1 UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO POSGRADO EN ESPECIALIDADES MÉDICAS Cambios moleculares con relevancia clínica en el Carcinoma Colorrectal. Revisión bibliográfica sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Especialidades Médicas para optar el grado y título de Especialista en Anatomía Patológica María Paz Alán Cantón SERVICIO DE PATOLOGÍA, HOSPITAL MÉXICO CIUDAD UNIVERSITARIA RODRIGO FACIO SAN JOSÉ, COSTA RICA 2021 2 DEDICATORIA A DIOS POR SIEMPRE GUIARME POR EL CAMINO CORRECTO Y NUNCA ABANDONARME. A MIS PADRES Y HERMANA POR SU APOYO INFINITO Y MI INSPIRACIÓN. A ALEX POR SU APOYO Y AMOR INCONDICIONAL A LO LARGO DE MI CARRERA. AGRADECIMIENTO AL DR. ALFARO, MI MENTOR, POR SUS CONSTANTES ENSEÑANZAS Y QUIEN ME GUIO PASO A PASO DESDE EL INICIO DE MI CARRERA. A LA DRA CASCO POR SER MI APOYO INCONDICIONAL Y ESE IMPULSO EN EL DÍA A DÍA. A LA DRA MORENO POR SIEMPRE CREER EN MI Y POR AYUDARME A CRECER COMO PERSONA Y PROFESIONAL. A TODOS MIS TUTORES Y COLEGAS POR SIEMPRE ESTAR DISPUESTOS A ENSEÑARME Y SER MEJOR DÍA A DÍA. 3 4 Tabla de contenidos Índice de figuras ......................................................................................... 6 Índice de imágenes .................................................................................... 8 Índice de tablas .......................................................................................... 9 Índice de abreviaturas .............................................................................. 10 Metodología ............................................................................................. 12 Objetivo General ...................................................................................... 12 Objetivos específicos ................................................................................ 12 Introducción ............................................................................................. 13 Anatomía del colon; Estructura general y Morfología del colon ............... 16 Histología del Colon ................................................................................. 19 Hallazgos histopatológicos asociados a cambios moleculares .................. 23 Subtipos histológicos ............................................................................ 24 Linfocitos Intraepiteliales ..................................................................... 25 Infiltrado tipo Crohn ............................................................................. 27 Otras características histopatológicas .................................................. 29 Invasión linfovascular ....................................................................... 29 Invasión perineural ........................................................................... 29 Budding tumoral ............................................................................... 30 Carcinogenesis Colorectal ........................................................................ 32 Vías de carcinogénesis .......................................................................... 35 Vía Supresora (Inestabilidad cromosómica) ...................................... 39 Vía mutadora (inestabilidad microsatelital) ...................................... 41 5 Vía Aserrada ..................................................................................... 43 Vía del fenotipo metilador de islas CpG ............................................ 44 Clasificación molecular del Carcinoma Colorrectal ................................... 48 Significancia clínica de los subtipos moleculares en CCR: ..................... 49 Relevancia clínica de las alteraciones moleculares en el carcinoma colorrectal ................................................................................................ 51 Importancia de la Inestabilidad Microsatelital en el Síndrome de Lynch ............................................................................................................. 56 Relevancia clínica en la detección de mutaciones en los KRAS Y BRAF . 61 Detección de las alteraciones moleculares ............................................... 68 El diagnóstico histológico certero como primer biomarcador .............. 68 Fase pre-analítica ................................................................................. 69 Fase analítica: ....................................................................................... 72 Detección IMS .................................................................................. 72 Estado mutacional de KRAS .............................................................. 74 Determinación de BRAF .................................................................... 76 Conclusiones ............................................................................................ 77 Bibliografía ............................................................................................... 78 6 Índice de figuras Figura 1: Procesos de recambio celular en la cripta intestinal .En la zona de proliferación, el fenotipo hiperproliferativo se mantiene gracias a la expresión de proteínas antiapotóticas como Bcl-2 y por la activación de la vía Wnt/β-catenina. En la zona de diferenciación, la especialización de las células intestinales se mantiene gracias a la inactivación de la vía Wnt/β- catenina. 5 ................................................................................................ 34 Figura 2: Imagen suministrada por Dr. Abbas Patólogo y Biólogo molecular del Hospital Calderón Guardia, San José, Costa Rica. La imagen muestra la progresión adenoma-adenocarcinoma. ................................................... 40 Figura 3: Vía clásica de la carcinogénesis colorrectal a partir de adenomas. En la mitad superior se muestra las alteraciones de la vía supresora y en la mitad inferior la vía mutadora. Vías de carcinogénesis colorrectal y sus implicaciónes clínicas, María C. Sanabria, Julio 2012. .............................. 43 Figura 4: Vías alternas de carcinogénesis colorrectal a partir de pólipos hiperplásicos aserrados. (a)Vía aserrada por mutaciones en BRAF. (b) Vía aserrada por mutaciones en KRAS . En ambas figuras se muestra la progresión de las lesiones aserradas hasta su malignización, en correlación con las alteraciones moleculares. Vías de carcinogénesis colorrectal y sus implicaciónes clínicas, María C. Sanabria, Julio 2012. ............................... 44 Figura 5: Figura H: Se ilustra la secuencia del modelo genético de la carcinogénesis colorrectal propuesto por Vogelstein, que explica la progresión del CCR desde la mucosa normal del colon hacia el carcinoma. Se describen las diferentes vías relacionadas con el origen del CCR: la supresora, la mutadora y la de metilación. CIN: inestabilidad cromosómica. MSI: inestabilidad microsatélital. CIMP: fenotipo de metilación de las islas 7 CpG. MMR: genes del sistema de reparación de bases mal apareadas. Bases moleculares del cáncer colorrectal Katherine Andrea Palacio Rúa1,3, Carlos Mario Muñetón Peña ............................................................................... 46 Figura 6: La estrategia de prueba propuesta y los posibles resultados de la prueba, las pruebas adicionales posteriores la asignación de subgrupos, el pronóstico y la predicción de la respuesta terapéutica. MSS (Estabilidad microsatelital) MSI (Inestabilidad microsatelital). WT (Wild type), Mut (Mutant) Relevance, Pathogenesis, and Testing Algorithm for Mismatch Repair–Defective Colorectal Carcinomas. A report of the association for molecular pathology. William K. Funkhouser 2012. ................................. 55 Figura 7: Algoritmo de los estudios moleculares en el carcinoma colorrectal. Autoría: propia ......................................................................................... 67 8 Índice de imágenes Imagen A: Morfología general del colon, con el segmento transverso y el epiplón levantados. 1. Ciego; 2. colon ascendente; 3. ángulo derecho o hepático; 4. colon transverso; 5. ángulo izquierdo o esplénico; 6. colon descendente; 7. colon ilíaco. 1 .................................................................. 17 Imagen B:Capas histológicas de colon. Pathology Outlines. ..................... 21 Imagen C: 1. Imagen con H-E de un adenocarcinoma moderadamente diferenciado señalado con la flecha gruesa. La flecha delgada muestra nódulos linfáticos transmurales, conocido este fenómeno como infiltrado peritumoral (infiltrado Crohn-like) 2. Acercamiento (40x) ........................ 28 Imagen D: A. Imagen con hematoxilina-eosina (HE) de un adenocarcinoma de colon bien diferenciado. La inmunomarcación negativa de la misma lesión para MLH1 (B) y PMS2 (C). La ausencia de expresión nuclear de estas proteínas indica un sistema de reparación del DNA deficiente. Características histopatológicas del carcinoma colorrectal con inestabilidad microsatelital (IMS), Rafael Baracaldo, Fundación Universidad de Ciencias de la Salud, Bogotá DC, Colombia. 2020. .................................................. 53 9 Índice de tablas Tabla 1: Criterios Amsterdam II y Criterios Bethesda ............................... 58 Tabla 2: Score anatomopatológico de inestabilidad micro- satelital (MsPath Score) Estudio fenotípico de inestabilidad microsatelital en cáncer colorrectal. Correlación con parámetros histológicos y clínicos, Lilia Schmitz, 2014 ......................................................................................................... 60 Tabla 3: Descripción de fase preanalítica ................................................. 72 10 Índice de abreviaturas IMS: Inestabilidad microsatelital MSS: Estabilidad microsatelital CCR: Carcinoma colorrectal MMR: reparación de errores de apareamiento del AND (en íngles mismatch repair genes) ANC: Alteración número de copias NGS: Secuenciación de nueva generación IHQ: Inmunohistoquímica S.L: Síndrome de Lynch CMS: Consensus molecular subtype SSA: Adenoma serrado sesil TSA: Adenoma serrado tradicional FCA: Focos de criptas aberrantes 11 CIMP: Alta frecuencia fenotipo metilador ( en ingles CpG island methylador phenotype) EFGR: Factor de crecimiento epidérmico PCR: Reacción en la cadena polimerasa 12 Metodología Revisión sistemática de la literatura que incluye artículos científicos recientes sobre los estudios moleculares en el adenocarcinoma colorectal. Se utilizará herramientas de búsqueda de bibliografía en línea (pubmed, google scholar) para seleccionar los artículos necesarios para el desarrollo de la revisión sistemática. Objetivo General Describir la relevancia clínica de los estudios moleculares en el carcinoma colorectal. Objetivos específicos 1. Definir los cambios moleculares básicos de la carcinogénesis colorrectal. 2. Describir las características histopatológicas claves del adenocarcinoma colorrectal que sugieran cambios moleculares. 3. Identificar alteraciones moleculares específicas observadas en el carcinoma colorrectal así como su relevancia clínica. 4. Analizar el concepto de inestabilidad microsatelital en el adenocarcinoma colorrectal y su impacto sobre el origen y la evolución de esta neoplasia. 