Ficha Técnica Cuantificación espectrofotométrica de! cloruro en suero mediante reacción con tiocianato de mercurio K A R L S C H O S I N S K Y N E V E R M A N N , Ph.D.* ; Lic . A L I C I A CHAVES CHAVARRÍA*; M A N U E L JIMÉNEZ DÍAZ, Ph.D.*; Lic . I L E A N A H O L S T S C H U M A C H E R * ; K T T - T X T I . V * * íífSíK C O X ALVARAbo** ; Lic . ZAIDA MORA C A S T R O - y Lic. SANDRA V A L V E R D E N Ú N E Z - * Departamento de Análisis Clínicos, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica. ** Caja Costarricense del Seguro Social. , Introducción u n espectrofotometro p a r a los análisis de r u t i n a . A u n más, estos métodos ut i l i zan re - E l anión que se encuentra en mayor con- activos de bajo costo y gran estabilidad. centración en el fluido extracelular es el ion De éstos, e l método más uti l izado es el cloruro ( i ) (2), por lo que juega un papel i m - de Levinson (5) (9) (15), que se basa en el p o r t a n t e en r e g u l a r l a distr ibución de l desplazamiento cuant i tat iva del tiocianato agua, l a presión osmótica y el balance anió- unido a l mercurio, por el anión cloruro, for- nico-catiónico (2). mando cloruro de mercurio . E l t iocianato L o s métodos más usados ac tua lmente reacciona con n i t rato férrico produciendo p a r a l a cuantificación de cloruro en suero, tiocianato de hierro I I I , de color rojo l a d r i - se fundamentan en l a poca solubilidad que llo, cuya absorbancia se determina espectro- presentan las sales de cloruro de plata (3-5) fotométricamente a 460-480 n m (9). L a sen- y en l a ba ja ionización de las sales de cloru- sibilidad y e l intervalo analítico se a justan ro de mercurio (7-9). mediante u n exceso de ion mercurio. E l clo- Los métodos titrimétricos p a r a el análi- ruro se combina primero con iones de mer- sis de cloruro en fluidos biológicos, se basan curio libres, para luego desplazar a l tiocia- en l a titulación manua l con nitrato de mer- nato del tiocianato de mercurio (9). curio (S) (JO) y en l a titulación coulométri- Los métodos colorimétricos basados en ca-amperométrica (11). Otros tipos de técni- este principio han sido ampliamente usadas cas incluyen la dilución isotópica (12), l a del electrodo ion selectivo (13) y las técnicas co- en sistemas automatizados. L a s principales lorimétricas que ut i l i zan reactivos libres de desventa jas de éstos e s t r i b a n en l a poca mercurio sensibil idad p a r a el análisis de cloruro en (14). sudor o en agua y en que e l intervalo analí- L a s desventajas del método titrimétrico tico abarca valores de 80 a 120 mmol /L (2), manual , radican en l a lentitud y en la poca por lo que e l método no cumple l a ley de reproducibi l idad causada por l a subjet iv i - Lambert y Beer. Debido a lo anterior, se de- dad en l a detección del punto final de l a t i - be preparar una c u r v a de calibración para tulación. cada serie de análisis y determinar frecuen- Los métodos coulométrico-amperométri- temente el intervalo analítico cada vez que co y el electrodo ion selectivo, requieren de se uti l icen reactivos de diferentes lotes. equipo costoso que no se j u s t i f i c a , funda- mentalmente en laboratorios pequeños que Por lo tanto, consideramos de suma i m - anal i zan un número limitado de muestras. portancia modificar el método de Lev inson con el propósito de ev i tar los inconve- S i n embargo, las técnicas colorimétricas nientes mencionados. E s t a s modificaciones pueden ser uti l izadas en estos laboratorios, que sólo disponen de u n fotómetro o bien de ahorrarán reactivos, tiempo y por ende cos-tos. Además permitirán incorporar l a meto- ACTA BIOQUÍMICA CLÍNICA LATINOAMERICANA. Vol. XXIX, N° 4, 541-549 1995 Incorporada al Chemical Abstract Service. Código bibliográfico- ABCLDL ISSN 0325-2957 541 ACTA BIOQUÍMICA CLÍNICA LATINOAMERICANA VOL. XXIX, N= 4,1995 dología a sistemas de análisis automatiza- de 100 m L que contenga 50 m P de agua de- dos, s i n necesidad de comprar juegos de re - s ionizada , aforar con agua desionizada y activos comerciales a u n alto costo. mezclar. 