Cuadro 6. Coeficientes de regresión y probabilidades asociadas a los factores en el modelo para la predicción de la producción de peptaiboles de T. asperellum en fermentación líquida. Cuadro 7. Valores observados y predichos para la producción de peptaiboles para cada experimento para la validación del modelo central compuesto que evalúa las concentraciones de Aib y Fusarium. Cuadro 8. Secuencias de aminoácidos de los peptaiboles producidos por T. asperellum. N: modificación N-terminal, Ac: acetilación, Lxx: leucina/isoleucina, Vxx: valina/isovalina. Cuadro 9. Datos de densidad óptica máxima y tasa de crecimiento máxima calculados para cada bacteria. x Lista de figuras Figura 1. Estructura del peptaibol RK-026A de Trichoderma sp. que destaca el extremo N-terminal acetilado (azul), el extremo C-terminal aminoalcohol (naranja) y el aminoácido Aib (verde). Figura 2. Bosquejo de la formación de poros por péptidos antimicrobianos según el modelo en forma de barril. Figura 3. Esquema de los ensayos para la fermentación de optimización del medio de cultivo con la adición de suplementos. Figura 4. Producción de peptaiboles (eje izquierdo) y de biomasa (eje derecho) de T. asperellum según la fuente de carbono adicionada al medio de cultivo. Figura 5. Producción de peptaiboles (eje izquierdo) y consumo de sacarosa (eje derecho) de T. asperellum según el elicitor fúngico adicionado al medio de cultivo. Figura 6. Producción de peptaiboles de T. asperellum según el aminoácido adicionado al medio de cultivo. Figura 7. Gráfico de contorno del modelo central compuesto generado para la optimización de la producción de peptaiboles en la fermentación de T. asperellum. Figura 8. Fragmentación del ion 1718 m/z correspondiente a la tricotoxina A-50I. Figura 9. Fragmentación del ion 1704 m/z correspondiente a la tricotoxina 1704E. Figura 10. Curvas de crecimiento de las bacterias (A) E. coli, (B) L. inocua 3.1, (C) L. inocua 4.1, (D) P. fluorescens y (E) L. paracasei G714, bajo condiciones control y tratamiento con el fermento crudo. xi Lista de abreviaturas Af: factor de certeza Aib: AMP: ácido 2-aminoisobutírico péptidos antimicrobianos Aps: sensores de péptidos antimicrobianos ATS: agar tripticasa soya Bf: factor bias CCD: diseño central compuesto CENIBiot: Centro Nacional de Innovaciones Biotecnológicas CID disociación inducida por colisión CIET: Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales CTS: caldo tripticasa soya ESI: ionización por electrospray ETA: enfermedad transmitida por alimentos HPLC: cromatografía líquida de alta resolución INTA: Instituto Nacional de Innovación y Transferencia en Tecnología Agropecuaria LIMA: MRS: Laboratorio de Investigación y Entrenamiento en Microbiología de Alimentos Man, Rogosa y Sharpe MS: espectrometría de masas MS/MS: espectrometría de masas en tándem NRPS: sintetasas de péptidos no ribosomales OD600: absorbancia a 600 nm PDA: agar papa dextrosa PDB: caldo papa dextrosa R2: coeficiente de determinación Marco teórico 1. Problemática en el uso de antimicrobianos Los antimicrobianos son sustancias que tienen la propiedad de afectar el crecimiento bacteriano. Uno de los grupos antimicrobianos más importantes son los antibióticos, ya que son de amplio uso en la medicina y otros campos. Sin embargo, el uso incorrecto y desmedido de los antibióticos, tanto en la medicina como en la industria, ha incidido en la aparición de bacterias resistentes a estos fármacos (WHO, 2018). La resistencia a antibióticos se considera uno de los mayores problemas de salud a nivel mundial, con alta mortalidad y costos económicos significativos (Barnes et al., 2017; Voulgaris et al., 2019). Estos fármacos son indispensables en el tratamiento de infecciones pero algunas enfermedades infecciosas, como la neumonía y la tuberculosis, se han tornado difíciles de tratar debido a la pérdida de eficacia de los antibióticos (Su et al., 2012a; WHO, 2018). A pesar de su importancia en la medicina, la última clase de antibióticos descubierta fue la daptomicina en 1986 y se aprobó su uso por la FDA hasta el año 2003 (Durand et al., 2019). Durante los últimos 30 años, el desarrollo de nuevos antibióticos comerciales se mantuvo estancado (Seal et al., 2018), debido a la falta de inversión económica y los complejos requisitos que deben cumplir para su comercialización (Lakshmaiah Narayana & Chen, 2015; Tacconelli et al., 2018). Por esta razón, desde el año 2010 solamente se han aprobado 17 antibióticos sistémicos y muy pocos se encuentran en fase clínica de desarrollo (Chahine et al., 2021). Además, estas nuevas moléculas se basan en mejoras o variaciones a otras ya existentes (Durand et al., 2019). La aparición de brotes causados por cepas resistentes a los antibióticos clásicos en distintas partes del mundo ha presionado fuertemente a la comunidad científica en la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos (Mukherjee et al., 2011). En el año 2017, la OMS publicó una lista prioritaria de bacterias resistentes contra las cuáles se debe desarrollar nuevos antibióticos, lo cual reactivó el interés comercial (Tacconelli et al., 2018). El último antibiótico aprobado por la FDA en marzo del 2021 fue Kimyrsa (oritavancina), un lipoglicopéptido recetado para el tratamiento de infecciones cutáneas causadas por Staphyloccocus aureus meticilina resistente y otros microorganismos (Nambiar S, 2021). 2. Péptidos antimicrobianos Ciertos metabolitos secundarios de organismos bacterianos, fúngicos y vegetales pueden actuar como compuestos bioactivos para combatir infecciones, debido a que inhiben naturalmente el crecimiento de algunos microorganismos por competencia (Seal et al., 2018). Los péptidos antimicrobianos (AMP, por sus siglas en inglés) son un ejemplo de metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana. Este grupo de péptidos pequeños (7-50 aminoácidos) se caracteriza por formar parte de la respuesta innata de protección de los seres vivos (Lakshmaiah Narayana & Chen, 2015; Su et al., 2012), y sus mecanismos de acción usualmente se relacionan con la generación de daños en la membrana celular y en blancos intracelulares (Ageitos et al., 2017). Por esta razón, los AMP podrían utilizarse como sustitutos o complementos de los antibióticos en diversas áreas como la industria porcina y aviar, entre otras. Por ejemplo, se ha utilizado lactoferrina, crecopina AD y sublancina, para el control de microorganismos pertenecientes a los géneros Escherichia, Lactobacillus y Clostridium, respectivamente, en la microbiota intestinal de animales de granja, a nivel de investigación (Wang et al., 2016). A pesar de su efectividad como agentes antimicrobianos, los AMP requieren una concentración mínima inhibitoria para ser efectivos contra los microorganismos (Ageitos et al., 2017), y en la actualidad los rendimientos de producción son bajos por lo que los costos de obtención se encarecen. Las técnicas más comunes para la producción de AMP, para fines terapéuticos, corresponden a la síntesis de péptidos en fase sólida, la síntesis por métodos enzimáticos y la obtención por medio de sistemas recombinantes. Actualmente, otros mecanismos de producción se están investigando, como la optimización de bioprocesos con microorganismos que los producen naturalmente seguido de métodos fisicoquímicos de purificación (Mahlapuu et al., 2016; Rai et al., 2016). Por esta razón, la bioprospección de microorganismos con actividad biológica ha ido en aumento en la búsqueda de nuevos AMP como los peptaibióticos (Su et al., 2012). 2.1. Peptaibióticos Los peptaibióticos son un amplio grupo de péptidos lineares o cíclicos con propiedades antibióticas que poseen un peso molecular entre 500-2200 Da (Degenkolb et al., 2006). Su biosíntesis ocurre de forma no ribosomal y son comunes en gran variedad de ascomicetos (Degenkolb, Karimi Aghcheh, et al., 2012). Estos péptidos están compuestos por altos contenidos de ácido 2-aminoisobutírico (Aib) y otros aminoácidos no proteinogénicos y lipoaminoácidos. Además, estos péptidos poseen un extremo N- terminal acetilado y un extremo C-terminal sustituido. Estas propiedades estructurales les otorgan características físico químicas y actividad biológica únicas (Degenkolb, Gräfenhan, et al., 2006). Los más de 1000 peptaibióticos descubiertos se han clasificado como peptaiboles, lipopeptaiboles, lipoaminopéptidos y peptaibióticos cíclicos (Chutrakul et al., 2008; Zeilinger et al., 2016). El potencial biológico de los peptaibióticos ha sido estudiado como fuente alternativa a los antibióticos y otros agentes terapéuticos (van Bohemen et al., 2016b). Su actividad biológica se basa en la formación de poros en la membrana bilipídica de otros organismos, por lo que pueden tener actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral, insecticida y antiparasítica. También, estos péptidos han mostrado otros mecanismos de acción relacionados con la inhibición de ATPasas mitocondriales, alteración del proceso de fosforilación oxidativa, inhibición de la agregación plaquetaria, inducción de morfogénesis en hongos y generación de efectos neurolépticos, entre otros (Degenkolb, Gräfenhan, et al., 2006). 2.1.1. Peptaiboles 2.1.1.1. Características y estructura Los peptaiboles son péptidos anfipáticos cuya estructura puede ser lineal o cíclica (poco común), y representan la mayor parte de los metabolitos secundarios producidos por hongos del género Trichoderma. Al ser metabolitos secundarios, no se consideran indispensables para su crecimiento primario. Estos péptidos poseen una longitud entre 5 a 21 aminoácidos (500-2200 Da). Comúnmente, su secuencia incorpora aminoácidos no proteinogénicos dialquilados o cuaternarios, como la isovalina, el iminoácido hidroxiprolina y el Aib. Este último corresponde al residuo más abundante. El residuo en el extremo N-terminal se encuentra acetilado, en pocos casos acilado, y el residuo en el C-terminal corresponde a un aminoalcohol como fenilalaninol, valinol, leucinol, isoleucinol, prolinol o triptofanol (Daniel & Rodrigues Filho, 2007; Degenkolb, Fognielsen, et al., 2015; Marik et al., 2017; Rawa et al., 2021; Ren et al., 2009), como se muestra en la Figura 1. Algunas de estas moléculas tienen modificaciones, como cadenas laterales, en los aminoácidos que conforman su secuencia (Chutrakul et al., 2008), que incluyen N-metilaciones, acilaciones, reducciones o epimerizaciones (Mukherjee et al., 2011). Figura 1. Estructura del peptaibol RK-026A de Trichoderma sp. que destaca el extremo N-terminal acetilado (azul), el extremo C-terminal aminoalcohol (naranja) y el aminoácido Aib (verde) (Rawa et al., 2021). Los peptaiboles se encuentran como mezclas de isoformas de manera natural. Más de 850 secuencias se han aislado de más de veinte géneros distintos de ascomicetos (Ren et al., 2009b; Wiest et al., 2002), entre ellos Trichoderma, Emericellopsis, Stibella, Gliocladium, Paecilomyces y Acremonium (Daniel & Rodrigues Filho, 2007a; Ruiz et al., 2007). Estos péptidos son de gran importancia a nivel ecológico y comercial, debido a que poseen actividad antimicrobiana, antiviral, antifúngica, antiparasitaria y anticancerígena. Además, tienen la capacidad de inducir resistencia sistémica en plantas que son atacadas por microorganismos fitopatógenos (Khan et al., 2020; Li et al., 2014; M. Shi et al., 2012; Wu et al., 2017). Algunos peptaiboles inhiben la replicación de virus envueltos como el virus de la influenza A y el virus de la inmunodeficiencia humana (Mukherjee et al., 2011). Incluso, estos péptidos se han encontrado en algunas formulaciones comerciales que contienen Trichoderma o derivados (Degenkolb, Fognielsen, et al., 2015). Por su parte, en modelos in vivo se ha determinado que los peptaiboles trilonginas A y B, como aditivo alimenticio, incrementan la lactancia y reducen la metanogénesis en el rumen de las cabras por sus propiedades antiprotozoarias, antihelmínticas y antiamebianas (Mohamed- Benkada et al., 2016). 