Artículo Científico González Torrivilla, C.; Hernández, L., Vaillant Barka, F.: Metabolómica en mora con stevia ANÁLISIS DE UN JUGO DE MORA (Rubus adenotrichos) ENDULZADO CON ESTEVIA (Stevia rebaudina Bertoni), UNA APROXIMACIÓN METABOLÓMICA ANALYSIS OF JUICE BLACKBERRY (Rubus adenotrichos) SWEETENED WITH STEVIA (Stevia rebaudina Bertoni), A METABOLOMICS APPROACH César González Torrivilla1, Lorena Hernández2, Fabrice Vaillant Barka3 1 Doctor en Ciencias, mención Ciencia y Tecnología de Alimentos, Departamento de Procesos Agroindustriales, Decanato de Agronomía. Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA), Av. Florencio Jiménez, Núcleo Obelisco. Barquisimeto - Lara, Venezuela, Código Postal 3001. Teléfono: 0058 4165539861, Dirección de correspondencia, email: cesargonzalez@ ucla.edu.ve; 2 Lic. en Química, Especialista en Espectrometría de Masas, Centro de Investigación en Productos Naturales, Ciudad de la investigación. Universidad de Costa Rica, Código Postal 11501-2060 San José, Costa Rica, email: lorena.her- nandez@ucr.ac.cr; 3 Doctor en Ingeniería de Procesos Agroalimentarios, Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD), UMR 95 QUALISUD, Montpellier, France, e-mail: fabrice.vaillant@cirad.fr Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient. 20(1): 121-129, Enero Junio, 2017 rESUMEN las formulaciones estudiadas, genera una variación de los iones presentes. La investigación tuvo como propósito analizar, a través de una aproximación de estudio metabolómico, la composi- Palabras clave: Iones, metabolitos, microfiltración, pasteuri- ción integral de un jugo microfiltrado a base de mora (Rubus zación. adenotrichos), endulzado con hojas deshidratadas de estevia (Stevia rebaudiana Bertoni) y su comparación con análogos SUMMarY obtenidos por tratamiento térmico convencional, endulzados con sacarosa. Para el registro de la información espectral, The purpose of the research was to analyze, through a se optó por un enfoque no dirigido, en el que se midieron, metabolomic study, the overall composition of a microfiltration simultáneamente, tantos metabolitos, como fue posible, en blackberry juice (Rubus adenotrichous) sweetened with los cuatro tipos de muestras elaboradas (jugo microfiltrado dried leaves of stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) and its no pasteurizado y pasteurizado, endulzado con estevia y sa- comparison with analogues obtained by conventional heat carosa). Fue empleado un sistema de Cromatografia Líquida treatment, sweetened with sucrose. The spectral information de Ultra Alta Resolución (UPLC), equipado con un detec- was obtained by an undirected approach. all possible tor de red de fotodiodos (PDA) acoplado a un electrospray metabolites produced in the four samples (unpasteurized de ionización y dispuesto con Q-TOF al espectrómetro de and pasteurized microfiltered juice, sweetened with stevia masas (ESI-Q-TOF/MS). Con base en los archivos formato and sucrose) were measured simultaneously. Analyses were SPL, aportados por el UPLC y, una vez convertidos a forma- conducted in series using a Waters Acquity Ultra Performance to NetCDF, se efectuó el análisis respectivo, en el software Liquid Chromatography system (UPLC) equipped with MZmine, el cual, detectó cada uno de los iones presentes, a photodiode array detector (PDA) and coupled with discriminando la presencia o no de los mismos, en las dife- Electrospray Ionization and Quadrupole Time-Of-Flight rentes muestras, identificándolos según su masa (molecu- Mass Spectrometry (ESI-Q-TOF/MS. SPL format files, lar) y el tiempo de retención donde fueron registrados en el provided by the UPLC, in the analysis of the samples were espectro, por el espectrómetro de masas. De acuerdo con converted to NetCDF format, the respective analyzes were las deducciones generadas, el análisis estadístico aplicado, performed by the MZmine software. all ions were detected, confirmó la variación de la composición del jugo endulzado, discriminating presence or not in the different samples. The tanto con estevia como con sacarosa, al ser sometidos a tra- mass (molecular) and the retention time were recorded by tamiento térmico, al corroborar diferencias estadísticamente the mass spectrometer. The results of the statistical analysis significativas, lo que permite afirmar que el tratamiento, para applied confirmed the variation in composition microfiltration 121 Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica 20 (1): 121 - 129 Enero - Junio 2017 blackberry juice sweetened with sucrose and stevia when ciones actuales de producción industrial de zumos de frutas subjected to heat treatment step, corroborating statistically es inevitable que sufran alteraciones en su metabolismo, por significant differences between them, which allows to affirm las propiedades y la intensidad de los tratamientos