4. Nitrato de Mercurio, 0,2 mol /L. Disol - ver 4,33 g de óxido de mercurio rojo Q. P. Fundamento (Fischer Scientific Company), con 10 m L de ácido nítrico concentrado caliente, en u n ba- E l fundamento del método se i lus t ra con lón aforado de 100 m L , enfriar y aforar con las siguientes ecuaciones: agua desionizada. 1. HgCSCN)2 + 2 C 1 — H g C l 2 + 2 S C N - 5. Solución de Trabajo: en u n a balón afo- 2. 3 S C N - + Fe+3 " — * é Fe(SCN)3 rado de 1.000 m L agregar 900 m L de agua color rojo ladrillo desionizada y 8 m L de ácido nítrico concen- trado. Mezclar y añadir 48 m L de l a solu- ción de nitrato férrico con agitación cons- Materiales y métodos tante y 14 m L de l a solución de tiocianato de potasio. De l a m i s m a forma agregar 14 A. EQUIPO m L de l a solución de nitrato de mercurio I I . L a s lecturas espectrofotométricas se rea- Ajustar esta solución a 0,230 ± 0,030 de ab- l i zaron en u n espectrofotometro B e c k m a n sorbancia contra agua, añadiendo gota a go- modelo 34 ( B e c k m a n Ins t ruments , F u l l e r - t a solución de t i o c ianato de potasio 0,4 ton, C A 92634). mol /L a una longitud de onda de 460 n m s i l a absorbancia es inferior a 0,200, o nitrato de mercurio 11 s i ésta es mayor de 0,260. ñ. LAVADO DELA CRISTALERÍA E s t a solución es estable a l menos durante L a cristalería se sumergió durante 12 seis meses a 25 °C, s i se mantiene en bote- horas en i m a solución de ácido nítrico a l 25 l l a ámbar. % (v /v ) y posteriormente fue escrupulosa- 6. Patrón de cloruro, 100 mmoPL. Disol - mente lavada con agua destilada. v e r 0 ,5845 g de c loruro de sodio (grado A C S ) prev iamente desecado, en u n balón C. MUESTRAS DESUERO aforado de 100 m P con 50 m L de agua de- P a r a evaluar el desempeño anaKtico del sionizada, mezclar y aforar. Se recomienda métodó, se obtuvo l a sangre en tubos de v i - desecar l a sa l en homo a 100 °C durante drio s i n anticoagulante, se dejó reposar has - dos horas. t a l a formación del coágulo, se centrifugó y se extrajo el suero. Se uti l izaron sueros con £ PROCEDIMIENTO niveles normales de b i l i rrubina , hemoglobi- 1. Preparar diluciones 1:11 del patrón y n a y triglicáridos. P a r a obtener el intervalo de los sueros con agua desionizada. de re ferenc ia , se a n a l i z a r o n muest ras de 2. Colocar'3,0 m L de l a solución de t r a - suero de 146 adultos ambulatorios s in pato- bajo en l a cubeta. Medir l a absorbancia de logía aparente. este blanco de reactivos contra agua a 460 Los sueros son estables en tubos t a p a - nm. dos, por lo menos* cuatro horas a 25 °C, dos 3. A d i c i o n a r 20 p l de patrón de 100 días a 4 °C y varios meses a —10 °C (9). m m o l / L de cloruro p r e v i a m e n t e d i lu ido . Mezclar suavemente por inversión y medir D. REACTIVOS l a absorbancia a 460 nm. 1. Acido Nítrico Concentrado: 60 % (p/v), 4. Repetir los pasos 2 y 3, pero sust i tu - grado analítico ( E . Merck Darmstadt) . yendo l a solución patrón por 20 p L de l a 2. Nitrato Férrico: 1 mol/L, Disolver 40,4 g muestra di luida. de FeíNOalg.OHsO (Garlo E l b a Milano), en 5. P a r a el análisis de cloruros en sudor, i m balón aforado de 100 m L que contenga se debe usar 10 p L de muestra s i n dilución 40 m L de agua desionizada, aforar con agua previa y multipl icar l a absorbancia obteni- desionizada y mezclar. da por 0,18. P a r a obtener los va lo res en 3. Tiocianato de Potasio, 0,4 mol /L . D i - mmol /L, se ut i l i za l a concentración y l a ab- solver 3,89 g de tiocianato de potasio puro sorbancia del patrón, según el procedimien- ( E . Merck Darmstadt) en una balón aforado to descrito para suero. 