Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 doi: http://dx.doi.org/10.15517/am.v27i2.24361 EVALUACIÓN DE FERTILIZANTES AGRÍCOLAS EN LA PRODUCTIVIDAD DE LA MICROALGA Chlorella sorokiniana1 Ana Margarita Silva-Benavides2 RESUMEN ABSTRACT Evaluación de fertilizantes agrícolas en la productivi- Evaluation of agricultural fertilizers on the dad de la microalga Chlorella sorokiniana. El objetivo del productivity of microalgae Chlorella sorokiniana. The aim presente trabajo fue evaluar la productividad de la microalga of this study was to evaluate the productivity of microalgae verde Chlorella sorokiniana UTEX 1230 con fertilizantes Chlorella sorokiniana UTEX 1230 with two different foliar foliares usados en la agricultura y la comparación con el fertilizers used in agriculture and the comparison with the medio nutritivo Kolwitz (K3). Las variables evaluadas fueron nutrient medium Kolwitz (K3).Variables assessed were cell el crecimiento celular, la productividad, la concentración de growth, productivity, chlorophyll concentration, fluorescence clorofila, la fluorescencia (Fv/Fm), proteínas y carbohidratos. (Fv/Fm), proteins, and carbohydrates. Two commercial Se usaron dos fertilizantes comerciales con la composición fertilizers with NPK 20-20-20 and NPK 22-10-7 formula química NPK 20-20-20 y NPK 22-10-7 como medios nutriti- were used as nutrient media. The study was conducted at the vos. El experimento se realizó en el Instituto de Estudios para Institute of Ecosystem Studies, Florence, Italy, in 2014. Each los Ecosistemas, Florencia, Italia durante el año 2014. Cada experiment was repeated five times using three replicates in experimento se repitió cinco veces con tres réplicas cada uno, each experiment under a light intensity of 150 μmol photons a una intensidad lumínica de 150 μmol fotones m2/s, tempe- m2/s, temperature 28 °C and CO2/air (2:98v/v). The culture ratura de 28 °C y CO2/aire (2:98 v/v). Con cada fertilizante se media were prepared by using the following fertilizers: 1) diseñaron los siguientes tratamientos: 1) NPK 20-20-20 (1,00 NPK 20-20-20 (1.00 g/l) + 0.27 g/l MgSO4.7H2O, 2) NPK g/l) + 0,27 g/l MgSO4.7H2O, 2) NPK 22-10-7 (+2 MgO) (1,00 22-10-7 (+2 MgO) (1.00 g/l) + 0.27 g/l MgSO4.7H2O, 3) g/l) + 0,27 g/l MgSO4.7H2O, 3) NPK 22-10-7 (+2 MgO) (1,00 NPK 22-10-7 (+2 MgO) (1.00 g/l), 4) NPK 20-20-20 (1.00 g/l), 4) NPK 20-20-20 (1,00 g/l). Se utilizó el medio nutritivo g/l). The nutrient medium Kolwitz (K3) was used as a Kolwitz (K3) como control. Las mayores concentraciones control. Higher cell concentrations, productivity, chlorophyll, celulares, productividad, clorofila, fluorescencia, proteínas fluorescence, proteins, and carbohydrates were obtained in y carbohidratos, se cuantificaron en los medios provistos de cultures grown in the media prepared with magnesium sulfate sulfato de magnesio (NPK 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/l (NPK 20-20-20 (1.00 g/l) + 0.27 g/l MgSO4.7H2O, and MgSO4.7H2O, y NPK 22-10-7 (+2 MgO) (1,00 g/l) + 0,27 g/l NPK 22-10-7 (+2 MgO) (1.00 g/l) + 0.27 g/l MgSO4.7H2O). MgSO4.7H2O). Los menores crecimientos de la biomasa se Lower biomass growth was obtained in cultures lacking observaron en los tratamientos carentes de este compuesto. El magnesium sulfate. Sulfide and magnesium, as well as the sulfuro y el magnesio tuvieron efecto positivo en el crecimien- amounts of urea and ammonia in the chemical composition to y rendimiento del cultivo; así como las cantidades de urea y of each fertilizer, had a positive effect on the culture growth amonio en la composición química del fertilizante. and productivity. Palabras clave: fluorescencia de la clorofila, Keywords: chlorophyll fluorescence, microalgal productividad microalgal, nitrógeno total, sulfato de productivity, total nitrogen, magnesium sulfate. magnesio. 1 Recibido: 7 de mayo, 2015. Aceptado: 2 de setiembre, 2015. Este trabajo forma parte de una investigación de la autora en el Instituto de Estudios para los Ecosistemas, Florencia, Italia. 2 Universidad de Costa Rica, Escuela de Biología, Centro de Investigación en Ciencias del Mar y Limnología, San Pedro, San José 2060, Costa Rica. ana.silva@ucr.ac.cr © 2016 Agronomía Mesoamericana es desarrollada en la Universidad de Costa Rica y se encuentra licenciada con Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Costa Rica. Para más información escríbanos a pccmca@ucr.ac.cr SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana INTRODUCCIÓN costos de operación, según Jad-Allah (2012), y entre 10-30% según Borowitzka (1999). Por consiguiente, Las cianobacterias (procarioticas) y algas una alternativa es usar medios de enriquecimiento microscópicas (eucariotas) representan productores como los fertilizantes agrícolas; especialmente cuando primarios importantes en la naturaleza y forman se trabaja con volúmenes grandes de biomasa en la base de la cadena alimenticia en ambientes ambientes externos, pues son económicos y contienen acuáticos. Chlorella sorokiniana es una microalga incorporados en su preparación macronutrientes, verde unicelular, no flagelada, esférica, con 2-10 micronutrientes y vitaminas indispensables para el μm de diámetro, del phylum Chlorophyta (Schubert, crecimiento de las microalgas (Richmond, 1999). 