2.1.1.2. Clasificación Los peptaiboles se pueden agrupar según su longitud y por subfamilias. Según la longitud de su cadena de residuos de aminoácidos, estos péptidos se clasifican en cadena larga (17- 21 residuos), cadena media (11-16 residuos) y cadena corta (5-10 residuos) (Ren et al., 2009b). Otro subgrupo aparte, compuesto por los lipopeptaiboles, corresponde a un tipo de peptaiboles cuyo extremo N-terminal se encuentra acilado por un ácido octanoico, decanoico o (Z)-dec-4-enoico (Degenkolb, Gräfenhan, et al., 2006). Por su parte, la clasificación por subfamilias divide a los peptaiboles según su secuencia y la presencia de aminoácidos especiales en 9 grupos (SF1 a SF9). Esta agrupación categoriza todos los peptaiboles producidos por hongos del género Trichoderma en las subfamilias SF1, SF4, SF5 y SF9 (Mukherjee et al., 2011; Tamandegani et al., 2016). La subfamilia SF1, donde se encuentran los peptaiboles de interés para este trabajo, incluye tres subtipos según su residuo en la posición 2 y el amino alcohol en el C-terminal: - Subtipo 1: poseen un residuo de Pro en su posición 2 y terminan en Leuol, Ileol, Valol o Ivalol. Ejemplos: tricotoxinas, hipelcinas y estilboflavinas. - Subtipo 2: contienen un residuo de Pro en su posición 2 pero terminan en Pheol. Ejemplos: alameticinas, polisporinas y atroviridinas. - Subtipo 3: presentan un residuo de Ala en su posición 2 y terminación en Pheol. Ejemplos: longibracinas (Mohamed-Benkada et al., 2016). 2.1.1.2.1. Tricotoxinas Las tricotoxinas son un grupo de peptaiboles que fue aislado por primera vez de T. viride NRRL5242 en 1984. En la actualidad, se ha determinado que este grupo es producido por diversas especies de Trichoderma como T. asperellum y T. harzianum. Este tipo de peptaiboles pertenecen a la subfamilia SF1, subtipo 1 y poseen una extensión de 18 residuos de aminoácidos. Estos péptidos se caracterizan por tener particularmente un residuo de glicina en la posición 2 seguido por un residuo de Aib en la posición 3, y por terminar en el amino alcohol valinol en su extremo C-terminal. Usualmente, contienen uno o ningún residuo de isovalina. Además, las tricotoxinas pueden tener una forma ácida o neutra según el residuo de ácido glutámico o glutamina, respectivamente, en la posición 17 de su secuencia (Chutrakul et al., 2008; Suwan et al., 2000; Tamandegani et al., 2016, 2020). De todos los peptaiboles, las tricotoxinas poseen la mayor microheterogeneidad por lo que existen muchas isoformas (Chutrakul et al., 2008). Las tricotoxinas han demostrado la inducción de poros dependientes de voltaje en membranas bilipídicas (Tamandegani et al., 2016). Las isoformas neutras tienden a concentrarse y formar canales más fácilmente por su hidrofobicidad, mientras que las ácidas son menos efectivas en la formación de poros. No obstante, los poros formados por tricotoxinas ácidas son más estables y duraderos. La carga negativa en el extremo C- terminal estabiliza los poros de mayor tamaño debido a que forma puentes de hidrógeno con las hélices vecinas (Chutrakul et al., 2008). 2.1.1.3. Biosíntesis Los peptaiboles son péptidos producidos por una vía no ribosomal a través de sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS, por sus siglas en inglés). Estas enormes enzimas multifuncionales y multimodulares son capaces de producir péptidos fuera de las estructuras ribosomales, es decir, catalizan la unión de los aminoácidos a la cadena peptídica dentro de sus módulos por un mecanismo vía “thiotemplate’’, sin recurrir al proceso de traducción de los ribosomas (Chutrakul & Peberdy, 2005; Marik et al., 2017; J. C. Shi et al., 2020; Zhou et al., 2019). Las NRPS están compuestas por una cantidad específica de módulos semiautónomos capaces de cumplir las funciones de reconocimiento, activación y modificación de los aminoácidos (Marik et al., 2017). La cantidad de módulos en la enzima refleja la extensión de los péptidos que produce. Así, por ejemplo, las tricovirinas de 18 residuos y las tricorzianinas de 19 residuos son producidas por NRPS de 18 y 19 módulos, respectivamente (Degenkolb, Karimi Aghcheh, et al., 2012). Los genomas de Trichoderma spp. pueden contener los genes que codifican para NRPS de 7, 14, 18 o 20 módulos (Pachauri et al., 2019). Cada uno de los módulos posee un dominio de condensación (C), adenilación (A) y tiolación (T) (Marik et al., 2017) que son conservados. Los dominios C y T están relacionados con funciones de unión al ATP y de tioesterificación y transferencia de aminoácidos (Wiest et al., 2002). Los aminoácidos son activados como acil adenilatos por una molécula de ATP en el dominio C y enlazados covalentemente como un carboxitioéster en el dominio T. La elongación del péptido requiere de un cofactor 4- fosfopanteteína (Daniel & Rodrigues Filho, 2007a). El dominio A de cada módulo es el encargado de definir cuál aminoácido será incorporado mediante una secuencia de residuos específica para cada residuo (Chutrakul & Peberdy, 2005). Algunos investigadores han identificado estas secuencias específicas del dominio A para predecir los peptaiboles que va a producir una NRPS (Degenkolb, Karimi Aghcheh, et al., 2012). No obstante, la especificidad de los dominios A es limitada por lo que algunos de los módulos pueden aceptar otros aminoácidos con estructuras similares. Este fenómeno es conocido como microheterogeneidad y permite la biosíntesis de peptaiboles estructuralmente diversos, o varias isoformas, a partir de una sola NRPS (Degenkolb, Fognielsen, et al., 2015; Mukherjee et al., 2012; Zhou et al., 2019). Por ejemplo, se ha determinado que las secuencias de 21 peptaiboles de T. brevicompactum siguen un mismo patrón con variaciones de unos cuantos residuos de aminoácidos entre ellas (Ruiz et al., 2007). La falta de mecanismos de reparación en este proceso también favorece la variabilidad de isoformas (Marik et al., 2019). Estas isoformas en los peptaiboles ocurren de manera natural y podría favorecerse una isoforma sobre otra según la disponibilidad de aminoácidos (Wiest et al., 2002). Para organismos del género Trichoderma, se ha identificado que estas enzimas están codificadas en el gen pes (Chutrakul & Peberdy, 2005). En este género, se han identificado varias sintetasas no ribosomales relacionadas con la producción de peptaiboles. En el hongo T. virens, la sintasa TEX1 genera peptaiboles de 18 residuos de aminoácidos, mientras que una sintasa de 14 módulos produce peptaiboles de 11 y 14 residuos de aminoácidos. En el hongo T. reseei se ha identificado la enzima NRPS2 y en el hongo T. atroviride la enzima Tri como NRPS productoras de peptaiboles (Degenkolb, Karimi Aghcheh, et al., 2012; Khan et al., 2020). Los peptaiboles, epipolitiodioxopiperazinas y sideróforos son producidos por NRPS en hongos del género Trichoderma (Pachauri et al., 2019). 2.1.1.4. Regulación genética La regulación genética de la producción de peptaiboles en hongos del género Trichoderma no está clara. Algunos genes y reguladores transcripcionales se han identificado que afectan directamente la expresión de los genes que codifican para NRPS en diversas especies de este género. En T. atroviride, la deleción del gen tga1 que codifica para una adenilil ciclasa resultó en la disminución de la pirona 6-pentil-2H-piran-2-ona y en el incremento de la producción de peptaiboles (Khan et al., 2020). La deleción del gen tmk1, que codifica para una proteína quinasa de la vía dependiente de MAPK, mejoró la producción de peptaiboles y la actividad antifúngica. Caso contrario, la disrupción del gen tgf-1, que codifica para una histona acetiltransferasa, y del gen tga3 alteró de forma negativa la producción de estos péptidos. Este último gen es regulado por BLR1 y BLR2 que corresponden a reguladores transcripcionales. En cepas mutantes DTlstp1, los peptaiboles TKA y TKB se produjeron dos días antes que en la cepa original y en mayores concentraciones. El regulador transcripcional TISTP1 regula negativamente la expresión de los genes tlx1 y tlx2 que codifican para NRPS productoras de peptaiboles. Además, el regulador TISTP1 está relacionado con la expresión de transportadores de hexosas lo que sugiere una relación entre la disminución de la captura de glucosa y el aumento en la producción de peptaiboles (Pachauri et al., 2019; Zhou et al., 2019b). En T. virens, la biosíntesis de peptaiboles es regulada por los reguladores transcripcionales BLR1 y BLR2 que afectan la expresión del gen tex1 que codifica para las sintasas no ribosomales (Khan et al., 2020). La disrupción del gen tex1 elimina la síntesis de peptaiboles sin afectar la producción de otros metabolitos secundarios, lo cual confirma que una sola NRPS se encarga de la síntesis de todos los peptaiboles de este microorganismo. La secuenciación de las regiones flanqueantes a este gen podría revelar genes relacionados con la síntesis y transporte de los peptaiboles, ya que los genes de metabolitos secundarios usualmente se encuentran agrupados (Wiest et al., 2002). En T. longibrachiatum, la deleción del gen Tllae1, que codifica para el regulador global TILAE1, resultó en la afectación de la transcripción de los genes tlx1 y tlx2 que codifican para NRPS, por lo que se observó una disminución de la producción de peptaiboles (J. C. Shi et al., 2020). En T. asperellum, el nivel de ARNm del gen tex1 aumentó al interactuar con Rhizoctonia solani en pruebas in vitro, según análisis realizados mediante PCR de tiempo real (Tamandegani et al., 2020). El gen task1 juega un papel importante en la transducción de señal de las vías regulatorias relacionadas con el micoparasitismo y tiene un comportamiento hospedero dependiente que regula las respuestas de defensa según el fitopatógeno contra el cual compita el hongo (Yang, 2017). 