UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SEDE RODRIGO FACIO TESIS PARA OPTAR POR EL GRADO DE LICENCIATURA EN QUÍMICA “Determinación colorimétrica de hierro en agua potable mediante la utilización de imágenes obtenidas con el teléfono celular” Alejandro Pérez Blanco Año 2023 iii HOJA DE APROBACIÓN Esta tesis fue aceptada por la Comisión de Trabajos Finales de Graduación de la Escuela de Química de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en Química. Dra. Adriana Fernández Campos Directora de Tesis Dr. Eddy Gómez Ramírez Miembro del Tribunal Dr. Javier Quesada Espinoza Miembro del Tribunal Lcdo. Adrián González García Miembro del Tribunal Dr. Juan José Araya Barrantes Director de la Escuela Alejandro Pérez Blanco Sustentante iv v DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS Esta tesis se la dedico a mi hermano César, que ya no se encuentra con nosotros. Deseo agradecer a mis padres la oportunidad que tuve de estudiar una carrera en la Universidad de Costa Rica. También, a mis hermanos que en más de una ocasión han mostrado su apoyo. Asimismo, quiero agradecer a la Dra. Adriana Fernández Campos, quien me presentó la idea para este trabajo de investigación. Por último, agradecer a todas aquellas personas cuya colaboración hizo posible finalizar esta tesis. . vi vii ÍNDICE GENERAL HOJA DE APROBACIÓN ...................................................................................... iii DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS ............................................................... v ÍNDICE GENERAL ............................................................................................... vii INDICE DE FIGURAS ............................................................................................ ix INDICE DE CUADROS ........................................................................................ xiii INDICE DE ABREVIATURAS ............................................................................... xv RESUMEN .......................................................................................................... xvii CAPÍTULO I ............................................................................................................ 1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1 ANTECEDENTES ................................................................................................... 2 1.1. A cerca de la colorimetría de imágenes digitales y el teléfono celular .......... 2 1.2. Situación en Costa Rica ............................................................................... 8 JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 9 OBJETIVOS ............................................................................................................ 9 CAPÍTULO II ......................................................................................................... 11 MARCO TEÓRICO ............................................................................................... 11 2.1. Agua potable y el hierro .............................................................................. 11 2.2. Conceptos básicos de colorimetría ............................................................. 16 2.3. Utilización de teléfono celular en análisis químico ...................................... 22 2.4. Colorimetría mediante análisis de imágenes digitales ................................ 24 CAPÍTULO III ........................................................................................................ 38 METODOLOGÍA ................................................................................................... 38 viii 3.1. Materiales generales, equipos y reactivos .................................................. 38 3.2. Procedimientos generales .......................................................................... 44 3.3. Tratamiento de datos .................................................................................. 56 CAPÍTULO IV ....................................................................................................... 60 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................. 60 4.1. Fabricación y verificación del dispositivo para el control de iluminación ...... 60 4.2. Optimización de las condiciones de operación del dispositivo MDF 2.1 ..... 89 4.3. Validación del método propuesto ............................................................... 94 CAPÍTULO V ...................................................................................................... 103 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................... 103 REFERENCIAS .................................................................................................. 105 ANEXOS ............................................................................................................. 115 ix INDICE DE FIGURAS Figura 1. Espectro de radiación electromagnética .............................................. 17 Figura 2. Círculo cromático .................................................................................. 17 Figura 3. Anatomía del ojo humano, se indica la localización de los batones y conos .............................................................................................................................. 19 Figura 4. Absorción de la radiación ...................................................................... 21 Figura 5. Representación del espacio de color RGB ............................................ 25 Figura 6. Espacio de color CMY/CMYK ............................................................... 27 Figura 7. Espacios de color HSB (izquierda) y HSL (derecha) ............................. 28 Figura 8. Espacio de color CIE XYZ ..................................................................... 29 Figura 9. Espacio de color CIE L*a*b* .................................................................. 30 Figura 10. Estructura de un sensor CMOS de una cámara, con filtro RGB ........ 31 Figura 11. Mosaico de Bayer ............................................................................... 32 Figura 12. Interpolación de color de una imagen en formato RAW ...................... 32 Figura 13. Distribución de potencias espectrales de los iluminantes más comunes del CII .................................................................................................................... 34 Figura 14. Relación entre temperatura de color(K) y su correspondiente tono de blanco ................................................................................................................... 35 Figura 15. Ejemplificación de las posiciones recta e invertida del teléfono celular Samsung A51 ........................................................................................................ 47 Figura 16. Resumen del proceso de verificación de los prototipos hechos en cartón de presentación ..................................................................................................... 51 Figura 17. Caja de luz utilizada en la determinación de Fe(III) en biodiesel mediante el uso de un teléfono celular ................................................................................. 61 x Figura 18. Primer prototipo del dispositivo diseñado para controlar la iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono celular LG K4 ...... 62 Figura 19. Primeros prototipos del dispositivo diseñado para controlar la iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51 ...... 65 Figura 20. Interior de los prototipos 1.1.1 y 2.1.1 del dispositivo diseñado para controlar la iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51 ........................................................................................................ 65 Figura 21. Interior de los prototipos 3.1.1 y 4.1.1 del dispositivo diseñado para controlar la iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51 ........................................................................................................ 66 Figura 22. Curva de calibración obtenida durante la verificación del prototipo 1.1.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación. Señal normalizada; rango de concentración = ( (220 ± 6) - (1098 ± 6) ) mg·L-1. ............. 68 Figura 23. Curva de calibración obtenida durante la verificación del prototipo 1.1.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación. Conversión logarítmica; rango de concentración = ( (220 ± 6) - (1098 ± 6) ) mg·L-1 ............... 68 Figura 24. Variación en los valores de la pendiente y coeficiente de determinación para los prototipos iniciales del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación. Valores del canal B normalizados; rango de concentración = ( (220 ± 6) - (1098 ± 6) ) mg·L-1 ............................................................................. 69 Figura 25. Variación en los valores de la pendiente y coeficiente de determinación de los prototipos iniciales del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación. Valores del canal B convertidos logarítmicamente; rango de concentración = ( (220 ± 6) - (1098 ± 6) ) mg·L-1 .................................................. 70 Figura 26. Espectro de absorción molecular obtenido para una disolución de colorante naranja utilizada durante la fase de verificación de los prototipos iniciales. Concentración colorante = (549 ± 6) mg·L-1 .......................................................... 71 xi Figura 27. Exterior del prototipo 3.2.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51 .......................................................................................... 72 Figura 28. Complemento del prototipo 4.1.1 para aumentar en 2.5 cm la distancia entre la celda de medición y la cámara del teléfono Samsung A51 ...................... 73 Figura 29. Curva de calibración obtenida para la verificación del prototipo 3.2.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación; Resta de coordenadas Cie L*a*b*. Rango de concentración = ( (221 ± 6) – (1105 ± 7) ) mg·L-1 .................................................................................................................... 74 Figura 30. Configuración básica de cuatro fuentes de luz utilizadas en el dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51. Fuentes representadas: 36, 48 y 60 luces Led y luces Led extraídas de televisores viejos .................................. 77 Figura 31. Configuración básica de cuatro fuentes de luz utilizadas en el dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51. Fuentes representadas: paneles Led de 3 y 6 W y módulos Led interconectados ...................................... 78 Figura 32. Comparación entre dos patrones de colorante naranja y Fe (II)- ortofenantrolina; valores similares de B (extraídos con Color Grab). Concentración colorante = (1109 ± 7) mg·L-1 y Concentración Fe = (1.712 ± 0.008) mg·L-1 .............. 80 Figura 33. Variación en los valores de la pendiente y coeficiente de determinación, para el prototipo 3.2.1, al variar la intensidad del brillo en la aplicación Color Grab. Rango de concentración = ( (0.152 ± 0.006) - 2.03 ± 0.02) ) mg·L-1; Sistema Fe (II)- ortofenantrolina ..................................................................................................... 82 Figura 34. Prototipo MDF 1.0 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51 ........................................................................................................ 85 xii Figura 35. Prototipo MDF 2.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51. Vista frontal y lateral ..................................................................... 87 Figura 36. Prototipo MDF 2.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51. Vista interior y del lado de la puerta .............................................. 