542 DETERMINACIÓN DE CLORURO CON TIOCIANATO DE POTASIO 6. Interferencias debidas a concentracio- concentraciones de Fe(N03)3 en l a solución nes de hemoglobina de 100 a 500 mg/dL, se de color, se demostró que concentraciones corr igen agregando 50 p L de n i t r a t o de de 40 a 80 mmol /L no afectan l a l ineal idad mercur io 0,2 m o l / L después de l a l e c tura del método. S i n embargo, a l a u m e n t a r l a del producto final coloreado. E s t a absorban- concentración de FeCNOgla se produce u n l i - c i a leída contra agua , debe m u l t i p l i c a r s e gero aumento de las pendientes, por lo que por 1,016 y res tarse a l a absorbancia del se recomienda ut i l i zar u n a solución de 60 producto final coloreado. mmol /L (ñg. 2). 5. Tiocianato de mercurio: E n l a figura 3 F. CÁLCULOS se observa que el aumentar l a concentra- A m - A b - ción de tiocianato de mercurio, auinenta el Cloruro en suero (mmol/L) - xlOO i n t e r v a l o de l i n e a l i d a d de l método. U n a A p - A b concentración de H g ( S C N )2 de 2,8 mmol /L , Cloruro en sudor Am-Áb permite que se cumpla l a ley de L a m b e r t - (mmol/L) X100 X 0,18 Beer, h a s t a u n a concentración de 250 mmol A p - A b de ion cloruro por l itro de suero. A m = Absorbancia de l a muestra 6. Intervalo analítico: Uti l izando las con- Ap ^ Absorbancia del patrón centraciones óptimas previamente estable- = Absorbancia del blanco cidas p a r a el reactivo de color, se demostró 100 = Concentración del patrón de cloruro que el intervalo analítico del método es de en mmol /L a l menos de O a 250 mmol /L (fíg. 3 ) . 0,18 = Factor de dilución (3,01/3,02 x l / l l E s t e mismo comportamiento se observó x 2 / l ) . a l adicionar volúmenes crecientes de 5 j i L del suero diluido a 3,0 m L de reactivo de co- lor. Resultados 7. Temperatura: A l aumentar l a tempe- r a t u r a aumenta l a absorbancia del producto L a s condiciones usadas p a r a cada experi- final de l a reacción. Cuando las absorban- mento son las mismas que se especifican en cias de u n a muest ra de suero y de u n pa- el procedimiento, a menos que se indique en trón son leídas a l a misma temperatura, l a el texto alguna variación. concentración ca l cu lada de cloruro en l a J . Espectro de Absorción: L a absorbancia m u e s t r a no se a l t e ra . S i n embargo, s i las máxima se obtiene a 460 nm. Los espectros muestras se leen a temperaturas superiores de absorción del patrón y del suero mostra- a l a del patrón, los valores serán mayores ron superposición, por lo que el comporta- que el rea l y viceversa. miento del patrón en l a reacción es s imi lar 8. Efecto de algunos componentes séri- a l que presenta el suero. cos: 2. Tiocianato de potasio: Se demostró que a) Halógenos: Se evaluó el efecto del bro- l a concentración mínima de t iocianato de muro de potasio, yoduro de sodio y fluoruro potasio es de 5,6 mmoI/L. S i n embargo, debi- de sodio. Esto se logró agregando diferentes do a que trazas de nitrato de mercurio con- cantidades de cada imo de ellos, a u n a serie sumen ion cloruro, es necesario t i tu lar el re- de alícuotas de un suero humano activo de color con l a solución de tiocianato E n l a tabla I se muestra que tanto el yo- de potasio 0,4 moFL, has