2003). Este género se ha estudiado ampliamente Estudios han demostrado la eficiencia de desde el punto de vista de producción de lípidos para fertilizantes foliares como medios nutritivos en biodiesel, biorremediación, suplemento alimenticio y cultivos microalgales, cuyos resultados, en términos en medicamentos (Becker, 2013; Borowitzka, 2013; de productividad de la biomasa, son mayores o Liu y Hu, 2013). equivalentes con respecto a los medios nutritivos Con el propósito de obtener un buen crecimiento preparados a partir de reactivos químicos celular de las microalgas es indispensable el suministro convencionales como el BG11 y F/2 (Nieves et al., de nutrimentos en cantidades adecuadas (Abalde et 1996; Simental y Sánchez, 2003; Sánchez et al., 2008; al., 1995; Grobbelar, 2013). Los medios nutritivos Ortiz et al., 2011; Jad-Allah, 2012). están compuestos básicamente de macronutrientes El objetivo del presente trabajo fue evaluar la (nutrimentos esenciales para la formación estructural productividad de la microalga verde C. sorokiniana de las moléculas, p.ej. nitrógeno, carbono, oxígeno, UTEX 1230 con fertilizantes foliares usados en fósforo, hidrógeno, magnesio, calcio, potasio y agricultura usados en la agricultura y la comparación azufre), los elementos traza (micronutrientes que son con el medio nutritivo Kolwitz (K3). adquiridos por las células en cantidades mínimas, necesarios para la activación de algunas enzimas, p.ej. hierro, manganeso, cobre, cobalto y molibdeno) MATERIALES Y MÉTODOS y vitaminas (biotina, B12 y tiamina), preparados como soluciones patrones (Watanabe, 2005) y cuyas Diseño del experimento concentraciones varían principalmente del objetivo de estudio y la especie de microalga (Richmond, 1999). La investigación se realizó en el Instituto de El carbono, nitrógeno y fósforo son considerados los Estudios para los Ecosistemas, Florencia, Italia, nutrimentos limitantes para el crecimiento microalgal durante el año 2014. Se utilizó la microalga Chlorella en aplicaciones biotecnológicas (Grobbelar, 2013). sorokiniana UTEX 1230 disponible en la algoteca de Con el propósito de obtener productos de alto este instituto. valor agregado como lípidos, proteínas, carbohidratos Los experimentos se diseñaron como cultivos y pigmentos que pueden ser utilizados desde el discontinuos. Para la preparación de cada experimento punto de vista de la comercialización, es necesario las células crecieron previamente en medio nutritivo producir biomasa a gran escala (Schenk et al., 2008; Kolwitz (K3), se cosecharon en fase logarítmica, Liu y Hu, 2013). Este escalamiento a volúmenes centrifugadas y lavadas tres veces con agua destilada mayores, implica una alta demanda de reactivos de para eliminar los nutrimentos contenidos en el medio óptimo grado analítico y un consumo considerable original K3. de hombre-tiempo que conlleva la preparación de Se emplearon dos fertilizantes granulados los medios nutritivos, los cuales son costosos si se utilizados comúnmente en la agricultura NPK 22 tienen que adquirir en grandes cantidades, lo que -10-7 (+2 MgO) y NPK 20-20-20. Ambos poseen en eleva los costos de producción de los cultivos de las la composición química nitrógeno total (N), óxido microalgas (Molina et al., 2003; Simental y Sánchez, de fósforo (P2O5) y óxido de potasio (K2O7). Se usó 2003; Borowizka, 2005). La preparación de los medios el medio de cultivo convencional Kolkwitz (K3) de cultivo a gran escala representa un 30-40% de los como control (Concas et al., 2012). Los fertilizantes 2 66 Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana usados carecen de sulfato de magnesio y el fertilizante con presencia y ausencia de sulfato de magnesio NPK 22-10-7 (+2 MgO) posee en su composición (MgSO47H2O). Para preparar los tratamientos se agregó óxido de magnesio (2%). Los fertilizantes utilizados 1,00 g/l de cada fertilizante en volúmenes de 400 ml de contienen microelementos como el boro, cobre, hierro, agua destilada estéril. En los tratamientos con sulfato manganeso, zinc y molibdeno que son importantes para de magnesio se agregó 0,27 g/l de este compuesto, el crecimiento de la biomasa. El medio nutritivo K3 equivalente a la concentración que se encuentra en el contiene en su fórmula química el compuesto de sulfato medio K3. Los tratamientos fueron los siguientes: de magnesio. La caracterización y las concentraciones de cada especie química de los fertilizantes y el medio 1) NPK 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/l MgSO4.7H2O nutritivo K3 se describen en el Cuadro 1. 