88 Figura 37. Curva de calibración obtenida para verificar el funcionamiento del prototipo final del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación. Señales normalizadas; rango de concentración = ( (0.403 ± 0.003) – (1.611 ± 0.008) ) mg·L-1 ........................................................................................ 89 Figura 38. Ejemplo de la herramienta de blanco de referencia, de la aplicación Color Grab, en acción. Imagen tomada de: https://play.google.com .............................. 90 Figura 39. Comparación entre las imágenes de la celda de medición rotada y no rotada, prototipo MDF 2.1, la celda contiene agua destilada ................................ 91 Figura 40. Variación en los valores de la pendiente y coeficiente de determinación al cambiar la intensidad de brillo; Prototipo MDF 2.1 ............................................ 94 Figura 41. Curva de calibración obtenida para definir el rango lineal y de trabajo de la determinación de hierro (II) en agua potable mediante el uso del teléfono Samsung A51. Rango de concentración = ( (0.612 ± 0.007) – (10.20 ± 0.03) ) mg·L-1 .................................................................................................................... 95 Figura 42. Curva de calibración obtenida durante la determinación de hierro (II) en agua potable mediante el uso del teléfono Samsung A51, rango de trabajo = ( (0.612 ± 0.007) – (2.55 ± 0.02) ) mg·L-1 ........................................................................... 96 xiii INDICE DE CUADROS Cuadro 1. Características del teléfono celular Samsung A51 .............................. 39 Cuadro 2. Preparación de las disoluciones incógnita utilizadas para validar la determinación de hierro en agua potable mediante el uso del teléfono Samsung A51 .............................................................................................................................. 45 Cuadro 3. Características de los cuatro prototipos originales del dispositivo diseñado controlar la iluminación durante la obtención de coordenadas de color con el teléfono Samsung A51. ..................................................................................... 47 Cuadro 4. Comparación de los valores de la pendiente y coeficiente de determinación obtenidos para el prototipo 3.2.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación; Canal B normalizado y resta señal b* de Cie L*a*b*. Rango de concentración de colorante = ( (221 ± 6) – (1105 ± 7) ) mg·L-1 .................................................................................................................... 75 Cuadro 5. Variación en la pendiente y el coeficiente de determinación al cambiar la fuente de luz acoplada al prototipo 3.2.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación. Rango de concentración de colorante = ( (197 ± 6) - (986 ± 6) ) mg·L-1 .................................................................................................. 79 Cuadro 6. Valores experimentales de pendiente y coeficiente de determinación obtenidos al analizar una curva de calibración de hierro (II) con el prototipo 3.2.1 del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación. Rango de concentración = ( (0.152 ± 0.006) - 2.03 ± 0.02) ) mg·L-1; tres conversiones de señal .............................................................................................................................. 81 Cuadro 7. Valores experimentales de pendiente y coeficiente de determinación obtenidos al variar la fuente de luz acoplada al prototipo 3.2.1. Rango de concentración = ( (0.152 ± 0.006) - 2.03 ± 0.02) ) mg·L-1; sistema Fe (II) - ortofenantrolina ..................................................................................................... 83 xiv Cuadro 8. Valores experimentales de pendiente y coeficiente de determinación obtenidos al variar la fuente de luz acoplada al dispositivo MDF 2.1 .................... 92 Cuadro 9. Resultados parciales del proceso de validación de la determinación de hierro (II) en agua potable mediante el uso del teléfono Samsung A51 ................ 97 Cuadro 10. Sesgo obtenido durante la validación de la determinación de hierro (II) en agua potable mediante el uso del teléfono Samsung A51 ............................... 99 Cuadro 11. Porcentaje de recuperación obtenido durante la validación de la determinación de hierro (II) en agua potable mediante el uso del teléfono Samsung A51 ...................................................................................................................... 100 xv INDICE DE ABREVIATURAS Abreviatura Significado 3D Tres dimensiones A y A Instituto Costarricense de Acueductos y Alcantarillados A/D analógico/ digital ASADAs Asociaciones administradoras de los Sistemas de Acueductos y Alcantarillados comunales BR Blanco de referencia CIE Commission internationale de l'éclairage CII Comisión Internacional en Iluminación CMO Complementary metal oxide semiconductor CMY Cian, Magenta, Yellow CMYK Cian, Magenta, Yellow, Key GB Gigabyte HSI Hue, Saturation, Intensity HSV Hue, Saturation, Value JPEG Joint Photographic Experts Group JPG JPEG LC Límite de detección LD Límite de cuantificación LED Light-emitting diode MDF Medium-density fiberboard OLED Organic light-emitting diode µPAD Microfluidic paper-based analytical devices pH Potencial de hidrógeno RGB Red, Green, Blue USB Universal Serial Bus WLED White light-emitting diode xvi xvii RESUMEN La colorimetría de imágenes digitales se basa en la extracción de coordenadas de color de imágenes captadas con dispositivos como: escáneres, cámaras digitales y teléfonos celulares. El hierro es uno de los elementos más abundantes en el planeta Tierra y el control de los niveles presentes en agua potable se debe, principalmente, a un aspecto estético. El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar una metodología novedosa para la cuantificación de hierro en agua potable mediante la utilización del teléfono celular. Esto se logró mediante la fabricación y verificación de un dispositivo para controlar las condiciones de iluminación durante la obtención de coordenadas de color de disoluciones de Fe (II)-ortofenantrolina con el teléfono celular Samsung A51 y la aplicación Color Grab. El diseño final del dispositivo se hizo a base de madera MDF de 10 mm y su desempeño se valoró con la pendiente y coeficiente de determinación de curvas de calibración. Adicionalmente, se usó los valores del canal B (sistema RGB) normalizados como señales analíticas. Las condiciones óptimas de operación fueron: uso de blanco de referencia, celda rotada, fuente de 60 luces Led, distancia cámara-celda de 10.6 cm, segundo objetivo y brillo + 0.1. Durante la validación de la metodología, la sensibilidad y coeficiente de determinación promedio fueron: 0.183 L·mg-1 y 0.9998, respectivamente. Los límites de detección y de cuantificación fueron, según Eurachem, (0.04 ± 0.02) mg·L-1 y (0.013 ± 0.02) mg·L-1, en el orden dado. Aplicando lo establecido por Miller y Miller, se obtuvo: LD = (0.04 ± 0.02) mg·L-1 y LC = (0.012 ± 0.02) mg·L-1. De forma similar, se determinó la precisión intradía y interdía, cuyos valores fueron: 0.055 mg·L-1 (1.1 %) y 0.058 mg·L-1 (1.2 %), respectivamente. Se calculó el sesgo del método, tomando el análisis espectrofotométrico como estándar. Se obtuvo para las muestras artificiales: A, B y C, respectivamente, un sesgo de 0.19 %, 0.61 % y 1.19 %. Se estableció, mediante una prueba t de student xviii de comparación de medias, que no hubo diferencias significativas entre las medias obtenidas con ambas metodologías. Además, para la muestra A, se obtuvo una recuperación entre 99.8 y 100.8 %, para los tres niveles evaluados. Para la muestra C, la recuperación estuvo entre 97.8 y 100.9 %. Durante el estudio de interferentes, se evaluó el efecto de agregar 10 y 50 veces la concentración del analito de: CO32-, SO42-, Cl -, Zn2+ y Mg2+, a dos niveles de concentración. Solo en las disoluciones a las cuales se les agregó zinc hubo un efecto en la señal trasformada. Por otro lado, se determinó, por triplicado, el contenido de hierro en tres muestras de agua potable recolectadas en la Clínica Dr. Solón Nuñez Frutos y una tomada en el Laboratorio 0219 de la Escuela de Química de la Universidad de Costa Rica. En la segunda ubicación se logró detectar el analito mas no cuantificarlo, en el resto no se detectó. En conclusión, se logró validar exitosamente la metodología propuesta. Palabras clave: Colorimetría, digitales, hierro, validación, agua, RGB, teléfono celular. 1 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN Desde su creación en 1973, el teléfono celular ha experimentado muchas transformaciones, tanto física como funcionalmente. Ha pasado de ser una herramienta para comunicarse, ya sea mediante mensajes de texto o por llamadas telefónicas, a convertirse en una computadora de bolsillo. Dicha evolución ha sido tal, que hoy en día es posible mediante estos dispositivos extraer coordenadas de color de imágenes captadas con la cámara que muchos modelos tienen incorporada. El hierro es uno de los elementos más abundantes en el planeta Tierra y es importante tanto a nivel biológico como industrial. El control de los niveles de este elemento en cuerpos acuosos se debe, principalmente, a razones estéticas. La cuantificación de hierro en agua potable se lleva a cabo por métodos colorimétricos o espectrometría de absorción atómica. No obstante, en los últimos años, la colorimetría de imágenes digitales se ha postulado como otra opción para la determinación de este analito. Es así como, para el presente trabajo, se busca explorar el uso de la colorimetría de imágenes digitales para cuantificar hierro en agua potable y, en última instancia, desarrollar una metodología novedosa para determinar este analito mediante la utilización del teléfono celular. Entonces, esta tesis representa una crónica del proceso de creación de un dispositivo funcional con el cual fue posible cuantificar hierro utilizando un teléfono inteligente. Se incluirá la información y resultados más relevantes a lo largo de cinco capítulos. Primero, se realizará una reseña de algunas investigaciones llevadas a cabo en el campo de la colorimetría de imágenes digitales. Adicionalmente, se justificará la escogencia de este tema y se enlistará los objetivos asociados a la presente investigación. El segundo capítulo se centrará en los conceptos teóricos 2 necesarios para el adecuado entendimiento de la temática tratada. En el Capítulo III se detallará la metodología realizada para conseguir las metas propuestas. Luego, serán presentados y discutidos los resultados más relevantes. Por último, se formularán las conclusiones y recomendaciones con base en todo lo experimentado durante la ejecución de este trabajo. ANTECEDENTES Es esta sección se recabó información sobre algunos estudios realizados en el área de colorimetría de imágenes digitales, usando el teléfono celular para registrar la señal analítica. 