UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO EVALUACIÓN DE LA UTILIDAD COMO BIOMARCADOR DEL ADN CIRCULANTE TUMORAL PARA EL MONITOREO DE LOS ESTADIOS CLINICOS Y FUNCIONALES EN PACIENTES CON CANCER DE MAMA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología RICARDO CHINCHILLA MONGE Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii Dedicatoria y Agradecimientos Primero, quiero dedicar esta Maestría a Dios y a la dicha de la vida que me brinda la opor- tunidad de poder llevar a cabo uno de mis anhelos. Segundo, quiero dedicar este trabajo a mi familia: mi padre Edwin, mi madre Patricia, mi hermano César y mi hermana Adriana, quienes siempre han estado conmigo en las buenas y en las malas. Todo el sacrificio, las ayudas y los momentos que he podido compartir con ellos se los quiero dedicar en este trabajo, porque gracias a su apoyo incondicional es que me ha dado la fuerza para finalizarlo. Tercero, a mi tía y mis tíos: Sarita (mi segunda madre), Luis Diego, Ricardo y Daniel. Por- que gracias a ellos también he conocido el amor por el trabajo que permite llevar a cabo proyectos e ideales, porque me han enseñado que con esfuerzo y constancia se logran gran- des metas. Cuarto, a las familias de mis tíos y primos, que siempre me han apoyado a lo largo de mi vida. Quinto, quiero agradecer todo el apoyo brindado por mis amigos de toda la vida, un gran abrazo. También al personal del CICICA, a mi tutor y mis lectores, por todos los consejos, recomendaciones y correcciones para finalizar la Maestría. Por último, pero no menos importante, quiero dedicar y agradecer a mi esposa Lucía, que ha sido mi compañera, que me ha sostenido, que me ha dado su fortaleza, que me brinda alegrías, que me apoya en los momentos difíciles y que ha sido un pilar para alcanzar la meta de finalizar esta Maestría. Nunca podré compensar todo lo que me has apoyado. ¡Infi- nitas gracias por tu amor! A todos ellos, mi más sincero agradecimiento. iv Tabla de contenido Dedicatoria y Agradecimientos ...............................................................................................ii Hoja de aprobación ............................................................................................................... iii Resumen ejecutivo .................................................................................................................. v Lista de Tablas ......................................................................................................................vii Lista de Figuras ................................................................................................................... viii Lista de Abreviaturas ............................................................................................................. ix 1. Introducción ........................................................................................................................ 1 2. Justificación ........................................................................................................................ 4 3. Hipótesis ............................................................................................................................. 5 4. Objetivo general .................................................................................................................. 5 4.1. Objetivos específicos ....................................................................................................... 5 5. Estrategia metodológica ...................................................................................................... 6 6. Materiales y métodos .......................................................................................................... 6 6.1. Reclutamiento de pacientes ......................................................................................... 6 6.2. Preparación de la muestra del ADNct ......................................................................... 7 6.2.1 Extracción de muestras de sangre ............................................................................. 7 6.2.2 Extracción del ADNct ............................................................................................... 8 6.2.3 Cuantificación del ADNc .......................................................................................... 8 6.2.4 Cuantificación del ADNct específico de cada gen por PCR digital .......................... 8 6.2.5 Análisis estadístico .................................................................................................... 8 7. Resultados ........................................................................................................................... 9 8. Discusión .......................................................................................................................... 23 9. Conclusiones ..................................................................................................................... 31 10. Bibliografía ..................................................................................................................... 33 11. Anexo 1. Documento del permiso por parte del CEC-CENTRAL de la Caja Costarricense de Seguro Social (CCSS). .............................................................................. 42 Anexo 2. Concentraciones de ADNc y frecuencias alélicas de los SNVs del gen ESR1 Y537C y D538G y del gen PIK3CA E545K y H1047L. ...................................................... 43 v Resumen ejecutivo El cáncer comprende un conjunto de enfermedades con alta incidencia y mortalidad. En Costa Rica, el cáncer de mama es el más frecuente en las mujeres y el primer lugar en mortalidad. Sin embargo, las estrategias de tamizaje y monitoreo de la terapia contra el cáncer presentan limitaciones que impiden conseguir una mayor sensibilidad y especificidad, y por ende un mayor impacto. La determinación de ADN circulante (ADNc) se basa en la cuantificación del ADN fragmentado que se encuentra libre en la sangre total de las personas. En presencia de un cáncer, la liberación de ADN circulante aumenta debido principalmente a dos razones: 1) en el tumor no se realizan adecuadamente los procesos de clarificación del ADN por parte de los fagocitos; 2) se dan una mayor cantidad de procesos necróticos y apoptóticos que conllevan a mayor liberación de ADN tumoral. La detección de variantes de nucleótido simple (SNVs) en el ADNc es lo que nos permite nombrarlo como ADN circulante tumoral (ADNct), al detectar un SNVs específico asociado al proceso neoplásico. La utilización de metodologías específicas que permitan cuantificar las SNVs en el ADNct como un biomarcador relacionado con la dinámica de crecimiento y evolución tumoral permite monitorear el tratamiento de la enfermedad y evaluar la enfermedad mínima residual, la progresión y pronóstico en pacientes de diagnóstico inicial como en pacientes metastásicos. En este trabajo se evaluó la factibilidad de realizar la determinación en el ADNct de mutaciones en genes específicos relacionados con el cáncer de mama y correlacionar estas con la progresión de la enfermedad. También, se evaluó la correlación entre la respuesta al tratamiento y los niveles de ADNct en plasma de pacientes de acuerdo con los estadios clínicos y funcionales. Finalmente, el estudio comparó la posible relación entre la supervivencia libre de progresión, supervivencia global y los niveles de ADNc de las pacientes. El estudio reveló que la determinación en muestras seriadas (del mismo paciente) de SNVs en los genes ESR1 y PIK3CA permite monitorear la evolución de la enfermedad. El seguimiento en las muestras seriadas evidenció cambios en la dinámica evolutiva del vi tumor (i.e. surgimiento de subclonas) a partir del aumento en la frecuencia alélica de ciertos SNVs con respecto a otros. El estudio también reveló que la concentración de ADNc correlaciona con el beneficio clínico en la respuesta al tratamiento y la supervivencia global de las pacientes de cáncer de mama, pese a ser un grupo histológicamente heterogéneo. A partir de este proyecto, se concluye que el ADNc es útil como biomarcador para determinar la supervivencia global de las pacientes y en conjunto con el ADNct permite evidenciar cambios en la dinámica del tumor que se asocian con los estadios clínicos y funcionales de las pacientes con cáncer de mama metastásico. vii Lista de Tablas Tabla 1. Características clínico-patológicas de las pacientes de cáncer de mama metastásico. ............................................................................................................................. 