ta obtener una ab- duro como el bromuro interf ieren equimole- sorbancia de 0,230 ± 0,030 leída contra agua cularmente , produciendo u n error positivo a 460 n m (fig. 1). en los resultados. S i n embargo, no se obser- 3. Ácido nítrico: Se prepararon var ias so- v a interferencia por fluoruro (estos datos no luciones de trabajo con diferentes concentra- se inc luyen en la tabla) . ciones de HNOg. Analizando soluciones pa - b) B i l i r rub ina , hemoglobina y tríglicéridos trón de cloruro de 50, 100 y 145 nmoFL, se no producen interferencia en concentraciones demostró que el HNOg, es necesario para que de 15, 100 y 800 mg/dL, respectivamente. I n - la línea de l a curva de calibración pase por el terferencias debidas a concentraciones de he- origen y mantenga el intervalo de linealidad. moglobina de 100 a 500 mg/dL se corrigen L a concentración óptima de ácido nítrico fue utilizando blanco de muestra, y los produci- de 112 mmol/L. dos por triglicérídos de 800 a 1.200 mg/dL no 4. Nitrato férrico: A l u t i l i z a r diferentes supera el 3,8 por ciento. 543 ACTA BIOQUÍMICA CLINICA LATINOAMERICANA VOL XXIX, N° 4.1995 oc •B b < 100 150 200 250 Ch (mmol/L) FlG. 1. Efecto de la absorbancia del reactivo de color en la linealidad del método. TABLA I . E F E C T O D E L l O D U R O Y D E L BROMURO E N L A CUANTIFICACIÓN D E L I O N C L O R U R O . Cloruro (mmal/L) Sin aditivo Con aditivo Interferencia^ loduro (mmol/L) 5,7 85,2 89,8 0,81 8,5 85,2 93,5 0,97 11,3 85,2 96,4 0,99 17,0 85,2 103,6 1,08 - x = 0,96 Bromuro (mmol/L) 6,6 88,6 95,2 1,0 9,8 88,6 99,1 1,07 13,1 88,6 101,2 0,96 19,6 88,6 111,0 1,14 X = 1,04 valor aditivo — valor sin aditivo B Interferencia (mmol/L) = cantidad de halógeno agregado 9. Recuperación: L a tabla I I muestra que trac iones aprox imadas de ion cloruro en a l agregar de 25 a 100 mmol de cloruro por suero de 70, 100 y 130 mmol /L. litro de suero, se obtuvo porcentajes de re - 11. Estudio comparativo: L a figura 4 cuperación de 99,4 a 100,6 por ciento (x = muestra el estudio comparativo del método 99,8 % ) . propuesto con el método amperométrico- 10. Imprecisión: L a tabla I I I muestra las coulométrico (14) usado como referencia, en imprecisiones obtenidas en un mismo día y muestras de suero con concentraciones de día a día, en sueros que contem'an concen- cloruro de 75 a 120 mmol /L . 544 . DETERMINACIÓN DE CLORURO CON TIOCIANATO DE POTASIO 0.3 P 80 mmol/L - i - 60 mmol/L ^ 40 mmol/L --- 20 mmol/L 0.2 'oc nr a om < 100 150 CI-- (mmol/L) F I G . 2. Efecto del nitrato férrico en la linealidad del método. E l estudio comparativo se llevó a cabo en los 18 y los 60 años. Los inten-alos de refe- 46 mues t ras de suero utlízando l a misma rencia (x ± 2DS) obtenidos son los siguien- solución patrón p a r a ambos métodos. Los tes: mujeres 102,5 ± 5,6, hombres 101,3 ± resultados obtenidos fueron los siguientes: 5,0 e incluyendo ambos sexos 101,8 ± 5,5 y =0,987 X Cmmol/L) + 2,9 (mmol/L) . mmol/L. E l coeficiente de correlación ( r ) fue de 0,988 y e l error estándar del estimado (Sy^) Discusión y conclusiones de 1,824 mmoVL. L a concentración de nitrato de mercurio 12. Intervalo de referencia: Se utilizó una agregada a l reactivo de color, disminuye La muestra aleatoria de una población aparen- sensibilidad del método y establece el inter - temente s a n a , que consistió en sueros de 146 personas (50 mujeres y 96 hombres) , valo de l inealidad (77). cuyas edades estaban comprendidas entre Varios métodos h a n sido desarrol lados basados en l a reacción del tiocianato, per- TABLA I I , R E C U P E R A C I Ó N A N A L Í T I C A D E L I O N C L O R U R O E N S U E R O . Concentración del ion cloruro (mmol/L) Agregada Obtenida Calculada % recuperación^ O 91.7 — 25 116,0 116,7 99,6 50 141,4 141,7 99.4 75 166,3 166,7 99,5 100 192,3 191,7 100,6 x = 9 9 , 8 a % recuperación = 100 (valor obtenido - 91,7)/cloruro agregado. 