aplicados. that the treatment for the formulations studied generates a Dada la poca identificación de afectaciones concretas, que variation of the ions present. caractericen el nivel de impacto de estos procesos en el es- tatus metabólico y su vinculación con la calidad final de los Key words: Ions, metabolites, microfiltration, pasteurization productos, el abordaje de este impacto, implica el uso com- (CAB Thesaurus). binado de diferentes metodologías y el análisis de algunos grupos específicos de sustancias trazadores de cambios, en iNTroDUCCiÓN el metabolismo de estos productos. En la actualidad, la demanda mundial por edulcorantes na- Actualmente, se presenta gran interés en las técnicas ómi- turales ha sido apreciable, debido a los diversos efectos se- cas, como la metabolómica, referida al conjunto de cien- cundarios asociados al consumo de edulcorantes sintéticos cias y de técnicas dedicadas al estudio completo del sistema (Keerthi et al. 2011). Un número reducido de compuestos constituido por el conjunto de moléculas que constituyen los edulcorantes, de este tipo, bajo en calorías y disponibles en intermediarios metabólicos, metabolitos, hormonas y otras la naturaleza, se utilizan comercialmente en diversos pro- moléculas, y los metabolitos secundarios, que se pueden ductos, como, por ejemplo: la taumatina, la glicirricina, el encontrar en un sistema biológico (Oliver et al. 1998). El xilitol, el phyllodulcin, el mogrósido y el esteviósido (Puri et estudio de la metabolómica de los alimentos ha aumentado al. 2011). Entre ellos, se destaca el interés que, en la última gradualmente en los últimos años, porque los sistemas ali- década, han generado los edulcorantes, obtenidos a partir mentarios están directamente relacionados con la nutrición de las hojas de la planta Stevia rebaudiana Bertoni, los cua- y la salud humana (Kim et al. 2016); sin embargo, el con- les, se encuentran disponibles en el comercio, en diversos junto completo de los metabolitos de pequeñas moléculas países, donde se han utilizado durante varias décadas para presentes en los alimentos que componen la dieta humana endulzar una gran variedad de alimentos, incluyendo, bebi- y el papel de los sistemas de producción de alimentos en la das, verduras dulces, encurtidos y mariscos (Sharoba et al. alteración de este metaboloma de los alimentos son todavía 2012). ampliamente desconocidos (Johanningsmeier at al. 2016). En este orden de ideas, y dada la importancia que el consu- Esta técnica ha sido aplicada en la evaluación de frutas y midor moderno le otorga a aquellos componentes de los ali- derivados, principalmente, en aspectos relacionados con la mentos que, a pesar de no ser nutricionalmente esenciales, identificación de variedades, diferenciación de la calidad y puedan promover su bienestar y ayudarle a reducir el riesgo propiedades organolépticas (nuevos marcadores químicos de presentar enfermedades crónicas y degenerativas; el uso de calidad sensorial), determinación de autenticidad y adul- de los esteviolglucósidos, como edulcorante y saborizante en teraciones en zumos y derivados, evaluación nutrabólica y la formulación de alimentos, resulta prometedora (González desarrollo de alimentos funcionales, entre otros. Respecto a et al. 2014). su uso, en estudios de evaluación de tecnologías de conser- vación de alimentos, es un campo de aplicación explorado a A este respecto, el aumento sostenido del consumo de zu- baja escala por la comunidad científica, que no proyecta, a mos procesados, evidenciado por la incorporación de una la fecha, una producción científica destacable (Vaclavik et al. amplia gama de productos pertenecientes a esta categoría, 2012; Cajka et al. 2011). favorecen su empleo para la fabricación de bebidas, concre- tamente, para la producción de jugos naturales. A pesar de Sobre la base de las ideas expuestas, la presente investiga- los avances tecnológicos, las industrias procesadoras de ju- ción apuntó esfuerzos en la evaluación de un jugo de mora gos de frutas aplican, principalmente, operaciones unitarias microfiltrado, dirigido a consumidores con regímenes espe- convencionales para la extracción, la filtración y la concen- ciales de alimentación, a fin de evidenciar, por medio de un tración de pulpas, a partir de los frutos enteros. La elección estudio metabolómico preliminar, diferencias entre jugos en- del equipamiento más adecuado para lograr cada uno de dulzados, tanto con sacarosa como con estevia y análogos estos propósitos, está determinado por muchos factores, sometidos a una etapa de pasteurización, como operación que deben ser sopesados cuidadosamente, para asegurarse de conservación. del cumplimiento de los requisitos del proceso y el costo de capital. Estos factores, incluyen, entre otras consideraciones, MaTErialES Y MÉToDoS las propiedades del material de alimentación, los