2) NPK 22-10-7 (+2MgO) (1,00 g/l) + 0,27 g/l Se compararon cuatro tratamientos los cuales MgSO4.7H2O consistieron en la combinación de cada fertilizante 3) NPK 22-10-7 (+2MgO) (1,00 g/l) Cuadro 1. Composición química de los fertilizantes agrícolas NPK 22-10-7 (+2 MgO), NPK 20-20-20 y medio nutritivo Kolwitz (K3). Italia. 2014. Table 1. Chemical composition of agricultural fertilizers NPK 22-10-7 (+2 MgO), NPK 20-20-20 and nutrient medium Kolwitz (K3). Italy. 2014. NPK 22-10-7 (+2MgO) NPK 20-20-20 Kolwitz (K3) Microelementos y magnesio Microelementos Microelementos y sulfato de magnesio Nitrógeno total: 22% (8,4% nítrico; Nitrógeno total: 20% (6% nítrico, Nitrógeno total: 9% 3,6% urea, 10% amonio) 8,8% urea, 5,2% amonio) P2O5 100,00 g/l P2O5 200,00 g/l K2HPO4 0,420 g/l (P= 4,3%) (P= 8,7%) (P=3%) (K= 7%) MgO 20,00 g/l 1,00 g/l Mg SO4 7H2O 0,270 g/l (Mg= 1,2%) (Mg=1,10%) (S= 1,43%) K2O 70,00 g/l K2O 200,00 g/l KNO3 1,710 g/l (K=5,7%) (K=16,5%) (K= 26%) Microelementos B 0,10 g/l B 0,50 g/l H3BO3 2,860 g/l Cu 0,10 g/l CuSO4 5H2O 0,080 g/l Cu-EDTA 0,10 g/l Cu-EDTA 0,10g/l CoCl2.5H2O 0,035 g/l Fe-EDTA 1,60 g/l Fe 2,00 g/l Fe2(SO4)3 7H2O 24,900 g/l Mn 1,00 g/l MnSO4. 4H2O 1,810 g/l Mn EDTA 0,60 g/l Mn-EDTA 1,00 g/l Zn 0,10 g/l ZnSO4.7H2O 0,222 g/l Zn-EDTA 0,10 g/l Zn-EDTA 0,10 g/l EDTA-Na 29,750 g/l Mo-EDTA 0,06 g/l Mo 0,05 g/l Na2MoO4.2H2O 0,230 g/l pH= 2,01-3,21 pH=7,02-7,50 pH= 7,20-7,50 Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 267 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana 4) NPK 20-20-20 (1,00 g/l) la oscuridad durante diez minutos; luego se colocó 5) K3 (control) un volumen de 0,50 ml en una cámara de 10 mm de longitud y se midió con un fluorómetro tipo PAM Métodos analíticos (Silva et al., 2013). Cada experimento se realizó cinco veces con Composición de la biomasa tres tubos tipo biorreactor en volúmenes de 400 ml cada uno. Las mediciones se iniciaron con una Las proteínas se determinaron con el método concentración inicial de clorofila a de 4,00 mg/l en de Lowry y Rosenbrough (1951), previa extracción el inoculo, expuestos a una temperatura de 28 °C con con hidróxido de sodio 0,1 N. Los carbohidratos una intensidad lumínica artificial de 150 μmol fotones se cuantificaron con el método según Dubois et m2/s provista con tubos blancos fluorescentes. A cada al. (1956). Los estándares usados en las curvas de cultivo se le incorporó CO2/aire en una relación 2:98 calibración correspondieron a albúmina de bovino v/v y un flujo constante de 5 l/min. El pH se midió cada para la determinación de proteínas y glucosa anhidra veinticuatro horas y se mantuvo en un valor de 7,0. para carbohidratos. En caso de una disminución del pH, este se ajustó con NaOH 1M estéril. Para evitar variaciones, todos los Análisis estadístico experimentos se realizaron en las mismas condiciones iniciales de concentración de clorofila, temperatura e Los análisis estadísticos se realizaron con el intensidad lumínica. paquete estadístico Stat Graphics Plus, versión 5.1 para Windows. Las diferencias fueron examinadas por Medición del crecimiento y productividad medio de un análisis de variancia (ANOVA) de una vía, con pruebas post-hoc de Tuckey. El crecimiento en términos de peso seco (g/l) se cuantificó a partir de volúmenes de 10 ml (en duplicado) de cada experimento, con filtros pre- RESULTADOS Y DISCUSIÓN pesados (GF/F). Los filtros con las muestras se secaron a una temperatura de 105 °C durante tres horas y se Los resultados indicaron que el crecimiento, la pesaron en una balanza de 0,01 mg de precisión. La productividad, pigmentos, fluorescencia y composición productividad (mg/l/h) se calculó según la siguiente bioquímica de C. sorokiniana estuvieron influenciadas ecuación, x1- x0/∆ t, donde x1 y x0 (mg/l/h) corresponden por la presencia de sulfato de magnesio, donde los ma- a la diferencia entre el peso seco al final e inicio del yores valores se observaron en los tratamientos que pre- experimento y ∆ t es el número total de horas. sentaron este compuesto. Las microalgas presentaron un patrón de crecimiento que involucró las fases de adapta- Pigmentos: clorofila total (mg/l) ción, logarítmica, estacionaria y declinación (Arredondo y Voltolina, 2007; Lee et al., 2013) (Figura 1). La clorofila total (mg/l) se extrajo con acetona 90% El mayor crecimiento (fase exponencial), se midió (Lichenthaler, 1987) y se midió con un espectrofotómetro. entre el cuarto y sexto día (3,25 g/l) en el cultivo con el tratamiento NPK 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/l Fluorescencia de la clorofila (Fv/Fm) MgSO4.7H2O y entre el sexto y octavo día (2,24 g/l) en el cultivo con NPK 22-10-7 (+2 MgO) (1, 00 g/l) + La fluorescencia de la clorofila (Fv/Fm = relación 0,27 g/l MgSO4.7H2O. El cultivo con el control (K3) entre la fluorescencia variable Fv con respecto a la presentó el crecimiento más alto (3,65 g/l), con una fluorescencia máxima Fm, es una herramienta confiable tendencia de crecimiento similar al primer tratamiento. para estudiar el estado fisiológico de las plantas y Los tratamientos ausentes de sulfato de magnesio microalgas (Krause y Weis, 1984; Torzillo et al., 2012; mostraron una fase logarítmica de uno-dos días, con Masojídek et al., 2013; Torzillo y Vonshak, 2013). un crecimiento menor de 1,00 g/l, y declinando entre el Para la medición del Fv/Fm cada muestra se adaptó en tercer y cuarto día, manifestando un color amarillento. 