545 ACTA BIOQUÍMICA CLÍNICA LATINOAMERICANA VOL. XXIX, N= 4,1995 0,5 — 0,4 mmol/L T- 1,2 mmol/L 2,0 mmol/L 2,8 mmol/L 'co ce X I 100 150 250 C l - (mmol/L) PlG. 3. Curva de calibración de cloruro por el método colorimétrico usando "diferentes concentraciones de HgCSCN)2. TABLA JH. IMPRECISIÓN E N L A DETERMINACIÓN D E L ION CLORURO POR E L MÉTODO E N ESTUDIO. Mismo día (n = 21) Día adia(n= 21) mmol/L mmol / L X DS CV% X DS CV% 77,3 0,96 0,96 77,5 1,29 1,67 104,1. 1,10 1,10 102,7 1,64 1,60 128,7 1,52 1,52 130,5 2,04 1,57 mitiendo l ineal idad entre 80 y 120 mmol de permite que se cumpla l a ley de L a m b e r t - cloruro por l itro de suero, por lo que mues- Beer has ta 250 mmol de cloruro por litro de t r a s con niveles fuera de este intervalo de- suero. ben ser concentradas o d i lu idas , según e l E s t a modificación elimina la necesidad de caso (18-21). _ , preparar constantemente curvas de calibra- Debido a esto se tñratará de establecer las ción y permite cuantiñcar la concentración de condiciones adecuadas a l método colorimé- ion cloruro en diferentes fluidos biológicos, trico que permit i eran obtener una l i n e a l i - sin tener que alterar el volumen de muestra dad continua h a s t a aproximadamente 250 agregado. mmol /L . L a longitud de onda en l a cual se obtiene Esto se logró eliminando el exceso de n i - l a máxima absorbancia es de 460 n m , con trato de mercurio , mediante l a adición de u n a meseta entre 450 y 470 n m , lo que per- tiocianato de potasio hasta obtener i m a ab- mite el uso de fotómetros que tengan incor- sorbancia del reactivo de color de 0,230 ± porados filtros de 450 n m . 0,030 leído contra agua a 460 nm. A l eva luar el método propuesto, se en - E s t e exceso de tiocianato de potasio ga- contró que l a intensidad del producto final r a n t i z a que todo el nitrato de mercurio íne coloreado depende en g r a n medida de l a transformado en tiocianato de mercurio y temperatura. Como l a absorbancia aumen- 546 DETERMINACIÓN DE CLORURO CON TIOCIANATO DE POTASIO 125 - 100 o B E, I O _oo" i— E io_ oo •o oa O 25 50 75 100 125 Método coulométrico-amperométrico, C|- (mmol/L) FlG. 4. Regresión lineal del estudio comparativo entre un método amperométrico-coulométrico y el mé- todo colorimétrico. t a a l aumentar l a temperatura, el patrón y te el total de halógenos en suero no contri- l a muestra deben leerse a l a misma tempe- buye en más del uno por ciento, por lo que r a t u r a , de lo contrario se obtiene u n error s u efecto es insignificante {18} (29). de aproximadamente 0,5 mmol /L por cada Pseudohipercloremias pueden ser el r e - grado centígrado de diferencia entre el pa- sultado del uso de drogas que contengan trón y l a muestra . E s t e mismo efecto se re - bromuro o bien por ingestión del mismo. E s - porta en el método descrito por Anderson y t a interferencia se presenta en var ias técni- Mi l lar (5) . cas, por lo que pueden producir errores i m - Debido a l a a l t a sensibil idad de l a reac- potantes en l a interpretación del análisis de ción, se debe d i lu ir l a muestra previamente cloruro en suero (23-27). 