requisitos de calidad del producto, las condiciones de funcionamiento Todas las actividades que comprenden la formulación y la y el costo de operación (Prada et al. 2004). Bajo las condi- elaboración del jugo de mora fueron realizadas en las ins- 122 Artículo Científico González Torrivilla, C.; Hernández, L., Vaillant Barka, F.: Metabolómica en mora con stevia talaciones del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de pasteurizado) fueron almacenadas durante un mes, bajo 5 Alimentos (CITA), Universidad de Costa Rica. Se emplea- condiciones de temperatura distintas: 5ºC, 20ºC, 30ºC, 37ºC ron moras (Rubus adenotrichos) de la variedad “vino con y 45ºC, en cavas especiales, acondicionadas para tal fin. espinas”, en estado de madurez fisiológico y congeladas a –20ºC. Para la obtención de la pulpa refinada, se sometió Con el propósito de analizar el conjunto de iones presentes y la totalidad del lote de moras, a una etapa de prensado. La así evidenciar similitudes o diferencias entre su información pulpa refinada obtenida fue envasada en tambores plásticos espectral, se optó por un enfoque no dirigido, en el que se desinfectados y almacenada bajo condiciones de congela- midieron, simultáneamente, tantos iones, como fue posible. ción (-20°C). El jugo formulado fue endulzado con hojas Se tomaron algunas de las consideraciones, señaladas en de Stevia rebaudiana deshidratadas en polvo, de la varie- estudios previos, principalmente, los efectuados por Keerthi dad Morita II, producida por un productor del municipio Su- et al. (2011), Rodríguez, et al. (2013) y García et al. (2014). cre, Aragua, Venezuela. La determinación de su proporción Su ejecución fue realizada en las instalaciones del Centro en la formulación de uno de los jugos formulados, se rigió de Investigaciones de Productos Naturales (CIPRONA) de por criterios sensoriales, a través de dos pruebas afectivas, la Universidad de Costa Rica. A continuación, se describen celebradas con anterioridad, en las cuales, se definió 2,5g/ cada una de las actividades involucradas para el análisis de Ljugo. Una vez formulados los jugos endulzados, tanto con las muestras: sacarosa como con estevia, fueron sometidos a una etapa de microfiltración tangencial. El sistema de microfiltración Preparación de muestras para análisis metabolómico: Se estuvo conformado por una bomba centrífuga, para el su- extrajo, dos veces por semana, una porción de cada muestra ministro del flujo tangencial; una bomba de desplazamiento almacenada, a las cinco condiciones diferentes; el procedi- positivo, que condujo la alimentación y un intercambiador de miento, se realizó en el interior de una campana de flujo la- calor tubular, para el control de la temperatura. Se mantuvo minar. Las muestras fueron preservadas en tubos eppendorf la temperatura del jugo a 35°C, para evitar la disminución de de 1,5mL y conservadas a -70ºC. El día estipulado para el la aceptación sensorial del jugo en estudio. La membrana análisis, todas las muestras fueron descongeladas, centrifu- empleada durante la etapa de microfiltración posee un ta- gadas (14000rpm por 10 minutos), diluidas con agua grado maño de poro igual a 10nm, de 5kDa, área de filtración de HPLC en proporción 1:1 y trasvasadas a los viales para intro- 0,33m2, fabricada por Pall Corporation, USA. Los ensayos ducirlas al UPLC. de microfiltración, se iniciaron en condiciones de presión, a través de la membrana igual a 2,54bar y un flujo de per- Sistema CL-MS empleado: Los análisis fueron realizados meado de 270L/hm2. Dichos ensayos, se efectuaron a una en un sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Alta Reso- temperatura constante, con una presión transmembranaria lución (UPLC) de Waters Acquity, el cual, estuvo equipado constante, una velocidad tangencial constante y un tiempo con un detector de red de fotodiodos (PDA), acoplado a un aproximado de 70 min. electro spray de ionización (tensión capilar de 2,3 kV, tem- peratura seca 270° C) y dispuesto con Q-TOF (analizador El permeado obtenido fue envasado asépticamente, me- cuádruplo de tiempo de vuelo) al espectrómetro de masas diante un sistema acoplado a la salida del sistema de MF, (ESI-Q-TOF/MS) (Waters SYNAPT G1, Waters Corporation, conformado por una cámara hermética, con inyección cons- Milford, MA, EE.UU.). El equipo estaba dotado, además, de tante de nitrógeno, con instalación interna de una lámpara un dosificador binario de disolvente, un muestreador auto- de luz ultravioleta. El jugo fue envasado en bolsas especiales, mático y un desgasificador, controlado por MassLynx V4.1 a base de un laminado, compuesto por capas interpuestas (Waters Corporation, MA, EE.UU.); las condiciones croma- de polietileno-aluminio-polietileno. La mitad de las bolsas de tográficas empleadas son descritas en la tabla 1. El espec- cada formulación fue sometida a una