2 68 Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana Figura 1. Curvas de crecimiento (g/l) del cultivo de Chlorella sorokiniana UTEX 1230 en cuatro tratamientos con dos fertilizantes agrícolas. Italia. 2014. Letras diferentes en cada curva indican diferencia significativa a P≤0,05 una vía ANOVA. Figure 1. Growth curves (g/l) for Chlorella sorokiniana UTEX 1230 culture at four treatments with two agricultural fertilizers. Italy. 2014. Curves denoted by different letters differ significantly at P<0.05 one-way ANOVA. En términos de productividad, los cultivos con El cultivo con la combinación del fertilizante sulfato de magnesio presentaron los mayores valores NPK 20-20-20 y sulfato de magnesio, resultó el con respecto a los cultivos ausentes de este compuesto tratamiento con la mayor concentración de clorofila (P≤0,01), donde el cultivo con el tratamiento NPK total (mg/l), aunque significativamente menor que el 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/l MgSO4.7H2O fue el que control K3 (P≤0,01). Los cultivos que presentaron mostró la productividad más alta (Figura 2). menor concentración de pigmentos correspondieron a Figura 2. Productividad (mg/l/h) del cultivo de Chlorella sorokiniana UTEX 1230 en cuatro tratamientos con dos fertilizantes agrícolas. Italia. 2014. Letras diferentes en cada curva indican diferencia significativa a P≤0,05 una vía ANOVA. Figure 2. Productivity (mg/l/h) of Chlorella sorokiniana UTEX 1230 culture at four treatments with two agricultural fertilizers. Italy. 2014. The bars denoted by different letters differ significantly at P<0.05 one-way ANOVA. Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 269 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana los tratamientos que no contienen sulfato de magnesio. que se reflejó en el color amarillento de la biomasa en Relacionado con esta observación, Mellis et al. los últimos días del experimento (Figura 3). (2000), reportaron una disminución en la actividad El magnesio (Mg2+) se encuentra incorporado fotosintética en cultivos de microalgas deprovistos en la fórmula química del fertilizante NPK 22-10-7 de azufre; por consiguiente, para evitar un severo y se encuentra asociado a la estructura de la clorofila daño oxidativo en las células de las microalgas en como ión magnesio (Mg2+), aspecto fundamental en la ausencia de este elemento (Torzillo et al., 1996), y con función de esta molécula. La importancia de este ión ello una reducción en el metabolismo general de las se evidencia en la mayor concentración de clorofila y células y composición bioquímica de la biomasa, es fluorescencia en el tratamiento con el fertilizante NPK importante la adición de sulfato en la fórmula química 22-10-7(+2 MgO) (Fv/Fm 0,55) en ausencia de sulfato, del medio nutritivo. Los resultados mostraron que con respecto al tratamiento con el fertilizante NKP 20- los mayores porcentajes de carbohidratos y proteínas 20-20 (1,00 g/l) (Fv/Fm 0,43) carente de este compuesto. correspondieron a los tratamientos con sulfato de Además del sulfuro en los fertilizantes utilizados, magnesio, comparables con la biomasa creciendo es importante considerar la presencia de diferentes en el medio nutritivo K3; mientras que los valores iones de nitrógeno, especialmente amonio (NH +4 ) y menores se evidenciaron en los cultivos ausentes de urea (CH4N2O). La composición y la concentración este compuesto, situación que se reflejó en el color del nitrógeno, ya sea en forma de amonio, urea, amarillento que presentó la biomasa, indicando una nitrito y nitrato, afectan el valor del pH del medio oxidación del cultivo (Cuadro 2). nutritivo (Silva y Torzillo, 2012), el crecimiento Con el propósito de monitorear la actividad de los y la productividad de la biomasa, contenido de cultivos en los diferentes tratamientos, se realizaron proteínas, carbohidratos, clorofila y fluorescencia de mediciones de fluorescencia de la clorofila (Fv/Fm). las células (Becker, 1995; Grobbelaar, 2013). Los Los cambios más importantes se observaron en una fertilizantes usados contienen en su composición disminución de esta variable y en la productividad altas concentraciones de nutrimentos inorgánicos, en los cultivos desprovistos de sulfato de magnesio especialmente nitrógeno, el cual se encuentra en (P≤0,01) con respecto a los tratamientos provistos de diversas formas como óxido nítrico, urea y nitrógeno azufre donde alcanzaron valores de F +v/Fm cercanos o de amonio (N-NH4 ) en diferentes proporciones iguales a 0,7 y semejantes con el cultivo control (K3) (Cuadro 1). Tam y Wong (1990) han observado la (P=0,01) (Figura 3). Los bajos valores en la relación Fv/ asimilación de amonio y nitrito en la especie Chlorella Fm en los tratamientos sin sulfato (0,43 en NPK 20-20- pyrenoidosa removiendo de esta manera nutrimentos 20 (1,00 g/l) y 0,55 en NPK 22-10-7 (+2 MgO) (1,00 del medio. Estudios realizados con la microalga g/l) indicaron un “stress” fotohinbitorio en los cultivos, Dunaliella sp. reportan buenas concentraciones de Cuadro 2. Valores promedio y desviación estándar de las proteínas (%) y carbohidratos (%) de Chlorella sorokiniana UTEX 1230 en dos medios de fertilizantes evaluados. Italia. 