5. Conocer los métodos y técnicas empleados para la detección de las alteraciones moleculares en el adenocarcinoma colorrectal. 13 Introducción El carcinoma colorrectal es una enfermedad heterogénea con múltiples vías moleculares que lleva a su aparición. La mayoría son adenocarcinomas y son la tercera causa más frecuente de cáncer en el mundo y la cuarta causa más frecuente de mortalidad en el mundo relacionada con cáncer. En Costa Rica el cáncer colorrectal es una de las neoplasias más mortales junto con las neoplasias de próstata, mama, pulmón y estómago. La incidencia a nivel nacional en hombres es de 9,92 por cada 100000 habitantes, siendo el cuarto tumor más frecuente en este género, mientras que en mujeres ocupa el sexto lugar en incidencia con un 11,85 por cada 100000 habitantes. En cuanto a su mortalidad, tanto en la población masculina, como en la femenina, ocupa el tercer lugar. Fuente: Ministerio de Salud, Costa Rica, Registro Nacional de Tumores. Los protocolos de tratamiento y pronóstico de los pacientes han mejorado gracias a las nuevas herrramientas moleculares y la comprensión de los mecanismos de carcinogénesis que presenta esta neoplasia. Nuestra tarea esencial como patólogos es identificar aquellos pacientes que se beneficiarían de estudios moleculares, enfocándonos en la historia clínica, origen macroscópico del tumor y hallazgos histopatológicos. 14 Estos estudios moleculares nos darán información sobre el origen hereditario o somático de la neoplasia; además nos guía hacia la escogencia del tratamiento más adecuado y hacia la determinación del pronóstico de dicha neoplasia. Por ejemplo si se logra determinar que el adenocarcinoma colorrectal es de origen hereditario esto ayuda a sospechar en un síndrome específico en el paciente tal como el Síndrome de Lynch lo cual sugeriría incluir a este paciente y familia en un programa de consejo genético de cáncer para tamizaje, detección temprana y manejo preventivo. Por eso es primordial tener en cuenta que al hacer el diagnóstico de adenocarcinoma colorectal tenemos una tarea esencial, a tráves de ciertos hallazgos histopatológicos, de identificar a los pacientes candidatos a estudios moleculares adicionales avanzados. Existen ciertos hallazgos macroscópicos e histopatológicos, tales como la localización del tumor en colon derecho, la falta de diferenciación histológica y la presencia de infiltrado linfocítico intratumoral, los cuales nos sugieren ciertos cambios moleculares específicos. De los cambios moleculares más descritos en el adenocarcinoma colorrectal se menciona mutaciones en el gen APC, cambios mutacionales en la vía de señalización en el gen RAS y cambios moleculares que alteran los mecanismos de reparación del ADN llevando a la producción de inestabilidad microsatelital. Para la detección de estos cambios moleculares existen diferentes técnicas categorizadas como técnicas in situ como por ejemplo la 15 inmunohistoquímica en caso de detección de la inestabilidad microsatelital, o técnicas ex situ tales como técnicas de secuenciación (PCR tiempo real, Sanger, secuenciación de segunda generación) para la detección de mutaciones puntuales, deleción, inserciones, y alteraciones en el mecanismo de reparación del ADN. Es importante saber que en estás la obtención de resultados adecuados depende de forma primordial de la fase preanalítica dirigida por el patólogo y que contribuye en mantener el tejido a estudiar en una buena calidad. 16 Anatomía del colon; Estructura general y Morfología del colon El colon o intestino grueso tiene una longitud aproximada de 1,50 metros, es la porción del aparato digestivo comprendida entre la válvula ileocecal y el recto, este forma un marco alrededor del intestino delgado. 1 Desde el punto de vista anatómico se divide en las siguientes porciones; el ciego, apéndice cecal, colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, colon sigmoideo y recto. 1 El ciego es la primera porción del intestino grueso y se extiende desde la válvula ileocecal hasta su extremo más inferior.1 El colon derecho se extiende desde el ángulo ileocecal hasta que el colon transverso cruza la segunda porción del duodeno, este incluye el apéndice cecal, colon ascendente, ángulo hepático y parte del colon transverso.1 El colon izquierdo se extiende desde el borde izquierdo de la segunda porción del duodeno hasta la cresta íliaca e incluye, el resto del transverso, el ángulo esplénico y el colon descendente.1 El colon pelviano también conocido como colon sigmoides, va desde la cresta ilíaca y llega a la altura de la tercera vertebra sacra donde se hace 17 fijo, e incluye el colon sigmoides que conforma una figura omega siguiendo el borde izquierdo del psoasilíaco izquierdo.1 El recto se extiende desde la tercera vertebra sacra hasta el anillo anorectal el cual es el punto de confluencia del músculo elevador del ano con el borde superior de los esfínteres externos e internos del ano y se continua con el conducto anal que se extiende desde el anillo anorectal previamente descrito hasta el margen cutáneo mucoso del ano.1 Imagen A: Morfología general del colon, con el segmento transverso y el epiplón levantados. 1. Ciego; 2. colon ascendente; 3. ángulo derecho o hepático; 4. colon transverso; 5. ángulo izquierdo o esplénico; 6. colon descendente; 7. colon ilíaco. 1 La vascularización del colon recibe sangre arterial predominantemente de las arterias mesentéricas superior e inferior. La arteria mesentérica superior irriga el ciego, el apéndice, el colon ascendente y los dos tercios proximales del colon transverso a través de sus tres ramas principales; arteria ileocólica, cólica derecha y cólica media. La arteria mesentérica inferior 18 irriga el tercio posterior del colon transverso, el colon descedente, el sigmoides, el recto y la parte superior del canal anal a través de tres ramas: arteria cólica izquierda, sigmoidea y rectal superior. Las arteriales rectales media e inferior que provienen de la arteria ilíaca interna también proveen riego sanguíneo. 2 Las ramas mesentéricas superior e inferior que irrigan el colon, se anastomosan para formar la Arteria Marginal de Drummond. Esta corre a lo largo del margen interno del intestino grueso, dentro del mesenterio, y emite ramas arteriales directas al intestino grueso.2 19 Histología del Colon El colon tiene 4 capas histológicas distintivas entre sí: 1. Mucosa 2. Submucosa 3. Muscular propia 4. Serosa La mucosa colónica luminal es la capa más activa metabólicamente e inmunológicamente. La superficie luminal se encuentra cubierta por glucocáliz (glucanos, enzimas, lectinas y mucina) esto facilita la formación de un ecosistema microbiano sirviendo como una barrera integral.3 Debajo de esta superficie luminal encontramos epitelio columnar que recubre las criptas intestinales espaciadas en la lámina propia, esta consta de elementos estromales que recubren las criptas y se extiende desde el epitelio de la superficie hasta las células del músculo liso de la muscular de la mucosa.3 Entre los elementos que conforman esta primera capa se encuentra varios componentes celulares entre los cuales podemos encontrar cinco células epiteliales distintivas, estos son los enterocitos absortivos los cuales conforman la mayoría de la superficie epitelial; células caliciformes secretoras de moco, éstas se encuentran dispersas en el epitelio de la superficie y criptas y presentan gran cantidad de gránulos mucosos en su polo apical los cuales les dan una morfología característica que se describe como copa de vino; células enteroendocrinas éstas representan la 20 población más grande de células productoras de hormonas en el cuerpo y comprenden aproximadamente el 1% de las células individuales que revisten la luz intestinal, se ubican predominantemente en las criptas; células de Paneth ástas ignoran la regla de la migración luminal y normalmente las encontramos en la base de las criptas en colon derecho, sus diversos contenidos celulares reflejan un importante papel en la inmunidad así como regulación de las interacciones de la matriz celular, la apoptosis y la inmunidad celular y por último las células M, estás conocidas como células membranosas se encuentran en la región del domo de los folículos linfoides organizadas y están asociadas tanto con células inmunológicas como con los enterocitos absorbentes.3 Además de estos elementos, encontramos la lámina propia ya descrita previamente, ésta presenta entre sus células, células inflamatorias (mezcla de linfocitos B y T, células plasmáticas, eosinófilos, mastocitos y macrófagos) y mesenquimales (miofibroblastos). El límite profundo forma una capa delgada de músculo liso, la muscular de la mucosa, esta capa está unida a la mucosa, con células de músculo liso ocasionales que se extienden a la lámina propia. 3 Se debe dar especial importancia a los linfocitos intraepiteliales tanto en su histología básica como histopatología en carcinomas, en esta segunda se explicará detalladamente su importancia en los tumores posteriormente. Los linfocitos intraepiteliales se encuentran en dos compartimentos: en los espacios paracelulares del epitelio y asociados a agregados linfoides. En el 21 espacio paracelular son predominantemente linfocitos T supresores ( CD3+, C8+), correspondiendo aproximadamente a un 15- 40% de la población mientras que los asociados a agregados linfoides son una mezcla de CD3+/CD45+ y células B secretoras de IgM.3 La densidad normal de los linfocitos intraepiteliales varía de 1 a 5 linfocitos por 100 enterocitos, excepto en el epitelio asociado a fóliculos donde estos abundan. Estos suelen tener una disminución gradual desde colon ascendente hasta el recto.3 La submucosa se encuentra conformada por haces de músculo liso, tejido fibroelástico y adiposo. También encontramos el sistema nervioso entérico (plexo submucoso de Meissner) y vasculatura. Además se pueden observar algunas células inflamatorias.3 Imagen B:Capas histológicas de colon. Pathology Outlines. 22 La muscular propia se encuentra compuesta por capas de músculo liso constituidas por una circular interna y una longitudial externa. El plexo miénterico también conocido como plexo de Auerbach se encuentra entre estas dos capas.3 La capa serosa se encuentra constituida por una capa simple de células mesoteliales y tejido fibroelástico adyacente. 