pasteurización, intro- trómetro de masas fue equilibrado previamente, con las so- duciéndolas en una marmita de doble chaqueta (calentada luciones estándares correspondientes. Los experimentos de con vapor), dispuesta con agua potable. Se estableció, con fragmentación inducida por colisión MS2, se realizaron uti- base en pruebas preliminares (carga inicial de 7,5 x 104UFC/ lizando la interfaz ESI operativa, en el modo de ion positivo, mL, determinada mediante la realización de pruebas micro- usando una velocidad de barrido de exploración de 1/s y una biológicas) y en valores referenciales obtenidos de la litera- rampa de energía de colisión de 10 a 40 eV. La temperatura tura (valor Z = 5,5°C y tiempo de reducción decimal D = 5 de desolvatación fue 330ºC y el flujo de gas de desolvatación minutos), como condiciones de pasteurización: 90ºC por 30 de 350 L/h. Todas las muestras fueron inyectadas por tripli- segundos. Transcurrido el tiempo, eran removidas y sumer- cado, en dos réplicas de forma aleatoria. gidas en un baño de agua helada. Cada una de las cuatro muestras (jugo MF endulzado con estevia sin pasteurizar, Análisis de los resultados obtenidos: Se convirtieron los jugo MF endulzado con estevia pasteurizado, jugo MF endul- archivos programados por el sistema acoplado de CL-MS, de zado sacarosa sin pasteurizar y jugo MF endulzado sacarosa formato SPL, aportados por el UPLC, a formato AFAM.raw y, 123 Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica 20 (1): 121 - 129 Enero - Junio 2017 Tabla 1. Condiciones cromatografías empleadas durante el análisis LC-MS, para el estudio metabolómico de muestras de jugo de mora, bajo los diferentes tratamientos, endulzados con esteviolglucósidos o sacarosa, sometidos o no a pasteriza- ción. VARIABLE CONDICIONES ESPECÍFICAS EN LA MEDICIÓN Modo de ionización de los espectros Modo positivo Rango de medición de espectros de 50m/z a 1000m/z. Disolvente A H2O + 0,01% Ácido Fórmico. Disolvente B ACN + 0,01% Ácido Fórmico. Columna UPLC BEH C18, 1,0 x 100mm, 1,7μm. Flujo de inyección 0,4mL/min. Volumen inyectado 6mL Temperatura de la columna 50°C La tasa de adquisición de datos 0,02s por último, a NetCDF (a través del software Masslynx Data- rESUlTaDoS Y DiSCUSiÓN bridge). Seguidamente, se efectuó el análisis respectivo, en el software especializado MZmine, el cual, detectó, organizó El modelo ajustó 656 variables, de las cuales, 654 pertene- y enlistó, cada uno de los iones presentes, discriminando, cen a la variable X y dos son de la variable Y; a partir de a su vez, la presencia o no de los mismos, en las diferentes ellas, se realizaron los tres análisis PLS. A continuación, se muestras, identificándolos según su masa (molecular) y el presentan los resultados obtenidos en las tres mencionadas tiempo de retención, registrados en el espectro por el espec- comparaciones establecidas. trómetro de masas. El listado detallado fue analizado esta- dísticamente, a través del software SIMCA 13.0.2, que per- COMPARACIÓN A: Cotejo efectuado entre muestras de mitió efectuar un análisis de componentes principales (PCA). jugo de mora microfiltrado formulado con estevia pas- Estableciendo diferentes comparaciones para, de esta ma- teurizado y no pasteurizado: La figura 1 presenta, en su nera, construir la data que alimentó el análisis discriminante sección A, la dispersión de las muestras en el espacio X, es PLS, específicamente, se empleó un análisis de tipo PLS-DA. decir, representa cómo se sitúan las observaciones modela- Las comparaciones establecidas para cada análisis PLS-DA das en el espacio X; en él, se puede apreciar que las mues- efectuado, fueron: A) Comparación de iones presentes en las tras pertenecientes a cada grupo (azul, para las muestras muestras de jugo MF con estevia, con y sin pasteurización; de jugo de mora microfiltrado formuladas con estevia pas- B) Comparación de iones presentes en las muestras de jugo teurizadas y, en color verde, las muestras de jugo de mora MF con sacarosa, con y sin pasteurización y, C) Compara- microfiltrado formuladas con estevia no pasteurizadas), no ción de iones presentes en las muestras de jugo MF con es- exhiben un patrón definido, distribuyéndose en el plano de tevia y formulado con sacarosa. forma indistinta. El PCA registró los resultados en puntuaciones (scores) (eje A pesar de ello, el análisis estadístico aplicado sobre los va- de coordenadas) y plots (manchas). Las puntuaciones de lores de las intensidades de los diferentes iones identificados las manchas en el eje de coordenadas (score-plot) permitió en dichas muestras y que consistió en un análisis de varian- describir las relaciones de las muestras entre sí, visualizándo- za, confirmó, estadísticamente, diferencias significativas (p se, de esta manera, las similitudes y las diferencias entre las valor es menor a 0,05), con un nivel de confianza del 