1.1. A cerca de la colorimetría de imágenes digitales y el teléfono celular El análisis de imágenes es la extracción de información significativa a partir de documentos digitales, esto mediante diferentes técnicas de procesamiento. Se ha utilizado este tipo de análisis para diferentes propósitos y las imágenes se pueden obtener mediante dispositivos como cámaras digitales, escáneres y celulares (Sorouraddin et al., 2015). El desarrollo de nuevos procedimientos basados en el análisis de imágenes ha atraído mucha atención en la última década debido al bajo costo, simplicidad y velocidad de este tipo de análisis (Coutinho et al., 2017). En el caso de los teléfonos móviles, su constante mejora tecnológica ha permitido el desarrollo de métodos colorimétricos, monitoreo, electrocardiógrafos, entre otros. Se debe agregar que los celulares son relativamente fáciles de manejar, ya que no se requiere de mayor entrenamiento para su operación (Hernández et al., 2017). En las investigaciones enfocadas en la colorimetría de imágenes digitales se recurre a aplicaciones o software que procese las imágenes y extraiga las coordenadas de color de estas. Existen diferentes sistemas para expresarlas, tales como: RGB (Red, Green y Blue), Cie L*a*b*, CMYK (cian, magenta, amarillo y negro), entre otros. Estos valores son empleados como señales, para construir curvas de calibración y así cuantificar el analito de interés. Por lo general, cuando 3 se utiliza coordenadas de color se escoge un solo canal para trabajar, logrando una mayor sensibilidad y mejores resultados (Grudpan et al., 2015). Las investigaciones existentes incluyen, entre otras, determinaciones analíticas de: metales, aniones, herbicidas y pesticidas, antibióticos, indicadores bioquímicos y productos naturales. A continuación, se ahondará en cada una de las categorías mencionadas. 1.1.1. Metales En esta línea de trabajo ha sido reportada una cantidad importante de estudios. Uno de ellos es la cuantificación de Hg (II) mediante el uso de membranas e imágenes digitales obtenidas con un teléfono celular convencional. Esta metodología permitió determinar la presencia de Hg (II) a un nivel milimolar- nanomolar en las membranas después de haberlas sumergido en una disolución que contenía el analito (el Kaoutit et al., 2013). En otro estudio, se llevaron a cabo análisis colorimétricos de: cobalto, níquel, cobre, plata y hierro. En el caso del hierro, se usó la ortofenantrolina como agente cromogénico. Los autores desarrollaron su propia aplicación, con la cual fueron analizadas las imágenes de pequeñas placas de metacrilato que contenían diferentes reactivos para la generación de color. El método mostró linealidad en el rango de 0.01-3.0 mg·L-1 y buena selectividad hacia los analitos examinados (Urazov et al., 2018). También, se ha reportado la cuantificación de calcio a niveles traza en agua y alimentos, esto se alcanzó combinando una extracción líquido-líquido y la medición de color con un teléfono celular. Se trabajó con la aplicación Color Grab para monitorear la formación de un complejo rojo entre el glioxal-bis (2-hidroxianilo) y el calcio, en medio básico. Los autores obtuvieron un rango lineal de 0.06-1.5 mg·L-1. Los límites de detección y cuantificación fueron 0.017 y 0.056 mg·L-1, respectivamente (Peng et al., 2019). 4 1.1.2. Aniones El primer ejemplo en esta categoría es la determinación de sulfitos en vino. Esto por medio de un dispositivo microfluídico basado en un aplicador de algodón. En el proceso se convirtió el sulfito en dióxido de azufre por acidificación, este a su vez redujo Fe (III) a Fe (II), el cual formó un complejo anaranjado-rojizo con ortofenantrolina. Estas dos últimas reacciones ocurrieron en el aplicador que estaba encima de un vial que contenía la disolución. Posteriormente, se colocó el aplicador en un dispositivo que estaba acoplado al teléfono celular y fueron obtenidas imágenes (con su propia fuente Led), que fueron posteriormente analizadas con la aplicación “Colorimetric sensor”. Fueron obtenidos dos rangos lineales: 0.30-2.25 mg·L-1 (como SO2), con R2 = 0.9931 y 2.25-18.75 mg·L-1, con R2 = 0.9956. El límite de detección fue de 100 µg·L-1. No hubo diferencias significativas con respecto al método estándar (Khamkhajorn et al., 2022). También, se pudo estimar la cantidad de fósforo (como fosfato) en suelo y agua. El principio de detección se apoyó en el método de azul de molibdeno, con ácido ascórbico como agente reductor. Para este estudio se creó un sistema con control de iluminación y un soporte para la celda que contenía la disolución. Se aprovechó la cámara del celular y dos aplicaciones de Android para obtener las coordenadas de color. Fue seleccionado el canal V del espacio HSV para realizar la cuantificación. Se consiguió rangos lineales de 0-1 mg·L-1 y de 1-5 mg·L-1 y límites de detección de 0.01 y de 0.03 mg·L-1, para agua y suelo respectivamente. El sesgo experimental fue menor a 1 % y la precisión menor a 2% (Das et al., 2022). 1.1.3. Herbicidas y pesticidas Se ha reportado la construcción de un biosensor que contenía un homogeneizado bacteriano único con alta actividad de lipasa que fue utilizado en un ensayo colorimétrico con un teléfono inteligente como detector. El sensor se construyó como una herramienta basada en inhibidores de lipasa, se aprovechó que el paraoxón es un inhibidor de la actividad de la lipasa y se eligió el indoxilacetato como sustrato para la generación de color. Se trabajó con los canales R, G y B. Se 5 logró un límite de detección de 3.72 x 10-8 mol·L-1 y una muestra de 5 µL fue suficiente para la medición (Pohanka et al., 2018). Asimismo, se ha diseñado una plataforma de análisis que constaba de una placa con una única hilera de pocillos y se hizo una calibración (canales R y B) con disoluciones de azul de metileno y rodamina B. En este estudio se utilizó la aplicación Yamera para obtener las imágenes y se creó un programa en Matlab para procesarlas. El ácido 2,4-diclorofenoxiacetico fue detectado en un rango de 1 a 80 µg·L-1 en muestras enriquecidas de agua de tubo, plasma y suero humano. Además, el porcentaje de recuperación fue de 93.7-106.9 % (Wang et al., 2017). Otro caso es la determinación cualitativa de residuos de metil paratión. Esto a través de códigos de barras, que podían ser leídos con el teléfono celular. Con la acetilcolinesterasa se hidrolizó el yoduro de acetiltiocolina, obteniéndose la forma desprotonada de tionitrobenzoato (amarillo). La aplicación móvil escogida para la lectura del canal Y del espacio de color CMYK fue QuickMark. Con este método se logró un límite de cuantificación 0.2 μg·L-1 para el metil paratión (Guo et al., 2015). 1.1.4. Antibióticos En cuanto al análisis de antibióticos utilizando el teléfono celular, se ha establecido la concentración de tetraciclina en leche de vaca, luego de una extracción de fase sólida. Los autores crearon una aplicación para iPhone llamada ColorConc, la cual recurre a un algoritmo de coincidencia de imágenes para realizar la cuantificación. Se trabajó con diferentes espacios de color: RGB, HSV y escala de grises. Se alcanzó un rango lineal de 0.5-10 mg·L-1 y límites de detección y cuantificación de 0.5 y de 1.5 mg·L-1, respectivamente (Masawat et al., 2015). En otra publicación, se determinó el nivel de sulfonamidas en formulaciones farmacéuticas y veterinarias. Para conseguir este propósito fue desarrollado un programa especial, pero primero el sistema fue optimizado. En este caso, se aprovechó el canal B del espacio RGB y se obtuvo: un rango de trabajo de 0.5-2.5 mg·L-1, R2= 0.996, un límite de detección de 0.11 mg·L-1, recuperaciones entre 98.7 y 102 % y una precisión menor o igual al 7 % (Ait Errayess et al., 2018). 6 Otro ejemplo es la determinación de carbamazepina, ciprofloxacina y norfloxacina en formulaciones farmacéuticas. Se tomó como base la realización de pruebas en placas (“spot test”) y se ejerció control de las condiciones de iluminación con una caja de luz. Es importante mencionar que estas estructuras fueron construidas en una impresora 3D. Se utilizó el programa Image J para extraer las coordenadas RGB de las fotografías generadas con el celular. En este estudio se alcanzó límites de detección de: 3.0, 1.0 y 1.0 mg·L-1 y límites de cuantificación de: 5.0, 3.0 y 3.0 mg·L-1, para la carbamazepina, ciprofloxacina y norfloxacina, respectivamente. Otro punto a favor para este método fue que el tiempo total invertido es menor a un minuto. Además, el volumen necesario de muestra fue 8 µl y tuvo un costo por prueba de 2 USD (Lamarca & Lima Gomes, 2020). 1.1.5. Indicadores bioquímicos En este tema, destaca el aprovechamiento de los sensores de imagen incorporados en las cámaras de los teléfonos inteligentes para el monitoreo de los niveles de glucosa en sangre total de ratones. Esto gracias a la creación de un chip de tereftalato de polietileno con un agente generador de color, el cual estaba inmovilizado en nanopartículas de sílice aminofuncionalizado. En este dispositivo se llevó a cabo una reacción enzimática a varias concentraciones de glucosa (110- 586 mg·dL-1). El analito oxidado generaba una coloración verde y el celular se utilizó como un contador de fotones, los cuales disminuyen conforme aumenta la cantidad de glucosa presente (Devadhasan et al., 2015). Otro indicador importante es la fosfatasa alcalina, la cual es una metaloproteína que se encuentra naturalmente en la leche cruda. Está relacionada con la calidad de ésta y permite diferenciar un producto pasteurizado de uno crudo. Por este motivo, fue desarrollado un biosensor a base de papel, para la detección a simple vista de fosfatasa alcalina en leche. Esto fue posible con la inmovilización de un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina en la superficie funcionalizada del papel. La acción enzimática del analito sobre el sustrato cromogénico fosfato de 5-bromo-4- cloro-3-indolilo, generó un precipitado verde-azulado. El canal R (espacio RBG) fue 7 la respuesta analítica seleccionada. De esta manera se obtuvo un rango dinámico de 10-1000 UI·mL-1 y un límite de detección de 0.87 UI·mL-1 (Mahato & Chandra, 2019). También, se ha estudiado el desempeño de la aplicación “Albumin Smart Test” (Android), para medir niveles de albumina en orina. Se aprovechó la reacción entre la albumina y 3',3'',5',5''-tetrabromofenolftaleínato de etilo, en presencia de Triton X- 100, para producir un compuesto de color verde. Se recurrió a tiras reactivas para autocalibrar el sistema, lo que eliminó la necesidad de controlar las condiciones de iluminación. Se captó imágenes de las tiras junto a las muestras que contenían albúmina. Con la metodología propuesta se consiguió un análisis rápido (3 min), con una precisión menor al 2.5 % y una recuperación de 98.7 % (Mathaweesansurn et al., 2017). 1.1.6. Compuestos naturales Se pudo determinar el contenido de ácido ascórbico en jugos naturales de fruta. Esto se logró monitoreando el cambio en la intensidad de coloración del complejo Fe (II)-ortofenantrolina (anaranjado), debido al efecto del compuesto estudiado. Las imágenes tomadas fueron almacenadas en formato JPEG y la región de interés (ROI) fue analizada para extraer las coordenadas RGB, se seleccionó el canal B para trabajar. Se obtuvo límites de detección y cuantificación de 0.005 y de 0.015 mg·L-1, respectivamente. La precisión fue 1.2 %. Además, fueron evaluados jugos de: limón, naranja, uva, marañón, lima, piña, mandarina y mango. Las concentraciones variaron entre 45 y 1825 mg·kg-1. Mediante una prueba t de student, se estableció que no hubo diferencias significativas con respecto al método espectrofotométrico (Porto et al., 2019). Otro ejemplo es la medición de niveles de furfural en destilados de jugo de caña. La importancia de este compuesto radica en que es considerado un contaminante que devalúa la calidad y precio del producto. Para la generación de color se tomó como base la reacción del furfural y la anilina, en medio acido. Fue llevada a cabo en los pocillos de una placa de porcelana (“spot test”) y las imágenes 8 tomadas con el teléfono celular fueron analizadas con el programa libre Image J. Se trabajó con el sistema RGB, fue escogido el canal G como señal analítica. El rango lineal fue de 16.7-100 mg·L-1 (alcohol anhidro; r = 0.998), con límites de detección y cuantificación de 3.4 y 11.5 mg·L-1, respectivamente. Se logró una recuperación de 85.7 - 106 % y un volumen necesario para el análisis muy pequeño (600 µL por prueba) (de Oliveira Krambeck Franco et al., 2017). De manera similar, se analizó el contenido de azúcar total en bebidas no alcohólicas. Esto mediante un dispositivo generado con una impresora 3D, el cual tenía acoplada una cámara USB que estaba conectada directamente a un teléfono inteligente. Se monitoreó la generación de color debida a la reacción de monosacáridos con el reactivo de Benedict. Para el control del dispositivo y procesamiento de las imágenes se usó la aplicación Photometrix UVC y las imágenes fueron evaluadas antes y después de centrifugar. Se recurrió a una calibración de mínimos cuadrados parciales para realizar los cálculos. Se obtuvo: un coeficiente de determinación superior a 0.99 y errores de raíz cuadrada media de calibración y validación cruzada menores a 0.07 y 0.23 mg·L-1, respectivamente. La metodología propuesta presentó una concordancia de 95.3-108.7 % con respecto al método oficial (Schlesner et al., 2022). 