3 23 Hallazgos histopatológicos asociados a cambios moleculares Nuestro papel como patólogos es hacer un diagnóstico inicial temprano y certero en las biopsias iniciales en su mayoría endoscópicas y en la pieza quirúrgica su clasificación adecuada ya que esto tendrá un gran impacto en el pronóstico y tratamiento del paciente. Por lo que es importante abarcar en el diagnóstico; el tipo histológico, grado de diferenciación, extensión tumoral, los márgenes, invasión linfovascular, además del tamaño tumoral, su ubicación, invasión perineural y el estado de los ganglios linfáticos regionales. Existen características histopatológicas que deben hacernos sospechar la presencia de alteraciones moleculares entre algunas de ellas se encuentran la presencia de linfocitos intratumorales, el infiltrado inflamatorio de tipo Crohn y el subtipo histológico. Los tumores más frecuentes que encontramos en colon son los carcinomas y de estos más del 90% corresponden a adenocarcinomas, estos suelen ser de tipo usual y son de moderadamente a bien diferenciados o de bajo grado. Histológicamente los adenocarcinomas se caracterizan por la formación de glándulas con variación en tamaño y la forma. Las células epiteliales suelen tener una morfología columnar. El lumen de las glándulas contiene material mucoide eosinófilico así como dedritos celulares lo que se conoce como necrosis sucia sin embargo encontramos otros subtipos 24 histológicos como carcinoma epidermoide, carcinoma sarcomatoide, carcinoma neuroendocrino, carcinoma adenoneuroendocrino, entre otros.6 Los pólipos adenomatosos son los precursores de la mayoría de las neoplasias primarias epiteliales. Estos se describen como pólipos de origen epitelial caracterizados por un exceso de células displásicas. Estos pólipos pueden ser tipo tubular, velloso o tubulovelloso. Los de tipo velloso son los que tienen mayor potencial de malignidad.5 También encontramos los pólipos hiperplásicos aserrados por su morfología glandular aserrada o dientes de sierra y se caracterizan por presentar una dilatación de sus criptas y una apariencia normal en su superficie celular, estos pueden ser displásicos (10-20%) o no displásicos (80-90%).5 Los pólipos aserrados no displásicos incluyen: la variante microvesicular, el rico en células caliciformes, y el pobre en mucina, el adenoma sésil serrado se caracteriza por poseer un mayor número de células epiteliales anormales.5 Subtipos histológicos De los subtipos histológicos aceptados por la OMS, en la literatura se reportan algunos que se asocian con niveles altos de inestabilidad microsatelital, como el carcinoma medular, este se ha reportado que hasta en un 95% de los casos cursa con una alta mutación de BRAF y baja 25 mutación de KRAS. Este suele ubicarse de preferencia en colon proximal con una incidencia que suele aumentar con la edad y además tiene predominio por el sexo femenino. Histopatológicamente el carcinoma medular se caracteriza por un patrón de crecimiento sólido en nidos, patrón organoide o trabecular sin evidencia inmunohistoquímica de diferenciación neuroendocrina.4 Otro subtipo histológico asociado a inestabilidad microsatelital es el adenocarcinoma mucinoso: se definen como tumores con un aumento de la mucina extracelular mayor o igual a un 50%. Son más frecuentes en pacientes jovenes y en pacientes con Síndrome de Lynch, con alteraciones genéticas que difieren del adenocarcinoma de tipo usual. Los adenocarcinomas mucinosos que muestran alta inestabilidad microsatelital son considerados de bajo grado mientras que los que son estables o muestran baja inestabilidad microsatelital son considerados de alto grado.4 El adenocarcinoma con células en anillo de sello se caracteriza por estar conformado por células en anillo de sello en al menos un 50%, suelen estar ubicados en colon derecho y suelen presentarse en edades más jovenes. Histológicamente las células presentan vacuolas de mucina que empujan el núcleo hacia la periferia dándole esa característica imagen de anillo de sello.4,6 Linfocitos Intraepiteliales 26 Otro de los hallazgos histopatológicos importante de evaluar son los linfocitos intraepiteliales. Según el Instituto Nacional de Cáncer de los Estados Unidos se puede definir el infiltrado linfocitario intraepitelial como el movimiento de una célula inmune desde el torrente sanguíneo hasta el tumor, creyéndose entonces que es un signo de respuesta por parte del sistema inmune contra el tumor.4 Los linfocitos intraepiteliales son de dos tipos4: 1. Linfocitos T CD4 + tipo ayudadores (helper) 2. Linfocitos T CD8+ citotóxicos El sistema inmune suele reconocer pobremente las neoplasias, sin embargo se ha visto que en los carcinomas que albergan inestabilidad microsatelital presentan linfocitos infiltrando el tumor lo que ha demostrado que los mecanismos de citotoxicidad T están activados.4 Las células inmunes que se encuentra en contacto con el tumor difieren tanto en su fenotipo como en su función de los linfocitos estromales (aquellos que se encuentran alrededor del tumor) y de los que se encuentran en sangre periférica.4 Aquellos que se encuentra en el estroma (peritumoral) son en su mayoría CD4+ mientras que aquellos que se encuentran intratumorales son CD8+ lo que les da un rol en la respuesta inmunitaria, por lo cual los linfocitos intratumorales están asociados a un mejor pronóstico lo que difiere de los linfocitos estromales o peritumorales.4 27 Si no hay una adecuada respuesta inmune se ha visto que hay mayor invasión vascular, linfática y perineural y eventualmente la diseminación del mismo. Un infiltrado inmune prominente se ha asociado a menor cantidad de metástasis incluyendo émbolos vasculares, invasión linfática y perineural.4 Se ha asociado un infiltrado denso linfocítico en el cáncer colorrectal con una supervivencia más larga, y esto puede ser un indicador de la respuesta inmune del huésped al tumor.7 Los tumores con inestabilidad de microsatélites se encuentran asociados a una alta densidad de linfocitos infiltrantes tumorales, lo cual a su vez se encuentra relacionado a un mejor pronóstico que aquellas neoplasias con estabilidad de microsatélites.7 Infiltrado inflamatorio tipo Crohn Se describe tipo Crohn por su semejanza a los agregados linfoides transmurales que se observan en esta enfermedad.4 El infiltrado tipo Crohn se caracteriza por agregados linfoides incorporados en un estroma colagenoso entre la muscular propia o el tejido fibroadiposo pericólico.4 Su presencia en la periferia del tumor refleja la actividad de células inmunes contra el tumor. Este infiltrado tipo Crohn se ha utilizado como criterio estándar cuando se han encontrado al menos 3 a 4 agregados linfoides, en otros estudios se ha 28 sugerido dos o más agregados o un mínimo de 3 agregados linfoides, asociando además el tamaño del agregado mayor, si este es mayor de 1 mm se ha asociado a un mejor pronóstico.4 Imagen C: 1. Imagen con H-E de un adenocarcinoma moderadamente diferenciado señalado con la flecha gruesa. La flecha delgada muestra nódulos linfáticos transmurales, conocido este fenómeno como infiltrado peritumoral (infiltrado Crohn-like) 2. Acercamiento (40x) Se ha visto que los tumores con inestabilidad microsatelital tienen un aumento de linfocitos T citotóxicos a nivel tumoral y peritumoral. Este infiltrado suele estar presente cuando hay IMS alta, por lo cual se considera que el pronóstico del paciente está basado en la presencia IMS ya que ésta se considera como un factor pronóstico que es favorable en el carcinoma colorrectal y esto suele deberse al alto infiltrado inflamatorio local y su respuesta inmunitaria al tumor.4 La reacción tipo Crohn like se clasifica en tres grados: Basado en el número y tamaño de linfocitos y cantidad de centros germinales.4 x Grado 0: sin linfocitos x Grado 1: Linfocitos ocasionales y pequeños, agregados linfoides con centros germinales ausentes. 29 x Grado 2: Linfocitos numerosos y grandes, centros germinales frecuentes. Otras características histopatológicas Invasión linfovascular Se describe como la presencia de células tumorales en los vasos sanguíneos con recubrimiento endotelial así esté ausente la capa muscular, ésta lleva por si misma el riesgo de metástasis a nivel nodal y extranodal.4 El pronóstico de los pacientes depende de manera importante del número de ganglios linfáticos con metástasis. De acuerdo a la AJCC más de 12 ganglios linfáticos evaluados han probado ser un factor pronóstico significativo en carcinomas localmente avanzados.4 En estudios realizados la disección ganglionar es mayor en carcinomas colorrectales con IMS y es posible que esto sea por la reacción inmune generada ya que esto hace que los ganglios linfáticos aumenten su tamaño y sean detectados con mayor facilidad.4 A su vez se ha visto la asociación entre IMS y un mayor número de ganglios comprometidos definido como más de 10 ganglios linfáticos afectados.4 Invasión perineural Esta se define como la invasión o diseminación a lo largo de los fascículos nerviosos. La incidencia de invasión perineural en los carcinomas colorectales es de aproximadamente un 20%.4 30 La invasión perineural se ha asociado a tumores agresivos, invasión linfovascular, patrón de crecimiento tumoral así como tumores pobremente diferenciados. La AJCC considera la presencia de éste parámetro como un factor pronóstico negativo, el cual indica un carcinoma de comportamiento agresivo.4 Budding tumoral Se describe como la presencia de células tumorales que se encuentran aisladas o en pequeños grupos de más de cinco células situadas en el estroma circundante.4 Este proceso representa la desdiferenciación de las células epiteliales en fenotipos más agresivos mediante un proceso que se conoce como transición mesenquimal-epitelial, este mecanismo consiste en que las células epiteliales polarizadas que normalmente interactuan con la membrana basal, están sujetas a múltiples cambios bioquímicos que le permiten asumir un fenotipo mesenquimal.4 El proceso culmina con la degradación de la membrana basal y la formación de células mesenquimales que pueden migrar lejos de la capa epitelial de la cual se originaron.4 31 El Colegio Americano de Patólogos (CAP) reseña los puntos de corte para reportar los nidos en: bajo de 0-4, intermedio 5-9 y alto mayor a 10 en un campo de área de 0.785 mm². Los tumores con alto budding tumoral se encuentran frecuentemente asociados a estabilidad microsatelital y son más frecuentes las mutaciones del gen KRAS, al contrario un bajo budding tumoral o ausencia de este se ha visto asociado a un mayor número de infiltrado linfocítico tumoral.4 Se considera el budding tumoral como un factor pronóstico adverso independiente.4 32 Carcinogénesis Colorectal El carcinoma colorrectal es altamente heterogéneo tanto en su fenotipo como genotipo lo que está en relación con las diferentes vías de carcinogénesis que implican diferentes mecanismos de progresión y agresividad de la enfermedad. El cáncer es una enfermedad que es causada por un crecimiento descontrolado de las células, que modifican su función, forma y tamaño. El resultado de este crecimiento descontrolado es un aumento en el número de células y su propagación por el órgano y tejidos circundantes y finalmente la colonización de otros órganos a distancia (metástasis). Puede presentarse como formas esporádicas o asociadas a Síndrome de Lynch (CCR hereditario no polipósico) en el cual se observan mutaciones en genes que codifican proteínas de reparación de errores de apareamiento de nucleótidos (MMR), lo cual determina el estatus de inestabilidad de microsatélites. La mayoría de los casos ocurren como consecuencia de la metilación esporádica de MLH1 (95-97%); sin embargo, en el síndrome de Lynch ocurren por mutaciones en la línea germinal (1-3%) afectándose uno solo de los alelos, con retención de la capacidad