2014. Table 2. Mean and standard deviations of proteins (%) and carbohydrates (%) of Chlorella sorokiniana UTEX 1230 in two evaluated fertilizer media. Italy. 2014. Tratamiento Proteínas (%) Carbohidratos (%) Kolwitz (K3) Control 52,08±0,07 *** 38,04 ±0,05*** 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/l MgSO4.7H2O 50,10 ±0,10*** 37,32±0,27*** 22-10-7 (+2 MgO) 1,00 g/l + 0,27 g/l MgSO4.7H2O 48,40±0,36*** 35,12±0,10*** 20-20-20 (1,00 g/l) 4,10±0,10** 2,05±0,00 n.s 22-10-7 (+2 MgO) 1,00 g/l 3,24±0,25** 1,98±0,00 n.s El nivel de significancia de las pruebas corresponde al p<0,05, n.s= no significativo / The significance level of the test was p<0.05 one-way ANOVA, n.s. = not significant. 270 Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana Figura 3. Fluorescencia de la clorofila a (Fv/Fm) del cultivo de Chlorella sorokiniana UTEX 1230 en cuatro tratamientos con dos fertilizantes agrícolas. Italia. 2014. Letras diferentes en cada curva indican diferencia significativa a P≤0,05 una vía ANOVA. Figure 3. Chlorophyll a fluorescence (Fv/Fm) of Chlorella sorokiniana UTEX 1230 culture at four different treatments with two agricultural fertilizers. Italy. 2014. Bars denoted by different letters differ significantly at P<0.05 one-way ANOVA. células en medios nutritivos ricos de nutrimentos energía para su asimilación en comparación con el (Becerra-Dórame et al., 2010) y una alta densidad de nitrito o nitrato; además, es más económico que estos Nannochloropsis gaditana en el medio F/2 enriquecido dos compuestos con sus respectivas ventajas para los con nitrato (Converti et al., 2009). cultivos a gran escala (Becker, 1995). El fertilizante El fertilizante NPK 22-10-7 contiene en su NPK 20-20-20 contiene una cantidad doblemente composición un 10% de nitrógeno-amonio, equivalente superior de este elemento (8,80%) que el NPK 22- a una concentración de 100 mg/l, mientras que el 10-7 (3,60%) (Cuadro 1), situación que beneficia fertilizante NPK 20-20-20 posee un 5,20% de este ión un aumento en la tasa de crecimiento de la biomasa (50 mg/l), y aunque es la forma preferida de nitrógeno en el cultivo con el primer fertilizante, favorecido para la asimilación por parte de las microalgas (Abalde también por el contenido de carbono en la urea que et al., 1995; Becker, 1995), cuando se presenta en promueve los procesos fotosintéticos de las células de altas concentraciones, el pH del medio disminuye las microalgas. El efecto positivo de la urea sobre otras significativamente (Silva y Torzillo, 2012; Grobbelaar, fuentes de nitrógeno en el crecimiento de microalgas 2013). En Chlorella vulgaris, concentraciones como Nannochloropsis sp. y diatomeas marinas ha superiores a 80 mg/l de amonio, disminuyeron el sido confirmado por Rocha et al. (2003), Piña et al. crecimiento y productividad celular (Tam y Wong, (2007) y Jad-Allah (2012). 1996). En el presente trabajo la disminución del pH en Una consideración para usar un medio nutritivo el cultivo con el fertilizante NPK 22-10-7 (pH=2,02- diferente al K3, es asegurar la posibilidad de obtener 3,21), debido al alto contenido de N-NH +4 , incidió buen crecimiento y productividad celular en un medio en una disminución en el crecimiento celular. Las nutritivo más económico que el convencional. El microalgas presentan un pH óptimo entre 7,00-8,00 costo de los reactivos químicos para cada uno de los y una reducción a niveles menores de 6,00 puede ser tratamientos utilizados en el experimento e hipotizando letal para los organismos (Abalde et al., 1995; Silva y una producción máxima de 60 000 kg/ha/día (Tredici, Torzillo, 2012). 2010) en cultivos masivos de biomasa con el medio La presencia de urea (CH4N2O) en el medio también nutritivo K3, se presentan en el Cuadro 3. es importante para el crecimiento y productividad K3 (Kolkwitz): para el cálculo con este medio del cultivo; es una fuente de nitrógeno apta para la nutritivo se consideró las principales soluciones producción de microalgas, pues estas requieren menos “madre”: nitrato de potasio (KNO3), potasio hidrógeno Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 271 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana Cuadro 3. Costos de los tratamientos K3, 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/l MgSO4.7H2O y 22-10-7 (+2 MgO) 1,00 g/l + 0,27 g/l MgSO4.7H2O para una producción hipotética de 60 000 kg/ha/día de cultivo masivo de microalgas. Italia. 