2.1.1.5. Mecanismo de acción La actividad biológica de los peptaiboles se adjudica a su estructura anfipática y helicoidal que le brindan la capacidad de agruparse para formar poros o canales iónicos dependientes de voltaje en la membrana bilipídica. Los peptaiboles interactúan con la membrana celular y ocasionan su disrupción, sin embargo, el mecanismo utilizado aun no se comprende en la mayoría de estos péptidos (Touati et al., 2018). La alameticina es el peptaibol más estudiado y es producido por T. viride (Ageitos et al., 2017; Degenkolb et al., 2015; Dotson et al., 2018). Su mecanismo de acción se basa en adoptar una orientación transmembrana cuando se han agregado suficientes péptidos. Esta interacción péptido- membrana es estabilizada por residuos hidrofóbicos como leucina e isoleucina. Los peptaiboles se configuran en una superestructura cilíndrica hexamérica, con forma de barril (Figura 2) de manera que sus regiones hidrofílicas, conformadas por residuos de glutamina o ácido glutámico, se orientan hacia el interior y forman canales. Estos poros transmembrana actúan como canales iónicos que conducen la corriente de iones hacia dentro y, junto a los cambios superficiales que produce en la estructura, permiten el intercambio libre de material desde y hacia el espacio citoplasmático (Degenkolb et al., 2006; Fuente-Núñez et al., 2013; Peltola et al., 2004; Perrin & Pastor, 2016; van Bohemen et al., 2016a; Vestergaard et al., 2017). La entrada de moléculas nocivas para la célula a causa de la permeabilización de la membrana puede ocasionar daños importantes, sin embargo la fuga del material citoplasmático hacia fuera de la célula ocasiona la muerte celular. El citoplasma genera la presión de turgencia al presionarse contra la membrana celular, de manera que tiene un papel importante en el mantenimiento de la estructura de la célula. Al perder parte del citoplasma, se reduce la presión de turgencia, la estructura celular se altera y las propiedades mecánicas de la célula se pierden, lo cual ocasiona que muera (Su et al., 2012a). Los peptaiboles de cadena larga, al tener una estructura muy similar a la alameticina, presentan este mecanismo de acción sobre la membrana celular, basado en la formación de canales iónicos dependientes y no dependientes de voltaje. El efecto sobre la membrana celular puede variar entre microorganismos (Ageitos et al., 2017; Degenkolb et al., 2006; Leitgeb et al., 2007; Perrin & Pastor, 2016; Salnikov et al., 2019). Los peptaiboles de cadena corta no son lo suficientemente largos para insertarse en la membrana por lo que forman agregados que la desestabilizan (Whitmore & Wallace, 2004b). Figura 2. Bosquejo de la formación de poros por péptidos antimicrobianos según el modelo en forma de barril. Los péptidos se representan como hélices verdes y los fosfolípidos en color naranja (Vestergaard et al., 2017). La alta proporción de residuos de Aib en los peptaiboles resulta en la conformación de alfa-hélice, que es esencial para generar los canales iónicos en las membranas celulares, sumado a la carga catiónica y a la alta hidrofobicidad de la molécula le permite translocarse fácilmente por la membrana de los microorganismos (Touati et al., 2018). Cabe destacar que la capacidad permeabilizadora de la membrana es concentración dependiente (Pachauri et al., 2019). Este efecto sobre la membrana celular parece ser dependiente de su carga y composición lipídica (Dotson et al., 2018), ya que se ha observado que las membranas celulares más permeables con bajas concentraciones de esteroles tienden a ser más fácilmente penetradas por compuestos hidrofóbicos y anfifílicos, como los peptaiboles, en comparación con membranas celulares con mayor proporción de esteroles (Peltola et al., 2004). La cantidad de péptidos que conforman el poro depende de la composición lipídica de la membrana (Perrin & Pastor, 2016). Además, la actividad biológica de los peptaiboles parece variar según su composición de aminoácidos, ya que se observó que la tricorzina HA V interactúa de manera selectiva con el receptor de calcitocina en Schizosaccharomyces pombe, mientras que la alameticina, que solamente posee un residuo distinto, no presenta esta interacción ni ocasiona los efectos celulares consecuentes en el microorganismo (Tamandegani et al., 2020). También, se han asociado otros mecanismos a la bioactividad de los peptaiboles. Por ejemplo, el peptaibol Trichokonin VI de T. pseudokoningii es capaz de inducir muerte celular programada o apoptosis sobre fitopatógenos (Khan et al., 2020; M. Shi et al., 2012). Por su parte, la tricokonina IV de T. pseudokoningii induce muerte celular apoptótica independiente de metacaspasa y la acumulación de vacuolas citoplasmáticas en F. oxysporum. Por otro lado, se ha observado un sinergismo entre peptaiboles y enzimas hidrolíticas, donde los peptaiboles inhiben la actividad de la enzima ß-1,3- glucano sintasa lo que evita la biosíntesis de ß-glucanos y facilita la entrada de las hidrolasas a la célula (Marik et al., 2017); sin embargo, el papel de los peptaiboles en el biocontrol de F. oxysporum es más relevante que el efecto antagónico dado por las enzimas hidrolíticas (Khare et al., 2018). La alameticina tiene la capacidad de permeabilizar la membrana mitocondrial de Yerwinia lipolytica lo cual permite la entrada de NADH y otros compuestos hidrofílicos pequeños que alteran su funcionamiento (Rawa et al., 2021). 2.1.1.6. Efecto antimicrobiano La actividad antimicrobiana de la alameticina se ha evidenciado en bacterias Gram positivas como: Enterococcus faecalis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus viridans y S. aureus. Asimismo, otros peptaiboles producidos por diversas especies de Trichoderma han mostrado efectividad ante S. aureus (Ageitos et al., 2017; Xiao-Yan et al., 2006), Bacillus subtilis (Li et al., 2014; Oh et al., 2002; Su et al., 2012a; van Bohemen et al., 2016a; Xiao-Yan et al., 2006), Mycobacterium megmatis, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mohamed-Benkada et al., 2016; Pruksakorn et al., 2010), y Streptococcus faecalis (Xiao-Yan et al., 2006). También, los peptaiboles de T. asperellum parcialmente purificados poseen actividad antimicrobiana contra la bacteria Bacillus stearothermophilus, importante agente de deterioro en alimentos enlatados (Konakovsky, 2012), y el extracto crudo obtenido de una fermentación de este hongo mostró actividad antibacteriana contra Micrococcus luteus (Tamandegani et al., 2016, 2020). Respecto a bacterias Gram negativas, solamente un ensayo por difusión en disco del extracto crudo del micelio de T. orientale ha encontrado inhibición del crecimiento de bacterias de este grupo, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella Enteriditis (Touati et al., 2018). Otros experimentos reportan no haber encontrado evidencia de que los peptaiboles inhiban el crecimiento de bacterias Gram negativas (Li et al., 2014; Mohamed-Benkada et al., 2016; Xiao-Yan et al., 2006). Los peptaiboles poseen capacidad inhibitoria sobre el crecimiento bacteriano por lo que son una potencial herramienta para el control de patógenos de importancia para la industria alimentaria. El uso de péptidos para el control de microorganismos no es nuevo en esta industria ya que existen aditivos alimentarios que utilizan péptidos antimicrobianos, como las bacteriocinas, para la preservación de alimentos (Stanbury et al., 2017). Así, los peptaiboles podrían ser una alternativa o un complemento a los antibióticos y otras sustancias antimicrobianas utilizadas por la industria de los alimentos. 2.1.1.6.1. Membranas celulares bacterianas Las bacterias se clasifican en Gram positivas y Gram negativas según las características de su pared celular y la presencia de una membrana externa. Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa conformada por varias capas de peptidoglicano y está ubicada hacia el exterior de la célula contigua a su membrana citoplasmática. Por su parte, las bacterias Gram negativas poseen una pared celular delgada de peptidoglicano ubicada entre la membrana citoplasmática y una membrana externa (Sohlenkamp & Geiger, 2015). Las membranas bacterianas consisten en una bicapa lipídica heterogénea, con incrustaciones proteicas, que se comporta como un mosaico fluido. Estas membranas poseen tanto asimetría axial, dada por la composición heterogénea de lípidos y proteínas, como asimetría lateral, la cual incluye la formación de balsas lipídicas y microdominios. La asimetría de la membrana influye sobre las funciones, localización y orientación de las proteínas embebidas en esta estructura (Paulowski et al., 2020). La membrana citoplasmática bacteriana está formada por glicerofosfolípidos y delimita el citoplasma celular. Estas moléculas poseen dos ácidos grasos, un glicerol, un grupo fosfato y un grupo variable (Sohlenkamp & Geiger, 2015). La membrana está compuesta principalmente por glicerofosfolípidos anfifílicos aniónicos como fosfatidilglicerol, cardiolipina y fosfatidiletanolamina (no cargado); y proteínas incrustadas entre las moléculas lipídicas (Strahl & Errington, 2017). También, estas membranas pueden contener ácido fosfatídico, lisil fosfatidilglicerol, fosfatidilserina y glucolípidos, entre muchos otros grupos de lípidos que carecen del grupo fosfato o son modificados con acilaciones, aminoácidos y azúcares (Sohlenkamp & Geiger, 2015). La membrana externa de las bacterias Gram negativas está conformada por lipopolisacáridos o lipooligosacáridos en la sección externa y por glicerofosfolípidos en la sección interna. Esta membrana es considerada la más asimétrica descrita (Paulowski et al., 2020). Los lipopolisacáridos están formados por el lípido A, azúcares y el antígeno O. Los lipooligosacáridos carecen del antígeno O y poseen otros glúcidos en su lugar. El lípido A posee carga negativa, dada por una fosforilación, que le permite interactuar con cationes divalentes del ambiente para estabilizar la membrana externa. No obstante, esta naturaleza aniónica hace a la membrana susceptible a péptidos antimicrobianos catiónicos (Powers & Trent, 2018). Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular externa conformada principalmente por peptidoglicano o mureína, un heteropolímero de N-acetil-glucosamina y ácido N- acetilmurámico. El lípido II funciona como anclaje del peptidoglicano a la membrana citoplasmática. Además, esta pared posee ácido teicoico y ácido lipoteicoico. Estas moléculas contienen disacáridos de anclaje unidos por un enlace fosfodiéster a una molécula de poliglicerol fosfato o poliribitol fosfato, los cuales dan una carga negativa neta a la pared celular (Joo et al., 2016). 2.1.1.6.2. Mecanismos de resistencia ante péptidos antimicrobianos Los AMP son liberados como parte de la respuesta del sistema inmune innato de los organismos. Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos de resistencia que les permiten sobrevivir ante la presencia de estos péptidos (Ravensdale et al., 2016). Estas estrategias se basan en cambios en la carga neta de la membrana para reducir la atracción electrostática, la elusión de las interacciones AMP-membrana y la limitación de la inserción de los péptidos en la membrana (Nawrocki et al., 2014). Estos mecanismos son activados y regulados por los sensores de péptidos antimicrobianos (Aps, por sus siglas en inglés) en Gram positivas y los sensores histidina quinasa PhoQ en Gram negativas. Ambos tipos de sensores se localizan en la membrana citoplasmática (Joo et al., 2016). La secreción de enzimas proteolíticas y secuestradoras es el primer mecanismo utilizado por las bacterias al detectar AMP en el ambiente. Estas enzimas tienen la capacidad de romper o secuestrar los AMP de manera que no puedan integrarse a la membrana bacteriana (Nawrocki et al., 2014). No obstante, algunos AMP poseen enlaces disulfuro y modificaciones estructurales que les permiten burlar este mecanismo de defensa bacteriano (Joo et al., 2016). También, algunas proteínas superficiales de la membrana pueden enlazarse a los AMP para evitar su agrupación, el primer paso para generar los canales iónicos (Nawrocki et al., 2014). Las bacterias que se agrupan en biopelículas tienen resistencia inherente hacia los AMP por la existencia de la matriz extracelular. Esta matriz está compuesta por proteínas, ADN, exopolisacáridos y polisacáridos capsulares extracelulares. Los distintos polisacáridos de la matriz capturan o repelen los AMP antes de que puedan interactuar con las membranas celulares de las bacterias pertenecientes a la biopelícula (Joo et al., 2016). Los mecanismos de resistencia contra AMP de las bacterias Gram negativas se han dirigido a la modificación de su membrana externa. La modificación o eliminación de los grupos fosfato en el lípido A, o del lípido A completo, así como la incorporación de moléculas aminadas, como aminoazúcares y fosfoetanolamina, provocan un aumento en la carga positiva de la membrana lo cual reduce la afinidad de los AMP catiónicos. Las modificaciones al lípido A incluyen adiciones de aminoarabinosa, galactosamina o glucosamina a los grupos fosfato, y la extensión de las cadenas acilo o la adición de glicina (Joo et al., 2016; Powers & Trent, 2018). Las bacterias Gram positivas han optado por añadir modificaciones al ácido teicoico de su pared celular. Estas modificaciones incluyen la adición de L-alanina y L-ramnosa, lo cual disminuye la atracción electrostática de los péptidos hacia la pared celular, aumenta la densidad y reduce la permeabilidad superficial de la pared celular. El lípido II es usado como anclaje por los AMP a la membrana celular para la formación de poros. Por esto, la modificación del lípido II con D-lactato o D-serina aumenta la resistencia ante AMP, como se reporta también en cepas vancomicina resistentes (Joo et al., 2016). Por otro lado, estas bacterias liberan polisacáridos capsulares de carga negativa que interactúan con los AMP catiónicos lo cual previene que estos péptidos lleguen a la membrana (Nawrocki et al., 2014). La alteración estructural de la membrana citoplasmática reduce la atracción e inserción de los AMP que traspasaron las barreras externas de la bacteria. La estrategia más común consiste en la aminoacilación con lisina de los grupos fosfato de los glicerofosfolípidos lo cual genera repulsión electrostática. También, la rigidez de la membrana es aumentada con la adición de cadenas acilo saturadas o del carotenoide estafiloxantina. La fluidez de la membrana incrementa con la incorporación de cadenas acilo insaturadas. Estas últimas dos estrategias parecen tener un papel importante en la resistencia bacteriana ante AMP que aún no está claro (Joo et al., 2016; Nawrocki et al., 2014). A pesar de todas estas estrategias, el desarrollo de resistencia a los peptaiboles en patógenos es reducido debido a su mecanismo de acción generalizado sobre la membrana celular (Dotson et al., 2018). 2.1.1.6.3. Pruebas antimicrobianas Las pruebas antimicrobianas permiten establecer la resistencia o susceptibilidad de un microorganismo ante la actividad de una molécula con propiedades antimicrobianas. Específicamente, las pruebas in vitro de susceptibilidad antimicrobiana se consideran los métodos más eficaces para determinar el efecto de antibióticos y otros antimicrobianos sobre el crecimiento de uno o varios microorganismos. Este tipo de pruebas evalúan la eficacia del agente antimicrobiano para inhibir la bacteria a través del tiempo (Schumacher et al., 2018). Las pruebas más comunes incluyen métodos de difusión como la difusión por disco y el Etest, métodos de dilución, citometría de flujo, bioluminiscencia de ATP, entre otros (Balouiri et al., 2016). 2.1.1.6.3.1. Bacterias subrogadas Las bacterias subrogadas son aquellas equivalentes a bacterias patógenas en la determinación de resistencia y susceptibilidad ante antimicrobianos, así como cinéticas de inactivación relacionadas. Estas bacterias se emplean en pruebas antimicrobianas cuando no se tiene acceso a un laboratorio de bioseguridad 2 o cuando no se desea utilizar un patógeno dentro de un laboratorio o industria, principalmente en la alimentaria (Hu & Gurtler, 2017). También, estas bacterias forman parte de los métodos de validación de los procesos de descontaminación (Busta et al., 2003). A pesar de su utilidad, cada subrogado es específico para cada matriz alimentaria y para cada tratamiento de inactivación, y debe validarse para cada una de estas condiciones. Algunas características deseables para una bacteria subrogada incluyen: - No patogénica - Fácil cultivo en grandes poblaciones - Estable genéticamente - Características de crecimiento consistentes y estables - Comportamiento y características de inactivación similares a las del patógeno evaluado (Busta et al., 2003; Hu & Gurtler, 2017). Algunas cepas de Listeria innocua se utilizan como subrogadas de L. monocytogenes para evaluar tratamientos aplicados para preservar alimentos y en estudios para la inactivación del patógeno (Hu & Gurtler, 2017), principalmente en procesos térmicos en leche (Friedly et al., 2008) y probar la efectividad de tratamientos de luz pulsada (Proulx et al., 2015). Esta bacteria Gram positiva también es usada como indicador de la presencia del patógeno L. monocytogenes en la industria alimentaria (Moorman et al., 2008). Por su parte, Escherichia coli ATCC 25922 es una de las subrogadas más importantes para cepas de E. coli O157:H7, patógeno asociado a contaminación fecal (Hu & Gurtler, 2017; Proulx et al., 2015). Esta bacteria se ha utilizado en el estudio de criotolerancia y las características superficiales del patógeno (Kyung Kim & Harrison, 2009). Pseudomonas fluorescens se utiliza como subrogada del patógeno P. aeruginosa. Esta bacteria se relaciona con el deterioro de leche cruda y pasteurizada, especialmente en quesos. Se ha probado en tratamientos de inactivación del patógeno por luz pulsada (Proulx et al., 2015). Lactobacillus paracasei es utilizada como probiótico en la industria alimentaria, principalmente en productos lácteos (Ye et al., 2021), y en la preparación de embutidos que no requieren refrigeración. También, están relacionadas con el deterioro de algunos alimentos. Algunas bacterias lácticas se han utilizado como subrogadas de E. coli O157:H7 y algunos serovares de Salmonella enterica en pruebas de resistencia térmica (Borowski et al., 2009). 3. Producción de peptaiboles Debido a su importancia biotecnológica y farmacéutica (Ren et al., 2009a), la producción de los peptaiboles debe optimizarse con el fin de obtener rendimientos factibles para su escalamiento a nivel industrial (Konakovsky, 2012). La expresión de los genes relacionados con metabolitos secundarios dependen de las condiciones bióticas o abióticas en que se encuentre el hongo, por lo que las condiciones de cultivo en laboratorio se direccionan hacia el aumento de esta expresión (Pachauri et al., 2019). La modificación del medio de cultivo corresponde a una de las técnicas más comunes para mejorar los rendimientos fermentativos. Esta técnica consiste en añadir, eliminar o sustituir los componentes del medio para inducir mayor productividad. Lo anterior se puede lograr, por ejemplo, mediante la variación de la fuente de carbono o de nitrógeno, o la adición de otros compuestos como aminoácidos, vitaminas o elementos traza. Sin embargo, los cambios al medio de cultivo pueden involucrar un aumento significativo en los costos de producción (Stanbury et al., 2017). Los medios de cultivo comunes para la producción de peptaiboles contienen fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato, así como los elementos traza zinc, cobre, manganeso, hierro, magnesio, potasio y calcio (Daniel & Rodrigues Filho, 2007b). La producción de estos metabolitos específicos se puede inducir mediante la adición de otros componentes al medio de cultivo para estimular la respuesta del hongo ante la presencia de agentes elicitores. Uno de los aditivos propuestos consiste en restos celulares de otros microorganismos que generan una respuesta de defensa o competencia en el hongo de interés y estimulan la producción de metabolitos específicos. Por ejemplo, se ha observado que al agregar restos de la pared celular del micelio o cuerpo fructífero del hongo Laetiporus sulphureus, se induce la generación de la enzima mutanasa en Trichoderma harzianum (Wiater et al., 2012). Por otro lado, el co-cultivo en medio líquido de T. asperellum y Bacillus amyloliquefaciens incrementa la expresión de genes relacionados con micoparasitismo al detectar la presencia de esta bacteria en el mismo medio de cultivo (Karuppiah et al., 2019). 3.1. Organismo productor: Trichoderma asperellum Los hongos del género Trichoderma poseen una serie de herramientas que les otorgan su éxito ecológico como el micoparasitismo, la versatilidad nutricional, la tasa de reformación de sus genomas y la antibiosis, entre otros (Kubicek et al., 2019), de las cuales la antibiosis les ha permitido atacar directamente otros microorganismos. T. asperellum se encuentra ampliamente distribuida en suelos y se considera un hongo micoparasítico por lo que es utilizado en la agricultura contra enfermedades ocasionadas por fitopatógenos (Ren et al., 2009a). Se ha determinado que una sola especie de Trichoderma es capaz de producir hasta cinco tipos diferentes de peptaiboles (Castagnoli et al., 2018). T. asperellum es un productor eficiente de peptaiboles. En esta especie se han identificado dos grupos: asperelinas y tricotoxinas. De estos, 38 corresponden a asperelinas y cinco a tricotoxinas, los cuales poseen capacidad antifúngica comprobada (Brito et al., 2014; Ren et al., 2009, 2013). Se ha reportado la producción de tricotoxinas de la familia A-50 en cepas de T. asperellum (Degenkolb et al., 2006). En el año 2007, se realizó una colaboración entre el CENIBiot y el Instituto Nacional de Innovación y Transferencia en Tecnología Agropecuaria (INTA), que consistió en un tamizaje de cepas de varios géneros de hongos como Trichoderma y Beauveria aislados de suelo para determinar su actividad biológica. Se determinó que una de las cepas de Trichoderma asperellum aislada de muestras de suelo posee mayor actividad biológica que los otros hongos evaluados gracias a los metabolitos secundarios que produce en grandes cantidades. Estos metabolitos fueron identificados como peptaiboles. 