de reparación del ADN en las células no tumorales y pérdida de la misma en las células neoplásicas (estado de inestabilidad genómica).8 Las vías clásicas correspondientes a la vía supresora y mutadora se caracterizan por una serie de alteraciones genéticas relacionadas con los 33 cambios fenotípicos de la progresión morfológica en la secuencia de adenoma-carcinoma.5 También hay vías alternas que se relacionan por mutaciones en los genes de KRAS y BRAF y se relacionan con la progresión de un pólipo serrado a carcinoma.5 Las vías de carcinogénesis son una secuencia de alteraciones moleculares que llevan al desarrrollo de un tumor, y estar relacionados con este concepto es clave para la prevención, diagnóstico temprano, tratamiento y pronóstico.5 Para entender este concepto debemos empezar desde lo más básico y esto se refiere al mecanismo de malignización del epitelio colorrectal y lesiones premalignas implicadas. Este mecanismo consiste en un recambio celular que ocurren en las criptas intestinales. Estas criptas intestinales son invaginaciones del epitelio superficial y se dividen en dos zonas. La primera de ellas se conoce como la zona proliferativa o nichos de células madre, y se encuentra ubicada en la base y la zona de diferenciación que se ubica hacia el lumen intestinal.5 El recambio ocurre cada tres a seis días y consiste en generar nuevos clones a partir de las células madre que se ubican en la zona proliferativa, que se especializan en células epiteliales intestinales en la zona de diferenciación.5 34 En la zona de proliferación, esta hiperproliferación se mantiene gracias a proteínas cuya función antiapoptótica como la proteína Bcl-2 y también por señales que favorecen la proliferación como la vía Wnt/B catenina . En la zona de diferenciación esto difiere, la especialización de las células intestinales se da por que existen señales anti proliferativas, como la proteína APC y las proteínas Bmp que se encargan de regular negativamente la vía de Wnt/B catenina.5 Figura 1: Procesos de recambio celular en la cripta intestinal .En la zona de proliferación, el fenotipo hiperproliferativo se mantiene gracias a la expresión de proteínas antiapotóticas como Bcl-2 y por la activación de la vía Wnt/β-catenina. En la zona de diferenciación, la especialización de las células intestinales se mantiene gracias a la inactivación de la vía Wnt/β-catenina. 5 Las alteraciones en las vías de señalización de este recambio celular que conducen a una proliferación sostenida y a la antiapoptosis pueden iniciar la vía de la carcinogénesis y eventualmente a la aparición de carcinoma colorrectal. Este desequilibro entre señales proliferativas y disminución de la apoptosis hace que ocurrra un agrandamiento y fusión de las criptas formando focos de criptas aberrantes que macroscópicamente visualizamos como pólipos.5 35 Vías de carcinogénesis Desde el punto de vista genético el carcinoma colorrectal puede clasificarse como hereditario y esporádico. El hereditario incluye síndromes causados por mutaciones germinales en genes de alta penetracia como APC, MYH, familia de genes MMR, SMAD4 BMPR1, STK11 y PTEN.5 La gran mayoría de casos corresponden a los de origen esporádico, lo que implica factores de riesgo ambientales (dieta, actividad física etc) y también factores genéticos caracterizados por ganancia de mutaciones somáticas y polimorfismo de baja penetrancia.5 Los estudios han demostrado consistentemente que existen al menos 3 mecanismos que se relacionan con el origen y progresión del carcinoma colorectal5: x Inestabilidad cromosómica (Vía supresora) x Inestabilidad microsatelital (Vía mutadora) x Fenotipo metilador de islas CpG Las vías de la carcinogénesis incluyen las vías clásicas que favorecen la progresión de un adenoma a un carcinoma conocida como secuencia adenoma-carcinoma y las vías alternas que son aquellas que consisten en la progresión de un pólipo aserrado a adenocarcinoma conocida como la vía aserrada de la carcinogénesis.5 36 En 1988 Volgestein describió la primera vía de carcinogénesis que corresponde a la vía supresora también conocida como inestabilidad cromosómica, la cual consiste en ganancia de cambios moleculares en los pólipos adenomatosos que llevan a su malignización.5 Años después se describió otra vía de progresión adenoma- adenocarcinoma conocida como la vía mutadora. Ambas se consideran como las vías clásicas.5 La vía más común que representa hasta un 85% de los casos de carcinoma colorrectal esporádico y también explica los casos de poliposis adenomatosa familiar es la vía supresora.5 Esta vía afecta con mayor frecuencia el colon distal y se caracteriza por generar inestabilidad cromosómica, aneuploidía y pérdida de heterogocidad. Antes de entrar en detalle en estás vías se describiran algunos de los genes que han sido involucrados en la secuencia adenoma- carcinoma. x APC (Poliposis adenomatosa coli): Es un gen de 15 exones que codifica una proteína de 300-kDa, esta proteína regula la adhesión celular así como la migración celular, segregación cromosómica y la apoptosis en las criptas colónicas. La mayoría de los CCR (hasta en un 85%) presentan mutaciones en el gen APC, las cuales suelen encontrarse de manera temprana en los adenomas. 37 Este actúa en el proceso carcinogénico como un regulador de B- catenina por lo que es también llamado vía canónica o de señalización dependiente de B- catenina, cuando ambos alelos del APC se encuentran mutados, la B- catenina se acumula en el citoplasma y se activan factores de transcripción. Un 50% de ellos muestran mutaciones que son independientes de la B- catenina, en donde destaca entonces el papel de WNT por su implicación en la regulación de señales apoptóticas, concediéndole una ventaja a la célula epitelial que se múltiplica.8,9 x KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene) : Es un gen con cuatro exones que codifica para una estructura proteíca GTPasa. Esta proteína actua en la vía de transducción de señales de crecimiento y diferenciación celular. El KRAS correponde a la familia de los genes RAS: HRAS, NRAS y KRAS. Es uno de los genes implicados en la vía del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), esta vía transmite señales desde el exterior de la célula hacia su interior con la finalidad de regular el crecimiento, la división, supervivencia y muerte celular. Constituyen en las neoplasias humanas uno de los grupos de oncogenes más frecuentemente alterados. Las mutaciones KRAS constituyen alrededor de un 85% de todas las mutaciones RAS mientras que NRAS son aproximadamente 15% y HRAS 0.12 a 1%.5 38 La mutación de KRAS se describe como el evento genético más común en el desarrollo de tumores malignos: 30% pulmón, 40% colon, 80% para páncreas y 55% para tiroides.5 Alrededor de un 90% de las mutaciones de este gen se ubican en sitios específicos del primer exón, siendo aproximadamente un 80% en el codón 12 y un 15-20% en el codón 13. 8,9 La terapia usada en algunos estadios avanzados de CCR incluye el uso de anticuerpos monoclonales tales como Panitumumab y Cetuximab, capaces de bloquear la activación de EGFR.8 x BRAF : Situado en el brazo largo del cromosoma 7 (7q34), codifica una quinasa serina/treonina citoplasmática de la familia RAS que media la transducción de señales en la ruta MEK/ERK, siendo una vía importante para el crecimiento, diferenciación y regulación celular, más la promoción de la apoptosis.8,9 Aproximadamente el 90% de las mutaciones BRAF V600E son conocidas, involucran la sustitución de ácido glutámico (E) por valina (V) en la posición V600 de la cadena de proteína, resultando en un oncogén BRAF constitutivamente activo. Como resultado de esta activación, la señalización hiperactiva MEK y ERK conduce a la proliferación celular excesiva y la supervivencia, que es independiente de los factores de crecimiento. La señalización oncogénica BRAF puede conducir a un aumento incontrolado de la proliferación celular y la resistencia a la apoptosis.8,9 39 TP53 (Proteína tumoral 53): Este gen juega un rol importante en la defensa contra el desarrollo y la progresión del cáncer, en respuesta al daño del ADN y activación de oncogenes. Es responsable de la integridad del genoma, induciendo la detención del ciclo celular y la apoptosis, procesos dependientes de diferentes tipos de lesión celular, como el daño del ADN. La mutación de TP53 se ha reportado en un porcentaje que oscila entre un 40 y 50% de los casos de CCR. La mutación tiene como consecuencia pérdida de la habilidad de unirse al ADN y por lo tanto pérdida de la función.8,9 Vía Supresora (Inestabilidad cromosómica) Las alteraciones de la vía supresora se pueden dividir en: x Mutaciones en los genes APC y CTNNB1 que son importante en la vía de señalización de Wnt/B -Catenina, generando una resistencia a la degradación de la B-catenina mediante el sistema ubiquitina- proteosoma, esto favorece la sobreexpresión de oncoproteínas lo que genera un estado de hiperproliferación, favoreciendo la ganancia de mutaciones en otros genes permitiendo la progresión de un adenoma temprano.5 En los casos de poliposis adenomatosa familiar, la mutación en el gen APC es una mutación germinal. x El adenoma temprano va a progresar hacia a un adenoma intermedio por mutación en el gen KRAS que produce una ganancia de función y esto lleva a la activación constitutiva de este oncogén. 40 x El adenoma intermedio presenta un patrón hiperproliferativo muy marcado, lo que permite el desarrollo de una inestabilidad cromósomica que conduce a una pérdida de genes ubicados en el brazo largo del cromosoma 18: DCC, SMAD4, SMAD2 e ITF-2. Esto contribuye a una inmortalización celular y la progresión del adenoma. x Por último esta inmortalización celular en el adenoma tardío conduce a la adquisición de mutaciones incluido el gen TP53. 5 Ver figura 3. Figura 2: Imagen suministrada por Dr. Abbas Patólogo y Biólogo molecular del Hospital Calderón Guardia, San José, Costa Rica. La imagen muestra la progresión adenoma-adenocarcinoma. 