2014. Table 3. Costs of treatments, 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/l MgSO4.7H2O and 22-10-7 (+ 2MgO) 1,00 g/l + 0,27 g / l MgSO4. 7H2O for a hypothetical output of 60 000 kg/ha/day of mass cultivation of microalgae in bioreactors. Italy. 2014. Tratamiento Productividad Producción Costo del Superficie de terreno (%) (kg/ha/día) tratamiento para necesario para producir 1 kg de producir 60 000 kg/ biomasa ($) ha/día (m2) K3 100 60 000 7,28 10,000 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 g/lMgSO4.7H2O 90 54 000 4,01 11,400 22-10-7 (+2 MgO) 1,00 g/l + 0,27 g/l MgSO4.7H2O 67 40 200 1,16 15,000 de fosfato (K2HPO4) y sulfato de magnesio (MgSO4- 20-20 fue más económico que el cultivo con el medio 7H2O). No se cuantificaron los reactivos que conforman convencional K3 y presentó una productividad alta, los microelementos. comparable con este último medio, resultado que lo Fertilizantes: se incluye únicamente en el análisis hace atractivo para usarlo en cultivos masivos. de costos los tratamientos que se les agregó sulfato La incidencia del costo del tratamiento sobre el de magnesio. costo total de la producción microalgal en el presente Los cálculos incluyen el costo de los reactivos, estudio (Acién et al. 2012), corresponde para el no considera variables como mano de obra, tiempo de tratamiento con K3 un 48,50%, para el NKP 20-20- preparación, consumo del dióxido de carbono, equipo 20 un 26,73% y para el fertilizante NKP 22-10-7 un de laboratorio, tamaño y materiales del biorreactor. valor de 7,70%. Este último dato coincide con los Los resultados en el laboratorio demostraron valores de incidencia reportados por Norsker et al. que el tratamiento NPK 20-20-20 (1,00 g/l) + 0,27 (2011), los cuales se encuentran en un ámbito entre g/l MgSO4.7H2O presentó un 90% de productividad 4,6-10%. Adicionalmente, se observa en el Cuadro y el NPK 22-10-7 (+2 MgO) 1,00 g/l + 0,27 g/l 3 el dato calculado para la cantidad de terreno (m2) MgSO4.7H2O un 67% con respecto al K3 (Figura 2). necesario para producir 60 000 kg/ha/día con cada Extrapolando estas productividades a cultivos masivos tratamiento. Es evidente que con el NPK 22-10-7 (+2 en biorreactores, se necesitaría una producción de MgO) 1,00 g/l + 0,27 g/l MgSO4.7H2O se necesitaría 54 000 kg/ha/día en el primer tratamiento y 40 invertir en una cantidad mayor de terreno, aspecto a 200 kg/ha/día en el segundo tratamiento. En el considerar cuando se realiza un análisis de costos en Cuadro 3 se observa que para producir un kilo una producción masiva de microalgas. de biomasa el costo es mayor en el cultivo con La preparación de los medios nutritivos basados medio nutritivo convencional, mientras que el más en fertilizantes conllevan a una reducción de tiempo económico es el tratamiento con el fertilizante NPK comparado con K3, ya que para preparar este último, 22-10-7, reflejando este último, un ahorro de un 84% se deben pesar once reactivos diferentes, mientras que con respecto a un 45% con el fertilizante NPK 20- con fertilizantes se realiza solo una pesada, pues todos 20-20, si se compara con el precio del medio K3. Si los reactivos están incorporados en la fórmula química se considera el significativo ahorro en términos de del fertilizante. dinero que representa usar el fertilizante NPK 22-10- Aunque el uso de fertilizantes se propone como 7, no obstante la disminución de la productividad del una alternativa con respecto a los medios nutritivos cultivo que presentó este tratamiento, el bajo costo del convencionales para la producción de la biomasa en fertilizante podría ser considerado una ventaja para biorreactores a gran escala, en la contabilidad total, usarlo en cultivos masivos en condiciones externas. Es se debe cuantificar no solamente el costo de los importante considerar que aún el fertilizante NPK 20- reactivos, sino también la productividad de la biomasa, 272 Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana aspecto importante para la rentabilidad del cultivo, Arredondo, y D. Voltolina, editores, Métodos y especialmente si se cultiva en volúmenes grandes para herramientas analíticas en la evaluación de la biomasa propósitos comerciales. Otros aspectos a considerar microalgal. Centro de Investigaciones Biológicas del son el costo del terreno, mano de obra, electricidad, Noroeste, S.C. La Paz, CA, USA. p. 17-26. agua, dióxido de carbono, material y tamaño del Becerra-Dórame, M., J. A. López, F. Enríquez, N. Huerta, biorreactor, costos de mantenimiento, objetivo de la D. Voltolina, I. Osuna, and G. Izaguirre. 2010. The producción (uso comestible, medicinal, fertilizante, effect of initial cell and nutrient concentrations on the biodiesel), aspectos que pueden variar el costo. growth and biomass production of outdoor cultures of La reducción de los costos de producción de los Dunaliella sp. Ann. Bot. Fennici. 