4. Modelado para optimización La optimización de los procesos fermentativos es indispensable para aumentar la productividad del metabolito objetivo y para facilitar el escalamiento específico de cada proceso (Rayhane et al., 2019). El método tradicional para la optimización de procesos es ‘una variable a la vez’; sin embargo su implementación requiere el consumo de tiempo y materiales, y además no considera las interacciones entre las variables de interés. Por su parte, los métodos de modelado por superficie de respuesta o diseño central compuesto (CCD, por sus siglas en inglés) se caracterizan por ser estrategias estadísticas eficientes que involucran diseño factorial y análisis de regresión robusto, lo cual permite definir las condiciones óptimas de un proceso y crear modelos que consideren las interacciones entre las variables de interés, con un menor consumo de tiempo y materiales. Además, los CCD no pierden poder de discriminación y mantienen sensibilidad ante la ocurrencia de valores atípicos (Santos et al., 2015; Song et al., 2007). Estos modelos se han utilizado exitosamente en la optimización del medio y otras condiciones de cultivo para la producción de enzimas, azúcares y antibióticos, entre otros (Song et al., 2007). La validación de estos modelos es necesaria para medir su confiabilidad al comparar con observaciones que no fueron utilizadas para generar el modelo. Los índices de factor bias (Bf) y nivel de certeza (Af) se proponen como factores determinantes de la validez de un modelo central compuesto (Baranyi et al., 1999). El Af indica la cercanía de los valores experimentales a la línea de equivalencia, mientras que el Bf determina en promedio los valores predichos son mayores o menores que los valores observados. Estos factores indican la cercanía entre los valores observados y los valores predichos por el modelo y, por lo tanto, su validez (Ortiz-Suárez et al., 2021). 5. Análisis de peptaiboles por espectrometría de masas La peptaibiómica consiste en el análisis del peptaibioma expresado por un microorganismo el cual comprende todos los peptaiboles que este produce. La espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) es una herramienta predilecta para la secuenciación de peptaiboles y la determinación del peptaibioma de un hongo a partir de muestras puras y mezclas complejas (Daniel & Rodrigues Filho, 2007b). La MS determina el valor de masa carga (m/z) de los iones que componen la muestra. El método de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) permite seleccionar de manera precisa los iones precursores y detectar los iones producidos por la fragmentación de cada péptido sin generar una secuenciación ambigua (Ren et al., 2013a; Suwan et al., 2000). Los iones de fragmentación se producen por la disociación inducida por colisión (CID, por sus siglas en inglés) del ion parental seleccionado al atravesar el triple cuadrupolo del espectrómetro de masas (Degenkolb et al., 2003). El procedimiento consiste en calcular las pérdidas de m/z entre dos iones sucesivos lo cual indica la masa del aminoácido entre esos dos iones. La identidad de cada aminoácido consecutivo determinado por estas pérdidas sucesivas conforma la secuencia del péptido en cuestión (Xiao-Yan et al., 2006). El bombardeo por electrospray (ESI) permite el acoplado a técnicas de separación como HPLC. La técnica ESI-MS consiste en pasar la muestra por un capilar con un campo eléctrico que rocía gotas cargadas de la muestra, pierden el solvente y los iones se trasladan al espectrómetro de masas para su detección. Esta técnica es apropiada para el análisis de un amplio espectro de moléculas, que incluye los peptaiboles, ya que no requiere generar una matriz y la muestra debe estar en forma líquida (Daniel & Rodrigues Filho, 2007b). El modo positivo del ESI-MS/MS permite obtener la fragmentación secuencial de los aminoácidos a partir del extremo C-terminal de cada peptaibol (Ren et al., 2009a). Se prefiere analizar los fragmentos a partir del extremo C-terminal ya que se reduce la complejidad del espectro al darse fragmentación secundaria reducida (McMullin et al., 2017). La carga positiva en el fragmento N-terminal genera iones positivos tipo a-, b- y c-. Los fragmentos tipo b- se producen más comúnmente. Los fragmentos tipo b- [M – H2O+] son producidos en el modo positivo de manera que debe restarse la masa de una molécula de agua a la masa de cada aminoácido para determinar la masa de cada ion al secuenciar el péptido (Degenkolb et al., 2003). El enlace Aib-Pro característico de los peptaiboles (Marik et al., 2017; Peltola et al., 2004) reduce la formación de iones tipo b- acilados. La ruptura de este enlace es preferencial y provoca un ion N+ acilado en el extremo N-terminal, iones C-terminales diprotonados y la ausencia de algunos iones de mayor masa cercanos al extremo C-terminal (Degenkolb et al., 2003). Los peptaiboles pueden ocurrir en isoformas que difieren en apenas una unidad de masa (Chutrakul et al., 2008), por lo que este método permite identificarlas a partir de su secuencia de aminoácidos. 5.1. Aminoácidos en los peptaiboles Los aminoácidos son los monómeros que conforman los péptidos y las proteínas. Estas moléculas orgánicas poseen un grupo amino N-terminal y un grupo carboxilo C-terminal entre los cuales se forman los enlaces peptídicos mediante una reacción de deshidratación (Nelson & Cox, 2021). Los peptaiboles se caracterizan por tener aminoácidos proteinogénicos como leucina, glutamina y alanina, así como no proteinogénicos como Aib e isovalina (Rawa et al., 2021) (Cuadro 1). Los aminoácidos proteinogénicos histidina, lisina, arginina, metionina, cisteína y aspartato no se han encontrado en las secuencias de peptaiboles. Los aminoácidos aromáticos son poco comunes (frecuencia de 4%) y se limitan a los extremos C- y N- terminal (Daniel & Rodrigues Filho, 2007b; Whitmore & Wallace, 2004b). Cuadro 1. Abundancia absoluta y relativa de los aminoácidos más comunes en la secuencia de los peptaiboles producidos por hongos del género Trichoderma. Aminoácido Abundancia absoluta Abundancia relativa (%) Ácido 2- aminoisobutírico 1156 36.9 Leucina/Isoleucina 465 14.8 Glutamina 319 10.2 Valina/Isovalina 305 9.7 Alanina 282 9.0 Prolina 261 8.3 Glicina 145 4.6 Fenilalanina 72 2.3 Serina 43 1.4 Asparagina 38 1.2 Glutamato 32 1.0 Triptófano 10 0.3 Otros 8 0.3 Total 3136 100 Fuente: Elaboración propia basada en la información reportada en la base de datos Peptaibol Database (Whitmore & Wallace, 2004a). Los aminoácidos que componen los peptaiboles cumplen un rol estructural y funcional específico. Estos conforman secuencias alifáticas que brindan estabilidad y capacidad de inserción en las membranas (Whitmore & Wallace, 2004b). En las tricotoxinas, la estructura α-helicoidal estable característica se debe a una alta presencia de residuos de Aib en su secuencia que forman dominios helicoidales. Además, el Aib brinda resistencia ante enzimas proteolíticas (Ruiz et al., 2007; Tamandegani et al., 2020) y sus átomos de oxígeno de los grupos carbonilo forman parte del interior hidrofílico del canal iónico. Los residuos de glutamina a la mitad y en el extremo C-terminal de la secuencia forman parte de la sección hidrofóbica del péptido. El residuo de glutamina a la mitad de la secuencia tiene una función crítica en la conducción del canal iónico en miembros de la familia SF1 (Chugh et al., 2002; Whitmore & Wallace, 2004b). La presencia de residuos de glutamina en las posiciones 6/7 y 17, así como un residuo de prolina en la posición 13, están relacionados con la formación del lumen del poro y el mecanismo de inserción en la membrana celular (Tamandegani et al., 2020). La presencia de un residuo de glutamato en lugar de glutamina en la posición 17 reduce la hidrofobicidad (Tamandegani et al., 2016) y la actividad lítica de la molécula, ya que provocaría repulsión de cargas en el ensamblaje del canal iónico (Chugh et al., 2002). Los canales octaméricos se forman por enlaces de hidrógeno entre residuos de glutamina en las posiciones 6/7 y entre un átomo de nitrógeno de la glutamina en la posición 17 y un átomo de oxígeno del Aib en la posición 16 del péptido vecino. Los aminoácidos leucina y valina corresponden a residuos hidrofóbicos que se ubican en el exterior del canal e interactúan con la membrana celular. El motivo en el extremo N-terminal formado por los residuos de Aib-Gly-Aib-Leu se inserta primero en la membrana e interactúa con su región intracelular (Chugh et al., 2002). Los aminoácidos aromáticos estabilizan los segmentos transmembrana al interactuar con los grupos polares en las membranas lipídicas (Whitmore & Wallace, 2004b). Además, los residuos de prolina y glicina también tienen efectos sobre la bioactividad relacionados con la flexibilidad de la molécula (Touati et al., 2018). Los aminoácidos que componen la secuencia de cada peptaibol influyen en sus propiedades químico-físicas y biológicas. Esta secuencia depende de los dominios A de la NRPS y de los aminoácidos disponibles para la biosíntesis de los péptidos. La complejidad y la cantidad de peptaiboles producidos en una fermentación pueden modificarse con la adición y la modificación de las concentraciones de aminoácidos en el medio de cultivo (Daniel & Rodrigues Filho, 2007b). Justificación Las ETAs son ocasionadas por microorganismos patógenos y sustancias tóxicas y afectan a millones de personas al año en todo el mundo, con cerca de 420.000 casos mortales. De esta cifra, una tercera parte son niños menores a 5 años (OMS, 2015). Incluso, las ETAs más agresivas pueden dejar secuelas como discapacidades y trastornos físicos al paciente por el resto de su vida. Estas enfermedades afectan el desarrollo socioeconómico el turismo y el comercio (OMS, 2015) provocando pérdidas millonarias a la industria alimentaria y la salud pública (Jorquera et al., 2015). La industria agroalimentaria es una de las más importantes para la economía costarricense. Para el 2017, los sectores agrícola y alimentario sumaron 42% de las exportaciones. Los principales productos fueron frutas, café, jarabes, jugos y concentrados (Jorquera et al., 2015). Por esta razón, se han establecido controles químicos y microbiológicos para el agua potable y los alimentos, con la acción de instituciones como el Ministerio de Salud y el Ministerio de Agricultura y Ganadería. Estas instituciones procuran la inocuidad alimentaria y la reducción de ETAs en la población (Estudio de Caso – Enfermedades Transmitidas por Alimentos en Costa Rica, 2008). En Costa Rica, se reportan cerca de 312.000 casos de diarrea al año relacionados con la ingesta de alimentos contaminados. Las poblaciones más susceptibles como los niños menores de diez años y los adultos mayores son las más afectadas (Kopper et al., 2009). Los principales agentes causantes de ETA son agentes químicos, biotoxinas y bacterias de los géneros Shigella y Salmonella. Para evitar estos agentes, una variedad de herramientas se han implementado durante el proceso productivo. El uso de antimicrobianos es una de las prácticas más comunes; sin embargo, su uso excesivo e incorrecto en cadenas productivas, principalmente para aumentar los niveles de productividad de los animales a nivel de granja, y en la medicina, se ha relacionado con el surgimiento de cepas bacterianas resistentes a algunos de estos antimicrobianos que provocan ETAs intratables (OMS, 2020). La alta incidencia de ETA alrededor del mundo ha aumentado la necesidad de generar nuevas herramientas para controlar la diseminación de los microorganismos en los ambientes de producción y manipulación de alimentos. Una alternativa con gran auge es el uso de biotecnología para la producción de antimicrobianos (Seal et al., 2018) a partir de fuentes novedosas y alternativas como es el caso de algunos microorganismos. Ciertos microorganismos con potencial biotecnológico, como el caso de T. asperellum, se pueden encontrar de fuentes ambientales a nivel nacional por lo que es importante el impulso de líneas de investigación que se enfoquen en el aprovechamiento de este tipo de recurso. Se busca evaluar su potencial aplicación en la industria alimentaria, con la innovación de utilizar un microorganismo autóctono como herramienta biotecnológica. Hipótesis Trichoderma asperellum produce peptaiboles con actividad antimicrobiana contra bacterias, y su producción a partir de cultivo se puede optimizar mediante la adición de aminoácidos presentes en su estructura, así como la incorporación de restos celulares de otros hongos que funcionan como elicitores de la síntesis de estos péptidos durante su fase productiva. Objetivo general Optimizar las condiciones de cultivo para la producción de peptaiboles del hongo Trichoderma asperellum con potencial aplicación en el control de bacterias de origen alimentario. 1. Objetivos específicos 1.1. Determinar los factores del medio de cultivo más influyentes en la producción de peptaiboles a partir del cultivo en matraz de T. asperellum. 1.2. Elaborar un modelo central compuesto que permita definir las condiciones de cultivo para la mayor obtención de peptaiboles en matraz, necesarias para escalar el proceso. 1.3. Caracterizar los peptaiboles producidos por T. asperellum con el fin de elucidar su secuencia. 1.4. Evaluar bajo condiciones in vitro el efecto de los peptaiboles sobre bacterias de importancia en la industria alimentaria para delimitar su potencial aplicación en el área. Materiales y métodos 1. Pruebas de optimización en matraz 1.1. Formulación del inóculo El hongo Trichoderma asperellum se inoculó en placas de 90 mm con agar papa dextrosa (PDA, por sus siglas en inglés) a partir de un cultivo preservado a 4 °C en agua estéril. Esto se repitió para cada fermentación del proyecto con el fin de conservar los genes productores de peptaiboles del hongo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante siete días. Las esporas producidas por el hongo se recolectaron mediante la adición de 10 mL de Tween 80 (0.05% m/v) a cada placa y luego se raspó la superficie de las placas con una espátula Drigalski estéril. Luego, el volumen de todas las placas se trasvasó, a través de un filtro estéril (Whatman 1), a un matraz estéril de 125 mL. El matraz se mantuvo en agitación magnética durante 10 minutos. Se realizaron diluciones seriadas hasta 1x10-5 con una alícuota de 100 µL para realizar los conteos de esporas por citometría de flujo y determinar la concentración. El conteo de esporas por citometría de flujo se realizó en el citómetro Guava® easyCyteTM 8HT de Luminex, equipado con láseres verde (532 nm), rojo (642 nm) y violeta (405 nm). La tasa de adquisición fue de 5000 eventos por segundo. La concentración total de esporas se determinó al comparar los parámetros de forward scatter y side scatter en el software InCyte™. Para formular el inóculo, se calculó el volumen necesario mediante la fórmula C1*V1=C2*V2, para una concentración inicial de 1x106 esporas/mL en cada matraz. 1.2. Preparación de aminoácidos Los aminoácidos leucina, prolina, valina, glicina, alanina, ácido 2-aminoisobutírico (Aib) y glutamina (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) se eligieron debido a que son los aminoácidos más comunes en los peptaiboles producidos por hongos del género Trichoderma (Cuadro 1), según la información reportada en la base de datos Peptaibol Database (http://peptaibol.cryst.bbk.ac.uk/home.shtml) (Whitmore & Wallace, 2004a). Cada aminoácido se pesó en una balanza analítica y se disolvió en agua de ósmosis en balones aforados para obtener sus respectivas soluciones madre (Cuadro 2). Para ello, se tomó en cuenta la solubilidad en agua de cada aminoácido. En los casos necesarios, se agregó ácido acético glacial antes de aforar para aumentar la solubilidad del aminoácido. Las soluciones madre se esterilizaron por filtración (0.22 µm). Esta preparación se realizó el día correspondiente a la inducción de la fermentación. Cuadro 2. Datos para la formulación de las soluciones madre de los aminoácidos. Aminoácido Masa (g) Volumen (mL) Concentración (g/L) Aib 1.00 10.0 100.0 Prolina 1.00 10.0 100.0 Valina 2.12 25.0 84.8 Alanina 1.00 10.0 100.0 Glicina 1.00 10.0 100.0 Leucina 0.94 50.0 18.8 Glutamina 1.00 10.0 100.0 1.3. Preparación de elicitores Los hongos fitopatógenos Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea se evaluaron como potenciales elicitores de la producción de peptaiboles. Estas cepas forman parte de la colección de hongos del CENIBiot y han sido aislados de diversas parcelas y productos agrícolas. Estos hongos se eligieron debido a que previamente se ha determinado que tienen sensibilidad ante los peptaiboles producidos en CENIBiot (Bastos, 2018). Los hongos se inocularon en placas de 90 mm con PDA a partir de cultivo preservado a 4°C en agua Milli Q® estéril y se incubaron a 27 °C durante siete días. A partir de estas placas, los hongos se inocularon en matraces de 1 L con 200 mL de caldo papa dextrosa (PDB, por sus siglas en inglés) y se incubaron a 27 °C con agitación constante (200 rpm) durante diez días. En el caso de B. cinerea, se incubó a temperatura ambiente y sin agitación durante este periodo de tiempo. Una vez terminado el periodo de incubación, los matraces se autoclavaron en un ciclo húmedo de 20 minutos de esterilización a 121 °C. El contenido de cada matraz se filtró (Whatman 1). Los restos celulares recuperados en el filtro se colocaron en viales previamente pesados. Los viales se congelaron a -80 °C y se liofilizaron. La masa recuperada se determinó por diferencia de masas. Los restos celulares se maceraron a mano con una espátula y se almacenaron a temperatura ambiente dentro de un vial. 1.4. Fermentación Se prepararon matraces de 1 L con 200 mL de un medio de cultivo basado en Czapek-Dox modificado en el CENIBiot llamado medio CCM (sacarosa 30 g/L, KNO3 0.7 g/L, NaNO3 1.4 g/L, MgSO4·7H2O 1 g/L, KH2PO4 0.8 g/L, FeSO4·7H2O 0.01 g/L, MnSO4·H2O 0.01 g/L y CuSO4 0.005 g/L). Para cada tratamiento, se agregó la cantidad de azúcar o elicitor correspondiente según el esquema presentado en la Figura 3. Los elicitores se pesaron en una balanza granataria y se agregaron 0.2 g de restos celulares en cada matraz correspondiente. Los matraces se autoclavaron en un ciclo húmedo de 20 minutos de esterilización a 121 °C. Para todos los tratamientos se hicieron tres repeticiones. Se realizaron dos corridas: una para evaluar los aminoácidos, compuesta por 25 matraces (7 aminoácidos * 3 repeticiones + 4 controles) y otra para evaluar la fuente de carbono y los elicitores compuesta por 16 matraces (2 fuentes de carbono y 3 elicitores * 3 repeticiones + 1 control negativo). La fermentación se mantuvo en agitación constante (200 rpm) durante veintiún días a temperatura ambiente. El control positivo correspondió al medio sin modificaciones e inoculado. El control negativo no se inoculó (solo medio de cultivo sin modificaciones). Los controles se mantuvieron también por triplicado. Figura 3. Esquema de los ensayos para la fermentación de optimización del medio de cultivo con la adición de suplementos. 1.5. Procesamiento y análisis de muestras De cada matraz se tomó una alícuota de 10 mL cada 2-3 días y se colocó en un tubo Falcon de 15 mL. Los tubos Falcon se centrifugaron durante 15 minutos a 3000 rpm. El sobrenadante se decantó a otro tubo Falcon debidamente rotulado. Todos los tubos se congelaron a -20 °C hasta su procesamiento. Día de adición a la fermentación Concentración Tratamientos Optimización Fuente de carbono Sacarosa Glucosa 30 g/L Inicial Aminoácidos Leucina, prolina, valina, glicina, alanina, Aib y glutamina 1 g/L Noveno Elicitores C. gloeosporioides F. oxysporum B. cinerea 1 g/L Inicial 1.5.1. Peso seco Se monitoreó el peso seco de la biomasa producida. Un día antes de realizar el proceso, los filtros Sartorius 388 (diámetro 55 mm, retención de partículas 10-15 µm) para cada muestra se secaron durante 24 h en una estufa a 60 °C. Los filtros se pesaron fríos en una balanza analítica. Las muestras en los tubos Falcon se descongelaron a temperatura ambiente. En un sistema de filtración al vacío Sartorius, se colocó cada filtro y se decantó la muestra sobre el filtro. La muestra se recuperó en su totalidad mediante lavados con agua de ósmosis. Los filtros con cada muestra se secaron en la estufa a 60 °C durante 24 h. Cada filtro frío se pesó nuevamente en una balanza analítica. La biomasa se determinó restando la masa del filtro con los restos celulares menos la masa inicial del filtro. Se calculó la concentración de biomasa (g/L) para cada matraz. En los matraces con restos celulares de elicitores, se restó la masa inicial de estos (0.2 g) para evitar datos erróneos. 