9 Tabla 2. Análisis de los parámetros de las características clínico-patológicas de las pacientes de cáncer de mama metastásico con respecto a su concentración de ADNc. ...... 13 Tabla 3. Análisis de los estadios funcionales de las pacientes con cáncer de mama metastásico con respecto a la presencia de los SNVs para los genes ESR1 y PIK3CA. ....... 18 Tabla 4. Análisis del beneficio clínico de la respuesta al tratamiento de las pacientes con cáncer de mama metastásico con respecto a la presencia de los SNVs para los genes ESR1 y PIK3CA. ................................................................................................................................ 19 viii Lista de Figuras Figura 1. a) Distribución de la concentración de ADNc en las muestras recolectadas en cada paciente. b) Distribución de la concentración de ADNc según el número de muestra.12 Figura 2. Distribución de las concentraciones de ADNc de acuerdo con el subtipo de cáncer de mama. ................................................................................................................... 15 Figura 3. Gráfico de Kaplan-Meier para el periodo de supervivencia global estratificado por la concentración de ADNc con el uso de un punto de corte de 1 ng/µL. ....................... 16 Figura 4. Cantidad de pacientes con cáncer de mama metastásico positivas para los SNVs del gen ESR1 Y537C, Y537S, D538G y los SNVs del gen PIK3CA E545K y H1047L según la muestra de ADNct. ............................................................................................................ 16 Figura 5. Gráficos de Kaplan-Meier para el periodo de supervivencia global estratificado por presencia o ausencia de los SNVs a) Y537C y b) D538G del gen ESR1 y para las mutaciones c) E545K y d) H1047L del gen PIK3CA. .......................................................... 18 Figura 6. Monitoreo de los cambios en las concentraciones de ADNc y de las frecuencias alélicas de los SNVs en el gen ESR1 (Y537C, D538G) y en el gen PIK3CA (E545K y H1047L) en las pacientes ER+, HER2-. Se representa con la barra horizontal el día de la evaluación clínica con respecto a la respuesta al tratamiento. .............................................. 20 Figura 7. Monitoreo de los cambios en las concentraciones de ADNc y de las frecuencias alélicas de los SNVs en el gen ESR1 (Y537C, D538G) y en el gen PIK3CA (E545K y H1047L) en las pacientes triple negativo. Se representa con la barra horizontal el día de la evaluación clínica con respecto a la respuesta al tratamiento. .............................................. 21 Figura 8. Monitoreo de los cambios en las concentraciones de ADNc y de las frecuencias alélicas de los SNVs en el gen ESR1 (Y537C, D538G) y en el gen PIK3CA (E545K y H1047L) en las pacientes HER2+. Se representa con la barra horizontal el día de la evaluación clínica con respecto a la respuesta al tratamiento. .............................................. 21 Figura 9. a) Análisis de componentes principales (PCA) entre las características de cantidad de pacientes, cantidad de muestras, edad, concentración de ADNc (cnADNc) y estadio funcional de las pacientes con cáncer de mama metastásico. b) Distribución de cada muestra comparada con el PCA de las características analizadas. ....................................... 22 Figura 10. Esquema de la metodología utilizada en el estudio de pacientes con cáncer de mama metastásico con la aplicación de los biomarcadores ADNc y ADNct de la biopsia líquida. …..……………………………………………………...………………………….32 ix Lista de Abreviaturas ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc Ácido desoxirribonucleico circulante ADNct Ácido desoxirribonucleico circulante tumoral CA 15-3 Antígeno cancerígeno 15-3 CCSS Caja Costarricense del Seguro Social CEA Antígeno carcinoembriogénico CEC Comité Ético Científico cnADNc Concentración de ADNc ER Receptor de estrógeno ESR1 Gen del Receptor de estrógeno 1 FDA Food and Drug Administration HER2 Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo 2 pb Pares de bases de ADN PCA Análisis de componentes principales PI3K Fosfatidilinositol-3-quinasa PIK3CA Gen de la subunidad alfa catalítica de la quinasa 3 del fosfatidilinositol RECIST Criterio de la evaluación de la respuesta en tumores sólidos SNC Sistema nervioso central SNVs Variantes de nucleótido simple T-DM1 Trastuzumab emtansina TNM Sistema de estadificación tumor, ganglios linfáticos y metástasis UCR Universidad de Costa Rica Autorización para digitalización y comunicación pública de Trabajos Finales de Graduación del Sistema de Estudios de Posgrado en el Repositorio Institucional de la Universidad de Costa Rica. Yo, _______________________________________, con cédula de identidad _____________________, en mi condición de autor del TFG titulado ___________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ Autorizo a la Universidad de Costa Rica para digitalizar y hacer divulgación pública de forma gratuita de dicho TFG a través del Repositorio Institucional u otro medio electrónico, para ser puesto a disposición del público según lo que establezca el Sistema de Estudios de Posgrado. SI NO * *En caso de la negativa favor indicar el tiempo de restricción: ________________ año (s). Este Trabajo Final de Graduación será publicado en formato PDF, o en el formato que en el momento se establezca, de tal forma que el acceso al mismo sea libre, con el fin de permitir la consulta e impresión, pero no su modificación. Manifiesto que mi Trabajo Final de Graduación fue debidamente subido al sistema digital Kerwá y su contenido corresponde al documento original que sirvió para la obtención de mi título, y que su información no infringe ni violenta ningún derecho a terceros. El TFG además cuenta con el visto bueno de mi Director (a) de Tesis o Tutor (a) y cumplió con lo establecido en la revisión del Formato por parte del Sistema de Estudios de Posgrado. FIRMA ESTUDIANTE Nota: El presente documento constituye una declaración jurada, cuyos alcances aseguran a la Universidad, que su contenido sea tomado como cierto. Su importancia radica en que permite abreviar procedimientos administrativos, y al mismo tiempo genera una responsabilidad legal para que quien declare contrario a la verdad de lo que manifiesta, puede como consecuencia, enfrentar un proceso penal por delito de perjurio, tipificado en el artículo 318 de nuestro Código Penal. Lo anterior implica que el estudiante se vea forzado a realizar su mayor esfuerzo para que no sólo incluya información veraz en la Licencia de Publicación, sino que también realice diligentemente la gestión de subir el documento correcto en la plataforma digital Kerwá. https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio 1 1. Introducción El cáncer comprende un conjunto de enfermedades con altas tasas de incidencia y mortalidad a nivel mundial (1)⁠. Su incidencia en Costa Rica es de 176:100000 habitantes, con una razón de mortalidad a incidencia de 0,55. De acuerdo con el Registro Nacional de Tumores del Ministerio de Salud, anualmente se diagnostican más de 8000 nuevos casos de tumores malignos en Costa Rica, ocasionando la muerte a más de 3500 costarricenses cada año, por lo que puede decirse que en Costa Rica 1 de cada 5 personas muere por cáncer. Según datos del Ministerio de Salud del 2013, el cáncer de mama es el segundo tumor más incidente en las mujeres a nivel del país, después del cáncer de piel y es el más mortal. Para el 2020, el cáncer se convirtió en la primera causa de muerte a nivel nacional, con un aumento del 48,2 % (2)⁠. Aunado a la alta mortalidad y las complicaciones físicas, psicológicas y emocionales derivadas de la enfermedad y sus tratamientos, la atención de estos pacientes implica un alto impacto económico para nuestro país, que para el 2020 se estimó en $ 47 844 423 (3)⁠. El cáncer de mama es el cáncer más prevalente y causa la mayor cantidad de muertes en mujeres a nivel mundial (4, 5)⁠. Pese a que hay opciones para realizar un tamizaje como la mamografía, esta presenta variaciones metodológicas dependiendo de la densidad mamaria. El monitoreo con ultrasonido mejora la sensibilidad en la detección, sin embargo, es una tecnología que presenta problemas de estandarización en su interpretación (6)⁠. El monitoreo de la respuesta al tratamiento es crucial para modificar rápidamente el esquema de tratamiento en caso de que la terapia suministrada resulte inefectiva, para prevenir efectos secundarios y para determinar el beneficio de nuevas terapias (4)⁠. Aunque las biopsias o el tejido quirúrgico siguen siendo el estándar de oro para la investigación clínica y genómica, presentan limitaciones importantes, inherentes a la obtención de este material per se (7)⁠. La obtención de biopsias es un procedimiento invasivo que puede generar complicaciones clínicas para el paciente (8)⁠. Además, la repetitividad de las biopsias de tejido sigue siendo un problema, por lo que este tejido obtenido es como una fotografía en el tiempo y espacio, lo que conlleva a limitaciones temporales y espaciales debido a la heterogeneidad de los tumores (7). 