95%; mismas. Para ello, se empleó el software MZmize, siguiendo nótese que el valor p, en la prueba, fue de 0,04, ligeramente la metodología descrita por Pluskal et al. (2010). Con este inferior al valor establecido para confirmar diferencias (0,05). software, por tanto, se obtuvieron dos tipos de resultados: el Al confirmar diferencias estadísticamente significativas fue- score plot, representado por el eje de coordenadas, donde se ron seleccionados, a través del software, los iones de mayor sitúan las muestras con base en la cantidad de iones que la importancia, por su notable participación en la diferencia- conforman y los marcadores potenciales sobre o sub expre- ción de los tratamientos, en otras palabras, los iones que sados, en las dos clases de muestras. presentaron valores muy diferentes entre las muestras de una categoría con respecto a otra (muestras pasteurizadas y 124 Artículo Científico González Torrivilla, C.; Hernández, L., Vaillant Barka, F.: Metabolómica en mora con stevia A) B) A) Repres entación bidimensional arrojada por el modelo OPLS-DA estimado y B) Iones discriminantes (VIP) en el espacio, identificados por el sof tware SIMCA, durante la comparación de muestras de jugo de mora microfiltrado formulado con estevia con y sin tratamiento. Figura 1. Re presentación en el espacio de las muestras formuladas con estevia con y sin tratamiento. no pasteurizadas). Ya que el valor medio de la trama VIP es 1, no tratadas, no es posible apreciar diferencias entre los tra- esta selección consistió en señalar los iones con valores VIP tamientos, por lo que se decidió efectuar un análisis más más altos (por el elevado número del listado de iones arro- detallado de los datos, discriminado en cada temperatura jados por el software, se consideraron aquellos mayores o y así evitar el error generado, producto de la comparación iguales a 1,5). Al seleccionar dichos iones, el software aportó simultánea de todas las muestras, las cuales, fueron conser- el listado de dichos metabolitos, representándolos, además, vadas a diferente temperatura. en el plano, tal y como se muestra en la figura 1B. De los cinco nuevos análisis PLS-DA, correspondiente a la Estos metabolitos discriminantes, por su mayor influencia en comparación de las muestras de jugo de mora microfiltra- el modelo, pueden ser apreciados, en la mencionada figura, do endulzado con estevia a las diferentes temperaturas de por su ubicación más lejana al origen (puntos color rojo en almacenamiento (5, 20, 30, 37 y 45°C), solo se pueden afir- la figura) y, por el contrario, los iones con valores VIP, meno- mar diferencias estadísticamente significativas en el grupo res a este grupo, pueden ser visualizados de color verde en de muestras almacenadas a 5°C (en el análisis, se obtuvo la figura, se ubican cerca del centro, por lo que tienen una un p valor menor a 0,01, por lo que se puede avalar con influencia más débil el modelo. un nivel de confianza del 99%, que existen diferencias es- tadísticamente significativas entre las muestras formuladas Apoyados en los iones discriminantes arrojados por el pro- con estevia pasteurizadas y no pasteurizadas, almacenadas grama como iones VIP, por ser distantes, entre las muestras a dicha temperatura). Siguiendo con la metodología descri- tratadas o no, es decir, entre todos los 2.068 iones presentes ta fueron seleccionados, a través del software, los iones de en las muestras, este grupo presenta, en mayor medida, una mayor importancia, por su participación en la diferenciación intensidad distinta entre las muestras de diferente tratamien- de los tratamientos. Esta selección consistió en señalar los to; se construyeron los histogramas respectivos para, de una iones con valores VIP ≥ 1,5; el software aportó el listado de manera gráfica, poder visualizar la semejanza o no que pue- iones. Estos iones discriminantes, por su mayor influencia en da existir, según la intensidad de cada uno de los iones, entre el modelo, pueden ser apreciados, en la mencionada figura, las muestras tratadas o no (pasteurizadas o no). Dado los por su ubicación más lejana al origen (puntos color rojo, en resultados obtenidos en las gráficas elaboradas exhiben para la figura) y, por el contrario, los iones con valores VIP, meno- todos los iones empleados un comportamiento irregular, ya res a este grupo, pueden ser visualizados de color verde, en que no permiten definir una tendencia definida a disminuir la figura, se ubican cerca del centro, por lo que tienen una o por el contrario aumentar entre las muestras tratadas y influencia más débil el modelo. 