41 Vía mutadora (inestabilidad microsatelital) Se ha asociado a un 15% de los carcinomas esporádicos y también con el Síndrome de Lynch (también conocido como cáncer colorectal hereditario no polipósico). Esta vía es más común en colon proximal y se caracteriza por un fenotipo mutador en regiones microsatélite acompañado de inestabilidad cromosómica es decir son tumores diploides.5 Para analizar el concepto de inestabiidad microsatelital se debe primero tener presente la función de reparación de errores de apareamiento del ADN (MMR en íngles mismatch repair genes) conformado por genes de reparación encargados de mantener el ADN íntegro durante la replicación, corrigiendo alteraciones en el apareamiento de nucleótidos generados por el clivaje de un ADN anómalo.4 Un sistema de reparación comprometido va a llevar a la acumulación acelerada de mutaciones somáticas. Los genes MLH1, MSH2 MSH6, Y PMS2 son los productores de las proteínas encargadas de la reparación.4 Un defecto en estos genes lleva a mutaciones en secuencias repetitivas simples llamadas microsatélites las cuales causan inestabilidad microsatelital caracterizada por la expansión o contracción anormal de estas repeticiones, presentadas en su mayoría en intrones.4 Habiendo analizado este concepto, esta vía mutadora (inestabilidad microsatelital) a diferencia de la vía supresora no se ha relacionado con una cascada de eventos progresivos a escala genética. Se acepta que el primer paso corrresponde a una progresión de un epitelio normal hacia un 42 adenoma y este se da por un mecanismo de dos golpes que incluyen la mutación o inactivación de los dos alelos en un gen de la familia MMR mencionada previamente.5 En los casos de Síndrome de Lynch la primera mutación es germinal lo que predispone a fallas en los sistemas de reparación del ADN y un fenotipo mutador que provoca IMS alterando genes importantes en el control del ciclo celular como: CTNNB1, BAX, PTEN, TGF-BetaIIR, IGF-IIR. Las mutaciones en CTNNB1 se relacionan con un estadio hiperproliferativo mientras que BAX, TGF-BetaIIR, IGF-IIR confieren resistencia a la apoptosis.5 Las mutaciones más frecuentes son las de MSH2 y MLH1 con una frecuencia de 40 a 60% y de 40% a 50% respectivamente. Los dos otros genes tienen porcentajes menores dados por MSH6 (10-20%) y PMS2 (2%).5 Aproximadamente el 80% de los carcinomas colorrectales con inestabilidad microstelital se debe a una hipermetilación de MLH1, mientras que el 20% se asocia con mutaciones germinales de los genes MMR.5 En algunas literaturas se ha clasificado la inestabilidad cromosómica de acuerdo a los hallazgos de inmunohistoquímica relacionado con la ausencia de expresión nuclear como inestabilidad alta (mayor al 30%) e inestabilidad baja (menor al 30%).4 43 Figura 3: Vía clásica de la carcinogénesis colorrectal a partir de adenomas. En la mitad superior se muestra las alteraciones de la vía supresora y en la mitad inferior la vía mutadora. Vías de carcinogénesis colorrectal y sus implicaciónes clínicas, María C. Sanabria, Julio 2012. Vía Aserrada La vía aserrada de la carcinogénesis incluyen dos vías alternas de malignización a partir de un pólipo serrado por mutaciones en los genes KRAS o BRAF. 5 La ganancia de una mutación en BRAF conduce a una alteración en la vía señalización Ras/Raf/MAPK esto tiene como consecuencia el desarrollo de una cripta aberrante que progresa a un pólipo hiperplásico de variante microvesicular no displásico, precursor de un adenoma serrado el cual tendrá metilación de las islas CpG del ADN, lo que va a causar el silenciamiento de los genes, como los de la familia MMR que favorece a una inestabilidad microsatelital y progresión a un carcinoma colorrectal.5 La ganancia de una mutación en KRAS altera la misma vía Ras/Raf/MAPK, no está claro el precursor de esta vía pero se ha visto mutaciones de este gen en un 43% de los pólipos aserrados ricos en células caliciformes, 24% 44 de los adenomas serrados, 26% de los adenomas convencionales y en el 37,3% de los adenocarcinomas. Debido a que presenta un fenotipo de inestabilidad cromosómica, se considera que esta se sobrelapa con la vía supresora.5 Figura 4: Vías alternas de carcinogénesis colorrectal a partir de pólipos hiperplásicos aserrados. (a)Vía aserrada por mutaciones en BRAF. (b) Vía aserrada por mutaciones en KRAS . En ambas figuras se muestra la progresión de las lesiones aserradas hasta su malignización, en correlación con las alteraciones moleculares. Vías de carcinogénesis colorrectal y sus implicaciónes clínicas, María C. Sanabria, Julio 2012. Vía del fenotipo metilador de islas CpG La aparición del carcinoma colorrectal puede ocurrrir también por un mecanismo epigenético que se caracteriza por la inactivación de varios genes, principalmente por la metilación del ADN. Esta metilación del ADN 45 corresponde a la segunda vía genética más común del CCR esporádico, se presenta en aproxidamente un 15% de los casos. Esta vía consiste en la unión de un grupo metilo en el carbono 5 de la citosina por acción de la enzimas ADN-metiltransferasas, lo que da origen a la 5 metil- citosina también denominada quinta base.5 Las modificaciones por metilación ocurren en las citosinas de los dinucleótidos CpG, conocidas como islas CpG, que se localizan en los promotores de casi la mitad de todos los genes y se encuentran generalmente no metiladas en células normales.5 En las células tumorales la hipermetilación de las islas CpG de los promotores genera la inactivación en la expresión de diferentes genes, como los genes supresores de tumores y los de reparación.5 Este fenómeno de hipermetilación se conoce como fenotipo de metilación de las islas CpG o CIMP (por la sigla en inglés de CpG island methylator phenotype). 46 Figura 5: Figura H: Se ilustra la secuencia del modelo genético de la carcinogénesis colorrectal propuesto por Vogelstein, que explica la progresión del CCR desde la mucosa normal del colon hacia el carcinoma. Se describen las diferentes vías relacionadas con el origen del CCR: la supresora, la mutadora y la de metilación. CIN: inestabilidad cromosómica. MSI: inestabilidad microsatélital. CIMP: fenotipo de metilación de las islas CpG. MMR: genes del sistema de reparación de bases mal apareadas. Bases moleculares del cáncer colorrectal Katherine Andrea Palacio Rúa1,3, Carlos Mario Muñetón Peña En la carcinogénesis del CCR también se debe recalcar la importancia de la ubicación anatómica en colon donde se origina el adenocarcinoma, porque existen diferencias embriológicas, morfológicas y moleculares de la mucosa colónica normal que explican diferencias tanto en lesiones premalignas como malignas, de acuerdo a su localización. Ver cuadro comparativo I. La importancia de estas diferencias se sustenta en diferentes procesos de carcinogénesis donde en el colon proximal predomina la vía mutadora y la vía serrada mientras que en colon distal predomina la vía supresora.5 47 Cuadro comparativo 1: Diferencias entre colon proximal y distal. Vías de carcinogénesis colorrectal y sus implicaciónes clínicas, María C. Sanabria, Julio 2012. 48 Clasificación molecular del Carcinoma Colorrectal Como se ha descrito el carcinoma colorrectal deriva de múltiples eventos genéticos que incluyen mutaciones y modificaciones epigenéticas que eventualmente llegan a transformar un epitelio glandular normal hacia un adenoma y de éste a un carcinoma. En el 2015 un grupo de expertos desarrolló una clasificación molecular de consenso denominada Consensus Molecular Subtype, esta se desarrolló basada en el analisis de 4.151 pacientes que fueron clasificados en cuatro subtipos según su perfil molecular.11 x CMS1: Inmune: Se caracteriza por presencia de alta inestabilidad microsatelital, presencia de fenotipo metilador de islas CpG y BRAF frecuentemente mutado. Tiene baja alteración en el número de copias (ANC), infiltración inflamatoria y peor pronóstico. Representa el 14% de los CCR. x CMS2 : Canónico: Tienen alta ANC y son microsatelitalmente estables. Tienen mutación de la vía de señalización de WNT y los genes Myc, alta expresión EGFR y mutación TP53. Representa el 37% de los CCR. x CMS3: Metabólico: Tienen un patrón genómico y epigenómico con características mixtas. El 30% de los tumores CMS3 son hipermutados, con IMS moderada o baja y estatus fenotípico con metilador de islas CpG intermedio. Tiene activación moderada de 49 WNT y Myc, tiene mutación KRAS, PIK3CA y sobreexpresión de gen IGBP3. Representa el 13% de los CCR. x CMS4: Mesenquimático: Tiene marcada regulación de genes involucrados en transición de epitelio mesenquimatoso, remodelación de matriz extracelular, angiogénesis, señalización TGF beta y citoquinas proinflamatorias.11 Cuadro comparativo 2: Basado en Guinney et al. Nat Med 2016. MSI: Inestabilidad microsatelital. CIMP: Fenotipo metilador de islas CpG. SCNA: Alteración de número de copias somáticas. Anti-EGFR: inhibidores del factor de crecimiento epitelial. Significancia clínica de los subtipos moleculares en CCR: x CMS1: Los tumores con alta IMS tienen mejor pronóstico y mejor respuesta a fluoropirimidinas, sin embargo la presencia de mutación BRAF se asocia independientemente a peor pronóstico. Este 50 subgrupo también se caracteriza con metilación de islas CpG lo que frecuentemente se asocia a un mejor pronóstico. x CMS2 y CMS3: Estos dos subtipos moleculares son relativamente similares y comparten características significativas, pudiendo mostrar sensibilidad a varios agentes terapéuticos comunes. Las alteraciones en el número de copias somáticas (cambios en la estructura de los cromosomas que resultan en la ganancia o perdida de secciones de ADN) se detectan por secuenciación de nueva generación de todo el genoma, siendo un marcador del CMS2. Éste se caracteriza por la pérdida o ganancia en varios cromosomas (ganancia de 20q, 13q, 8q, y pérdida de 4, 8p, 18 q y 17 p). Los pacientes del CMS3 desarrollan frecuentemente mutación de KRAS, resultando en una activación constitutiva de la vía de las MAPK que se asocia a peor pronóstico y respuesta a tratamiento estándar. Igualmente, los tumores con mutación KRAS se asocian con mayor frecuencia de metástasis pulmonares. Además, la mutación del gen NRAS está presente en el 5% de los CRC y también se asocia a peor pronóstico. x CMS4: Este subtipo molecular presenta igualmente alteraciones en el número de copias somáticas, similar a lo descrito en el subtipo CMS2, pero con incremento en la expresión de vías de señalización relacionadas con TGF beta. Se ha reportado que las células estromales son altamente ricas en TGF beta y, por lo tanto, pueden ser inhibidas para evitar la progresión tumoral. En este sentido, el porcentaje en las células estromales tumorales se asocia con peor pronóstico en CRC, dado que la infiltración estromal inhibe la función inmune en el tumor.11 51 Relevancia clínica de las alteraciones moleculares en el carcinoma colorrectal Dos tipos de pruebas moleculares se han establecido para evaluar la deficiencia del sistema de reparación de errores de emparejamiento del ADN (MMR): Inestabilidad de microsatélites y análisis inmunohistoquímico. La detección de la función de ADN MMR se aplica, no solo al cribado molecular inicial para el Síndrome de Lynch, sino también a la selección de pacientes adecuados para la inmunoterapia. La deficiencia del sistema de reparación de desajustes de ADN puede ser evaluado a través de enfoques en dos niveles diferentes: el nivel genómico (análisis IMS, PCR o NGS) y a nivel de proteínas (IHQ). A nivel genómico, los enfoques basados en PCR (reacción en cadena polimerasa) han sido el estándar de oro para el análisis de IMS. Con el desarrollo de la tecnología NGS (secuenciación de nueva generación), el análisis IMS basado en NGS se ha adoptado cada vez más por sus dos ventajas principales. La primera de ellas es que los paneles de secuenciación NGS pueden capturar simultáneamente el espectro de mutación y el estado de IMS lo que reduce la cantidad de muestra de tejido requerida y simplifica el proceso de prueba y segundo se elimina la necesidad de muestras de control normales, lo que beneficiará a los pacientes sin cirugía, especialmente para la mayoría de los cánceres metastásicos. 