1.5.2. Cromatografía líquida de alta resolución El consumo de sacarosa, y glucosa cuando se requirió, se determinó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). Para ello, se siguió el protocolo para cuantificación de azúcares por medio de HPLC establecido por CENIBiot. En la preparación de los patrones, se pesaron las masas (50, 100, 150, 200, 250, 300) mg de estándares de glucosa, fructuosa y sacarosa. Las masas de cada estándar se llevaron a balones aforados de 10 mL y se aforaron con agua Milli Q®. Los patrones se filtraron (0.45 µm) y se colocaron en viales de 2 mL. En la preparación de estándares a partir del medio CCM, se preparó el medio CCM y se diluyó hasta una concentración de 1 g/L de sacarosa, la cual se llamó disolución 1. Se prepararon 3 disoluciones madre para cada carbohidrato: glucosa (3 g/L), fructuosa (3 g/L) y sacarosa (15 g/L). Se tomó una alícuota de 500 µL de cada disolución madre y se colocó en un vial de 2 mL de tal manera que la concentración final de la disolución mezcla fue: 1 g/L glucosa, 1 g/L fructuosa y 5 g/L sacarosa. Las muestras provenientes de fermentaciones se congelaron hasta el día del análisis. Previo al análisis, se descongelaron las muestras y se colocaron en el baño sónico. Las muestras se filtraron (0.45 µm) y se colocaron en un vial de 2 mL. Se utilizaron los siguientes parámetros para realizar los análisis HPLC: Columna: Luna 5µ NH2, 250 x 300 mm (Phenomenex) Detector: índice de refracción Agilent® 1200 infinity Horno: 27.5 °C Velocidad de flujo: 1 mL/min Volumen de inyección: 2 µL En el canal 2: A: 25% de agua Milli Q® B 75% de acetonitrilo Método: isocrático Duración del análisis: 10 min Horno de IR: 27.5 °C 1.5.3. Espectrometría de masas La producción de péptidos se midió por espectrometría de masas. Las muestras en los tubos Falcon se descongelaron a temperatura ambiente. En una cámara de extracción en fase sólida, se colocaron cartuchos de fase reversa C18 (Degenkolb et al., 2006). Los cartuchos se activaron con un volumen de etanol (96% v/v) y se limpiaron con dos volúmenes de agua de ósmosis. Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min y se filtraron (0.45 µm). Cada muestra se añadió a un cartucho y se activó la bomba de vacío para que pasara la muestra por el cartucho. Luego, se realizaron cuatro lavados con un volumen de agua de ósmosis. Se colocaron tubos de ensayo rotulados dentro de la cámara y se realizó una elución con dos volúmenes de etanol (96% v/v) en los cartuchos (Song et al., 2007). Los tubos de ensayo se mantuvieron a 4 °C hasta su procesamiento. El solvente se eliminó mediante un concentrador por vacío (SpeedVac). Una vez secas las muestras, se disolvieron en 2 mL de una solución de metanol (75.0% v/v), agua de ósmosis (24.9% v/v) y ácido fórmico (0.1% v/v). Cada muestra se filtró (0.20 µm) y se recibió en un vial de HPLC debidamente rotulado. La metodología para el análisis de las muestras se basó en un método previamente utilizado en CENIBiot (Bastos, 2018). Las muestras se analizaron en el espectrómetro de masas (MDS SCIEX Applied Biosystems 4000 Qtrap HPLC MS/MS). La fase móvil correspondió a una mezcla de agua Milli Q® y metanol grado HPLC, ambos con ácido fórmico (0.1% v/v). Las condiciones del HPLC fueron las siguientes: Cromatógrafo: Agilent® 1200 Detector: espectrómetro de masas Temperatura del horno: 25 °C Temperatura de la columna: 25 °C Flujo: 450 μL/min Volumen de inyección: 28 μL Cuadro 3. Gradiente utilizado en HPLC para el análisis de las muestras. Tiempo (min) A (%): Agua/H+ B (%): Metanol/H+ 0 30 70 16 15 85 25 0 100 35 0 100 Fuente: Unidad de Bioprospección, CENIBiot (Bastos, 2018). La búsqueda de masas se realizó por medio del Cuadrupolo 1, en un intervalo de masas de 200 a 2000 m/z, en modo positivo. Para esto, se utilizaron los siguientes parámetros: CUR: 26 psi IS: 5500 IS TEM: 250°C GSI: 23 psi GS2: 19 psi Ihe: on CAD: medium El análisis ESI-MS se realizó con el fin de determinar los tiempos de retención y el área de los peptaiboles, así como la abundancia de éstos en las muestras. El análisis de los espectros se realizó mediante el software Analyst® versión 1.6.2. La selección del mejor tratamiento consistió en el que produjo mayor intensidad (cps) de los peptaiboles de interés: tricotoxinas. 1.6. Análisis estadístico Para determinar si existió diferencia significativa entre los tratamientos aplicados en los distintos ensayos en matraz, los supuestos estadísticos se evaluaron inicialmente. El supuesto de homoestacidad se evaluó mediante un análisis de Levene. La normalidad de los datos se determinó con un análisis Ryan-Joiner. Los resultados de estos análisis indicaron que los datos siguen una distribución normal, por lo que una prueba ANOVA de un factor se aplicó para el análisis de los datos, con la producción de peptaiboles como variable de respuesta. Al encontrar diferencias significativas entre tratamientos, se realizó un análisis Post Hoc de medias de Tukey para definir tratamientos que difieren entre sí. Para el tratamiento con azúcares se ejecutó una prueba de t-student debido a que solo comprendía dos factores. Los análisis estadísticos se realizaron en el software Matlab 20 con un 95% de confianza y un valor p < 0.05. 2. Modelado del proceso fermentativo 2.1. Planteamiento del modelo Un Diseño Central Compuesto (DCC) se utilizó para evaluar los efectos estadísticos de la combinación de varios niveles de factores en la producción de peptaiboles durante la fermentación. La variable de respuesta correspondió a la cantidad de peptaiboles generados y los factores fueron la concentración de Aib y la concentración del elicitor F. oxysporum. Estas variables se eligieron debido a que demostraron un aumento significativo en la producción de peptaiboles en los ensayos realizados en la sección 1. Los valores axiales se codificaron como –α y +α y representaron los niveles más bajos y altos para cada factor. Los valores de los niveles factoriales codificados como -1 y 1 se calcularon según la siguiente ecuación: 𝑋! = |#!$#"| %&#' ! $ Ec.1 donde Xi es el valor adimensional de la variable, X1 el valor real de la variable, X0 el valor real en el punto central, k es el número de factores independientes. Un DCC factorial 22 con cuatro puntos factoriales, cuatro puntos axiales (dos por cada factor) y cinco réplicas en el punto central para un total de 13 corridas se utilizó para la optimización de las condiciones necesarias para producir peptaiboles (Cuadro 4). Cuadro 4. Valores utilizados en el diseño central compuesto del experimento. 2.2. Fermentación de modelado Una vez diseñado el experimento, se procedió a realizar la fermentación en matraz bajo las mismas condiciones y periodo de incubación, así como la misma preparación del medio de cultivo descritas en la sección 1.4. En este caso, se varió la concentración del elicitor F. oxysporum y del aminoácido Aib, según los tratamientos determinados en el diseño. La inducción con el aminoácido se realizó el día siete de la fermentación. Se mantuvo la toma de muestras de la sección 1.5. y el análisis por espectrometría de masas en la sección 1.5.3. 2.3. Ejecución del modelo Una ecuación polinomial de segundo orden (Ec. 2), que incluye todos los términos de interacción se usó para calcular la respuesta predicha. 𝑌 = 𝛽) + ∑ 𝛽!𝑥!* !+, + ∑ 𝛽!!𝑥!&* !+, + ∑ 𝛽!-𝑥!𝑥-* !.- + 𝜀 Ec.2 donde Y es la respuesta predicha, xi y xj las variables de entrada, β0 el intercepto, βi los efectos lineales, βii los efectos cuadráticos, βij la interacción, y ε es el error. Factor - α -1 0 1 α Aib 0.500 0.866 1.750 2.634 3.000 Fusarium 0.500 0.866 1.750 2.634 3.000 La regresión y el análisis gráfico se hizo con el programa Design Expert versión 12 de StatEase®. Los niveles óptimos de las combinaciones se obtuvieron al resolver la ecuación y al analizar los gráficos de contorno por medio del Countour Profiler del programa. El nivel de ajuste del modelo se evaluó por medio de parámetros críticos como la falta de ajuste (P > 0.05), R-cuadrado y la significancia del modelo (P < 0.05). 2.4. Validación del modelo El desempeño predictivo del modelo se determinó con diez experimentos adicionales, utilizando niveles intermedios de los factores dentro del rango utilizado para construir el modelo e incluyendo el valor óptimo (Cuadro 7). Se utilizaron las mismas condiciones de fermentación descritas en la sección 1.4. y la toma y análisis de muestra de las secciones 1.5. y 1.5.3. Los índices de validación se calcularon de acuerdo con Baranyi et al para calcular el nivel de certeza (Ec. 3) y el factor bias (Ec. 4) del modelo (Baranyi et al., 1999). Se utilizaron las siguientes ecuaciones: 𝑁𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑟𝑡𝑒𝑧𝑎 5𝐴/7 = 10 ∑ 1 %&'()*+,-./'&01(,1 2 Ec.3 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑏𝑖𝑎𝑠 5𝐵/7 = 10 ∑ %&'()*+,-./'&01(, 2 Ec.4 3. Secuenciación de péptidos Las muestras de peptaiboles obtenidas en la fermentación para el modelado se purificaron con la metodología explicada en la sección 1.5.3. La muestra fue inyectada directamente a la fuente del electrospray con una jeringa Hamilton (Touati et al., 2018). El espectro MS/MS de los peptaiboles se obtuvo mediante el análisis de los espectros de masas de los iones precursores y su fragmentación. Para ello, se utilizaron los parámetros de funcionamiento de ambos equipos establecidos anteriormente en la misma sección. Una vez obtenidos los espectros para cada peptaibol, se procedió a secuenciarlos de forma manual basado en secuencias previamente reportadas. 4. Inhibición de crecimiento bacteriano La muestra para estas pruebas se obtuvo de la fermentación para el modelado. Una alícuota de 50 mL del fermento crudo (sin ningún tratamiento físico o químico) se centrifugó a 3000 rpm durante 20 minutos y se decantó en un tubo Falcon de 50 mL. El fermento se neutralizó (pH 7) con una solución de NaOH (0.1 M), se filtró (0.20 µm) y se colocó en una botella estéril de 100 mL. La botella se mantuvo en refrigeración a 4°C hasta su uso. El efecto bacteriostático del fermento se evaluó sobre una serie de bacterias de origen alimentario, que incluyen: - Una cepa genérica (no patógena) de referencia Escherichia coli ATCC 25922. - Dos cepas de Listeria innocua (3.1 y 4.1), ambas aisladas de embutidos tipo salchichón que presentan resistencia aumentada al cloro. - Una cepa de Pseudomonas fluorescens proveniente de la bacterioteca de la Facultad de Microbiología, posiblemente aislada de carnes, no resistente a aditivos en productos cárnicos, y causante de deterioro importante en este tipo de alimentos. - Una cepa ácido-láctica de Lactobacillus paracasei G714. Esta se incluyó con el fin de evaluar la acción de los peptaiboles contra bacterias que podrían deteriorar un alimento. Todas las cepas pertenecen a la colección del Laboratorio de Investigación y Entrenamiento en Microbiología de Alimentos (LIMA) del Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET). Cada cepa se inoculó en una placa de 90 mm con agar tripticasa soya (ATS) que se incubó durante 48 h a 37 °C. De cada aislamiento se tomó una colonia y se suspendió con un hisopo estéril en un tubo de ensayo con 5 mL de agua peptonada estéril hasta una concentración equivalente a un estándar de MacFarlan de 0.5. Este se midió en el espectrofotómetro a 600nm, para obtener una densidad óptica de 0.7- 1.0. La prueba se realizó en placas de 96 pocillos con 150µL de volumen final en cada uno. Cada bacteria (25 µL) se inoculó en 75 µL de caldo tripticasa soya (CTS) con 50 µL de agua peptonada como control positivo del crecimiento, y en 75 µL de CTS con 50 µL del fermento como tratamiento. Los controles negativos correspondieron a (1) 75 µL de agua peptonada con 75 µL de CTS (control de esterilidad), y (2) 25 µL de agua peptonada con 75 µL de CTS y 50 µL de fermento (blanco de reactivos). La placa se incubó a 35 °C por 24 h en condiciones de alta humedad. En todos los ensayos correspondientes a la cepa ácido-láctica se sustituyó el CTS y el ATS por el medio y el agar de Man, Rogosa y Sharpe (MRS), respectivamente. 