125 Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica 20 (1): 121 - 129 Enero - Junio 2017 Resultados comparables fueron obtenidos por Khan et al. COMPARACIÓN B: Cotejo efectuado entre muestras 2017, quienes emplearon igualmente UPLC-MS, para anali- de jugo de mora microfiltrado formulado con sacarosa zar metabolitos polares y no polares de pancharishtha, una pasteurizado y no pasteurizado: El análisis efectuado por formulación tradicional poliherbal, preparada por cocción y el software SIMCA, tal y como fue descrito para la compa- por fermentación, de diversos vegetales. Los resultados del ración anterior (comparación A), permitió obtener el com- análisis UPLC-MS fueron empleados por los autores para portamiento de los iones presentes en las muestras, según efectuar un análisis multivariante, a través de XLSTAT. El dia- el tratamiento. Su distribución en el espacio bidimensional grama de Análisis de Componentes Principales (PCA) distri- puede ser observado en la figura 2A. buyó todas las muestras en cuatro grupos diferentes, con dos formulaciones cada uno, encontrando, de esta manera, En ellas, se puede apreciar claramente, cómo las muestras diferencias significativas, en el contenido de las diferentes pertenecientes a cada categoría se distribuyen de forma si- formulaciones. milar, agrupándose entre sí y diferenciándose por clase; nó- tese, cómo los puntos azules (muestras pasteurizadas) en las Según la metodología empleada, restaría apoyarse en los io- figuras, se ubican a la derecha y en la parte superior, con la nes discriminantes arrojados por el programa y, a través del única excepción de la muestra SANP05D01 (jugo de mora software Masslynx versión 4.0, será posible la visualización de microfiltrado endulzado con sacarosa, conservado a 5°C y cada tiempo de retención, en el cual, fue detectado cada uno almacenado durante un día), la cual, es posición atípica, res- de estos iones discriminantes y los espectros de cada mues- pecto al resto de las muestras de su categoría y las mues- tra, lo que permitiría, a su vez, la comparación de los iones tras color verde (muestras no pasteurizadas), se sitúan a la asociados con bases de datos on line para, de esta manera, izquierda y en la parte inferior. Dicha diferenciación entre las poder identificar con qué metabolitos pueden estar relacio- muestras, según el tratamiento, fue corroborado por el aná- nados y así poder reconocer qué molécula representan. lisis de varianza efectuado, al alcanzar un p valor inferior a 0,05, lo que corrobora diferencias estadísticamente signifi- cativas, entre las mismas. A) B) A) Representación bidimensional de la distribución de muestras formuladas con sacarosa, con y sin tratamiento, arrojado por el modelo PCA estimado y B ) Representación gráfica de los iones discriminantes (VIP) en el espacio, identificados por el software SIMCA, durante la comparación de m uestras de jugo de mora microfiltrado formulado con sacarosa, con y sin tratamiento. Figura 2. Representación de la distribución de muestras formuladas con sacarosa con y sin tratamiento. Del mismo modo, el software permitió obtener el listado de io- COMPARACIÓN C: Cotejo efectuado entre muestras de nes discriminantes que, para esta comparación, está integra- jugo de mora microfiltrado formulado con estevia y sa- do por 33 iones aportados, inicialmente, el software MZmine, carosa sometidos o no a pasteurización: Una vez realizado que alcanzaron valores VIP superiores a 1,5. La representación el análisis global de las intensidades de los diferentes iones gráfica de los mismos es presentada en la figura 2B. presentes en las muestras (tanto formuladas con estevia como con sacarosa, pasteurizadas y no), por medio del soft- 126 Artículo Científico González Torrivilla, C.; Hernández, L., Vaillant Barka, F.: Metabolómica en mora con stevia ware SIMCA, tal y como fue mencionado anteriormente, fue Se puede apreciar notoriamente, cómo las muestras perte- posible visualizar la tendencia de los iones presentes en las necientes a cada categoría, según el tratamiento, se distri- muestras, según el tratamiento. Su distribución en el espacio buyen de forma similar, agrupándose entre sí, concentrán- bidimensional puede ser observado en la figura 3A. dose de forma diferente en el espacio, las muestras de jugos A) B) A) Representación bidimensional de la distribución de muestras formuladas con estevia y sacarosa, con y sin tratamiento, arrojado por el modelo. B) Representación gráfica de los iones discriminantes (VIP) en el espacio, identificados por el software SIMCA, durante la compa- ración de muestras de jugo de mora microfiltrado formulado con estevia y sacarosa, con y sin tratamiento. Figura 3. Representación de la distribución de las muestras formuladas con estevia y sacarosa, con y sin tratamiento, arrojado por el modelo. pasteurizados (resaltados en la figura 3A color verde) de los como tecnología de procesamiento, el tratamiento térmico. no pasteurizados (azul). Esta variación entre las muestras, Malveira (2010) fijó, como variables en estudio, el tiempo según el tratamiento, fue corroborado por el análisis de