2 Los métodos basados en mediciones serológicas de bioanalitos se han usado en la práctica clínica oncológica por varias décadas. Algunos de los comúnmente utilizados incluyen el antígeno carcinoembriogénico (CEA), el antígeno cancerígeno 15-3 (CA15- 3) y el conteo de células tumorales (6)⁠. El sistema CellSearch System es la única prueba aprobada por la Food and Drug Administration (FDA), que cuenta con una sensibilidad del 65 % (9)⁠. Sin embargo, su uso se limita en pacientes que se encuentran en etapas avanzadas y metastásicas (6)⁠. En la última década ha aumentado enormemente el interés, y consecuentemente el número de estudios, en torno a la posible utilización de ADN circulante como un biomarcador en la práctica clínica (10)⁠. El ADN fragmentado se encuentra en circulación como un componente libre en la sangre total. En oncología, la detección de ADN circulante libre derivado de tumores, también conocido como ADN circulante tumoral (ADNct), ha sido todo un reto principalmente por tres razones: la discriminación correcta entre ADNct y el ADN circulante de procesos homeostáticos normales, los muy bajos niveles de ADNct y la adecuada cuantificación del número de fragmentos mutantes en la muestra (11) No obstante, estas dificultades están siendo superadas en la actualidad, gracias al desarrollo poderosas herramientas tecnológicas altamente sensibles y el desarrollo de nuevas metodologías. Por ejemplo, la discriminación entre ADNct y ADN circulante normal se realiza por el hecho que el ADN tumoral se define por la presencia de SNVs características de los tumores. Estas SNVs somáticas, comúnmente por sustituciones de una o un par de bases, están presentes solo en los genomas de las células cancerígenas o precancerígenas y no en el resto del ADN del individuo, lo que permite que el ADNct presente una gran especificidad biológica como biomarcador. En general, los pacientes con cáncer presentan niveles más elevados de ADN circulante que los individuos sanos y conforme el tumor incrementa en volumen, aumenta el número de células necróticas y apoptóticas (10). Bajo condiciones fisiológicas normales, los remanentes apoptóticos y necróticos son clarificados por los fagocitos infiltrados. Sin embargo, esto no sucede eficientemente dentro de la masa tumoral, lo que lleva a la acumulación de detritos celulares y su inevitable liberación a la 3 circulación (12)⁠. Generalmente, los fragmentos de ADN liberado presentan una longitud de 85 a 230 pares de bases en promedio y pueden presentar un segundo pico en un rango de 240 a 400 pb (10, 13–17)⁠. Entre las principales ventajas de las técnicas avocadas a la medición de ADN circulante en la oncología es que este representa un biomarcador tumoral mucho más dinámico, comparado a los biomarcadores proteicos y los estudios de imágenes. Esto debido a que el ADNct tiene una vida media corta (aproximadamente de 2 horas), lo que permite la evaluación de los cambios del tumor en cuestión de horas, en lugar de ser semanas o meses (11, 14)⁠. Otras de las ventajas es que la técnica es menos invasiva para el paciente y lo que posibilita obtener resultados en “tiempo real” de lo que está aconteciendo con el paciente oncológico. Por ello, la tecnología de detección de ADN circulante ha surgido como un potencial biomarcador oncológico muy promisorio. El ADNct ha demostrado ser más útil para el monitoreo de cáncer de mama metastásico versus los marcadores convencionales. Estos fragmentos de ADN portan alteraciones en secuencias específicas, las cuales son halladas en la fracción no celular de la sangre, representando una fracción variable y pequeña de todo el ADN circulante. Estas alteraciones genéticas, que provienen de células somáticas, pueden utilizarse para diseñar ensayos que permitan monitorear el ADNct (4)⁠. Así, entre los biomarcadores genéticos potenciales que se pueden utilizar para la detección, monitoreo y pronóstico del cáncer de mama se encuentran las SNVs en el gen ESR1 [Y537C (c.1610 A>G), Y537N (c.1609 T>A), Y537S (c.1610 A>C), D538G (c.1613 A>G)] (18–22) y las SNVs en el gen PIK3CA [E545K (c.1633 G>A) y H1047L c.3140 A>T] (21, 23–26)⁠. Estos biomarcadores relacionados con el cáncer de mama se pueden utilizar para evaluar resistencia al tratamiento. El 70 % de todos los cánceres de mama son positivos para el receptor de estrógeno (ER) y pese a que estos son sensibles al tratamiento endocrino, la mitad presentan resistencia primaria a la terapia endocrina (22)⁠. Mutaciones en el gen ESR1, por ejemplo, han sido implicadas recientemente en la resistencia a la terapia endocrina (22)⁠. El gen PIK3CA, que codifica para la subunidad catalítica p110α de las proteínas PI3K, se encuentra mutado en más de un tercio de los 4 casos de cáncer de mama. Específicamente, el 40 % de los cánceres dependientes de hormonas presentan SNVs en este gen, lo que lo convierte en un candidato atractivo para el monitoreo del tumor a través de su cuantificación en las muestras de plasma (27)⁠. La medición de ADNct, entonces, provee información valiosa para diagnóstico del cáncer, lo que puede traducirse en detección en etapas más tempranas de la enfermedad; para la detección de la enfermedad mínima residual, principalmente después de una cirugía o terapia con agentes quimioterapéuticos; y para el monitoreo de la resistencia y evaluación de la heterogeneidad tumoral, lo que permite medir el grado de eficacia del tratamiento dado al paciente y con ello facilitar la toma de decisiones sobre el esquema de tratamiento a seguir. 2. Justificación En la actualidad, las metodologías utilizadas en la práctica clínica para la detección, evaluación del pronóstico, seguimiento y monitoreo de la respuesta del tratamiento quimioterapéutico dado a los pacientes con cáncer de mama se centran en el uso de marcadores proteicos, ultrasonido, mamografías y biopsias. Estas son las herramientas con que se cuenta en la oncología para la toma de decisiones, esto es, para definir el tratamiento indicado para cada etapa de la enfermedad. Sin embargo, dichas metodologías presentan limitantes importantes que no permiten un diagnóstico más temprano del cáncer, un monitoreo más dinámico de la evolución de la enfermedad o conocer de forma rápida si hay resistencia al tratamiento. Esto provoca que la toma de decisiones por parte del médico tratante se retrase, y que haya un desfase entre la dinámica evolutiva del cáncer y los datos obtenidos por los marcadores proteicos, el ultrasonido, las imágenes radiológicas y los estudios de biopsias. La medición de ADNct se perfila como el enfoque que viene a solventar las limitaciones mencionadas. Dado que el ADNct se aísla de sangre periférica, este presenta la ventaja que es una muestra muy poco invasiva, contrario a la toma de biopsias que es un procedimiento mucho más invasivo, doloroso y que puede acarrear complicaciones. Comparado con la mamografía es un procedimiento menos incómodo, mucho más sensible y específico. 5 Otra ventaja de la incorporación de la metodología de ADNct es que la muestra obtenida es dinámica, es decir, se puede monitorear la progresión de la enfermedad en menores intervalos de tiempo, lo que permite al médico tratante una mejor toma de decisiones para el tratamiento terapéutico del paciente. Por todo lo anteriormente mencionado, el establecimiento y estandarización de la metodología para la medición de ADNct en Costa Rica abre toda una nueva línea de investigación con mucha aplicación clínica. Esto porque se podría contribuir a mejorar el manejo oncológico del cáncer de mama en el país, lo cual es de mucha relevancia al ser este un tumor altamente incidente y mortal en Costa Rica. Esta metodología podría tener impacto sustancial en la detección, manejo y tratamiento de la enfermedad, lo cual podría incidir importantemente en el bienestar y la salud de las personas afectadas por este tipo de cáncer; así como en uso más eficiente del económico destinado al manejo oncológico por parte del sistema de salud costarricense. 