12,13 52 En los laboratorios de patología el método más utilizado es por IHQ, el cual evalúa la presencia o ausencia de la expresión de MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2. La expresión nuclear de todos los marcadores permite designarlo como un sistema de reparación intacto (eficiente). La ausencia de expresión nuclear de alguno de los marcadores permite clasificar al adenocarcinoma como con un sistema de reparación deficiente.12,13 Ver imagen D. Las mutaciones más frecuentes son las de MSH2 y MLH1 con una frecuencia de 40% a 60% y de 40% a 50 %, respectivamente. Los otros dos genes tienen porcentajes menores dados por MSH6 (10-20%) y PMS2 (2%). 5 Aproximadamente 80% de los CCR con inestabilidad microsatelital se deben a la hipermetilación del MLH1, mientras que 20% se asocia con mutaciones germinales de los genes MMR.5 Con esto se puede decir que los pacientes sin un defecto germinal en el gen MMR pero con inestabilidad microsatelital y pérdida de las proteínas de expresión MMR están cerca a tener un Síndrome de Lynch, siempre y cuando se hayan descartado otras causas de inestabilidad como la metilación del promotor MLH1.12,13 Se ha observado que aquellos pacientes con alteración en MLH1 se les deben realizar la mutación BRAF V600E, asociada con estudios de 53 hipermetilación de MLH1, para determinar si corresponde a un caso esporádico o hereditario.12,13 Imagen D: A. Imagen con hematoxilina-eosina (HE) de un adenocarcinoma de colon bien diferenciado. La inmunomarcación negativa de la misma lesión para MLH1 (B) y PMS2 (C). La ausencia de expresión nuclear de estas proteínas indica un sistema de reparación del DNA deficiente. Características histopatológicas del carcinoma colorrectal con inestabilidad microsatelital (IMS), Rafael Baracaldo, Fundación Universidad de Ciencias de la Salud, Bogotá DC, Colombia. 2020. Los defectos de pérdida de función en la reparación del desajuste del ADN (MMR) ocurren en aproximadamente el 15% de todos los carcinomas colorrectales. Este subconjunto molecular puede ser esporádico o estar asociado a Síndrome de Lynch y caracteriza a los pacientes con mejores pronósticos que no experimentan ningún beneficio con la quimioterapia con 5- fluorouracilo. La mayoría de los carcinomas con deficiencia de MMR son esporádicos, pero entre el 15% y el 20% se deben a una predisposición hereditaria (Síndrome de Lynch). 12 Aunque el pronóstico del CCR y la predicción de la respuesta al 5- fluorouracilo son similares en los subgrupos de Lynch y la inestabilidad microsatelital esporádica, estos subgrupos difieren significativamente con respecto a las implicaciones para los miembros de la familia. 54 Se ha propuesto que la mayoría de los carcinomas con IMS esporádicos surgen en adenomas/pólipos serrados sésiles en el colon proximal de personas mayores, estas características morfológicas son claramente diferentes de los adenomas polipomatosos convencionales que son los precursores del carcinoma esporádico y de Síndrome de Lynch.12 Los pólipos con morfología serrada con displasia se consideran el precursor de CRC con IMS esporádico y muestran características moleculares únicas, incluidas la mutación BRAF, generalizado aumento en la metilación de la isla CpG (CIMP), hipermetilación además de IMS.13 El reconocimiento de un mejor pronóstico y la ausencia de respuesta a la terapia con 5-FU justifican una estrategia de prueba para la detección del subgrupo esporádico.12,13 A nivel clínico y morfológico, la IMS de tipo esporádico se presenta con frecuencia en la porción proximal del colon en pacientes mayores, es más común en mujeres, y muestra un patrón de crecimiento en expansión, características mucinosas, linfocitos infiltrantes tumorales y ausencia de necrosis tumoral.12 En este subgrupo se espera una mutación del BRAF en el 60% de los casos. Si esta mutación está presente, entonces el síndrome de Lynch se excluye.12 El carcinoma de colon asociado a Sd. de Lynch y la IMS esporádica debe diagnosticarse en todos los pacientes para garantizar un pronóstico, tratamiento y evaluación de riesgos precisos para los familiares. 16 55 La presentación clínica, los antecedentes familiares, las características morfológicas del tumor, la IHC y la IMS no son 100% sensibles; por lo tanto, se necesita un mejor algoritmo de prueba para identificar los casos de carcinoma con inestabilidad microsatelital y asignar con precisión estos casos a Lynch y subgrupos esporádicos con IMS.16 Se propone un algoritmo de cribado MMR que incluya pruebas paralelas para MSI, mutación BRAF c.1799T A e IHC para las cuatro proteínas MMR.16 Figura 6: La estrategia de prueba propuesta y los posibles resultados de la prueba, las pruebas adicionales posteriores la asignación de subgrupos, el pronóstico y la predicción de la respuesta terapéutica. MSS (Estabilidad microsatelital) MSI (Inestabilidad microsatelital). WT (Wild type), Mut (Mutant) Relevance, Pathogenesis, and Testing Algorithm for Mismatch Repair–Defective Colorectal Carcinomas. A report of the association for molecular pathology. William K. Funkhouser 2012. El uso de este algoritmo debería permitir la asignación del subgrupo de MMR en la mayoría de los casos (Figura 6). Si el CRC es MSS (estabilidad microsatelital) con IHC normal, entonces es MMR competente. Si el CCR 56 tiene IMS alta o IMS-alta y la IHC muestra solo pérdida de MSH6 o PMS2, entonces aumenta la probabilidad de Síndrome de Lynch y se indica la secuenciación del gen MSH6 o PMS2, respectivamente. Si el CRC tiene IMS alta y IHC muestra pérdida de MSH2 y MSH6, entonces aumenta la probabilidad de Síndrome de Lynch y está indicada la prueba de secuenciación / deleción de MSH2. Si el CRC tiene IMC y la IHC muestra pérdida de MLH1 y la mutación BRAF c.1799T A está presente, entonces es muy probable que sea un CCR dMMR esporádico.16 Sólo con la combinación de IMS, pérdida de inmunorreactividad MLH1 y ausencia de la mutación BRAF existe una incertidumbre sustancial, y la probabilidad de Síndrome de Lynch frente a un carcinoma de colon con inestabilidad microsatelital de tipo esporádico puede variar según el escenario clínico.16 De manera simplificada podemos tener una sospecha de Síndrome de Lynch cuando tenemos pérdida de MSH6 o PMS2 y entonces debemos solicitar una secuenciación. Podemos tener la sospecha de un IMS tipo esporádico con pérdida de MLH1 y mutación BRAF. Importancia de la Inestabilidad Microsatelital en el Síndrome de Lynch El síndrome de Lynch es un síndrome de cáncer hereditario con una frecuencia poblacional estimada de 1: 300 individuos. 17 57 Se caracteriza por un mayor riesgo de cáncer colorrectal y cáncer de endometrio, pero también de cáncer de ovario, tracto hepatobiliar, tracto urinario superior, intestino delgado, gástrico, páncreas, cerebro y piel, que ocurren con mayor frecuencia a una edad temprana.17 Es causado principalmente por variaciones que inactivan la línea germinal dominante en los genes MLH1, MSH2, MSH6 o PMS2 de reparación de desajustes del ADN (MMR). Como consecuencia, los tumores de los pacientes presentan IMS y una pérdida de expresión de las proteínas MMR. El diagnóstico es importante, ya que los pacientes se benefician de protocolos adaptados de manejo clínico con vigilancia y cirugía más radical. Los criterios clínicos para identificar a los pacientes con alto riesgo de ser afectados por S.L se denominan criterios de Amsterdam (tabla 1), con una especificidad muy alta (98%) pero una sensibilidad baja (22-42%), ya que más del 50% de las familias con S.L no cumplen con estos criterios.17 Por lo tanto, las Directrices Bethesda actualizadas (Tabla 1), han mejorado la identificación de casos con una edad más avanzada al inicio y / o sin antecedentes familiares sólidos al seleccionar los casos que deberían beneficiarse de una análisis de tumores, es decir, análisis de microsatélites y / o inmunohistoquímica de las proteínas MMR . Las Directrices Bethesda revisadas arrojaron una sensibilidad significativamente mayor en comparación con los criterios de Amsterdam, pero una especificidad menor (82-95% y 77-93%, respectivamente).17 58 Criterios Amsterdam II y Lineamientos Bethesda revisados Criterios Amsterdam II (1) Tres o más familiares con cáncer asociado al Síndrome de Lynch histológicamente verificado (cáncer colorrectal, cáncer del endometrio, intestino delgado, uretra o pelvis renal), uno de los cuales es un familiar en primer grado de los otros. (2) Cáncer afectando al menos dos generaciones. (3) Uno o más casos de cáncer diagnosticados antes de la edad de 50. (4) Poliposis adenomatosa familiar debe ser excluida. Criterios Bethesda (solo uno de estos criterios necesita darse) (1) CRC o cáncer de endometrio diagnosticado antes de los 50 años. (2) Presencia de un tumor sincrónico o metacrónico, del tipo colorrectal u otro, relacionado al Síndrome de Lynch, sin importar la edad. (3) Un caso de cáncer colorrectal en el que se ha encontrado histología compatible con IMS alta,(Infiltrado inflamatorio tipo Crohn, componente mucinoso y/o células en anillo de sello, o patrón de crecimiento medular) en una persona menor a 60 años de edad. (4) Paciente con cáncer colorrectal o un tumor asociado a Síndrome de Lynch diagnosticado antes de los 50 años en al menos un familiar de primer grado. (5) Paciente con cáncer colorrectal o un tumor asociado a Síndrome de Lynch diagnosticado a cualquier edad en uno o más parientes en primer o segundo grado. Tabla 1: Criterios Amsterdam II y Criterios Bethesda Más del 75% de los cánceres de MSI esporádicos ocurren en mujeres ancianas (edad media al diagnóstico 72-74 años), mientras que el CCR asociado a S.L tiende a ocurrir en pacientes más jóvenes (45-60 años) con un ligero porcentaje de predominio en varones. Pacientes con una IMS del lado izquierdo o rectal es probable que sea S.L. 17 Mientras que más del 75% de los cánceres de los IMS esporádicos ocurren en el colon proximal.17 Las características de CRC con IMS han sido bien descritas e incluidas en las Pautas de Bethesda. Incluyen tumores pobremente diferenciados, patrón de crecimiento medular, alto componente mucinoso, células en anillo de sello, numerosos linfocitos infiltrantes de tumores (TILS) y una reacción similar a la de Crohn. Además, se informó recientemente que el ligando 1 de muerte programada (PD-L1), que es un ligando principal del receptor inmunosupresor PD-1, se expresa con frecuencia en la superficie del CCR con IMS. Estas características son típicas de los tumores IMS, sin distinción entre S.L o cáncer esporádico.17 59 Las pautas de Bethesda mencionadas (ver tabla 1) se utilizan para reconocer a los pacientes con riesgo de síndrome de Lynch. Sin embargo, la obtención de datos de tumores familiares y personales a veces puede resultar difícil. La puntuación de ruta de microsatélites (MsPath), una puntuación patológica basada en la edad, la ubicación del tumor y las características patológicas, se ha desarrollado para predecir eficazmente el cáncer colorrectal con deficiencias en la reparación de errores de emparejamiento del ADN (MMR).18 El MsPath score es un sistema que emplea 6 parámetros independientes