47:109-112. medios nutritivos basados en fertilizantes agrícolas Becker, E. 1995. Microalgae: Biotechnology and no se reflejó en un detrimento en la productividad microbiology. Cambridge University Press, USA. ni en los componentes bioquímicos de la biomasa Becker, W. 2013. Microalgae for human and animal microalgal. Una buena producción de biomasa se nutrition. In: A. Rhichmond, and Q. Hu, editors, obsevó en el alga T. suecica creciendo en fertilizantes Handbook of microalgal culture: applied phycology foliares (Fábregas et al., 1987). Un buen crecimiento and biotechnology. John Wiley y Sons, Ltd. GBR. p. celular y altos valores de proteínas, carbohidratos y 461-503. lípidos comparables al medio nutritivo f2 se reportó Borowizka, M.A. 1999. Economic evaluation of microalgal en cultivos de Chaetoceros muelleri, Thalassiosira processes and products. In: Z. Cohen, editor, weissflogii, Isochrysis sp. y Tetraselmis suecica (Piña Chemicals from microalgae. T.J. International Ltd, et al., 2007). Por otra parte, un buen crecimiento y Padstow, GBR. p. 387-409. una óptima composición bioquímica se demostró Borowitzka, M.A. 2005. Culturing microalgae in outdoor en diatomeas bentónicas marinas y Rhodomonas sp. ponds. En: R.A. Andersen, editor, Algal culturing creciendo al utilizar fertilizantes comerciales (Simental techniques. Elsevier Academic Press, CA, USA. p. et al., 2001; Simental y Sánchez, 2003; Valenzuela et 205-218. al., 2005). Borowitzka, M. 2013. High-value products from microalgae- Los resultados indicaron buenos rendimientos their development and commercialization. J. Appl. en los cultivos de C. sorokiniana con fertilizantes Phycol. 25:743-756. agrícolas comerciales en condiciones de laboratorio. Concas, A., G. Lutzu, M. Pisu, and G. Cao. 2012. Se evidencia que para obtener un buen crecimiento y Experimental analysis and novel modeling of semi- productividad de la biomasa microalgal, una adecuada batch photobioreactorsoperated with Chlorella concentración de clorofila, proteínas y carbohidratos vulgaris and fed with 100% (v/v) CO2. Chem. Eng. en esta microalga, se debe asegurar que el fertilizante J. 213:203-213. usado contenga una adecuada combinación de urea, Converti, A., A. Casazza, E. Ortiz, P. Perego, and Del Borghi. amonio y elementos como potasio, fósforo, magnesio, 2009. Effect of temperature and nitrogen concentration sulfuro, micronutrientes, vitaminas y un aporte parcial on the growth and lipid content of Nannochloropsis de CO2 que ayudaría a estabilizar el pH. oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production. Chem. Eng. Process. 48:1146-1151. Dubois, M., K. Guilles, J. Rebers, and F. Smith. 1956. LITERATURA CITADA Colorimetric method for determination of sugar and related substances. Anal. Chem. 28:350-356. Abalde, J., A. Cid, P. Fidalgo, E. Torres, y C. Herrero. Fábregas, J., L. Toribio, J. Abalde, B. Cabezas, and C. 1995. Microalgas: cultivos y aplicaciones. La Coruña: Herrero. 1987. Approach to biomass production of Universidade Da Coruña, ESP. the marine microalgae Tetraselmis suecica (Kylin) Acién, F.G., J. M. Fernández, J.J. Magán, and E. Molina. using common garden fertilizer and soil extract as 2012. Production cost of a real microalgae production cheap nutrient supply in batch cultures. Aquacult. Eng. plant and strategies to reduce it. Biotechnol. Adv. 30: 6:141-150. 1344-1353. Grobbelar, J. 2013. Inorganic algal nutrition. In: A. Arredondo, B.O., y D. Voltolina. 2007. Concentración, Rhichmond, and Q. Hu, editors, Handbook recuento celular y tasa de crecimiento. En: B. of microalgal culture: applied phycology and Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 273 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana biotechnology. John Wiley y Sons, Ltd. GBR. p. Chlorella sorokiniana en diferentes medios de 123-133. cultivo en condiciones autotróficas y mixotróficas. Jad-Allah, K. 2012. Development of cheap and simple ORINOQUIA 16:11-19. culture medium for the microalgae Nannochloropsis Piña, P., A. Medina, M. Nieves, S. Leal, J.A. López, y sp. based on agricultural grade fertlilizers available in M. Guerrero. 2007. Cultivo de cuatro especies de the local market of Gaza Strip (Palestine). J. Al Azhar microalgas con diferentes fertilizantes utilizados en University Gaza (Natural Sci.) 14:61-76. acuicultura. Rev. Invest. Mar. 28:225-236. Krause, G.H., and E. Weis. 1984. Chlorophyll fluorescence Richmond, A. 1999. Physiological principles and modes of as a tool in plant physiology. 2. Interpretation of cultivation in mass production of photoautotrophic fluorescence signals. Photosynth Res. 5:139-157. microalgae. In: Z. Cohen, editor, Chemicals from Lee, Y., W. Chen, H. Shen, D. Han, Y. Li, H. Jones, J. Timlin, microalgae. T.J. International Ltd, Padstow, GRB. p. and Q. Hu. 2013. Basic culturing and analytical 353-386. measurement techniques. In: A. Rhichmond, and Q. Rocha, J.M.S., J.E. García, and M.H. Henriques. Hu, editors, Handbook of microalgal culture: applied 2003. Growth aspects of the marine microalga phycology and biotechnology. John Wiley y Sons, Ltd. Nannochloropsis gaditana. Biomol. Eng. 20:237-242. GBR. p. 37-68. Sánchez, H., J. Juscamaita, J. Vargas, y R. Oliveros. 