3. Hipótesis La evaluación mediante ADN circulante tumoral de marcadores genéticos asociados al cáncer de mama es clínicamente útil para el monitoreo de los estadios clínicos y funcionales en pacientes con cáncer de mama. 4. Objetivo general Evaluar la utilidad del ADN circulante tumoral como biomarcador para el monitoreo de los estadios clínicos y funcionales en pacientes con cáncer de mama. 4.1. Objetivos específicos 1 Determinar la concentración de marcadores genéticos asociados al cáncer de mama en ADN circulante tumoral en pacientes con un estadio clínico y funcional definido. 2 Determinar los posibles cambios en la concentración de marcadores genéticos asociados al cáncer de mama en ADN circulante tumoral en las pacientes durante el monitoreo del curso de la enfermedad. 6 3 Establecer la relación que existe entre la respuesta al tratamiento quimioterapéutico y la concentración de marcadores genéticos asociados al cáncer de mama en ADN circulante tumoral durante el monitoreo de las pacientes. 5. Estrategia metodológica El proyecto presenta un diseño de cohorte observacional prospectivo. Es un estudio genético donde se hizo un monitoreo a cada paciente mediante tomas de muestras sanguíneas, espaciadas dichas muestras por un periodo de 3 a 4 meses. Este periodo corresponde al seguimiento clínico que se les da a las pacientes con cáncer de mama que inician terapia sistémica de primera línea por cáncer de mama metastásico. En las muestras, se determinaron las concentraciones de ADNc y SNVs de genes en el ADNct que según la literatura presentan relación con el cáncer de mama. De acuerdo con las concentraciones de ADNc obtenidas y la presencia/ausencia de SNVs para cada gen, se comparó su aumento o disminución en la concentración con respecto a la primera muestra tomada, lo cual se expresó en términos de porcentaje con respecto al tiempo del monitoreo. Además, en cada toma de la muestra se obtuvieron los datos de los estadios clínicos y funcionales de cada paciente, información que fue obtenida por el médico tratante a través de la revisión del expediente clínico. Una vez obtenida la concentración de ADNc y la frecuencia alélica de los SNVs en cada una de las muestras, se procedió a relacionar su concentración y la presencia/ausencia de SNVs con la respuesta al tratamiento quimioterapéutico, la cantidad de días que la paciente se encuentra libre de progresión y el tiempo de supervivencia. Todo esto se realizó posterior a la obtención del Consentimiento Informado de cada paciente y bajo la autorización de los Comités Éticos-Científicos (CEC) de la UCR y la CCSS (R018- SABI-00193, Anexo 1). 6. Materiales y métodos 6.1. Reclutamiento de pacientes Las pacientes fueron reclutadas al llegar a la consulta del servicio de Oncología del 7 Hospital San Juan de Dios. Ellas fueron valoradas por el oncólogo tratante, quién seleccionó y reclutó las pacientes a participar en el estudio, previa lectura, explicación, aceptación y firma del consentimiento informado. Los criterios de inclusión para participar en el estudio fueron los siguientes: a) Detección del tumor: pacientes de reciente diagnóstico clínico e histológico de cáncer de mama. b) Monitoreo del tratamiento: pacientes con diagnóstico de cáncer de mama metastásico que van a iniciar tratamiento contra la enfermedad. Se evaluó las concentraciones de ADNc y su asociación con las tasas de respuesta y periodos libres de progresión. El proyecto se realizó con un total de 25 pacientes, de acuerdo con el presupuesto del proyecto, para así realizar todo el esquema de análisis para cada una de las pacientes. A las pacientes que formaron parte del estudio, se les tomó la muestra sanguínea. Las pacientes fueron seguidas por el oncólogo tratante cada 3-4 meses, con exploración física, historia clínica y estudios de imágenes (tomografía o resonancia magnética) de acuerdo con su criterio clínico. La determinación de la respuesta al tratamiento se hizo de acuerdo con los criterios RECIST 1.1 (28)⁠. En estos seguimientos, se les tomó muestras sanguíneas adicionales, cada 3-4 meses hasta un total de 4 muestras, con la intención de ir viendo posibles cambios en la concentración de ADNc y en la frecuencia de marcadores genéticos (SNVs) en el ADNct. 6.2. Preparación de la muestra del ADNct 6.2.1 Extracción de muestras de sangre La muestra de sangre se obtuvo mediante una venopunción en tubos marca Streck, recomendados para la toma de muestras para ADNct. Una vez obtenida, se procedió a centrifugar la muestra a 1500 rpm por 10 minutos para separar el plasma del paquete de glóbulos rojos. Posteriormente, este plasma se trasladó a un tubo eppendorf para realizar una centrifugación a 13000 rpm por 10 min. Por último, en los casos que no se 8 extrajo el ADNct de inmediato, se almacenó en tubos eppendorf siliconizados (evitan la adherencia del ADN al plástico) a -80 ºC para su posterior extracción. 6.2.2 Extracción del ADNct: La extracción del ADNct se realizó con los equipos automatizados QIAvac y Qiacube de la marca Qiagen utilizando el kit comercial “QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit” donde se utilizó 4 mL de plasma como material de inicio. 6.2.3 Cuantificación del ADNc: Una vez obtenido el ADNct de cada una de las muestras se procedió a evaluar la calidad con el equipo Nanodrop mediante las relaciones 260/280 y 260/230 y la concentración con el cuantificador fluorométrico Qubit. Para evaluar si hay contaminación de ADN genómico proveniente de leucocitos, se realizó un análisis de los fragmentos del ADNc con el equipo Qiaxcel. 6.2.4 Cuantificación del ADNct específico de cada gen por PCR digital Se utilizó el reactivo TaqMan SNP Genotyping assay que permite realizar el análisis de variantes mutacionales específicas. Este kit se utilizó con el equipo de PCR digital QX200 de la marca Biorad. Se utilizaron sondas para la detección y cuantificación de las siguientes mutaciones somáticas específicas en los genes: ESR1 [Y537C (c.1610 A>G), Y537N (c.1609 T>A), Y537S (c.1610 A>C), D538G (c.1613 A>G)], así como para las mutaciones en el gen PIK3CA [E545K (c.1633 G>A) y H1047L (c.3140 A>T)]. 6.2.5 Análisis estadístico Se reportaron las variables categóricas como porcentajes y rangos, en tanto que las variables continuas se reportaron como medias o medianas según su distribución normal o no paramétrica. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para evaluar la normalidad de los datos. La comparación entre las variables se realizó mediante las pruebas de Wilcoxon y Kruskal-Wallis para la comparación de variables con respecto al ADNc. Se 9 utilizó la prueba de Dunn como prueba posthoc para la prueba Kruskal-Wallis. Se usó la prueba de Spearman Rank para comparar la edad con respecto a la concentración de ADNc. Se empleó la prueba de Fisher para comparar los estadios funcionales y el beneficio clínico con respecto a la presencia o ausencia de los SNVs en los genes ESR1 y PIK3CA, en tanto que se utilizó un modelo de regresión proporcional de Cox para asociar la supervivencia global y libre de progresión con las variables dependientes. El período libre de progresión o de supervivencia se calculó a partir del día de inicio del tratamiento médico para la enfermedad metastásica y el día de progresión determinado por criterios de RECIST 1.1 (por el oncólogo tratante), o el día de muerte (registrado en el Registro Civil de Costa Rica), respectivamente. Ambas variables fueron calculadas mediante el método de Kaplan-Meier y se hicieron las comparaciones entre curvas de supervivencia a través de la prueba estadística de Log-rank. En todos los casos un valor de p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo. Se empleó el software RStudio 4.1.2 (01-11-2021) para el sistema operativo Mac. Se realizó un análisis de componentes principales para definir si existían variables relacionadas entre sí. 7. Resultados En el estudio se reclutaron un total de 25 pacientes femeninas con cáncer de mama metastásico a quienes se les tomó una muestra de sangre antes del inicio de su tratamiento y posteriormente cada 3 a 4 meses hasta un total de 4 muestras. Las características clínico- patológicas de las pacientes enroladas son mostradas en la tabla 1. Tabla 1. Características clínico-patológicas de las pacientes de cáncer de mama metastásico. Parámetros Participantes Edad en años (rango) 56,9 (27-86) Estadio funcional 0 6 1 13 2 6 10 Clasificación TNM T X 1 1 3 2 12 3 2 4 7 N X 1 0 4 1 13 2 2 3 5 M 0 17 1 8 Receptor de estrógeno Positivo 17 Negativo 8 Receptor de progesterona Positivo 13 Negativo 12 Estatus HER2 Positivo 4 Negativo 21 Subtipos de cáncer de mama ER+, HER2- 15 ER+, HER2+ 1 HER2+ 3 Triple Negativo 6 Tiempo de supervivencia (días, rango) 199,1 (4 - 403) Sitios metastásicos 11 Hígado 12 Pulmón 14 Hueso 12 Piel 3 Adenopatías 6 SNC 3 Beneficio clínico de respuesta al tratamiento Sí (Parcial o completa) 5 No (Estable o progresión) 20 SNC: Sistema Nervioso Central Para determinar que no había contaminación de ADN genómico proveniente de leucocitos, se realizó un análisis de los tamaños de los fragmentos de ADN, donde los tamaños de las muestras fueron todos menores a 1000 pb, lo que indica que no había contaminación. Con respecto a la concentración de ADN circulante (ADNc) en las 25 pacientes, en la primera muestra se obtuvo un promedio de 7,396 ng/µL (0,191 – 81,5), en la segunda muestra se tomaron un total de 15 pacientes para un promedio de 4,766 ng/µL (0,151 – 46,5). En la tercera muestra se tomaron un total de 13 pacientes para un promedio de 6,536 ng/µL (0,459 – 42,3). Por último, la cuarta muestra se tomó en 9 pacientes para un promedio de 1,685 ng/µL (0,545 – 5,24). La distribución de las concentraciones de ADNc por paciente y por muestra se pueden observar en la figura 1. No se observa diferencia significativa en la concentración de ADNc según el número de muestra. 