va- (0,16-31min) y la temperatura (66-94°C), obteniendo, igual- rianza efectuado, al alcanzar un p valor inferior muy cercano mente, diferencias estadísticamente significativas, entre los a 0, (3,48E-11) lo que corrobora diferencias estadísticamen- metabolitos presentes, en las diferentes muestras. Entre los te significativas, entre las mismas, con un nivel de confianza metabolitos con distribución diferente y, por tanto, ejercieron de 99,99%, lo que permite afirmar que el tratamiento para un efecto significativo en la formación o la degradación del las formulaciones estudiadas genera una variación más mar- zumo a causa de la pasteurización, se destacan: 4 (1-metil- cada de los iones presentes, conducta esperada, dada las ciclohexanol) y 20 (glicina). Por su parte, De Paepe et al. diferencias existentes en la composición de las muestras, (2014) establecieron, como condiciones del tratamiento, especialmente, gracias a los componentes aportados por la 7.200 segundos en un rango de temperatura de 80 a 145°C estevia. En este orden de ideas, el listado de iones discrimi- y evaluaron con mayor especificidad, a través de un enfo- nantes estuvo conformado por 33 iones. La representación que metabolómico no dirigido, basado en espectrometría de gráfica de su ubicación en el espacio puede ser apreciada en masas y cromatografía líquida de alta resolución, los consti- la figura 3B. tuyentes fenólicos termolábiles, lo que les permitió descubrir la subclase de algunos de estos compuestos, como la Proc- Investigaciones similares, llevadas a cabo por Malveira yanidin, susceptibles a la degradación térmica. (2010), De Paepe et al. (2014), Vervoort et al. (2012) y To- ydemir et al. (2013), en las que se emplearon estudios me- De igual manera, Toydemir et al. (2013) emplearon, como tabolómicos en muestras zumo de melón, jugo de manzana metodología de análisis, LC-MS, para estudiar los efectos del no clarificado, jugo de naranja y jugo de guinda (Prunus ce- procesamiento de la fruta de la cereza agria sobre los com- rasus L.), respectivamente, permitieron evaluar, igualmente, puestos polifenólicos. Producto del análisis exhaustivo, los 127 Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica 20 (1): 121 - 129 Enero - Junio 2017 autores descubrieron 193 compuestos, en la mencionada BiBliografía fruta, de los cuales, 38 podrían ser identificados y, de éstos, solo siete se vieron afectados por el procesamiento, entre los 1. CAJKA, T.; RIDDELLOVA, K.; TOMANIOVA, M.; HAJ- cuales, cinco corresponden a compuestos fenólicos. SLOVA, J. 2011. Ambient mass spectrometry em- ploying a DART ion source for metabolomic fin- A diferencia de los anteriores, Vervoort et al. (2012) explora- gerprinting/profiling: A powerful tool for beer origin ron, como herramienta para comparar el impacto térmico recognition. Metabolomics. 7(4):500-508. leve del jugo de naranja, GC-MS, revelando diferencias indi- rectas durante el almacenamiento, que se atribuyen al cre- 2. DE PAEPE, D.; VALKENBORGC, D.; COUDIJZER, K.; cimiento microbiano en el jugo sin tratar y en la inactivación NOTEN, B.; SERVAES, K.; DE LOOSE, M.; VOORS- enzimática. POELS, S.; DIELS, L.; VAN DROOGENBROECK, B. 2014. Thermal degradation of cloudy apple juice De igual manera, Sugimoto et al. (2012) seleccionaron, phenolic constituents. Food Chem. 162:176-185. como metodología de análisis, un estudio metabolómico, para estudiar el efecto de la pasteurización sobre el sake 3. GARCÍA, C.; HERNÁNDEZ, L.; PÉREZ, A.; VAILLANT, F. japonés (vino de arroz). Los resultados de la investigación 2014. Diversity of urinary excretion patterns of main señalan la disminución de aminoácidos y de polisacáridos, ellagitannins’ colonic metabolites after ingestion of así como el aumento en las concentraciones de péptidos y tropical highland blackberry (Rubus adenotrichus) de glucosa en el sake pasteurizado, determinando, de esta juice. Food Research International. 55:161-169. manera, cambios característicos, a causa del tratamiento térmico. 4. GONZÁLEZ, C.; TAPIA, M.; PÉREZ, E.; PALLET, D.; DORNIER, M. 2014. Main properties of steviol gl- Asimismo, Park et al. (2013) analizaron los componentes ycosides and their potential in the food industry: a volátiles de un producto muy similar, vino de arroz corea- review. Fruits. 69:127-141. no tradicional, no pasteurizado y pasteurizado, durante 30 días de almacenamiento, a través de cromatografía de ga- 5. JOHANNINGSMEIER, S.D.; HARRIS, G.K.; KLEVORN, ses-espectrometría de masas. Un total de 11 compuestos C.M. 2016. Metabolomic technologies for improving de olor activos, tales como 3-metil-1-butanol (alcohol isoa- the quality of food: Practice and promise. Ann. Rev. mílico), 2-metil-1-butanol, 2,3-butanodiol, ácido butanoico, Food Science and Technology. 