predictores de IMS incluyendo la edad al diagnóstico y el sitio anatómico, y asigna un coeficiente a cada uno de ellos. La suma de estos coeficientes determina un valor que, trasladado a una escala de conversión, informa la probabilidad estimada que tiene el tumor de presentar IMS. 18 60 Tabla 2: Score anatomopatológico de inestabilidad micro- satelital (MsPath Score) Estudio fenotípico de inestabilidad microsatelital en cáncer colorrectal. Correlación con parámetros histológicos y clínicos, Lilia Schmitz, 2014 Como patólogos debemos tener el conocimiento que la inestabilidad microsatelital puede ser de tipo esporádica o relacionada al Síndrome de Lynch y que a pesar de que estás dos tienen tienen un pronóstico y respuesta al tratamiento similar, la importancia radica en poder identificar a los pacientes que se benefician de estos estudios tomando en cuenta la historia clínica del paciente, los antecedentes heredofamiliares, la edad de 61 aparición, sitió anatómico y en especial los hallazgos histopatológicos que debemos tener siempre presentes en identificar para sospechar y realizar estudios adicionales y así beneficiar a los pacientes con respecto a la respuesta al tratamiento, pronóstico y en el caso de Síndrome de Lynch permitir el desarrollo lógico de una estrategia de detección, orientar el manejo clínico, la vigilancia del paciente y consejería familiar.12,13 Relevancia clínica en la detección de mutaciones en los KRAS Y BRAF El oncogén BRAF es un componente integral de la vía MAP quinasa, y se produce una mutación activante de V600E en el 15% de los cánceres colorrectales esporádicos. Este es un evento temprano en la tumorogénesis de la vía serrada, y el BRAF V600E se ha asociado comúnmente con el fenotipo metilador de isla CpG, inestabilidad de microsatélites y una presentación clínica consistente que incluye una ubicación proximal y predilección por mujeres ancianas.14 La presencia de una mutación BRAF puede asociarse con un fenotipo agresivo y es un biomarcador pronóstico clave para un resultado desfavorable, particularmente en la etapa tardía de la enfermedad.14,15 La mutación BRAF se encuentra más estrechamente asociada con la vía neoplásica serrada en la que un pólipo de tipo serrado, ya sea un adenoma serrado sésil (SSA) o un adenoma serrado tradicional (TSA), adquiere aberraciones moleculares definidas que conducen al cáncer.14,15 La mutación BRAF V600E en el cáncer colorrectal es un evento temprano, como lo indica su presencia en una de las formas más tempranas de lesión 62 premaligna, los focos de criptas aberrantes hiperplásicos o serrados (63%), pero rara vez está presente en focos de criptas aberrantes (FCA) no serrados. (6%).14 Se entiende que los pólipos hiperplásicos microvesiculares son los precursores de los adenomas serrados sésiles que son el tipo de adenoma serrado más prevalente debido a la alta prevalencia de la mutación BRAF en ambos (70-95% y 78-85%), respectivamente.14 La mutación BRAF está presente en los adenomas serrados tradicionales (TSA), que son el tipo de pólipo colorrectal que se presenta con menor frecuencia (33-66%), pero rara vez en los adenomas convencionales (0,4- 5%).14 Las mutaciones de KRAS se han encontrado predominantemente en (FCA) no serrados (42%) y pólipos hiperplásicos de células caliciformes (43- 54%).14 Estos hallazgos demuestran que la mutación BRAF es una característica exclusiva de la vía serrada debido a su frecuencia en la mayoría de los pólipos serrados, pero a su rara presencia en los adenomas convencionales.14,15 Los cánceres BRAF mutantes pueden acompañarse de inestabilidad microsatelital, este es el subgrupo mejor caracterizado de la vía serrada debido a los hallazgos consistentes de varias características clínico- patológicas y moleculares. Histológicamente, muestran una pobre diferenciación, son productores de mucina y contienen linfocitos infiltrantes tumorales. 63 Las características moleculares incluyen una alta frecuencia del fenotipo metilador (CIMP) (80%)14, pérdida o mutación poco frecuente de los genes APC y p53, y una extensión mínima de aberraciones cromosómicas. La metilación del gen de reparación del ADN, MGMT, que se ha asociado con mutaciones de transición G> A en p53, fue más frecuente en los cánceres mutantes BRAF con inestablidad microsatelital en comparación con los cánceres mutantes BRAF con estabilidad microsatelital.14 Los cánceres mutantes BRAF restantes que no metilan MLH1 para desarrollar IMS permanecen como microsatélites estables (MSS). Este último subgrupo de cáncer BRAF mutante con MSS no se ha estudiado tan bien, pero se sabe que se asocia particularmente con un resultado deficiente del paciente.14,15 Sin embargo, se ha encontrado que se asocian sistemáticamente con un resultado perjudicial para el paciente y las investigaciones recientes los han identificado como un subgrupo único de cáncer colorrectal. Aunque derivan de un pólipo de tipo serrado debido a la presencia de la mutación BRAF, se diferencian de los cánceres de la vía serrada BRAF / IMS con el desarrollo de características clínicas distintivas y aberraciones genéticas que representan características de las vías serradas y convencionales.14 Clínicamente, los cánceres BRAF mutante con estabilidad MS son similares a los cánceres BRAF mutante con IMS, ya que ocurren con frecuencia en el colon proximal, pero también se asemejan a los cánceres BRAF de tipo salvaje en términos de distribución equitativa de género y una edad más 64 temprana de aparición y más comúnmente presente en estadios avanzados.14 Un estudio encontró que los cánceres con mutaciones BRAF con estabilidad MS eran los más propensos a presentarse en la etapa IV, de alto grado y más distalmente ubicados que los cánceres con mutaciones BRAF e inestabilidad.14 En general, algunos estudios indican que los cánceres mutantes BRAF con estabilidad MS representan clínicamente un subtipo de cáncer distinto. Histológicamente, estos son similares a los cánceres mutantes BRAF con IMS en términos de ser mucinosos y poco diferenciados . Sin embargo, muestran características morfológicas más adversas que se corresponden con su fenotipo agresivo, como la gemación frecuente del tumor, la falta de linfocitos que infiltran el tumor, la invasión linfática, perineural y venosa frecuente y el aumento de las metástasis en los ganglios linfáticos en comparación con el mutante BRAF con IMS.14 La mutación p53, que se asocia con un estadio avanzado, se ha correlacionado con los cánceres de la vía convencional, ya que era poco común en los cánceres con IMS.14 Se ha descubierto que los cánceres con mutaciones BRAF con estabilidad MS de la vía serrada tienen una tasa de mutación de p53 comparativamente más alta que los cánceres con mutaciones BRAF con IMS que tienen una tasa baja de mutación.14 Los cánceres con mutaciones BRAF / MSS a menudo muestran eventos de hipermetilación (al 60%) en comparación con la ocurrencia poco frecuente 65 en los cánceres de vías convencionales (3%).14 Por lo tanto, esto demuestra que CIMP es prevalente en todos los cánceres mutantes BRAF de la vía serrada, pero con mayor frecuencia en los cánceres con IMS (70-80%) que MSS (60%). El tratamiento del cáncer colorrectal (CCR) con anticuerpos monoclonales contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico requiere la evaluación del estado mutacional de los exones 2, 3 y 4 de los oncogenes NRAS y KRAS. Además, el estado mutacional del exón 15 del oncogén BRAF el cual es un marcador de mal pronóstico en el CCR.14,15 Tanto las proteínas NRAS como BRAF son componentes de la cascada de proteína quinasa activada por mitógenos que está implicada en una amplia variedad de funciones celulares, como la proliferación y supervivencia celular. Según las guías de práctica clínica, la identificación de las mutaciones KRAS y NRAS en los exones 2, 3 y 4 es necesario antes de administrar la terapia anti-EGFR. BRAF ayuda a la predicción de supervivencia pero también por su importante valor para la selección de pacientes asociados a la inestabilidad microsatelital que probablemente se beneficien de inmunoterapia. 14,15 El resultado de la mutación NRAS está destinado a ayudar a identificar a los pacientes que pueden beneficiarse o no de la terapia anti-EGFR, mientras que la prueba de mutaciones BRAF apoya el reconocimiento de pacientes con mal pronóstico.14,15 66 Numerosos estudios han mostrado que las mutaciones activadoras en KRAS son el principal factor predictivo de eficacia en pacientes que reciben cetuximab y panitumumab (anticuerpos anti- EGFR), las mutaciones somáticas en este gen permiten una activación intrínseca de la cascada de señalización dependiente de EGFR, de forma que esta activación es independiente de la expresión de EGFR y, por tanto, no puede inhibirse por anticuerpos anti-EGFR.20 Es importante destacar que las mutaciones en KRAS representan tan sólo el 35-45% de los pacientes no respondedores a la terapia anti-EGFR, de modo que aunque las mutaciones en este gen son un biomarcador muy específico de falta de respuesta (93%), su sensibilidad es baja (47%).20 Las mutaciones somáticas en BRAF ocurren en una tasa menor que las de KRAS en el CCR (entre 5-10%). Recientemente, se ha mostrado que las mutaciones de BRAF también afectan de forma negativa a la respuesta a estos fármacos. Dado que es bien sabido que las mutaciones KRAS y BRAF son mutuamente excluyentes, estos dos marcadores juntos pueden identificar hasta un 50-55% de los pacientes que no se beneficiarían de esta terapia.20 67 Sinopsis: Figura 7: Algoritmo de los estudios moleculares en el carcinoma colorrectal. Autoría: propia 68 Detección de las alteraciones moleculares El estudio de los biomarcadores de susceptibilidad al CCR hereditario, así como de los factores biológicos que condicionan la predicción de la respuesta a una terapia administrada o la elección de un tratamiento específico, requieren la participación de laboratorios moleculares. La situación ideal sería que fuera el propio laboratorio de anatomía patológica que custodia la muestra sea el que realice las técnicas de IHQ o moleculares pertinentes. El diagnóstico histológico certero como primer biomarcador Mientras que el primer diagnóstico histológico de un CCR se obtiene mediante el estudio de las biopsias endoscópicas, el diagnóstico definitivo se realiza en la pieza de resección quirúrgica. Para garantizar el diagnóstico histológico de CCR con el material endoscópico es esencial que el tumor esté bien muestreado y que, como mínimo, haya 3 muestras representativas del tumor. 