12 Las concentraciones de ADNc del estudio presentaron una distribución no paramétrica (Shapiro-Wilk p = 1,726 x 10-14). No se encontró diferencia significativa entre la edad de Figura 1. a) Distribución de la concentración de ADNc en las muestras recolectadas en cada paciente. b) Distribución de la concentración de ADNc según el número de muestra. 13 las participantes y las concentraciones de ADNc (p = 0,92). En la tabla 2 y la figura 2 se resumen las comparaciones entre las características clínico-patológicas y el ADNc, así como los resultados del análisis estadístico de dichas comparaciones. En síntesis, se encontró una diferencia significativa en los valores de ADNc de estadio funcional 0 con respecto al estadio funcional 1 (p = 0,0001) y al estadio funcional 2 (p = 0,0021). También se encontró una diferencia significativa entre los diferentes grados de clasificación de nódulos, la positividad de los receptores de estrógeno, progesterona y HER2, el subtipo HER2 positivo (figura 2), el sitio metastásico hígado, así como el beneficio clínico de la respuesta al tratamiento. Tabla 2. Análisis de los parámetros de las características clínico-patológicas de las pacientes de cáncer de mama metastásico con respecto a su concentración de ADNc. Parámetros Mediana de la concentración de ADNc (ng/µL) Valor de p Estadio funcional p < 0,001* 0 vs 1 (0,62 vs 1,90) p < 0,001* 0 vs 2 (0,62 vs 1,79) p = 0,002* 1 vs 2 (1,90 vs 1,79) p = 0,466 Clasificación TNM T p = 0,120 X 2,61 1 0,57 2 1,20 3 41,92 4 1,15 N p = 0,012* 0 vs 1 (0,70 vs 0,91) p = 0,407 0 vs 2 (0,70 vs 5,24) p = 0,009* 0 vs 3 (0,70 vs 1,18) p = 0,148 0 vs X (0,70 vs 2,61) p = 0,233 1 vs 2 (0,91 vs 5,24) p = 0,011* 14 1 vs 3 (0,91 vs 1,18) p = 0,121 1 vs X (0,91 vs 2,61) p = 0,242 2 vs 3 (5,24 vs 1,18) p = 0,196 2 vs X (5,24 vs 2,61) p = 0,389 3 vs X (1,18 vs 2,61) p = 0,411 M p = 0,384 0 1,11 1 1,18 Receptor de estrógeno p = 0,006* Positivo 0,89 Negativo 2,50 Receptor de progesterona p = 0,002* Positivo 0,88 Negativo 2,05 Estatus HER2 p = 0,008* Positivo 3,97 Negativo 0,95 Subtipos de cáncer de mama p = 0,022* HER2+ vs ER+, HER2+ 3,24 vs 4,91 p = 0,320 ER+, HER2- vs ER+, HER2+ 0,88 vs 4,91 p = 0,160 Triple Negativo vs RE+, HER2+ 1,55 vs 4,91 p = 0,227 ER+, HER2- vs HER2+ 0,88 vs 3,24 p = 0,019* Triple Negativo vs HER2+ 1,55 vs 3,24 p = 0,229 Triple Negativo vs ER+, HER2- 1,55 vs 0,88 p = 0,190 Sitios metastásicos (Presencia vs Ausencia) Hígado 4,48 vs 0,91 p = 0,011* Pulmón 0,97 vs 1,79 p = 0,355 Hueso 1,16 vs 1,09 p = 0,932 Piel 1,55 vs 1,07 p = 0,257 Adenopatías 1,19 vs 0,92 p = 0,788 SNC 5,24 vs 1,03 P = 0,053 Beneficio clínico de respuesta al p = 0,012* 15 tratamiento Sí (Parcial o completa) 0,89 No (Estable o Progresión) 1,41 SNC: Sistema Nervioso Central; * Estadísticamente significativo Para evaluar la supervivencia global de las pacientes de acuerdo con la concentración de ADNc, se utilizó como punto de corte 1 ng/µL para estratificar las pacientes. Con el uso de este valor, se determinó que las pacientes que tienen < 1 ng/µL tienen una mayor supervivencia global que las pacientes con valores de ADNc ≥ 1 ng/µL (HR = 3,041; IC 95 %: 0,991-9,33, p = 0,042), figura 3. Figura 3. Distribución de las concentraciones de ADNc de acuerdo con el subtipo de cáncer de mama. 16 Figura 3. Gráfico de Kaplan-Meier para el periodo de supervivencia global estratificado por la concentración de ADNc con el uso de un punto de corte de 1 ng/µL. Figura 4. Cantidad de pacientes con cáncer de mama metastásico positivas para los SNVs del gen ESR1 Y537C, Y537S, D538G y los SNVs del gen PIK3CA E545K y H1047L según la muestra de ADNct. 17 Con respecto a la detección de mutaciones en el ADNct (SNVs) los datos de la cantidad de pacientes positivas (con mutaciones) y negativas (sin mutaciones) se resumen en la figura 4. En el caso del gen ESR1, se encontraron mutaciones en 11 pacientes (40 %), de las cuales 1 (4 %) corresponde a la mutación Y537C (c.1610 A>G) y 8 (32 %) a la mutación D538G (c.1613 A>G). No se encontraron las mutaciones Y537N (c.1609 T>A) ni de Y537S (c.1610 A>C) para este mismo gen. Con respecto a la detección de mutaciones en el gen PIK3CA, se encontraron un total de 16 (64 %) pacientes con mutaciones, de las cuales 13 (52 %) corresponden a la mutación E545K (c.1633 G>A) y 8 (32 %) a la mutación H1047L (c.3140 A>T). También, destaca que 5 pacientes presentaron ambas mutaciones en el gen PIK3CA en las distintas muestras obtenidas durante el seguimiento clínico de la misma paciente. Este hallazgo es llamativo porque sugiere que se estarían dando cambios en la dinámica mutacional del tumor de cada una de esas pacientes durante el tratamiento. Del total de pacientes analizadas para los SNVs (mutación) de los genes ESR1 y PIK3CA, 20 pacientes (80 %) resultaron positivas (i.e. con al menos una mutación) en los genes mencionados. En un total de 16 pacientes (64 %) se detectaron SNVs para el gen PIK3CA; para el gen ESR1 se encontraron SNVs en 9 pacientes (36%). Con respecto a las 62 muestras tomadas en las 25 pacientes, 37 muestras (60 %) fueron positivas para alguna de las mutaciones de los genes ESR1 y PIK3CA, de las cuales 31 muestras (50 %) portaban al menos una mutación en el gen PIK3CA y 12 muestras (19 %) tenían al menos una mutación en el gen ESR1. También se evaluó si el estadio funcional de las pacientes difería en función de la presencia/ausencia de las SNVs Y537C y D538G del gen ESR1, o con respecto a las SNVs E545K y H1047L del gen PIK3CA. No se evidenció ninguna diferencia entre las pacientes positivas para las SNVs mencionadas y las pacientes negativas. Los resultados de este análisis se resumen en la tabla 3. 18 Tabla 3. Análisis de los estadios funcionales de las pacientes con cáncer de mama metastásico con respecto a la presencia de los SNVs para los genes ESR1 y PIK3CA. Figura 5. Gráficos de Kaplan-Meier para el periodo de supervivencia global estratificado por presencia o ausencia de los SNVs a) Y537C y b) D538G del gen ESR1 y para las mutaciones c) E545K y d) H1047L del gen PIK3CA. 19 No se observó diferencia significativa cuando se evaluó la supervivencia global de las pacientes de acuerdo con la positividad de las SNVs Y537C, D538G del gen ESR1, y E545k y H1047L del gen PIK3CA. Los gráficos de Kaplan-Meier de este análisis se muestran en la figura 5. Cuando se comparó el beneficio clínico de la respuesta al tratamiento con respecto a la presencia de las SNVs Y537C y D538G del gen ESR1 y las SNVs E545K y H1047L del gen PIK3CA, no se evidenciaron diferencias entre las pacientes positivas para SNVs y las pacientes negativas. Los resultados se pueden observar en tabla 4. Tabla 4. Análisis del beneficio clínico de la respuesta al tratamiento de las pacientes con cáncer de mama metastásico con respecto a la presencia de SNVs para los genes ESR1 y PIK3CA. De las 25 pacientes que participaron en el estudio, a 15 de ellas se les pudo tomar la segunda muestra de sangre, a 13 pacientes la tercera muestra de sangre y a 9 pacientes la cuarta muestra de sangre. Los resultados de la concentración de ADNc y de las frecuencias alélicas de cada SNVs del gen ESR1 (Y537C y D538G), y del gen PIK3CA (E545K y H1047L) se presentan en el anexo 2. El monitoreo durante todo el periodo del estudio de los cambios en las concentraciones de ADNc, así como de las frecuencias alélicas de las mutaciones del gen ESR1 (Y537C y D538G) y del gen PIK3CA (E545K y H1047L), para cada una de las pacientes del estudio según el subtipo de cáncer de mama se presentan en las figuras 6, 7 y 8. De acuerdo con la dinámica observada en dichas figuras, la fracción alélica de los SNVs de los genes ESR1 y PIK3CA, en general, siguió una tendencia concordante con respecto a la concentración de ADNc de las participantes. Pese a solo dar seguimiento con 8 SNVs, se observó que con ese número es suficiente para realizar un adecuado monitoreo de la enfermedad. 