7:413-438. ácido 3-metilbutanoico (ácido isovalérico), 2 metilbutanoico, 3 (metiltio) -1-propanol (metionol), 2-feniletanol, decanoato 6. KHAN, W.; CHESTER, K.; ANJUM, V.; AHMAD, W.; AH- de etilo, dodecanoato de etilo y acetato de tetradecanoat, MAD S.; NARWARIA, A.; KUMAR, D.; KATIYAR, C. fueron determinados; la mayoría, se encontraron en mayor 2017. Chromatographic profiling of Pancharishta proporción en las muestras no pasteurizadas, en compara- at different stages of its development using HPTLC, ción con las no pasteurizadas, durante el período de alma- HPLC, GC–MS and UPLC–MS. Phytochemistry let- cenamiento. ters. Disponible: on line. https:doi.org/10.1016/j. phytol.2017.04.034. Por último, el análisis realizado confirmó la variación de la composición del jugo de mora microfiltrado endulzado, tan- 7. KEERTHI, P.; VANKADARI, M.G.; KALAKOTI, S. 2011. to con estevia como con sacarosa, al ser sometidos a una Natural sweeteners: A complete review. J. Pharm. etapa de pasteurización (90°C). La información cuantitativa y Res. 4:2034-2039. cualitativa obtenida, en relación con el comportamiento del jugo de mora endulzado con estevia, sometido a tratamiento 8. KIM, S.; KIM, J.; YUN, E.J.; KIM, K.H. 2016. Food me- térmico, puede ser utilizado para monitorizar y controlar el tabolomics: from farm to human. Current Opinion procesamiento térmico del producto. Biotechnology. 37:16-23. Conflictos de intereses: El manuscrito fue preparado y revi- 9. MALVEIRA, J. 2010. Avaliação dos efeitos do tratamento sado con la participación de todos los autores, quienes de- térmico sobre o suco de melão: uso da metabolômi- claramos que no existe conflicto de intereses que ponga en ca para seleção de marcadores. Documento en línea. riesgo la validez de los resultados presentados. Disponible desde Internet en: http://www.google. co.ve/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&sourc e=web&cd=1&ved=0CBsQFjAA&url=http%3A% 128 Artículo Científico González Torrivilla, C.; Hernández, L., Vaillant Barka, F.: Metabolómica en mora con stevia 2F%2Fwww.alice.cnptia.embrapa.br%2Fbitstream% 16. SHAROBA, A.M.; El DESOUKY, A.I.; MAHMOUD, M.H. 2Fdoc%2F880989%2F1%2FOT10015.pdf&ei=b0E 2012. Effect of addition some hydrocolloids and GVMK2J4HxgwSbw4Eo&usg=AFQjCNFpq96OJG sweeteners on flow behavior and sensory properties OVdKBiaoRB_ghaTG5dQw&bvm=bv.74115972,d. of papaya-apricot nectar Blends. J. Food Process. eXY (con acceso 10/03/2015). Technol. 3:3-8. 10. OLIVER, S.G.; WINSON, M.K.; KELL, D.B.; BAGANZ, F. 17. SUGIMOTO, M.; KANEKO, M.; ONUMA, H.; SAKAGU- 1998. Systematic functional analysis of the yeast ge- CHI, Y.; MORI, M.; ABE, S.; SOGA, T.; TOMITA, nome. TrendsBiotechnol. 16(10):373-378. M. 2012. Changes in the charged metabolite and sugar profiles of pasteurized and unpasteurized ja- 11. PARK, H.J.; LEE, S.M.; SONG, S.H.; KIM, Y.S. 2013. panese sake with storage. J. Agric. Food Chem. Characterization of volatile components in makgeo- 60(10):2586-2593. lli, a traditional Korean rice wine, with or without pas- teurization, during storage. Molecules. 18(5):5317- 18. TOYDEMIR, G.; CAPANOGLU, E.; GOMEZ ROLDAN, 5325. M.; DE VOS, R.C.H.; BOYACIOGLU, D.; HALL, R.D.; BEEKWILDER, J. 2013. Industrial processing effects 12. PLUSKAL, T.; CASTILLO, S.; VILLAR, A.; OREŠIČ, M. on phenolic compounds in sour cherry (Prunus cera- 2010. MZmine 2: Modular framework for processing, sus L.) fruit. Food Research International. 53(1):218- visualizing, and analyzing mass spectrometry-based 225. molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11:395- 406. 19. VACLAVIK, L.; SCHREIBER, A.; LACINA, O.; CAJKA, T.; HAJSLOVA, J. 2012. Liquid chromatography–mass 13. PRADA, C. 2004. El futuro del control de procesos. Rev. spectrometry-based metabolomics for authenticity Iber. Autom. Inform. Ind. 1(1):5-14. assessment of fruit juices. Metabolomics 8:793-803. 14. PURI, M.; SHARMA, D.; TIWARI, A.K. 2011. Downstream 20. VERVOORT, L.; GRAUWET, T.; KEBEDE, B.; VAN DER processing of stevioside and its potential applica- PLANCKEN, I.; TIMMERMANS, R.; HENDRICKXA, tions. Biotechnol. Adv. 29:781-791. M.; VAN LOEY, A. 2012. Analytical methods heads- pace fingerprinting as an untargeted approach to 15. RODRÍGUEZ-PÉREZ, C.; QUIRANTES-PINÉ, R.; AMES- compare novel and traditional processing techno- SIS-OUCHEMOUKH, N.; MADANI, K.; SEGURA-CA- logies: A case-study on orange juice pasteurisation. RRETERO, A.; FERNÁNDEZ-GUTIERREZ, A. 2013. Food Chem. 134:2303-2312. A metabolite-profiling approach allows the identifi- cation of new compounds from Pistacia lentiscus Recibido: Octubre 22 de 2016 leaves. J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Aceptado: Mayo 29 de 2017 77:167-174. Como citar: González Torrivilla, C.; Hernández, L.; Vaillant Barka, F. 2017. Análisis de un jugo de mora (Rubus adenotrichos) endulzado con estevia (Stevia rebaudina Bertoni), una aproximación metabolómica. Rev. U.D.C.A. Act. & Div. Cient. 20(1): 121-129. 129