1.2. Situación en Costa Rica A nivel internacional, la colorimetría de imágenes digitales ha sido bastante estudiada y que el uso de teléfonos celulares para cuantificar diferentes analitos es muy común. Por el contrario, en Costa Rica esta rama de investigación no ha sido explorada como si se ha hecho fuera de nuestro país. Solo se encontró un trabajo final de graduación de un estudiante del Instituto Tecnológico de Costa Rica. El título de esta tesis es: “ Diseño de un prototipo de dispositivo de iluminación acoplable a una cámara fotográfica para el análisis de manchas de piel mediante procesamiento de imágenes digitales”. Este trabajo describió el proceso de diseño de un dispositivo para controlar la iluminación a la hora de tomar fotografías de manchas de piel y su potencial implementación en el 9 diagnóstico de melanoma. Se evaluó la calidad de la iluminación obtenida e incluso fue creado un algoritmo para el tratamiento de las imágenes y la sustracción de las coordenadas de color. También, se llevó a cabo una comparación contra una base de datos de manchas de piel (Zumbado-Ruiz, 2021). JUSTIFICACIÓN Considerando la gran variedad de literatura relacionada con la colorimetría de imágenes digitales y el uso del teléfono celular, una investigación en esta línea tendría un importante respaldo científico para sustentarse. Se debe recalcar, que en Costa Rica este tema ha sido poco explorado. Por lo que ejecutar un proyecto, orientado en esta línea de estudio, es atractivo y novedoso. Se escogió el sistema Fe (II) - ortofenantrolina, porque es muy conocido, ya que ha sido estudiado de forma exhaustiva. Así como por su metodología fácil de implementar y su alta sensibilidad. Otra ventaja de un método basado en colorimetría de imágenes digitales es que el equipo necesario para ponerlo en práctica es relativamente accesible, comparándolo contra el costo de un espectrofotómetro o un espectrómetro de masas. Considerando lo señalado anteriormente, se plantean los objetivos de la presente investigación, los cuales se detallan en seguida. OBJETIVOS 1.3.1. Objetivo principal Desarrollar una metodología novedosa para la cuantificación de hierro en agua potable mediante la utilización del teléfono celular. 1.3.2. Objetivos secundarios 1. Construir una caja de luz que permita controlar las condiciones de iluminación para obtener imágenes fotográficas de calidad adecuada. 10 2. Obtener coordenadas de color utilizando el teléfono celular, mediante el uso de una aplicación gratuita. 3. Utilizar una aplicación del celular para obtener las coordenadas de color (de preferencia Color Grab) y tomar fotografías para analizarlas con esta misma aplicación. Comparar los resultados obtenidos por ambas metodologías. 4. Optimizar las condiciones con las cuales se obtendrá la respuesta analítica relacionada con el analito de interés. 5. Obtener coordenadas de color de las disoluciones patrón de hierro y muestras de agua potable, posterior al desarrollo de color. 6. Cuantificar hierro en muestras de agua mediante los datos obtenidos con la aplicación escogida. 7. Validar la metodología propuesta, utilizando los parámetros establecidos por EURACHEM. 8. Comparar los resultados obtenidos con la metodología propuesta contra un método estándar. 11 CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO 2.1. Agua potable y el hierro En este apartado serán discutidos aspectos como: definición de agua potable, algunos datos sobre el hierro, la presencia de hierro en cuerpos de agua, determinación cuantitativa de hierro en agua y el análisis espectrofotométrico de hierro. 2.1.1. Definición de agua potable El agua potable se define como toda aquella agua que ha sido tratada para cumplir con los valores recomendables o máximos establecidos de acuerdo con parámetros: estéticos, organolépticos, físicos, químicos, biológicos y microbiológicos y que al ser consumida por la población no causa daño a la salud (A y A, 2016). Aunque, en algunos países se suele usar este concepto para definir el agua que ha sido desinfectada solo con cloro y que proviene de fuentes mejoradas (pública o conexión intradomiciliar). Este tipo de agua podría contener sustancias contaminantes que son un riesgo para la salud (Poder Ejecutivo de Costa Rica, 2015). En Costa Rica, el proceso de potabilización se da gracias a las labores realizadas por el Instituto Costarricense de Acueductos y Alcantarillados (A y A) y las Asociaciones Administradoras de los Sistemas de Acueductos y Alcantarillados comunales (ASADAS). Adicionalmente, el A y A se rige por la Ley general de Aguas, Ley General de Agua Potable, Reglamento para la Calidad del Agua Potable, entre otros. A través del Laboratorio Nacional de Agua, este instituto lleva el control de la calidad del agua potable que es consumida en Costa Rica (A y A, 2016). 12 2.1.2. Datos sobre el hierro El hierro pertenece al grupo de los metales de transición. Es el segundo elemento más abundante en la corteza terrestre y el cuarto a nivel general. En la industria, principalmente, es materia prima en la fabricación de acero, que es utilizado en ingeniería civil y manufactura. Además, es aprovechado en la síntesis de catalizadores. Otro dato importante es que el hierro es un elemento no tóxico y esencial para todas las formas de vida. Un humano en promedio contiene 4 g de hierro en su cuerpo, en su mayoría formando parte de la hemoglobina. Esta se encarga del transporte de oxígeno hacia las células. La necesidad diaria de este elemento es de 10-18 mg (Royal Society of Chemistry, 2022; Ward & Crichton, 2015). 2.1.3. Presencia de hierro en cuerpos de agua El agua actúa como una importante fuente de metales para el organismo. Estos materiales se incorporan a los cuerpos acuosos cuando la lluvia se infiltra en las rocas, disolviendo muy pequeñas cantidades de metales. Otra posible fuente de hierro se debe al descarte de desechos domésticos o de afluentes industriales (Khatri et al., 2017). La presencia de hierro en aguas superficiales se deriva, sobre todo, de la contaminación generada por industrias de acero y hierro, minería y la corrosión. En el caso de los mantos acuíferos, la causa se relaciona al desgaste provocado por este fluido en piedras y minerales. La concentración de hierro en estos cuerpos acuosos varía de 0 a 50 mg·L-1. A nivel nacional e internacional, para agua potable, se ha establecido 0.3 mg·L-1 como límite máximo permitido para este elemento (Chaturvedi & Dave, 2012; Colter & Mahler, 2006). En los cuerpos acuosos, el hierro existe en diferentes formas minerales. Estas se clasifican en 4 categorías básicas: óxidos, silicatos, carbonatos y sulfuros. También, se dividen en: orgánico e inorgánico, tomando como base la naturaleza química del compuesto derivado de hierro que esté presente. La forma inorgánica se encuentra disuelta en aguas subterráneas, esto debido a la baja concentración 13 de oxígeno, lo que previene su precipitación. En su forma orgánica, el hierro forma complejos con especies orgánicas como: ácidos y taninos. Esta se halla en aguas superficiales y subterráneas (Khatri et al., 2017). Con respecto a los efectos sobre la salud de este elemento, su consumo excesivo favorece la aparición de problemas en el proceso de síntesis de la hemoglobina y los glóbulos rojos. En algunas ocasiones, la acumulación de hierro podría derivar en una condición médica llamada hemocromatosis. Los efectos potenciales de esta enfermedad van desde la aparición de cáncer hasta daños en diferentes órganos y tejidos. Por el contrario, una baja ingesta favorece el desarrollo de anemia, que es una condición que afecta de forma directa el adecuado funcionamiento de las células (Royal Society of Chemistry, 2022; Ward & Crichton, 2015). Además, este metal imparte un sabor metálico y un color rojizo, en altas concentraciones. Puede manchar la ropa y otras superficies, así como formar coágulos por la precipitación del hierro en las líneas del acueducto. Y altas concentraciones de este elemento contribuyen en la proliferación de bacterias en tuberías, lo que podría derivar en su bloqueo y/o corrosión (Khatri et al., 2017). Por lo tanto, durante el proceso de potabilización, se debe considerar la remoción del hierro para alcanzar niveles aceptables de este elemento y evitar los problemas asociados a una concentración alta. El método más utilizado para lograr este objetivo es la oxidación-precipitación-filtración. Este tratamiento consiste en oxidar el hierro (con un agente como el hipoclorito de sodio), obteniéndose Fe (OH)3 el cual precipita y posteriormente se elimina mediante una microfiltración (Chaturvedi & Dave, 2012). 2.1.4. Determinación cuantitativa de hierro en aguas Dependiendo de la concentración de hierro que se espere encontrar en una muestra de agua, hay diferentes opciones para determinar los niveles de este metal. Para el agua potable el método de referencia es la espectrometría de absorción atómica. Sin embargo, para realizar esta cuantificación se puede recurrir a varias 14 técnicas: espectrofotometría, potenciometría, voltamperometría, volumetría, entre otras (Ward & Crichton, 2015). En el caso de la espectrometría, los métodos más comunes son los colorimétricos en los cuales se aprovecha la formación de un complejo entre el hierro (II/III) y un agente cromogénico como: ferrozina u ortofenantrolina (Ward & Crichton, 2015). También, dentro de este grupo se encuentra la determinación por espectrometría por absorción atómica, en la cual se mide la cantidad de radiación absorbida por átomos en estado elemental, formados en una llama u horno de grafito (Christian, 2009; Holler et al., 2015). En las valoraciones potenciométricas se mide el potencial de electrodo indicador contra un electrodo de referencia adecuado y se grafica la variación en el potencial contra el volumen de titulante. Para el análisis de hierro se usa ZnCl2 como agente reductor (convierte Fe(III) a Fe(II) ), electrodo de platino y dicromato de potasio como titulante. En el caso de la volumetría redox, se trabaja de forma similar a la determinación potenciométrica, pero se utiliza un indicador visual para definir el punto final de la valoración, para este analito se usa difenilamina-4-sulfonato de bario (Christian, 2009) Por otro lado, la voltamperometría es básicamente una electrolisis a microescala. Es una técnica de corriente-voltaje, en la cual el potencial de un microelectrodo de trabajo se varía (barre lentamente) y se registra la corriente resultante como una función del voltaje aplicado(voltamperograma). Entonces, la presencia de una especie reducible u oxidable influye en la cantidad de corriente utilizada en la electrolisis, lo que se relaciona con la concentración del analito en estudio. Un ejemplo de este tipo de metodología es la determinación voltamperométrica del complejo de trietanolamina y hierro en el electrodo de gota de bismuto. Con esta aplicación se puede alcanzar un límite de detección de 0.005 mg·L-1 y trabajar en concentraciones de 10-500 µg·L-1 (Metrohm, 2020). 