20 Figura 7. Monitoreo de los cambios en las concentraciones de ADNc y de las frecuencias alélicas de los SNVs en el gen ESR1 (Y537C, D538G) y en el gen PIK3CA (E545K y H1047L) en las pacientes ER+, HER2-. Se representa con la barra horizontal el día de la evaluación clínica con respecto a la respuesta al tratamiento. 21 Figura 10. Monitoreo de los cambios en las concentraciones de ADNc y de las frecuencias alélicas de los SNVs en el gen ESR1 (Y537C, D538G) y en el gen PIK3CA (E545K y H1047L) en las pacientes HER2+. Se representa con la barra horizontal el día de la evaluación clínica con respecto a la respuesta al tratamiento. Figura 13. Monitoreo de los cambios en las concentraciones de ADNc y de las frecuencias alélicas de los SNVs en el gen ESR1 (Y537C, D538G) y en el gen PIK3CA (E545K y H1047L) en las pacientes triple negativo. Se representa con la barra horizontal el día de la evaluación clínica con respecto a la respuesta al tratamiento. 22 Se realizó un análisis de componentes principales en el que se tomó en cuenta características de las pacientes como la edad, cantidad de muestras, cantidad de pacientes, estadio funcional y concentración de ADNc. De este análisis, se evidenció que hay una relación entre el estadio funcional y la concentración de ADNc (figura 9a). Al analizar las varianzas entre las distintas muestras de cada una de las pacientes, se determinó que no hay agrupamiento o relación entre ellas (figura 9 b). Figura 16. a) Análisis de componentes principales (PCA) entre las características de cantidad de pacientes, cantidad de muestras, edad, concentración de ADNc (cnADNc) y estadio funcional de las pacientes con cáncer de mama metastásico. b) Distribución de cada muestra comparada con el PCA de las características analizadas. 23 8. Discusión La biopsia líquida es una metodología que tiene mucho potencial y una serie de ventajas para ser utilizada de forma rutinaria en la práctica clínica. Algunas de sus ventajas sobre metodologías tradicionales son que es poco invasiva, la rapidez con que se obtienen resultados y se puede realizar de forma seriada para monitorear la evolución del tumor o la respuesta a la terapia. Adicionalmente, los recientes avances en la tecnología asociada a esta metodología hacen más sencillo, fidedigno, y por lo tanto aplicable, su uso (12, 14, 15, 29–31)⁠. Una de las mayores ventajas es que el uso dinámico del ADNct es una forma más rápida de obtener información respecto a la eficacia de la terapia en tiempo real (10, 32– 35)⁠. Uno de los principales hallazgos de este estudio, el cual tiene la fortaleza de ser un estudio prospectivo, es que se evidenció que el uso de las concentraciones de ADNc y de SNVs específicos de ADNct permite monitorear la progresión de la enfermedad y su relación con los estadios clínicos y funcionales de las pacientes con cáncer de mama metastásico. En el caso de las concentraciones de ADNc se observó que el promedio de las 4 tomas de muestras de ADNc se encuentra dentro del rango de 1 a 10 ng/µL reportado en otras investigaciones (10, 15, 17, 30, 36–38)⁠, y no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la concentración entre las 4 tomas de muestra en las pacientes (figura 1b). Es importante mencionar que 6 muestras sí superaron ese rango reportado de 1 a 10 ng/µL; esta observación, en sí misma, es notable del presente estudio porque hasta donde sabemos no se ha reportado anteriormente en la literatura científica. Es muy importante también hacer énfasis en el hecho de que la forma en la cual se tomó la muestra, así como los insumos utilizados, fueron adecuados, lo cual se evidencia en el hecho de que no hubo contaminación con ADN genómico proveniente de leucocitos. En este sentido, el tamaño del ADNc presenta una longitud de 166 pares de bases (85 – 230), lo cual se apega a lo reportado en la literatura (10, 13–17)⁠. Es importante destacar que la cantidad de plasma utilizado en esta investigación de cada paciente fue de 4 mL, mientras que en otras investigaciones se utilizan volúmenes de plasma menores (15, 26, 31, 36, 39, 40)⁠. Con respecto a la relación entre la concentración de ADNc y los estadios funcionales, sí se 24 encontró diferencia significativa entre el estadio funcional 0 versus los estadios 1 y 2. Los estudios han demostrado la correlación entre la carga tumoral y las concentraciones de ADNc (33, 39, 41)⁠. También se ha reportado que el aumento en el valor de los estadios funcionales se asocia con una mayor carga tumoral presente en las pacientes (42)⁠. Por lo tanto, pacientes con estadios funcionales más altos posiblemente presenten una mayor carga tumoral en la paciente y, por ende, un mayor número de síntomas asociados con la enfermedad. Esto explicaría la correlación observada en la presente investigación entre las concentraciones de ADNc de las pacientes y su estadio funcional. De acuerdo con la clasificación TNM, hubo una relación estadísticamente significativa a nivel de la diseminación, cantidad y tamaño de los ganglios linfáticos (N) del cáncer de mama entre los niveles 0 - 1 con respecto al nivel 2. El nivel 2 implica la presencia de células de cáncer en 4 a 9 ganglios linfáticos axilares, mientras que el nivel 1 indica presencia del cáncer en 1 a 3 ganglios linfáticos axilares y el nivel 0 indica ausencia de cáncer en los ganglios o áreas de cáncer menores a 0,2 mm (26, 34, 43, 44)⁠. Es importante tener en cuenta que las pacientes de este estudio ya presentaban metástasis a distancia, por lo que el efecto de las variables N y T de la clasificación TNM, en el caso específico aquí estudiadas, no es tan determinante comparado con la presencia de enfermedad a distancia (variable M de dicho esquema de clasificación). No obstante, es llamativo que, pese a la existencia de la enfermedad a distancia, se evidenció una diferencia significativa con respecto al parámetro N. Esto puede indicar que independientemente de las pacientes si presentan o no metástasis, el ADNc se asocia con la carga tumoral de las pacientes y, por ende, con la diseminación, cantidad y grado de compromiso de los ganglios linfáticos afectados. Con respecto al tamaño del tumor (parámetro T), pese a que en este grupo de pacientes no se encontró relación entre esta variable y la concentración de ADNc (p = 0,078), en otras investigaciones sí se ha encontrado relación entre la concentración de ADNc y la carga tumoral del paciente (15, 26, 34, 38)⁠. El motivo de no encontrar la correlación entre estos dos parámetros puede relacionarse al número reducido de participantes, lo cual se debe confirmar con estudios futuros con mayor tamaño de muestra. En cuanto a los receptores de estrógeno y progesterona, se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre las concentraciones de ADNc de las pacientes con 25 receptores positivos y las pacientes con receptores negativos. Además, se determinó una diferencia significativa entre las concentraciones de ADNc de las pacientes y el estatus de HER2, siendo mayor la concentración de ADNc en pacientes HER2 positivo que en las HER2 negativo. Al comparar la clasificación por subtipos de cáncer de mama, este estudio reveló que hay diferencia significativa en las concentraciones de ADNc del subtipo HER2 positivo con respecto a los otros subtipos (i.e. estatus de estrógeno y progesterona o las diversas combinaciones de estos). La evidencia indica que hay diferencias en las concentraciones de ADNc entre los diferentes subtipos de cáncer de mama (26, 34, 45)⁠. Sin embargo, nuestra investigación difiere de lo reportado en la literatura científica, ya que se ha encontrado que el subtipo Triple Negativo generalmente presenta las concentraciones mayores de ADNc con respecto a los demás subtipos (34, 45)⁠. Este hallazgo se debe confirmar con más estudios en población costarricense debido a que el presente estudio tiene la limitante de un reducido tamaño de muestra, por tratarse de un estudio piloto, lo que dificulta establecer relaciones más claras respecto a la concentración de ADNc según el subtipo de cáncer de mama. Es conocido que los diferentes (sub-)tipos de cáncer tienden a tener “sitios metastásicos” predilectos, fenómeno conocido como tropismo metastásico (46). En el caso específico de los cánceres de mama, usualmente los tumores HER2 positivos tienden a presentar con más frecuencia