4.1. Análisis de datos La curva de crecimiento de estas bacterias se determinó por medición de la absorbancia a 600 nm (OD600) durante 24 h cada 10 minutos. Con estos datos, se determinó el valor de OD600 máximo y la tasa máxima de crecimiento para cada bacteria tanto en el ensayo control como en el tratamiento. La tasa de crecimiento entre cada hora se calculó para cada bacteria. Las tasas de crecimiento de cada hora y los valores de OD600 de cada 10 minutos se evaluaron mediante una prueba de t-student pareado, para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas entre cada tratamiento y su control bacteriano respectivo. A partir de estos datos, se determinó si hay un efecto inhibitorio o bacteriostático del crecimiento de cada bacteria al estar expuesta al fermento. Resultados y discusión 1. Optimización de la producción de peptaiboles de T. asperellum Los ensayos de optimización en matraz se realizaron con la finalidad de determinar cuáles de los aditivos evaluados tienen un efecto significativo sobre el aumento en la producción de peptaiboles con la fermentación de T. asperellum. Para ello, tres grupos de aditivos fueron considerados como influyentes sobre la producción de los péptidos: fuente de carbono, aminoácidos y elicitores fúngicos. 1.1. La fuente de carbono influye en la generación de peptaiboles La fuente de carbono se consideró como uno de los factores que influyen en la producción de estos péptidos. Los azúcares glucosa y sacarosa fueron evaluados como fuentes de carbono. La adición de sacarosa al medio de cultivo incrementó de manera significativa (P = 0.003) la producción de peptaiboles en la fermentación respecto a la adición de glucosa, como se muestra en la Figura 4. La sacarosa es un disacárido compuesto por una molécula de glucosa más una molécula de fructosa, por lo que requiere de una hidrólisis por una invertasa antes de que la glucosa ingrese a la vía de la glucólisis (Nelson & Cox, 2021). La adición de sacarosa como fuente de carbono aumentó significativamente la producción de peptaiboles, mientras que la producción de biomasa es reducida (Figura 4). El crecimiento del hongo parece haber disminuido debido a que la cantidad de glucosa en el medio de cultivo para el metabolismo primario, al ser parte de la sacarosa, se limitó a la mitad en comparación con la adición de glucosa pura. Caso contrario, la adición de glucosa al medio de cultivo ocasionó un incremento en el crecimiento del hongo, sin embargo, conllevó a la producción reducida de peptaiboles (Figura 4). Figura 4. Producción de peptaiboles (eje izquierdo, barras) y de biomasa (eje derecho, líneas) de T. asperellum según la fuente de carbono adicionada al medio de cultivo. Los valores de intensidad en el eje izquierdo son relativos a la producción de peptaiboles. Los microorganismos consumen la fuente de carbono para generar biomasa y cumplir con sus funciones básicas de mantenimiento. La glucosa como fuente de carbono es preferida por la mayoría de microorganismos ya que no requiere de otros procesos catabólicos para entrar a la vía de la glucólisis (Zeilinger & Atanasova, 2020). La adquisición de glucosa es facilitada por transportadores de este azúcar que también pueden actuar como sensores en la vía de señalización de la glucosa (Zhou et al., 2019). Las altas concentraciones de glucosa extracelulares actúan como una señal hacia la célula la cual indica que las condiciones externas son favorables para el crecimiento y la reproducción celular, propios de la fase exponencial de crecimiento. No obstante, esta señalización reprime la expresión de algunos genes relacionados con el metabolismo secundario del microorganismo involucrados con su sobrevivencia ante condiciones desfavorables, como las que se presentan durante la fase estacionaria (Nelson & Cox, 2021). La disminución en esta productividad del metabolito podría explicarse por la presencia de homólogos de sensores de glucosa y reguladores transcripcionales que regulan negativamente los genes que codifican para NRPS cuando se saturan de glucosa. En 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 0.0E+00 1.0E+08 2.0E+08 3.0E+08 4.0E+08 5.0E+08 6.0E+08 7.0E+08 8.0E+08 2 5 7 9 12 14 16 19 21 B io m as a (g /L ) In te ns id ad (c ps ) Tiempo (días) Sacarosa Glucosa T. longibrachiatum SMF2, el regulador transcripcional TlSTP1 se encarga de la regulación negativa de genes que codifican para NRPS y de la regulación positiva de transportadores de hexosas. Este regulador posee un dominio conservado de transportador de glucosa con aparente función como sensor de este monosacárido. La deleción del gen que codifica para esta proteína ocasionó la disminución del crecimiento vegetativo del hongo relacionado con una deficiencia en la captura de glucosa por un cambio en la expresión de 20 transportadores de glucosa. Sin embargo, la producción de peptaiboles aumentó e inició dos días antes, lo cual se relaciona al aumento en la expresión de las NRPS codificadas por los genes tlx1 y tlx2 (Zhou et al., 2019). Análisis filogenéticos han demostrado la presencia de homólogos de TlSTP1 en especies productoras de peptaiboles con una alta identidad en las secuencias del 87-96%. Por ejemplo, en T. asperellum se encontró que la proteína putativa XP_024760452.1 es homóloga a este regulador transcripcional con una alta identidad, por lo que también podría tener funciones como transportador y/o sensor de glucosa (Zhou et al., 2019). Por otro lado, la glucosa se consumió por completo en los matraces donde se adicionó, mientras que el hongo solo utilizó una parte de la sacarosa en los matraces correspondientes. La producción de biomasa está relacionada directamente con la cantidad de azúcar consumido (Walker & White, 2018). Los matraces con mayor crecimiento fueron en los que se consumió en su totalidad la fuente de carbono. No obstante, la producción de biomasa no es una finalidad primaria de la fermentación. La producción reducida de biomasa atribuye una ventaja al bioproceso, ya que facilita su remoción en las etapas de separación y purificación del metabolito. A su vez, el aumento en la producción de peptaiboles podría deberse a la poca concentración de glucosa en el medio que sature los sensores de glucosa y, por ende, se produce una reducción en la regulación negativa de los genes de NRPS (Zhou et al., 2019). Los ensayos con sacarosa evidenciaron un aumento significativo en la producción de peptaiboles respecto a los ensayos con glucosa. Desde el punto de vista comercial, la sacarosa es más ventajosa por su alta disponibilidad y su bajo costo. Además, los procesos de purificación se facilitan y son más eficientes al tener menos biomasa como subproducto del bioproceso. Así, el uso de sacarosa como fuente de carbono se considera una mejor opción para la productividad, el escalamiento y la reducción de costos de esta fermentación. 1.2. Los elicitores fúngicos inducen la producción de peptaiboles Los elicitores fúngicos correspondieron a restos celulares de hongos fitopatógenos contra los cuáles se determinó previamente la actividad antifúngica de los peptaiboles de T. asperellum (Bastos, 2018; Carranza-Rodriguez J, 2019). Los restos se agregaron al medio de cultivo desde el inicio de la fermentación a la misma concentración para cada tratamiento (1 g/L). Para el día nueve de la fermentación, donde hubo mayor intensidad de peptaiboles, todos los elicitores evidenciaron que su adición al medio de cultivo conllevó a un incremento significativo (F = 28.11, P < 0.001) en la producción de estos compuestos, como se muestra en la Figura 5. Los ensayos con Fusarium y Botrytis tienen diferencias significativas respecto al control, mientras Colletotrichum no tiene esta diferencia; por lo tanto, solamente los primeros dos tratamientos sugieren un aumento significativo en la producción de peptaiboles. El uso de restos fúngicos como elicitores se basa en la capacidad de Trichoderma para reconocer la presencia de otros microorganismos circundantes. La liberación constante de enzimas líticas permite la captación, mediante sensores de membrana, de moléculas como oligopéptidos y oligosacáridos derivados de quitina provenientes de la membrana celular de otros microorganismos. Esta identificación activa una serie de cascadas de señales que encienden los factores de transcripción reguladores de los genes relacionados con la liberación de otras enzimas y metabolitos secundarios bioactivos, así como el micoparasitismo que explota al hospedero como fuente de nutrientes (Zeilinger & Atanasova, 2020). La simulación de la presencia de otro microorganismo en el medio de cultivo puede estimular las rutas de activación de los clústeres de genes relacionados con antibiosis y micoparasitismo (Mukherjee et al., 2012a). Figura 5. Producción de peptaiboles (eje izquierdo, barras) y consumo de sacarosa (eje derecho, líneas) de T. asperellum según el elicitor fúngico adicionado al medio de cultivo. Los valores de intensidad en el eje izquierdo son relativos a la producción de peptaiboles. Letras distintas representan diferencias significativas entre agrupaciones. La estrategia de micoparasitismo empleada por T. asperellum es distinta contra cada microorganismo (Mota et al., 2019). Su actividad micoparasítica contra F. oxysporum involucra la penetración directa y el enrollamiento en las hifas del patógeno. Este micoparasitismo también incluye la antibiosis con la liberación de metabolitos bioactivos como los peptaiboles (Stracquadanio et al., 2020). Rahimi et al (2020) encontraron que la interacción directa in vitro de Trichoderma asperellum con otros fitopatógenos intensifica la productividad de peptaiboles. Según análisis realizados mediante PCR de tiempo real, el nivel de ARNm del gen tex1 aumenta al interactuar con Rhizoctonia solani. Además, determinaron que la producción de peptaiboles incrementa significativamente al interaccionar con F. oxysporum (Tamandegani et al., 2020). Los resultados obtenidos concuerdan con esta investigación ya que se obtuvo mayor producción de los péptidos al añadir restos celulares de Fusarium al medio de cultivo respecto al tratamiento control sin elicitor (Figura 5). Los restos 0.00E+00 2.00E+08 4.00E+08 6.00E+08 8.00E+08 1.00E+09 1.20E+09 0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 In te ns id ad (c ps ) Tiempo (días) Control Fusarium Botrytis Colletotrichum A A B B celulares de Botrytis también incidieron en el aume