2008. Lichenthaler, H. 1987. Chlorophyll and carotenoids: Producción de la microalga Nannochloropsis oculata pigments of photosynthetic membranes. Methods (Droop) Hibberd en medios enriquecidos con ensilado Enzymol. 148:350-82. biológico de pescado. Ecol. Apl. 7:149-158. Liu, J., and Q. Hu. 2013. Chlorella: industrial production of Schenk, P., A. Thomas-Hall, S. Stephens, U. Marx, J. cell mass and chemicals. In: A. Rhichmond, and Q. Mussgnung, C. Posten, O. Kruse, and B. Hankamer. Hu, editors, Handbook of microalgal culture: applied 2008. Second generation biofuels: high-efficiency phycology and biotechnology. John Wiley y Sons, Ltd. microalgae for biodiesel production. BioEnergy Res. GBR. p. 329-338. 1:20-43. Lowry, O., and N. Rosenbrough. 1951. Protein measurement Schubert, E. 2003. Nonmotile coccoid and colonial green with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265- algae. In: J.D. Wehr, and R. Sheath, editors, Freshwater 272. algae of North America: ecology and classification. Masojídek, J., G. Torzillo, and M. Koblízek. 2013. CA, USA. p. 253-307. Photosynthesis in microalgae. In: A. Rhichmond, Silva, A.M., and G. Torzillo. 2012. Nitrogen and phosphorus and Q. Hu, editors, Handbook of microalgal culture: removals by means of laboratory batch cultures of the applied phycology and biotechnology. John Wiley y microalga Chlorella vulgaris and the cyanobacterium Sons, Ltd. GBR. p. 21-36. Planktothrix isothrix grown as monoalgal and as co- Mellis, A., L. Zhang, M. Forestier, M. Ghirardi, and M. cultures. J. Appl. Phycol. 24:267-276. Seibert. 2000. Sustained photobiological hydrogen Silva, A.M., G. Torzillo, J. Kopecky, and J. Masojıdek. gas production upon reversible inactivation of 2013. Productivity and biochemical composition oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas of Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae) reinhardtii. Plant Physiol. 122:127-136. cultures grown outdoors in tubular photobioreactors Molina, G.E., H. Belarbi, F.G. Acién, A. Robles, and Y. and open ponds. Biomas. Bioenergy 54:115-122. Chisti. 2003. Recovery of microalgal biomass and Simental, J.A, and M. Sánchez. 2003. The effect of metabolites: process options and economics. Biotech. agricultural fertilizer on growth rate of benthic Adv. 20:491-515. diatoms. Aquacult. Eng. 27:265-272. Nieves, M., D. Voltolina, M. Sapién, H. Gerhardus, A.L. Simental, J.A., M.P. Sánchez, and J. Correa. 2001. Robles, and M. Villa. 1996. Culturing microalgae with Biochemical composition of benthic marine diatoms agricultural fertilizers. Riv. Ital. Acquacoltura 3:81-84. using as culture medium a common agricultural Norsker, N.H., M.J. Barbosa, M. Vermue and R.H. Wijffels. fertilizer. J. Shellfish Res. 20:611-617. 2011. Microalgal production - A close look at the Tam, N., and Y.S. Wong. 1990. The comparison of growth and economics. Biotechnol. Adv. 29:24-27. nutrient removal efficiency of Chlorella pyrenoidosa Ortiz, M., C. Cortés, J. Sánchez, J. Padilla, y A.M. Otero. in settled and activated sewages. Environ. Pollut. 2011. Evaluación del crecimiento de la microalga 65:93-108. 274 Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 SILVA: Evaluación dE fErtilizantEs En la productividad dE Chlorella sorokiniana Tam, N., and Y.S. Wong. 1996. Effect of ammonia photobioreactors and open ponds. Eur. J. Phycol. 47: concentrations on growth of Chlorella vulgaris and 169-181. nitrogen removal from media. Bioresour. Technol. Torzillo, G., and A. Vonshak. 2013. Environmental stress 57:45-50. physiology with references to mass cultures. In: A. Tredici, M. 2010. Photobiology of microalgae mass cultures: Richmond, editor, Handbook of microalgal mass understanding the tools for the next green revolution. cultures. Blackwell Science, River Street, USA. p. Biofuels 1:143-162. 90-113. Torzillo, G., P. Accolla, E. Pinzani, and J. Masojidek. 1996. Valenzuela, E., F. Lafarga De La Cruz, R. Milán, y F. In situ monitoring of chlorophyll fluorescence to Núñez. 2005. Crecimiento, consumo de nutrientes y assess the synergistic effect of low temperature and composición proximal de Rhodomonas sp. cultivada high irradiance stress in Spirulina cultures grown en medio F/2 y fertilizantes agrícolas. Cienc. Mar. outdoors in photobioreactors. J. Appl. Phycol. 7:1-9. 31:79-89. Torzillo, G., C. Faraloni, M. Silva, J. Kpecky, and J. Watanabe, M. 2005. Freshwater cultura media. In: R. Masojidek. 2012. Photoacclimation of P. tricornutum Andersen, editor, Algal culturing techniques. Elsevier (Bacillariophycea) cultures grown outdoors in Academic Press, California, USA. p. 13-20. Agron. Mesoam. 27(2):265-275. 2016 ISSN 2215-3608 275