metástasis en las vísceras, mientras que los ER positivos producen más metástasis óseas (42)⁠. Este tipo de diseminación, de acuerdo con el subtipo de cáncer de mama, puede apoyar la evidencia encontrada en nuestro trabajo de investigación sobre las mayores concentraciones de ADNc cuando hay presencia de metástasis hepáticas que cuando estas son en hueso. En concordancia con este hallazgo, el estudio de Bando et al. evidencia que hay mayores niveles de ADNct en pacientes con metástasis a hígado comparado con otros sitios, tales como nódulos linfáticos, peritoneo o pulmón (46)⁠. Uno de los principales resultados del presente estudio es que demostró que el beneficio clínico de las pacientes a la respuesta al tratamiento varía de forma significativa (p = 0,012) con respecto a los valores de ADNc. Esta misma relación, ha sido encontrada en otros estudios (26, 31, 33, 34, 41)⁠. Interesantemente, al realizar la evaluación de la supervivencia 26 global de las pacientes en cuanto a su concentración de ADNc, estratificando con un punto de corte de 1 ng/µL, se demostró que aquellas que presentan niveles menores a 1 ng/µL presentan una mejor supervivencia global (HR (95 % CI) = 3,041 (0,991-9,33), p = 0,042). El motivo de usar el punto de corte de 1 ng/µL obedeció a que varias investigaciones indican que los valores de ADNc en pacientes sin hallazgos de cáncer presentan de 0 a 1 ng/µL, mientras que pacientes con cáncer tienen valores de 1 a 10 ng/µL (15, 30, 36–38)⁠⁠ . Pese al bajo número de pacientes reclutadas, se demuestra que la concentración de ADNc puede utilizarse como biomarcador para el monitoreo de los estadios clínicos y funcionales, para monitorear la respuesta al tratamiento e incluso para realizar estratificación de la prognosis (31, 33, 34, 41)⁠. Entre las ventajas de la utilización del ADNc con la metodología utilizada para medir la concentración es su bajo costo y su facilidad de implementación en la práctica rutinaria. Por ende, es importante realizar más estudios con la metodología usada aquí para confirmar la utilidad clínica en el monitoreo de la respuesta al tratamiento y la prognosis de las pacientes (10, 14, 30)⁠. Con respecto a las SNVs de los genes ESR1 y PIK3CA, se encontró que un 80 % de las pacientes presentaban al menos una SNVs en estos genes. Pese a la cantidad limitada de SNVs que se usaron en el proyecto, este resultado viene a ser una prueba de concepto que evidencia que la escogencia adecuada de SNVs en genes para su determinación en el ADNct de las pacientes de cáncer de mama puede ayudar a monitorear la evolución de la enfermedad de una forma mínimamente invasiva: en muestras de sangre periférica. Además, es interesante notar que el porcentaje de pacientes positivas (64 %) fue superior al reportado en otros estudios sobre SNVs del gen PIK3CA (16, 19, 26, 36, 39, 44, 47–50)⁠, mientras que el porcentaje de pacientes positivas con SNVs en el gen ESR1, el cual fue de 36 % en la presente investigación, está dentro de la frecuencia reportada del 14,8 – 37,3 % en otros estudios (16, 19, 20, 23, 44, 48, 49, 51–54)⁠. Estos hallazgos, sin embargo, deberán ser confirmados en estudios posteriores con series de pacientes más numerosas. Si consideramos las SNVs en conjunto con la concentración de ADNc, esta información proporciona mayor evidencia clínica de la condición del paciente (29, 31, 34, 35, 37, 38, 45, 47)⁠. Actualmente, se promueve el uso de paneles de NGS para una mayor cobertura de genes accionables, estrategia que debe ser considerada para futuras investigaciones (10, 14, 27 16, 22, 30, 33–35, 55)⁠. Es también importante mencionar, que las tecnologías como el PCR digital, con la cual ya se cuenta en la UCR, presentan una buena relación costo/beneficio y permiten alcanzar una alta sensibilidad en la detección de variantes puntuales, por lo que es una muy buena opción para el seguimiento de variantes en muestras subsecuentes de las pacientes (14, 18, 19, 26, 30, 32, 35, 37, 49, 50, 55)⁠. Cuando se estableció la relación de las SNVs de los genes ESR1 y PIK3CA encontradas en las pacientes con el parámetro de estadio funcional, esta no fue estadísticamente significativa. Tampoco se evidenció una relación de estos SNVs con la supervivencia global de las pacientes. Teóricamente, lo esperable hubiese sido encontrar una mejor supervivencia en pacientes que no albergaran mutaciones en los genes mencionados. Entonces, el resultado del presente estudio difiere de lo reportado en la mayoría de la literatura internacional, donde sí se ha reportado mayor supervivencia en las pacientes negativas con respecto a las positivas (16, 26, 29, 34, 41, 48, 49, 56–58).⁠ Lo anterior puede deberse a la heterogeneidad de las pacientes incluidas en el estudio (distintos subtipos, distinto estadio, etc.) y al número de pacientes incluidas (19, 48)⁠. Dicha limitación también se observa cuando se compara el beneficio clínico de la respuesta al tratamiento con respecto a la presencia de las SNVs, pero en este apartado sí se esperaba que dicha limitación se viera reflejada a nivel estadístico porque cada subtipo de cáncer de mama tiene diferentes líneas de tratamiento, lo que aumenta la heterogeneidad de las respuestas (16, 19, 26, 29, 49, 57)⁠. En estudios posteriores, sin embargo, se debe considerar los subtipos específicos de cáncer de mama metastásicos si se desea evaluar la influencia de la detección de SNVs en los genes ESR1 y PIK3CA sobre el beneficio clínico de la respuesta al tratamiento. Como ya se mencionó anteriormente, el presente estudio constituye un primer intento (un piloto) para estandarizar la metodología y revelar tendencias que sirvan de base para futuros estudios. Más específicamente, al ser esta investigación una prueba de concepto, el fin era exploratorio, comparando distintos parámetros clínico-patológicos recolectados en las pacientes de cáncer de mama metastásicas con la concentración de ADNc y la cantidad de SNVs detectados en los genes ESR1 y PIK3CA, que puedan revelar tendencias para ser confirmadas en estudios posteriores. En la evaluación individual de las 15 participantes del estudio para quienes fue posible 28 recolectar dos o más muestras (figura 5), fue interesante ver como en las pacientes como el CT-01, CT-06, CT-15, CT-18 y CT-24 hubo un incremento en la frecuencia alélica de un determinado SNVs mientras el otro SNVs disminuyó. Aunque esta es una observación de carácter descriptivo, es de mucho interés porque, al menos especulativamente, esto puede indicar que diferentes subclonas del cáncer responden de manera distinta al tratamiento. También, esta observación podría ser un reflejo de la compleja dinámica evolutiva de los tumores malignos y los cambios que estos experimentan en respuesta a la terapia (19, 57). En el caso de las pacientes CT-08, CT-09, CT-10, CT-14 y CT-19, se observa una disminución de la fracción alélica de los SNVs analizados pero un incremento en la concentración de ADNc. En la paciente CT-08 se presentó un incremento en la frecuencia alélica del PIK3CA E545K (2,929 %) en la muestra 2, pero un descenso en la concentración de ADNc (de 1,11 ng/µL a 0,623 ng/µL). Además, en la muestra 3 se presentó un incremento en la concentración de ADNc (0,881 ng/µL) en contraste con la disminución de la frecuencia alélica del PIK3CA E545K (0,369 %). En la paciente CT-09 se observó un ligero aumento de la frecuencia alélica de ESR1 D538G (0,149 % a 0,195 %) y una disminución de PIK3CA E545K (0,947 % a 0,014 %) que contrastó con un aumento notable del ADNc (1,79 ng/µL a 21,5 ng/µL). En la paciente CT-10 hubo detección del PIK3CA E545K en la tercera muestra (frecuencia alélica del 3,02 %) pero una disminución en la cuarta muestra (frecuencia alélica del 0,633 %), sin embargo, hubo un incremento ligero en la concentración de ADNc (de 0,459 ng/µL a 0,545 ng/µL). En la paciente CT-14 hubo relación entre la primera y la segunda muestra al disminuir tanto la frecuencia alélica del PIK3CA H1047L (1,00 % a 0 %) como la concentración de ADNc (0,752 ng/µL a 0,565 ng/µL), no obstante, en la tercera muestra hubo un aumento del ADNc (1,94 ng/µL), sin detección de ningún SNVs. En la paciente CT-19 hubo detección tanto del PIK3CA E545K (2,987 %) como de H1047L (3,324 %), pero no hubo detección en las muestras subsecuentes. Estas diferencias se pueden relacionar al hecho que subclonas que presenten otros SNVs no analizados por el estudio sean las responsables de la elevación del ADNc en las muestras posteriores (19, 57)⁠. Todos estos hallazgos, en conjunto, refuerzan lo anteriormente dicho respecto a la dinámica de crecimiento y evolución tumoral, así como el efecto que tiene