19 Las biopsias muy superficiales de la lesión permiten observar la atipia citológica y la complejidad arquitectural glandular, que son características suficientes para reconocer un tumor epitelial maligno. Sin embargo, para emitir un diagnóstico de adenocarcinoma infiltrante es imprescindible observar la presencia de glándulas tumoralees entre un estroma desmoplásico, para lo cual se precisa de biopsias de un mayor tamaño.19 69 A la hora de realizar estudios moleculares en muestras endoscópicas puede resultar difícil en determinadas ocasiones, es otro de los motivos que justifica obtener una mínima cantidad adecuada del tumor.19 Desde que la muestra de tejido tumoral llega al Servicio de Anatomía Patológica hasta que se emite el informe de resultados, se pueden establecer 3 fases que agrupan todos los procesos que se llevan a cabo, denominadas19: a) Fase pre-analítica, que incluye la fijación y el procesamiento de la muestra, pero también establece si existe indicación para llevar a cabo estudios adicionales. b) Fase analítica, que incluye la selección de la muestra y la técnica molecular más adecuada con sus controles correspondientes. c) Fase postanalítica, con la interpretación de los resultados y la emisión de un informe de diagnóstico molecular. Todas estas etapas son fundamentales, y en cualquiera de ellas se pueden producir problemas que interfieren con la calidad de la determinación correcta. Fase pre-analştica Las muestras endoscópicas deben fijarse una vez extraídas en formaldehído tamponado al 10%, durante un tiempo no superior a las 24 h y de forma previa a su inclusión en parafina. 19 Ver tabla 3. Es conveniente que las piezas de colectomía por tumor se remitan en fresco al servicio de anatomía patológica en el menor tiempo posible desde la 70 extracción, a ser posible en menos de 30 min. De esta manera se garantiza la integridad de los ácidos nucleicos, evitando su degradación por parte de las enzimas ribonucleasas (ARNasas).19 Se procede entonces a la criopreservación del tejido tumoral y no tumoral para poder realizar los estudios moleculares necesarios, garantizando en todo momento el correcto manejo de la pieza quirúrgica. El tumor se fija en formaldehído tamponado al 10% durante 24-48 h y posteriormente se corta en secciones representativas del tumor que se incluyen en parafina. Es también conveniente preservar en parafina una muestra de la mucosa cólica sana, ya que permite el diagnóstico histológico de las lesiones precursoras y se dispone de material parafinado de tejido no tumoral del paciente. 19 Además, las secciones representativas del tumor deben contener mucosa sana adyacente para poder descubrir la presencia de un pólipo previo sobre el que se ha podido desarrollar el carcinoma.19 Se debe ser consciente de intentar preservar un número no inferior a 5 bloques del tumor y, si es posible, destinar una muestra del tejido tumoral y otra del tejido sano en parafina. Además, es importante inspeccionar la mucosa sana alejada del tumor en busca de lesiones.19 Por otro lado, las variantes histológicas de tipo mucinoso y medular, así como la presencia de un elevado infiltrado inflamatorio linfocitario intratumoral o peritumoral, son características típicas de los CCR asociados al síndrome de Lynch como ya ha sido discutido previamente. 71 En estos casos se debería estudiar la expresión IHQ de las proteínas de los genes reparadores del ADN (MLH1, MSH2, MSH6 y MPS2), o bien realizar el estudio de la IMS mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por último, para que el resultado de las técnicas de biología molecular sea considerado válido, es imprescindible realizar una selección correcta de la muestra tumoral y esa es nuestra obligación como patólogos. Hay que tener en cuenta una serie de requerimientos indispensables, como: x Es mejor extraer el ADN del tumor de la pieza de resección que de la biopsia endoscópica. x Se deben evitar las áreas con necrosis y con abundante inflamación. x Se debe intentar disecar de forma manual la mayor porción posible de tumor, con la menor cantidad posible de tejido sano, para asegurar que la mayoría del ADN extraído pertenece a las células tumorales. En el caso de tumores sincrónicos, hay que recordar que se deben estudiar ambas neoplasias como tumores independientes.19 72 Tabla 3: Descripción de fase preanalítica Fase analítica: Detección IMS El estudio de la vía reparadora MMR se utiliza fundamentalmente para identificar a los pacientes con síndrome de Lynch. Se caracteriza por mutaciones en la línea germinal de MLH1, MSH2, MSH6 y, menos frecuentemente, en PMS2 o EPCAM. Se debe realizar en primer lugar el estudio de todos los pacientes por IHQ. En el caso de que la expresión no sea concluyente y existan criterios clínicos o anatomopatológicos definidos de alta sospecha de CCR familiar, es necesario además realizar el estudio de la IMS. El estudio por IHQ de MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 permite identificar mediante las proteínas que codifican qué gen está probablemente alterado. Un tumor muestra «expresión conservada» si se observa la tinción nuclear 73 de las células tumorales; «pérdida de expresión» si se observa ausencia de tinción nuclear en las células tumorales, con la presencia de control interno positivo (linfocitos intratumorales, células del estroma, mucosa no tumoral), y se considera «no valorable» cuando la ausencia de expresión no se acompaña de un control interno positivo. 19 Así, si existe pérdida de la expresión de MLH1, pueden existir otros marcadores complementarios, como la mutación de BRAF-V600E o la metilación del promotor MLH1. Casi todos los casos en los que se observa la hipermetilación del promotor de MLH1 son esporádicos como se ha mencionado previamente. Por el contrario, la determinación de la IMS se realiza sobre ADN tumoral. Actualmente se tiende a utilizar un panel de 5 marcadores mononucleótidos, comercializados en forma de ensayo, ya que realiza una determinación con mayor sensibilidad que el panel de Bethesda y no precisa la comparación con ADN constitucional. Un tumor se considera inestable si presenta, al menos, 2 marcadores alterados. 19 Para interpretar los resultados, se debe tener en cuenta lo siguiente: x En el 90% de los casos, la pérdida de expresión de MLH1 y PMS2 se considera un evento esporádico. Para identificarlo como tal, se puede realizar además el estudio de BRAF y la determinación de la metilación de MLH1. x La pérdida de expresión de MSH6 es un evento secundario, ya que MSH6 tiene una secuencia microsatélite en la región codificante. x La pérdidad de expresión de MSH2 y MSH6,de MSH6 aislada, de PMS2 aislada o la existencia de un tumor inestable sin pérdida de 74 expresión IHQ se asocia con mucha frecuencia a la existencia de un Síndrome de Lynch. x Si se observa un tumor estable con pérdida de expresión IHQ, se debe repetir la extracción de ADN y el estudio IHQ para confirmar la discordancia. Estado mutacional de KRAS Cuando exista la sospecha o la indicación por el médico tratante, nuestro papel como patólogos es llevar a cabo la determinación mutacional, tanto cuando el paciente tenga enfermedad avanzada, como cuando incluso se realice el diagnóstico histopatológico inicial del tumor. La determinación del estado mutacional de KRAS es importante porque ayuda a optimizar la selección de candidatos a recibir terapias basadas en inhibidores específicos además las mutaciones de KRAS que se asocian a una activación constitutiva confieren resistencia a los tratamientos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra EGFR, y por último en la actualidad, tanto la Agencia de Alimentos y Medicamentos Estadounidense (FDA) como la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) requieren el estudio mutacional de KRAS en CCR antes de administrar anticuerpos monoclonales contra EGFR. 19 Para la determinación del estado mutacional de KRAS es importante tener en cuenta las recomendaciones mencionadas, tanto para la fase pre- analítica como para la fase analítica, así como los métodos empleados en cada una de ellas. En la fase analítica, para el estudio de mutaciones de KRAS y de otras alteraciones moleculares es importante en primer lugar la selección de la muestra. En el caso de KRAS, dada la alta concordancia que 75 existe entre las mutaciones del tumor primario y las mutaciones de las metástasis, se puede elegir la muestra de tumor que sea más representativa la cual puede proceder tanto de la pieza quirúrgica como de una biopsia endoscópica o de una citología mediante punción aspiración con aguja fina de las lesiones metastásicas. Un tema que todavía se tiene en discusión es el porcentaje de tumor que debe tener la muestra para su estudio molecular. Con los avances continuos en los protocolos de diagnóstico molecular, en los que se va incrementando la sensibilidad diagnóstica, el porcentaje de células tumorales necesario para el diagnóstico molecular es cada vez menor. No obstante, se recomienda realizar el diagnóstico en bloques representativos, con un mínimo de 6 a 10 cortes de unas 5 micras cada uno. 19 En este sentido, se recomienda seleccionar el bloque con mayor porcentaje tumoral y/o marcar con un rotulador las áreas de mayor concentración tumoral viable, reflejar el porcentaje de necrosis observado en la muestra elegida y realizar posteriormente, si fuera necesario, una macrodisección de las secciones completas con una aguja histológica y/o un bisturí o una microdisección en el caso de que sean lesiones mínimas con un porcentaje de células tumorales muy escaso. Los métodos y técnicas moleculares que se utilizan para determinar las mutaciones de KRAS son los mismos que para cualquier estudio de patología molecular. En este sentido, se pueden utilizar métodos de secuenciación directa, como el método de Sanger. Es un método de alta especificidad pero de baja sensibilidad. Para realizarlo, se requiere 76 habitualmente una mayor cantidad de ADN mutado tumoral, con una sensibilidad en torno al 25%.19 Sin embargo, los métodos que se utilizan con mayor frecuencia son los métodos basados en la PCR cuantitativa a tiempo real, en la que hay diversos protocolos y aproximaciones metodológicas. Determinaciſn de BRAF La mutación V600E es el cambio más frecuente del gen BRAF en CCR y se puede estudiar de forma sencilla mediante secuenciación. 77 Conclusiones La identificación de diferentes vías moleculares de la carcinogénesis colorrectal ha demostrado la naturaleza heterogénea del cáncer colónico. La comprensión de las bases moleculares de la carcinogénesis colorrectal tiene consecuencias relevantes en la determinación del pronóstico y el tratamiento del CCR. La optimización de los protocolos de detección y vigilancia, y la individualización de la terapia basada en las características patológicas y moleculares de los tumores, pueden contribuir a mejorar las tasas de curación y supervivencia de los pacientes con cáncer colónico. Como patólogos es nuestra obligación estar familiarizados con las implicaciones clínicas de los tumores colorrectales de acuerdo con la vía de progresión mediante la cual se desarrolló el cáncer y su localización, así como los hallazgos histopatológicos que nos hacen sospechar que el paciente podría tener alguna alteración molecular todo esto centrándose en las diferencias que existen, principalmente, en el pronóstico y respuesta al tratamiento de la enfermedad de cada paciente individualmente. 78 Bibliografía 1. Anatomía quirúrgica del Colon, III 300, Jaime Szereszwski. Facultad de medicina (U.B.A). Buenos Aires. 2. Intestino grueso, Marcell Laguna, Octubre 2021. 3. 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