1:11 con agua desti lada, siendo a l a vez uno E n el método propuesto, se observa que de los inconvenientes del método. S i n em- el bromuro y el yoduro interf ieren equimo- bargo, esta propiedad permite cuantiñcar lecularmente, produciendo u n error positivo el ion cloruro en muestras con niveles muy en los resultados (tabla I ) . S i n embargo, u n bajos del anión, como por ejemplo en sudor valor elevado de cloruro sérico será l a p r i - p a r a e l diagnóstico de enfermedad fíbro- mera o única clave que evidencie u n posible quística del páncreas (22) . Publ i cac iones bromismo. Por lo tanto, bay c ierta jus t i f i ca - previas, describen l a formación de precipi- ción en ut i l i zar métodos de laboratorio para tado cuando e l suero es adicionado al reac- el análisis de cloruro sensibles a l a interfe- tivo (29) (20). P a r a e l i m i n a r este efecto, rencia por bromuro (27), H a m i l t o n (20) sugirió l a adición de ácido Komaiko, Husse in , Brecber y col. (26) re - perclórico y urea al reactivo. E s t e efecto i n - portan que una brecha aniónica negat iva , terferente no se presenta en el método des- es c a u s a d a pos ib lemente por b romismo . crito, debido a l a a l t a dilución del suero con. Drogas que contienen bromuro se u t i l i z a n agua desti lada. clínicamente en el control de enfermedades Los halógenos compiten con el cloruro agudas, miastenia gravis y glaucoma (26). por el desplazamiento del tiocianato unido E l método propuesto presenta una preci- a l mercurio, s i n embargo, proporcionalmea- sión adecuada, con coeficientes de variación 547 ACTA BIOQUÍMICA CLINICA LATINOAMERICANA V O L XXIX, N= 4 , 1 9 9 5 día a día no mayores de 1,67 %, para con- "Micromethod for analysis for chlo ""'de in physio- centraciones de 77 a 131 mmol/L. logical fluids", Clin. Chem., 2 2 , 1 . 3 3 9 - 1 . 3 4 2 , 1 9 7 6 . L e v i n s o n C9) reporta coeficientes de v a - 5. A N D E R S O N , F . P. and M I L L E R , W. G . , "Chloride", in: riación de 2,5 y 2 % para concentraciones de Kaplan, L . A. and Pesce, A. J . (eds.), Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation, The 105 y 111 mmol /L respectivamente, io que C.V, Mosby Company, St. Louis, Missouri, second demuestra que el método propuesto posee edition, 8 7 2 - 8 7 5 , 1 9 8 9 . menor imprecisión. A u n más, recientemen- 6. D I E T Z , A. A. and E P P E R S O N , E . B . , "Chloride: cou- te Legaz y colaboradores desarrol laron u n lorímetric amperoraetric method", in: Faulkner, método colorimétrico con reactivos libres de W. R. and Meites, S . (eds.), Selected methods of mercur io (14). E s t o s autores encontraron Clinical Chemistry, vol. 9 , 1 4 9 - 1 5 2 , 1 9 8 2 . coeficientes de variación de 1,76 y 2,93 %, 7. H A M I L T O N , E . H . , "Direct photometric method for en muestras analizadas en un mismo día y chloride in serum, employing mercuric thiocyana- día a día, respectivamente. te and percloric acid", Clin. Chem., 7, 5 8 1 - 5 8 7 , E l método muest ra una a l ta correlación 1 9 6 1 . con e l a m p e r o m é t r i c o - c o u l o m é t r i c o de 8. S C H A L E S , 0 . and S C H A L E S , S . S . , "Chloride" , Stand. Methods Clin. Chem., l, 3 7 - 4 2 , 1 9 5 3 . Cotlove (25). A l comparar 46 muestras con 9. L E V I N S O N , S . S . , "Chrloríde, colorimeric method", v a l o r e s de c loruro sérica entre 75 y 120 in Faulkner, W. R. and Meites, S . (eds.), Selected mmol /L , por ambos métodos, el coeficiente Methods of Clinical Chemistry, American Asso- de correlación fue de 0,988 y l a ecuación de ciation for Clinical Chemistry, Washington, D D , regresión l inea l Y = 0,987 X (mmol/L) + 2,9 vol. 9 , 1 4 3 - 1 4 8 , 1 9 8 2 . m m o l / L , Determinando el va lor calculado 10. K L E I N , B . , "Chloride", Stand. Methods Clin. p a r a u n a concentración de c loruro de 96 Chem., 2 , 2 2 - 2 5 , 1 9 5 8 . mmol/L, se obtiene un valor de 97,6 mmol /L 11. 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