15 2.1.5. Análisis espectrofotométrico de hierro Este es el procedimiento estándar preferido para medir hierro en agua potable y superficial, así como en aguas de desecho domésticas e industriales, en concentraciones de 0.5 a 5 mg·L-1 (Kafle, 2020). En este método el analito experimenta una reducción por la acción de una disolución de hidroxilamina (por lo general de 10 % m/m), de esta forma los iones de Fe(II) forman un complejo estable anaranjado con 1,10-fenantrolina. El pH se debe mantener entre 4 y 7, ya que una acidez menor a 3 provoca un desvanecimiento del color y a valores de pH por encima de 7, se forma hidróxido de hierro (Agustina et al., 2015a). A continuación, se muestra las principales reacciones químicas que ocurren durante la formación del complejo Fe(II)-ortofenantrolina: 4 𝐹𝐹𝐹𝐹3+ + 2 𝑁𝑁𝐻𝐻2𝑂𝑂𝐻𝐻 → 𝑁𝑁2𝑂𝑂 + 𝐻𝐻2𝑂𝑂 + 4 𝐹𝐹𝐹𝐹2+ + 4 𝐻𝐻+ (1) (2) La disolución coloreada obedece la ley de Beer, por lo tanto, hay una relación proporcional entre la concentración de hierro en la disolución y la absorbancia medida. De esta manera es posible cuantificar los niveles de analito, a través de la interpolación en una curva de calibración. Además, el color desarrollado es estable hasta por 6 meses (Christian, 2009). Agentes oxidantes fuertes, cianuro, nitrito y fosfato interfieren en la determinación. Para evitar este problema se recomienda hervir la muestra en medio 16 ácido. Con este paso extra, el polifosfato se convierte a ortofosfato y se remueve el cianuro y nitrito de la disolución. Aunque, lo más común es agregar hidroxilamina en exceso, para eliminar errores potenciales asociados a una alta concentración de compuestos oxidantes (Kafle, 2020). De igual forma, metales como: cromo, zinc, cobre y níquel, pueden provocar interferencias en este análisis, una manera de remediar esta situación es agregando un exceso de ortofenantrolina. Si es muy alta la concentración de interferentes, es necesario realizar una extracción con éter isopropílico para eliminar estos metales. Además, si en la muestra hay una alta cantidad de materia orgánica o coloreada, se debe llevar a cabo un proceso de evaporación y redisolución o inclusive una digestión-redisolución (Kafle, 2020). 2.2. Conceptos básicos de colorimetría En esta sección se hará un recuento de conceptos básicos de colorimetría. Primero, se dará una definición de qué es color y colorimetría, para luego discutir el papel de esta técnica en análisis químico. Además, se comentará la importancia de la ley de Beer en este tipo de análisis. 2.2.1. ¿Qué es el color? El espectro electromagnético incluye: ondas de radio, microondas, radiación infrarroja, luz visible, luz ultravioleta, rayos X y gamma (ver Figura 1). De todos estos tipos de radiación, el ojo humano es capaz de percibir la luz visible. Esta consiste en un grupo de ondas de diferentes longitudes de onda, entre 400 y 780 nm aproximadamente (Christian, 2009). 17 Figura 1. Espectro de radiación electromagnética. Tomada de: “Física Universitaria con Física Moderna” (12va ed., Vol. 2, p.1095), por R. Freedman, y H. Young, 2009, Ciudad de México: Pearson Educación. Estas ondas electromagnéticas se perciben como una variedad de colores. El color observado se debe a que moléculas coloreadas absorben determinadas longitudes de onda de luz y reflejan las ondas complementarias a la misma. La Figura 2 es una representación del círculo cromático, en el cual el color complementario se opone al de referencia (Grzybowski & Kupidura-Majewski, 2019). Figura 2. Círculo cromático. Tomada de: “Conceptos básicos de diseño gráfico: Teoría del color”, por GCF Global, n.d., GCF, Global, https://edu.gcfglobal.org/es/conceptos-basicos-de-diseno-grafico/teoria-del-color/1/ 18 Cuando se trata de un objeto blanco, no se absorbe ninguna longitud de onda y se reflejan todas. En cambio, en los objetos negros, son absorbidos todos los colores, sin luz siendo reflejada (Ly et al., 2020). Se debe añadir que el color no es una propiedad intrínseca de un objeto, sino que su percepción involucra tres factores importantes: la fuente de luz utilizada, el modo de detección de la radiación luego de su interacción con el objeto y el observador (Fernandes et al., 2020). En los mamíferos existen tres tipos de células fotorreceptoras: bastones, conos y las células ganglionares fotosensibles de la retina. Los bastones posibilitan la percepción en blanco, negro y escala de grises. Los conos permiten la detección de colores y funcionan óptimamente cuando hay una cantidad adecuada de luz (0.035 cd·m-2). Estos últimos se agrupan dependiendo del tipo de fotorreceptor presente, cada uno es sensible a una longitud de onda de la luz distinta, el cerebro las interpreta como rojo, verde y azul. La combinación de estos tres colores en diferentes proporciones genera todos los colores que se puede observar (Grzybowski & Kupidura-Majewski, 2019). Las células ganglionares fotosensibles se encargan de: proveer información acerca de la duración del día y la noche, contribuyen en el ajuste del tamaño de la pupila dependiendo de las condiciones de luz ambiental y también regulan la liberación de la hormona melatonina (sueño) (Choudhury, 2014a; Grzybowski & Kupidura-Majewski, 2019). En la Figura 3 se muestra un diagrama de los fotorreceptores presentes en el ojo humano: 19 Figura 3. Anatomía del ojo humano, se indica la localización de los batones y conos. Tomada de: “Ella es la costarricense detrás del primer método mundial para restaurar la visión. II Conferencia Inaugural de Farmacia 2019”, por J. Jímenez- Córdoba, 2019, Universidad de Costa Rica, https://www.ucr.ac.cr/noticias/2019/08/23/ella-es-la-costarricense-detras-del- primer-metodo-mundial-para-restaurar-la-vision.html. El ojo humano, aparte de los fotorreceptores mencionados, está equipado con una variedad de componentes ópticos que incluyen: la córnea, retina, iris, pupila, humores acuoso y vítreo, lentes y la retina. Además, el primer paso en el proceso sensorial es la estimulación de los receptores de luz en los ojos. Luego se da la conversión del estímulo de la luz o imagen en señales, para la posterior transmisión de impulsos eléctricos que contienen la información de la visión proveniente de ambos ojos, esto a través de los nervios ópticos. Como paso final se da el procesamiento, en las cortezas visuales del cerebro, de la información transmitida (Choudhury, 2014a; Grzybowski & Kupidura-Majewski, 2019). 2.2.2. Definición de colorimetría La colorimetría es la unión de ciencia y tecnología utilizada para describir y cuantificar la percepción que los humanos tienen del color. Esta disciplina se puede dividir en dos ramas: visual y fotoeléctrica. En la colorimetría visual se mide una 20 concentración mediante la observación de un cambio de color en la disolución estudiada, utilizando solamente la vista. En cambio, la colorimetría fotoeléctrica se vale del uso de aparatos como colorímetros o espectrofotómetros, los cuales permiten una mejor resolución para percibir cambios de color y un proceso de cuantificación más exacto (Choudhury, 2014b). 2.2.3. Colorimetría en análisis químico El color ha sido una herramienta muy explotada en la química. Desde una etapa temprana en el desarrollo de esta rama del saber, los científicos notaron que los cambios de color en una disolución indican una reacción química, así como que la intensidad del color se puede relacionar con la concentración de los productos involucrados en dicha reacción. Esta percepción fue descrita mucho antes del establecimiento de cualquier teoría de visión del color (Fernandes et al., 2020). Uno de los primeros reportes de una determinación colorimétrica cuantitativa fue realizado por W.A. Lampadius en 1838, quien estimó los niveles de hierro y níquel en un mineral de cobalto, esto comparando el color del filtrado contra disoluciones estándar preparadas en tubos cilíndricos, con diferentes porcentajes de estos metales. Más adelante, se llevaron a cabo análisis de otros compuestos inorgánicos como el bromo. Lamentablemente, la detección se basaba en observación y comparación de intensidad de color, lo cual conducía a errores debido a la evaluación del analista (Fernandes et al., 2020). Otro hito importante fue la formulación de la ley de Beer en 1852, la cual es un pilar de las determinaciones espectrofotométricas. Además, en 1864 surgió el primer sistema para análisis colorimétrico comercialmente disponible, producido por Siemens-Halske. Y para el año 1925, el sistema fotométrico se hizo popular. Pero fue hasta 1940 que se fabricó el primer espectrofotómetro funcional y con alto rendimiento y precisión (García, 2018). Luego de la aparición del espectrofotómetro, la colorimetría se convirtió en una técnica de suma importancia en el análisis químico cuantitativo. Su aplicación se extiende a: análisis de aguas y suelos, bioquímica, toxicología, medicina, ciencias 21 forenses, industria petrolera, farmacéutica y alimenticia, entre muchos otros (García, 2018). 2.2.4. La importancia de la ley de Beer La cantidad de radiación monocromática que absorbe una muestra obedece la ley de Beer – Bouguer- Lambert, conocida como ley de Beer. En la figura 4 se muestra el principio básico de la absorción de luz monocromática (Christian, 2009). Figura 4. Absorción de la radiación. Tomada de: “Química Analítica” (6ta ed., p.474), por G.D. Christian, 2009, McGraw Hill. La radiación incidente, con potencia P0, atraviesa una disolución de una sustancia absorbente con concentración 𝑐𝑐 recorriendo una trayectoria 𝑏𝑏 (longitud de la celda donde está contenida la muestra). De la celda sale como radiación emergente, con una potencia radiante 𝑃𝑃 (Skoog et al., 2008). Esta relación se expresa matemáticamente de la siguiente forma: A = log10 𝑃𝑃0 𝑃𝑃 = 𝜀𝜀𝑏𝑏𝑐𝑐 (3) En la ecuación anterior, 𝜀𝜀 corresponde a la absortividad molar. Esta depende de la longitud de onda, de la naturaleza del material absorbente y el peso molecular de la sustancia absorbente (Holler et al., 2015). En métodos colorimétricos se aprovecha de forma implícita la ley de Beer, esto mediante el uso de curvas de calibración. En estas se mide la respuesta de un instrumento para una serie de disoluciones de concentración conocida. Por lo 22 general, en un intervalo establecido, se obtiene una respuesta lineal y de esta manera es posible determinar la cantidad de analito en una disolución incógnita (Worsfold, 2005). 2.3. Utilización de teléfono celular en análisis químico En abril de 1973 se realizó la primera llamada utilizando un teléfono sin cable. En la actualidad se calcula que en el planeta hay más de 3 500 millones de teléfonos, aproximadamente. Su uso está afianzado en la vida diaria de las personas a nivel mundial. Esto gracias a la miniaturización de estos dispositivos (en comparación con los primeros aparatos de este tipo) y a la mejora en: las cámaras, audio, plataformas y la calidad de sus componentes (de Jesus et al., 2021). Es debido a: la simplicidad en el manejo de este tipo de dispositivos, su costo (comparado con un espectrofotómetro) y portabilidad, que su uso no sólo se limita a mantener comunicada a la población, sino que se puede implementar, a través de distintas aplicaciones, en múltiples áreas de la ciencia. Estos dispositivos han sido utilizados como: microscopios y endoscopios (Anderson et al., 2016), acoplados a drones se han aprovechado para la detección remota en análisis agrícolas (de Jesus et al., 2021), herramientas de aprendizaje en aulas, entre otros. Además, el teléfono celular es ideal para análisis in situ y gracias a esto ha ganado relevancia en áreas como: cuidado de la salud, agricultura, ambiente, química, entre otras (Rezazadeh et al., 2019). 2.3.1. Técnicas utilizadas en las aplicaciones del teléfono celular Los teléfonos celulares pueden actuar como un sistema de detección, pero también se tiene la opción de acoplarlos a sistemas externos que operan bajo distintos principios. Actualmente, en química analítica es posible encontrar diferentes sistemas de detección con el celular, basados en: óptica, electroquímica, electroquimioluminiscencia, microscopía de fluorescencia, entre otros (Rezazadeh et al., 2019). 23 2.3.1.1. Detección óptica Se logra mediante la cámara que el teléfono celular trae incorporada. Esta es capaz de tomar imágenes digitales, las cuales podrían ser posteriormente procesadas con la ayuda de aplicaciones instaladas. La detección y cuantificación son factibles gracias a la medición de una característica de la imagen digital que es dependiente de la concentración del analito incógnita. Algunas de estas características son: color, fluorescencia, conteo de pixeles, entre otras (Rezazadeh et al., 2019). En el caso de la detección colorimétrica, esta se basa en la utilización del color para cuantificar. Como más adelante se discutirá, para este tipo de detección se recurre a aplicaciones que brinden información del color en forma de coordenadas, perfilándose el sistema RGB como el más importante y común (Sivakumar & Lee, 2021). Por otro lado, la pixelación permite la conversión del color, iluminación y otras características visuales de la muestra en dígitos. Si la obtención de datos de color no es factible, una opción es convertir la imagen a una escala de grises y con software especial se puede contabilizar la cantidad de pixeles (unidad más pequeña con información de color) y emplear este valor como señal analítica (Lee et al., 2013; Yu et al., 2016). 2.3.1.2. Detección electroquímica En la mayoría de los casos en los que se ha implementado este tipo de detección, ha sido acoplada una celda electroquímica al celular. Se puede utilizar como señal analítica datos de: impedancia, amperometría o voltametría. Este tipo de análisis ha ganado adeptos en la detección in situ de analitos. Esto debido a la portabilidad, alta sensibilidad y capacidad de realizar mediciones analíticas en áreas remotas (Liao et al., 2020). 24 2.3.1.3. Detección por electroquimioluminiscencia Esta es una combinación de electroquímica y procesos de luminiscencia. Por lo general, en esta técnica se emplea luminóforos, que son átomos o grupos funcionales de un compuesto responsables de la luminiscencia, algunos ejemplos son: complejos de rutenio, ésteres de acridinio, luminol y compuestos derivados. La luz producida en el proceso es capturada por la cámara del celular y posteriormente se analizan los datos por medio de aplicaciones móviles. Con este recurso se logra una alta sensibilidad, eficiente emisión de luz, baja señal de fondo y análisis rápidos (Hu & Xu, 2010; Li et al., 2019). 2.3.1.4. Detección por imágenes microscópicas La potencia de la cámara del teléfono móvil puede mejorarse cuando se integran lentes desmontables, los cuales funcionan como un microscopio portable. Este tipo de aditamentos permite conseguir una resolución espacial de un micrómetro. Lo más común es usar la fluorescencia para obtener una señal analítica. Este método de detección ha sido muy implementado en determinaciones bioquímicas (Nguyen et al., 2018). 2.4. Colorimetría mediante análisis de imágenes digitales La medición de color mediante imágenes digitales se ve influenciada por variables como: espacios de color, herramientas para la captura de imágenes, condiciones de iluminación y las aplicaciones utilizadas para el análisis y cuantificación del color (Fan et al., 2021). 2.4.1. Espacios de color Un espacio de color es una representación matemática, que permite la especificación de los colores a través de tres componentes numéricos (por lo general). Los primeros modelos (espacios) que fueron propuestos se basaron en experimentos de la percepción humana, diseñados para desarrollar clasificaciones 25 de colores. Los más usados proponen una métrica para medir la distancia entre colores (Busin et al., 2009). 2.4.1.1. Modelo RGB (Rojo, Verde, Azul) Este es el espacio de color con el que trabajan la mayoría de los sistemas computarizados de visualización y es bastante utilizado en producción industrial, a menudo se representa como un cubo. Cada color (rojo, verde y azul) es asignado a uno de los tres ejes de las coordenadas ortogonales en el espacio tridimensional (ver Figura 5). A lo largo de cada eje del cubo, la gama de colores varía desde ninguna contribución de ese componente (0) hasta la saturación total del mismo (1) (Gonzalez et al., 2008; Tiuftiakov et al., 2021). En esta representación cualquier punto (color) se identifica con tres números (coordenadas RGB). Además, la línea diagonal del cubo que va desde negro (0, 0, 0) hasta blanco (1, 1, 1) corresponde a toda la escala de grises (Choudhury, 2014b). El cubo RGB representa una cantidad de colores menor a la que un ser humano promedio puede ver (Tiuftiakov et al., 2021). Figura 5. Representación del espacio de color RGB. Tomada de: “Fruit Classification by Extracting Color Chromaticity, Shape and Texture Features: 26 Towards an Application for Supermarkets” (p.4), Por F. García, J. Cervantes, A. López & M. Alvarado, 2016, IEEE Latin America Transactions,14 (7). Con respecto a las imágenes digitales, la expresión matemática con la cual trabajan los dispositivos modernos es: 𝐴𝐴(𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅) = 𝑟𝑟𝑅𝑅 + 𝑔𝑔𝑅𝑅 + 𝑏𝑏𝑅𝑅 (4) Donde: 𝐴𝐴(𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅) es el color final obtenido; 𝑟𝑟, 𝑔𝑔 y 𝑏𝑏 son las intensidades correspondientes a cada coordenada. Se trabaja con una escala que va de 0 a 255, obteniéndose hasta 16 777 216 posibles iteraciones. La combinación (0,0,0) corresponde al negro y (255, 255, 255) al blanco (Apyari et al., 2017). 2.4.1.2. Modelo CMYK (Cian, Magenta, Amarillo, Negro) Los espacios CMY y CMYK son muy usados en la impresión a color (ver Figura 6). Los colores primarios en CMY son el cian, magenta y amarillo, respectivamente. El rojo, el verde y el azul se obtienen por la combinación de estos. Al contrario del sistema RGB, que es un modelo de color aditivo, CMY es clasificado como uno sustractivo. Entonces, las coordenadas del blanco son (0,0,0) y las del negro (1,1,1). CMYK es una variación del anterior, en éste se adiciona el componente negro (Key). En teoría, el componente extra no es necesario. Pero en la práctica se ha observado que al mezclar iguales cantidades de cian, magenta y amarillo no se obtiene negro, sino un color café oscuro. Con la adición de este componente extra en la mezcla se consigue solucionar dicho problema (Zajc et al., 2003). 27 Figura 6. Espacio de color CMY/CMYK. Tomado de: “The Difference Between CMYK and RGB in Digital Printing”, Decal Impressions, 2018, Decal Impressions, https://www.decalimpressions.com/company-info/blog.html/article/2018/06/05/the- difference-between-cmyk-and-rgb-in-digital-printing. 2.4.1.3. Modelo HSB/HSL (Matiz, Saturación, Brillo/ Luminosidad) Este modelo define el espacio de color en términos de tres componentes: matiz, saturación y brillo o valor (H, S, B/V). El matiz se refiere al tipo de color (como rojo, azul o amarillo) y varia de 0° a 360° en la mayoría de las aplicaciones. Cada valor corresponde a un color: 0° es rojo, 45° es una sombra de anaranjado y 55° es una sombra de amarillo. La saturación es la intensidad del color, varía de 0 a 100 %, 0% significa ausencia de color y 100 % es un color intenso. El brillo o valor es la luminosidad u oscuridad relativa del color y se expresa en términos de porcentaje entre 0 %(negro) y 100 % (blanco o un color menos saturado, dependiendo de la saturación)(Woelk et al., 2005). En el caso del modelo HSL o HSI, el parámetro matiz tiene la misma definición dada anteriormente. La saturación es la variación del color, dependiendo de la luminosidad, de 0 a 100 % (desde el centro de los ejes blanco y negro). La luminosidad controla que tan claro u oscuro es el color, siendo 0 % negro y 100 % blanco. HSL es una aproximación más exacta del color, por esta razón es más 28 implementado en trabajos de fotografía (Woelk et al., 2005). En la Figura 7 se muestra los dos espacios explicados. Figura 7. Espacios de color HSB (izquierda) y HSL (derecha). Tomada de: “Digital image colorimetry on smartphone for chemical analysis: A review. Measurement” (p.3), por Y. Fan, J. Li, Y. Guo, L. Xie & G. Zang, 2021, Journal of the International Measurement Confederation, 171. 2.4.1.4. Modelo CIE 1931-XYZ En 1931, la Comisión Internacional de Iluminación (CII) estableció el espacio de color CIE XYZ, que está definido matemáticamente a partir de la percepción psicológica de la luz. En éste, un conjunto de tres funciones de combinación de colores, llamado colectivamente “el Estándar del Observador”, se relaciona a los conos presentes en el ojo que perciben los colores: rojo, verde y azul (Wu & Sun, 2013). Los valores X, Y, Z, por lo general, varían entre 0 y 100 %. En este modelo el valor de Y se usa para medir la luminosidad de un color, también brinda información relacionada a la respuesta del cono “M” del ojo (amarillo-verde). En cambio, los parámetros X y Z son dos componentes virtuales que actúan como indicadores de 29 la respuesta de los conos en el ojo humano hacia ondas de luz de frecuencia variada (Fan et al., 2021). En la Figura 8 se puede apreciar el espacio XYZ. Figura 8. Espacio de color CIE XYZ. Tomada de: “Digital image colorimetry on smartphone for chemical analysis: A review. Measurement” (p.3), por Y. Fan, J. Li, Y. Guo, L. Xie & G. Zang, 2021, Journal of the International Measurement Confederation, 171. 2.4.1.5. Modelo L* a* b* El modelo L* a* b* es, usualmente, empleado en la caracterización de alimentos. Fue adoptado por la CII en 1976 como estándar internacional en la medición de color y es una transformación lineal del sistema XYZ. El parámetro L* corresponde a la luminosidad, que varía entre 0 y 100 (negro a blanco). Además, a* (de verde a rojo) y b (de azul a amarillo) son dos componentes cromáticos cuyos valores están en un rango de -120 a 120 (Yam & Papadakis, 2004). Otro detalle importante es que este espacio es perceptualmente uniforme, ya que la distancia euclidiana entre dos colores distintos corresponde, aproximadamente, a la diferencia percibida por los ojos humanos. La Figura 9 es una representación del espacio CIE L* a* b*. 30 Figura 9. Espacio de color CIE L* a* b*. Tomada de “Clasificación automática de naranjas por tamaño y por defectos utilizando técnicas de visión por computadora” (p.12), por J.C. Miranda, 2018, Universidad Nacional de Asunción. 2.4.2. Herramientas para la captura de imágenes A menudo, los datos de imágenes digitales se extraen de dispositivos como: escáneres, cámaras digitales, cámaras web y teléfono celulares (Fernandes et al., 2020). Independientemente del equipo utilizado, la captura del color procede de forma similar. En el caso de los teléfonos inteligentes, estos tienen cámaras incorporadas a su estructura. En su interior, durante el proceso de captura de imágenes, la luz pasa a través de unos lentes e incide en un sensor especial (Lu et al., 2019). En el sensor de imagen, la luz es recolectada por una matriz de pequeños pozos potenciales, llamados pixeles, que generalmente tienen forma cuadrada. Su función es registrar la cantidad de luz que incide sobre ellos. Posteriormente, esta magnitud se transforma en el correspondiente número de electrones, mientras más fuerte sea la luz incidente mayor es el número de electrones generado. Luego, estos son convertidos en voltaje y en seguida a datos numéricos, mediante un convertidor A/D. Esta información es procesada por circuitos dentro de la cámara. Los sensores 31 más utilizados en teléfonos celulares son los semiconductores complementarios de oxido metálico (CMOS, por sus siglas en inglés) (Axis Communications, 2010). Es necesario aclarar que los sensores de imagen registran la cantidad de luz, de brillante a oscuro, sin información del color. Entonces, la presencia de un filtro frente al sensor permite la asignación de tonos de color a cada píxel. Los filtros habitualmente se basan en los espacios RGB y CMYG (cian, magenta, amarillo y verde) (ver Figura 10) (Axis Communications, 2010). El filtro RGB más común es el mosaico de Bayer, el cual contiene filas alternativas de filtros rojo-verde y verde- azul. Además, debido a que el ojo humano es más sensible al color verde, en este mosaico hay el doble de estos bloques en comparación con el resto (Figura 11). Con esto se consigue una detección más detallada de los colores que si se usara la misma cantidad de filtros de cada color (Lu et al., 2019). Figura 10. Estructura de un sensor CMOS de una cámara, con filtro RGB. Tomada de: “Sensores digitales de nuestras cámaras fotográficas: CCD y CMOS”, por D. García-Pérez, 2015, David García Pérez Fotografía, https://dgpfotografia.com/tag/cmos/. 32 Figura 11. Mosaico de Bayer. Tomada de: “CCD and CMOS sensor technology: Technical white paper”, por Axis Communications, 2010, Axis Communications. Además, con los datos de intensidad de color para cada píxel como resultado final se genera una imagen “Raw”, la cual tiene muy poco procesamiento. En este formato, los pixeles sólo tienen información de alguno uno de los canales R, G y B, pero se necesita conocer los tres valores para cada píxel. Entonces, se aplica la interpolación de color para determinar las otras dos coordenadas que faltan (ver Figura 12). Esto se consigue basándose en pixeles cercanos en los cuales los valores son conocidos. Luego de la fase anterior, se aplican otros procesos como: balance de blancos, corrección gamma, corrección del espacio de color y compresión, para convertir la imagen de formato Raw a JPEG (Kılıç et al., 2020). Figura 12. Interpolación de color de una imagen en formato RAW. Tomada de: “From Sophisticated Analysis to Colorimetric Determination: Smartphone Spectrometers and Colorimetry”, por V. Kılıç, N. Horzum & M. Ertugrul Solmaz, 2020, IntechOpen. 33 2.4.3. La iluminación Dependiendo de las condiciones, el color aparente de las imágenes puede ser influenciado por varios factores, tales como: una composición homogénea de las ondas de luz proveniente de la fuente de iluminación, intensidad y geometría de emisión de la fuente de luz, rugosidad de la superficie del objeto, homogeneidad e intensidad de la coloración. Por lo tanto, trabajar con mejores condiciones de iluminación no implica que se obtendrá una calidad de imagen mejor. Lo ideal es que se fotografíe las muestras siempre con estos parámetros técnicos bajo control (Fan et al., 2021). Aunado a esto, un sistema de iluminación bien diseñado permite aumentar la exactitud de la determinación, reducir el tiempo invertido y la complejidad de los pasos subsecuentes en el procesamiento de las imágenes. Esto al final da como producto un exitoso análisis de imágenes y se reducen los costos asociados a dicho proceso (Gunasekaran, 1996). En el caso de la colorimetría de imágenes digitales, se prefiere fuentes de iluminación que brinden una luz blanca fría. Se recomienda colocarlas arriba de la muestra, para evitar la formación de sombras o distorsión de la imagen y así se previene interferencias en la señal debido a la reflexión de la luz proveniente de la fuente. Además, la implementación de una caja de luz brinda resultados todavía más satisfactorios. Ya que se mantiene una iluminación uniforme y la posición de la cámara con respecto a la muestra permanece constante (Fan et al., 2021). 2.4.3.1. Iluminantes y fuentes de iluminación Una fuente de luz se define como un objeto que produce luz u otro flujo de radiación. En cambio, un iluminante es una tabla de valores (potencia espectral relativa versus longitud de onda) usada en computación colorimétrica. También, el iluminante A corresponde a una lámpara incandescente de filamento de tungsteno (temperatura de color= 2856 K); los iluminantes B y C se pueden obtener filtrando la luz proveniente de una fuente A, para emular la luz del sol al mediodía. En la actualidad, estas dos clases escasean o ya cayeron en desuso, como es el caso del 34 tipo C (Gilchrist & Nobbs, 2016). En la Figura 13 se indica la distribución de potencias espectrales de los iluminantes CII más comunes. Figura 13. Distribución de potencias espectrales de los iluminantes más comunes del CII. Tomada de: Standard Illuminants, por R. Ramanath & M. S. Drew, 2014, Springer US. Más recientemente la CII ha recomendado el uso exclusivo de iluminantes de la serie D, estos emulan la luz de día en varias fases. D75 (temperatura de color de 7 500 K) corresponde la luz de día del cielo norte, D65 (6 500 K) representa la luz de día promedio y D55 sería la luz de día a través de un tragaluz. Hay que resaltar que D65 es el iluminante referente para uso en colorimetría. Desafortunadamente, éste no es realizable en la práctica, por lo que se recurre a simular dicha fuente (luz fluorescente con un filtro) (Gilchrist & Nobbs, 2016). También, ha sido definida una serie de lámparas fluorescentes (serie F), aunque ninguna de estas se considera un iluminante estándar. Estas fuentes tienen mayor eficiencia luminosa(lumen·watt-1), en comparación con los bombillos de tungsteno. Están constituidas básicamente por una lámpara de descarga de gas que contiene mercurio a baja presión y que usa la fluorescencia para producir luz visible. Hay tres tipos: normal, banda amplia y tres bandas. Las más importantes 35 son: F2 (normal, conocido como “blanco frío”), F7 (banda amplia, conocida como “luz de día artificial” y usada comúnmente para combinación de colores) y F12 (tres bandas, con una eficiencia energética alta y usada frecuentemente en tiendas) (Gilchrist & Nobbs, 2016). En lo que respecta a los diodos emisores de luz (LED), se rigen por el principio de electroluminiscencia, presentado por semiconductores inorgánicos y orgánicos (OLED). Los más comunes en iluminación son los que generan luz blanca de alta intensidad (WLED). El tipo más popular es el blanco frío, cuya temperatura de color oscila entre 6 000 y 7 000 K (Oleari, 2016). En la Figura 14 se puede apreciar los tipos de WLEDS y su correspondiente temperatura de color. Figura 14. Relación entre temperatura de color(K) y su correspondiente tono de blanco. Tomada de: "El color como factor de calidad en la iluminación y su influencia sobre el estado de ánimo humano” (p.19), por L. Acosta-Martínez, 2019, De los métodos y las maneras, 4. 2.4.4. Programas y aplicaciones para colorimetría de imágenes digitales y cuantificación de color En la cuantificación de color se recurre a programas de análisis de imágenes para conseguir datos en formato digital (bajo un espacio de color definido), con el objetivo de correlacionar la señal analítica extraída de la imagen y la concentración del analito de interés. Algunos ejemplos de estas herramientas son: Adobe 36 Photoshop CC, Matlab, Pantone Studio, Digital Colorimeter, Image J, Color Pilot y otras personalizadas por los fabricantes (Fan et al., 2021). Adobe Photoshop es un programa de procesamiento de imagen multisistema que convierte información del color en valores de R, G y B. Matlab, desarrollado por MathWorks, es un ambiente de programación para: el desarrollo de algoritmos, análisis de datos, visualización y computación numérica. Pantone Studio es una aplicación de iOS, la cual tiene una colección de más de 10 000 colores de referencia, necesaria para la extracción del color de una imagen desde el teléfono inteligente. Además, Digital Colorimeter, que pertenece a la plataforma de MacOS (Apple), facilita la visualización de diferentes espacios de color como: RGB, sRGB, Adobe RGB, L*a*b*, entre otros. En éste, al mover el cursor se obtiene coordenadas de color del punto de la imagen en valoración (Fan et al., 2021). Otro programa es Image J, que trabaja en lenguaje Java y fue creado por el Instituto Nacional de Salud Mental de los Estados Unidos. Este es un sistema de análisis multiplataforma que permite manejar y editar imágenes en una variedad de formatos. En una línea similar, Color Pilot, que pertenece al ambiente Windows, posibilita corregir aberraciones de color y extrae valores de R, G y B (Fan et al., 2021). Es posible, a través de cualquiera de las herramientas mencionadas, extraer los valores cromáticos de una fotografía tomada con un teléfono móvil y establecer la relación entre la respuesta analítica y la concentración de un analito. Por supuesto, basándose en curvas de calibración preparadas a partir de materiales de referencia o estándar (de Jesus et al., 2021b). En comparación, aplicaciones en el teléfono ayudan en la obtención de coordenadas de color, ya sea con el procesamiento posterior de las imágenes captadas con la cámara o en vivo. Por lo general, se busca que tengan las siguientes funciones: modelo establecido de respuesta ante concentración, lecturas directas de los niveles de analito, preservación y almacenaje de los datos obtenidos, entre otras (Fan et al., 2021). 37 Algunas de las aplicaciones para teléfonos inteligentes más utilizadas son: Photometrix, Color Grab, Color Meter Free, ColorAssist, RGB Colour Detector, RGBCam, Color Picker, Color Analyzer y RGB Colour Reader. Photometrix es gratuita, dentro de sus funciones más atractivas están: quimiometría de mínimos cuadrados parciales y el análisis exploratorio utilizando agrupamiento jerárquico o curva de calibración univariada. En el caso de Color Analyzer y Color Picker, estas facilitan la detección de color en una imagen captada en vivo o partiendo de fotografías almacenadas. También hay diferentes espacios de color para trabajar como: RGB, HSL, HSV, CMYK, L* a* b*, entre otros. La aplicación Color Grab es muy similar a las dos anteriores, pero posee una mayor cantidad de funciones, por ejemplo: blanco de referencia, cambio en el tamaño de muestra de píxeles, indicación de enfoque, uso de la linterna del celular, variación del brillo, interpretación del color y la facilidad de compartir información sobre el color captado (Fernandes et al., 2020). En una categoría aparte están las aplicaciones personalizadas que han sido desarrolladas para metodologías específicas. Una de ellas es Albumin Tester, desarrollada para Android para la cuantificación de albumina en orina. Otro ejemplo es SPAQ, creada para la determinación de alcohol en saliva, valiéndose de un histograma de distribución. Además, Colorimeter Test Reader permite medir pH, proteínas y glucosa en orina. En otro estudio, se mensuró el contenido de peróxido con ChemTrainer, que es una aplicación que ejecuta un algoritmo de aprendizaje automático en un servidor remoto y empleó tiras reactivas para este propósito (Kılıç et al., 2020b). 38 CAPÍTULO III METODOLOGÍA Este capítulo se dividirá en tres secciones: fabricación y verificación del dispositivo diseñado para controlar las condiciones de iluminación, optimización de las condiciones de operación del diseño final y finalmente la validación de la metodología propuesta. Se enlistará los materiales, equipos y reactivos usados en cada una de las etapas y luego se procederá a explicar el procedimiento general llevado a cabo en cada parte del proceso. Adicional a esto se incluirá una sección de tratamiento de datos. 3.1. Materiales generales, equipos y reactivos 3.1.1. Equipo de cómputo, teléfono celular, programas y aplicaciones Durante las tres etapas se utilizó una computadora de escritorio con las siguientes características: Sistema Operativo Windows 10, Procesador AMD FX (tm)-6300 de 6 núcleos, 3500 MHz y Memoria RAM de 16 GB. Además, para el trabajo en el laboratorio 0219 de la Escuela de Química de la Universidad de Costa Rica, se usó una tableta RCA W101SA23T1P Cambio 2 en 1 con: Procesador Intel Atom Z8350, disco duro de 32 GB SSD, 2GB de memoria RAM, WIFI, Bluetooth, y sistema operativo Windows 10. En ambos casos para el procesamiento de datos se empleó el programa Office del ambiente Microsoft 365 (Microsoft 365, 2023). El teléfono móvil escogido para la obtención de las coordenadas de color fue Samsung A51, cuyas características están indicadas en el Cuadro 1. 39 Cuadro 1. Características del teléfono celular Samsung A51 Característica Valor Pantalla Super AMOLED 6.5" Resolución de 1080 x 2400 px Dimensiones y peso 158,5 x 73,6 x 7,9 mm3 172 g Procesador Octa-Core Memoria RAM 4 GB Almacenamiento 128 GB Cámara frontal 32 MP Cámara principal Cuádruple, 48MP+5MP+12MP+5MP Batería 4000 mAh, Carga rápida hasta 15W Sistema operativo Android 10 Samsung One UI 2.0 Conectividad 4G, Wi-Fi /Bluetooth USB-C, NFC y Minijack Otros Sensor de huella bajo la pantalla La obtención de coordenadas de color se logró con la aplicación para Android OS, Color Grab, creada por Loomatix. Algunas de sus funciones son: control de brillo, escogencia del tamaño de muestra de píxeles, blanco de referencia, balance de blancos, iluminación mediante la linterna incorporada, hasta dos espacios de color para trabajar simultáneamente, entre otras (Color Grab, 2021). 40 3.1.2. Fabricación y verificación del dispositivo para el control de iluminación Por efectos prácticos, sólo se incluirá listas parciales de materiales y equipos. En Anexos se puede verificar el listado completo. 3.1.2.1. Equipos y materiales usados en la fabricación de los prototipos • Cartón de presentación blanco y negro. • Madera MDF de 5 y 10 mm. • Cartulina Opalina blanca, 225 G/M2 21.5 x 28.0 cm. • Papel adhesivo de vinilo imprimible, marca: Limia' s Care, blanco mate. • Foamy moldeable blanco, marca Krear. • Foamy 10 mm de color verde. • Foamy blanco de 2 mm. • Lámina difusora blanca de plástico, 2 mm de grosor. • Resina de mesa, Decore S.A. • Herramientas varias para: corte, dimensionado y unión. • Materiales varios para unión de piezas. • Barniz Tinte Comex, base de agua, acabado brillante. • Barniz Aquavar de Lanco, 3 en 1, satinado Wengue. • Pintura en aerosol Harris, negro y blanco mate. • Impresora Epson L210. • Soporte universal para teléfono celular, marca Phicant, con tornillo estándar de 1/4 pulgadas, rotación vertical y horizontal. • Cuchara de medida de 15 mL. 3.1.2.2. Equipos y materiales usados en la fabricación de las fuentes de luz • Cartón de presentación blanco y negro. • Madera MDF de 10 mm de grosor • Herramientas varias para: corte, dimensionado y unión. • Tira Led blanca 5050 de 12 V, 6000 K, marca no especificada en el empaque. 41 • Adaptador de 12 V, 2 A, marca JCM, modelo 250-SA12V2A. • Eliminador regulado 12 V, marca Steren, modelo: ELI-1250, 3 A. • Módulos Led 3M IP-67, 12 V y 1.2 Watts, para interiores y exteriores. • Luminario de Leds super brillante, Marca: Good Will AZ-Energy, modelo: 20365. 85-265 V, 60 Hz y 3 W. • Panel de luces Led Blanco Frío de 6500 K, marca: Wellmax, 480 lúmenes, 120-240 V, 50-60 Hz y 6 W. 3.1.2.3. Equipos y materiales usados en la verificación de los prototipos • Balanza analítica Sartorious, modelo: ENTRIS224I-1S. • Espectrofotómetro Genesys UV/Vis 10 s. • Back- UPS 425, marca: APC, modelo: BE425M-LM. • Celda de cuarzo UV para espectrofotómetro, marca AMTAST, camino óptico de 10 mm y 3.5 mL de capacidad. • Balones y pipetas aforadas de diferentes volúmenes. • Pipetas graduadas de 10.0 y 5.0 mL. • Equipo volumétrico variado. • Pipeta automática de 1-10 mL, marca, Eppendorf Research. • Botellas de plástico y vidrio de: 125, 200, 500 y 1000 mL. 3.1.2.4. Reactivos usados en la verificación de los prototipos diseñados • Colorante vegetal amarillo y rojo, marca desconocida. • Acetato de sodio anhidro, marca Amresco, grado ACS. • Clorhidrato de hidroxilamina, marca Sigma Aldrich, pureza 99 %. • Sal de Mohr, marca Fermont, pureza de 100.3 %. • 1,10-fenantrolina, marca Sigma Aldrich, pureza 99 %. • Ácido sulfúrico concentrado, grado reactivo, marca EM. • Ácido nítrico 70 %, grado reactivo A.C.S, marca Spectaum. 42 • Disoluciones de 1,10-fenantrolina de 0.1 y 0.3 %, elaboradas por la Proveeduría de la Escuela de Química de la Universidad de Costa Rica. • Agua destilada. Con base en los reactivos incluidos en la lista anterior se preparó las siguientes disoluciones acuosas: • Disolución de Fe(II): Se trabajó con disoluciones madre de: 250 -1000 mg·L-1. A partir de estas se obtuvo una disolución intermedia de 100 y 250 mg·L-1 y de trabajo de 10 mg·L-1. • Colorante naranja: Se preparó una disolución de trabajo de: 2000 – 10000 mg·L-1. • Disolución de clorhidrato de hidroxilamina al 10 % (m/v). • Disolución de acetato de sodio al 10 % (m/v). • Disolución de 1,10-fenantrolina al 0.1 - 0.3 % (m/v). 3.1.3. Optimización de las condiciones de operación 3.1.3.1. Materiales y equipo usados para optimizar las condiciones de operación • Fuentes de luz variadas y prototipo MDF 2.1. • Eliminador regulado 12 V, marca Steren, modelo: ELI-1250, 3 A. • Teléfono celular Samsung A51. • Balanza analítica Sartorious, modelo: ENTRIS224I-1S. • Espectrofotómetro Genesys UV/Vis 10 s. • Celda de cuarzo UV para espectrofotómetro (ver punto 2.1.2.3) • Balones y pipetas aforadas de diferentes volúmenes. • Pipeta automática de 1-10 mL, marca: Eppendorf Research. • Equipo volumétrico variado. 43 3.1.3.2. Reactivos usados para optimizar las condiciones de operación • Disoluciones: (251.8 ± 0.4) mg·L-1 y (10.07 ± 0.04) mg·L-1 de hierro a partir de sal de Mohr (P= 100.3 %), clorhidrato de hidroxilamina al 10 % (m/v), ortofenantrolina al 0.1 - 0.3 % (m/v) y acetato de sodio al 10 % (m/v). Así como agua destilada. • Patrón para absorción atómica de 1000 mg/L de Fe (II), marca Perkin Elmer Pure. • Muestras acidificadas de agua potable tomadas en la Clínica Dr. Solón Nuñez Frutos y el Laboratorio 0219 de la Escuela de Química de Universidad de Costa Rica. • Muestras artificiales de agua, enriquecidas con disoluciones concentradas de hierro (II). 3.1.4. Validación del método propuesto En este caso, los reactivos y materiales son similares a los utilizados en la optimización de condiciones, con algunos cambios: • Se seleccionó la fuente de 60 luces Led interconectadas • El espectrofotómetro utilizado fue: Shimadzu Pherma Spec UV-1700. Para el análisis de interferencias fueron empleados: • Patrones para absorción atómica de 1000 mg·L-1 de: Zn y Mg, marcas variadas. Se preparó disoluciones de 300 mg·L-1 de cada metal y un cóctel de ambos, concentración individual de 500 mg·L-1. • Sulfato de sodio anhidro, marca Merck, Pureza= 99%; carbonato de sodio, marca Laboratorios Meyerk S.A., Pureza= 99.5 %; cloruro de sodio, no especifica marca ni pureza. Con estas sales se preparó disoluciones de 300 mg·L-1 de cada metal y un cóctel de todas, concentración individual de 2500 mg·L-1. 44 3.2. Procedimientos generales 3.2.1. Preparación de los reactivos utilizados y muestras En la presente sección se explicará, de forma general, como fueron preparados los reactivos utilizados durante los diferentes procesos llevados a cabo. 3.2.1.1. Disolución de hierro (II) Fue preparada a partir de sal de Mohr, la cual había sido morterizada y almacenada en un recipiente adecuado el cual se mantuvo en un desecadora con sílica gel activa. Para hacer una disolución de 250 mg·L-1 se pesó 0.35 g de sal de Mohr. Luego, se disolvió en una pequeña cantidad de agua y se trasvasó cuantitativamente a un balón aforado de 200.0 mL. Se agregó 2 mL de ácido sulfúrico concentrado, se aforó con agua destilada y se mezcló bien. La disolución fue almacenada en una botella plástica ámbar de 250 mL, la cual se enjuagó tres veces con la disolución antes de ser llenada. 3.2.1.2. Disolución de colorante naranja Se mezcló partes iguales de colorantes vegetales amarillo y rojo, consiguiéndose un colorante naranja. Este fue morterizado y almacenado en un recipiente adecuado, el cual se mantuvo en una desecadora con sílica gel activa. Se hizo una disolución de trabajo de 2000 - 10 000 mg·L-1, pesando 0.2 – 1.0 g del colorante y se disolvió en una pequeña cantidad de agua. La disolución se trasvasó cuantitativamente a un balón aforado de 100.0 mL. Después, se aforó con agua destilada y se mezcló bien. 3.2.1.3. Disolución de clorhidrato de hidroxilamina (10 % m/v) Para preparar 200 mL, se pesó 20 g de clorhidrato de hidroxilamina y se añadió agua destilada hasta la marca de 200 mL, se agitó hasta disolver. Se guardó la disolución en una botella de vidrio ámbar de 250 mL. 45 3.2.1.4. Disolución de acetato de sodio (10 % m/v) Para preparar 1 L, se pesó 100 g de acetato de sodio anhidro y se agregó agua destilada hasta la marca de 1000 mL, se agitó hasta disolver. Se almacenó la disolución en una botella de vidrio ámbar de 1000 mL. 3.2.1.5. Disolución de ortofenantrolina (0.1 – 0.3 % m/v) Para preparar 1 L, se pesó 1-3 g de ortofenantrolina y se agregó agua destilada hasta la marca de 1000 mL, se agitó hasta disolver. Se guardó la disolución en una botella de vidrio de 1000 mL. 3.2.1.6. Muestras artificiales de agua Previo a la validación del método, se preparó tres muestras artificiales, que consistían en agua destilada o potable del grifo a la cual se le agregó una pequeña cantidad de hierro. En el Cuadro 2 se detalla la elaboración de estas disoluciones. Cuadro 2. Preparación de las disoluciones incógnita utilizadas para validar la determinación de hierro en agua potable mediante el uso del teléfono Samsung A51. Designación Alícuota para análisis (mL) Preparación A 6.50 4 mL de disolución de Fe (II) (250 mg·L-1), más agua destilada hasta V Final= 200 mL. B 6.50 1 mL de disolución de Fe (II) (1000 mg·L-1), más agua destilada hasta V Final= 200 mL. C 10.00 200 mL de agua de tubo más 0.6 mL de disolución de Fe (II) (1000 mg·L-1). 3.2.1.7. Proceso de muestreo Previamente, se alistó botellas plásticas de 125 mL, fue añadido 1 mL de HNO3 concentrado a cada una. Se tomó una muestra de agua de grifo del 46 Laboratorio 0209, para su posterior análisis. Esto se logró, dejando correr el agua (flujo intermedio) por un minuto y llenando el contenedor hasta el nivel marcado previamente (100 mL). En el próximo paso, se ejecutó un muestreo en tres puntos de la Clínica Dr. Solón Nuñez Frutos: baño de mujeres y pila de la Sección de Serología, ambos ubicados en el Laboratorio Clínico. Así como en la pila central izquierda del comedor. Se dejó correr el agua (flujo intermedio) por 1 minuto y se llenó la botella hasta el nivel marcado previamente (100 mL). Las muestras fueron refrigeradas a 4 °C hasta su posterior análisis. Para cuantificar, se midió una alícuota de 10.00 mL con una pipeta automática de 1-10 mL, en un balón aforado de 25.00 mL. 3.2.2. Desarrollo y verificación de funcionamiento de los prototipos 3.2.2.1. Fabricación de prototipos en cartón de presentación Tomando como base el trabajo realizado por João y otros (2019). Se construyó 4 cajas hechas a partir de cartón de presentación. Las mismas tenían una abertura para la cámara del celular, una base para celda de medición y el teléfono era fijado a la caja mediante ligas de hule. En el caso de los prototipos 1.1.0 y 3.1.0, estos tenían un fondo blanco. Su principal diferencia era que en el primero el celular estaba en posición invertida y en el segundo estaba recto, con respecto a la celda (ver Figura 15). Para la caja 2.1.0, el fondo era negro y el celular estaba en posición invertida. Para la caja 4.1.0, el celular se encontraba por encima de la celda, esta consistía en una cuchara de medida de 15 mL modificada. Además, a las cajas 1.1.0, 2.1.0 y 3.1.0, se les acopló una fuente de luz, que consistía en 12 tiras Led interconectadas y pegadas en un cartón de presentación (36 luces en total). En el caso del prototipo 4.1.0, la fuente tenía 14 tiras Led interconectadas (42 luces en total) y estaba incorporada a la estructura de la caja. Las especificaciones de estos prototipos se indican en el Cuadro 3. 47 Figura 15. Ejemplificación de las posiciones recta e