la terapia, actuando como una presión selectiva, en la dinámica (sub)clonal 29 del cáncer. Es así como actualmente se promueve el uso de paneles con distintos SNVs en el análisis de ADNct, con el fin de ampliar la posibilidad de detección para el monitoreo adecuado de la respuesta al tratamiento y evolución de la enfermedad (10, 14, 16, 22, 33, 34, 39, 55, 57)⁠. Con respecto al monitoreo de las variaciones entre las muestras, tanto en las frecuencias alélicas de los SNVs de los genes PIK3CA y ESR1 como de la concentración de ADNc, en las pacientes con dos o más muestras de seguimiento de acuerdo con el subtipo de cáncer de mama, se evidenció que 5 de las 8 pacientes con el subtipo ER+ HER2- mantuvieron estables las concentraciones de ADNc desde su muestra inicial hasta su muestra final (variaciones en un rango de ± 1 ng/µL). En las restantes tres pacientes, la CT-12 (de 1,79 ng/µL a 42,3 ng/µL), la CT-14 (de 0,752 ng/µL a 1,94 ng/µL) y la CT-24 (de 1,20 ng/µL a 4,48 ng/µL) se presentaron variaciones mayores a 1 ng/µL entre su muestra inicial y su muestra final. Estas pacientes recibían como tratamiento tamoxifeno (la CT-12 y CT-14) y ribociclib más fulvestrant (paciente CT-24). En las pacientes CT-12 como en la CT-24, al menos uno de los SNVs detectados aumentó en congruencia con la concentración de ADNc, mientras que en la paciente CT-14 el SNVs PIK3CA H1047L no se detectó a partir de la segunda muestra (figura 6). Con respecto a las pacientes con el subtipo triple negativo (a quienes se les pudo tomar dos o más muestras) (figura 7), 3 de las 4 pacientes presentaron aumentos abruptos en la concentración de ADNc, mayores a 10 ng/µL; solamente la paciente CT-18 presentó una disminución en las concentraciones de ADNc. El tratamiento de las tres pacientes CT-06, CT-09 y CT-13 consistía en paclitaxel, mientras que la paciente CT-18 el tratamiento fue de carboplatino más paclitaxel. Los aumentos abruptos en las tres pacientes que tenían tratamiento con paclitaxel se pueden explicar debido a que este tratamiento presenta una tasa de respuesta más baja, del 38 % (IC 95 %: 25 – 53) (59), comparado con el tratamiento de paclitaxel más carboplatino, con una tasa de respuesta entre el 53 % al 62 % (60). Además, este comportamiento coincide con el comportamiento del subtipo triple negativo, que presenta menor supervivencia global y peor pronóstico con respecto a los otros subtipos de cáncer de mama (61, 62). En el caso del subtipo HER2+, las tres pacientes que tuvieron dos o más muestras de seguimiento, tuvieron descensos en las concentraciones de ADNc desde su muestra inicial a la muestra 30 final. Dicho comportamiento se puede explicar por el uso de tratamientos de terapia dirigida como lo son el trastuzumab, pertuzumab y el trastuzumab emtansina (T-DM1) utilizado en estas pacientes, que presenta una media de supervivencias libres de progresión de 18,5 meses y una tasa de respuesta del 80 % (61). Al realizar el análisis de componentes principales, se deduce que el estadio funcional y la concentración de ADNc presentan asociación, lo cual es apoyado por el análisis estadístico que demostró una diferencia significativa entre la concentración de ADNc y el estadio funcional de las pacientes (figura 9a). Cuando se grafica la distribución de las participantes con respecto a las características estudiadas (figura 9b), se evidenció una distribución homogénea de las pacientes del estudio; es decir, que no hay influencia de las participantes en cuanto a la relación encontrada entre la concentración de ADNc y el estadio funcional. En resumen, a la luz de los resultados y la discusión aquí presentada, con este estudio se demuestra la utilidad del ADNc como biomarcador para el monitoreo de los estadios funcionales en las pacientes con cáncer de mama. Las principales razones para considerar esta estrategia con fines clínicos son diversas, entre ellas que de una forma mínimamente invasiva permite diferenciar entre distintos estadios funcionales, refleja progresión de la enfermedad y la prognosis de las pacientes, así como el beneficio clínico de la respuesta al tratamiento y monitoreo de este en las muestras subsecuentes, tomadas en el curso terapéutico de las pacientes. 31 9. Conclusiones El cáncer de mama es uno de los tumores más comunes a nivel mundial y que presenta una amplia gama de heterogeneidad mutacional (59)⁠. Por tanto, es indispensable el uso de biomarcadores que permitan monitorear la evolución de la enfermedad, los estadios clínicos y funcionales, la progresión, la prognosis y respuesta al tratamiento (60). Con este estudio, se evidencia que el monitoreo en tiempo real de la concentración del ADNc y variantes mutacionales específicas aportan la información diagnóstica necesaria para monitorear la evolución de la enfermedad, para evaluar la progresión, la prognosis y la respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer de mama metastásico. La biopsia líquida es una metodología que cumple con las características idóneas relacionadas a un biomarcador (60). En este estudio, se demuestra su utilidad como biomarcador para el monitoreo de los estadios clínicos y funcionales con el uso de la concentración de ADNc al permitir diferenciar entre cantidad de nódulos y diferenciar entre estadios funcionales. Además, con el uso del punto de corte de 1 ng/µL, la concentración de ADNc determina prognosis con respecto a la supervivencia global de las pacientes con cáncer de mama metastásico. Es importante destacar que en este estudio se demuestra que la cnADNc se relaciona con el beneficio clínico en la respuesta al tratamiento y la supervivencia global de las pacientes, pese a ser un grupo heterogéneo en cuanto a subtipos de cáncer de mama. Además, el estudio de los SNVs en los genes ESR1 y PIK3CA en muestras seriadas permite monitorear la evolución de la enfermedad y evidenciar cambios en la dinámica del tumor que se asocian con las distintas subclonas del cáncer al denotar aumentos en la frecuencia alélica de ciertos SNVs con respecto a otros y con los estadios clínicos y funcionales de las pacientes con cáncer de mama metastásico. Por último, al ser un estudio de prueba de concepto con el uso de la biopsia líquida, el mismo contribuye a la estandarización de procedimientos logísticos y metodológicos que pueden servir de base para futuras estudios en esta misma línea de investigación. En este sentido, en la figura 10 se resume de los principales aspectos logísticos y metodológicos de esta investigación con la intención de que sirvan como ejemplo de aspectos a tomar en cuenta en futuras investigaciones. 32 Figura 10. Esquema de la estrategia logística y metodológica utilizada en el estudio biomarcadores ADNc y ADNct mediante la biopsia líquida en pacientes con cáncer de mama metastásico. 33 10. Bibliografía 1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. 2021. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2. Ministerio de Salud CR. 2012. Registro Nacional de Tumores. 3. 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Paciente Muestra Concentración ADNc (ng/µL) ESR1 (%) PIK3CA (%) Y537C D538G E545K H1047L CT-01 1 0,88 0,887 CT-01 2 0,54 CT-01 3 0,48 CT-01 4 0,74 1,80 CT-02 1 2,61 CT-03 1 0,97 CT-04 1 2,50 16,46 CT-05 1 2,33 30,8 CT-06 1 2,64 1,281 5,653 CT-06 2 46,5 0,127 0,064 9,621 CT-07 1 0,83 0,853 CT-08 1 1,11 CT-08 2 0,62 2,929 CT-08 3 0,88 0,369 CT-08 4 0,91 CT-09 1 1,30 4,86 CT-09 2 1,79 0,149 0,947 CT-09 3 21,5 0,195 0,014 CT-10 1 0,19 CT-10 2 0,15 CT-10 3 0,46 3,022 CT-10 4 0,55 0,633 CT-11 1 1,03 0,512 CT-12 1 1,79 0,914 0,963 CT-12 2 0,87 2,905 16,08 CT-12 3 42,3 0,043 0,019 21,97 CT-13 1 0,49 CT-13 2 10,1 0,198 CT-14 1 0,75 1,00 CT-14 2 0,57 CT-14 3 1,94 CT-15 1 0,43 1,362 CT-15 2 0,52 5,063 CT-15 3 0,56 3,019 CT-15 4 0,57 1,296 1,216 CT-16 1 0,82 0,318 CT-17 1 4,910 CT-18 1 2,77 0,222 44 CT-18 2 0,85 0,889 CT-18 3 1 2,692 0,461 CT-18 4 0,92 2,719 CT-19 1 0,83 2,987 3,324 CT-19 2 1,51 CT-19 3 1,31 CT-19 4 0,89 CT-20 1 81,5 5,13 CT-21 1 7,16 CT-22 1 4,70 0,365 CT-22 2 1,18 0,816 CT-22 3 0,82 0,652 CT-22 4 0,87 CT-23 1 6,61 CT-23 2 1,85 CT-23 3 2,25 1,402 CT-24 1 1,20 CT-24 2 1,22 CT-24 3 4,37 1,190 0,284 CT-24 4 4,48 2,396 0,159 CT-25 1 49,73 0,071 CT-25 2 3,24 CT-25 3 7,1 0,255 CT-25 4 5,24 Yo: Ricardo Chinchilla Monge con cédula de identidad: 1-1180-0205 condición 1: circulante tumoral para el monitoreo de los estadios clínicos y funcionales en pacientes con cáncer de mama" condición 2: titulado: "Evaluación de la utilidad como biomarcador del ADN establezca el Sistema de Estudios de Posgrado SI: NO: X En caso de la negativa favor indicar el tiempo de restricción: 1 Firma: