Rev. peru. biol. 19(3): 335 - 340 (Diciembre 2012) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM Implementación de dos métodos para la detección de coliIfSaSgNos 1 s5o6m1á-t0i8c3o7 s NOTA CIENTÍFICA Implementación de dos métodos de recuento en placa para la detección de colifagos somáticos, aportes a las metodologías estándar Implementation of two plate count methods for detection of somatic coliphages and contributions to the standard methodologies Melissa Solano Barquero, Luz María Chacón Jiménez, Kenia Barrantes Jiménez y Rosario Achí Araya Universidad de Costa Rica, Insti- Resumen tuto de Investigaciones en Salud (INISA), Sección de Infección- Los métodos de recuento en placa capa doble y capa simple de agar, para la cuantificación de colifagos so- Nutrición. Apartado 11501-2060, máticos en aguas, fueron implementados utilizando como base metodologías estándar. Diferentes variables San Pedro Montes de Oca, San José, Costa Rica. fueron ensayadas, lo cual permitió la precisión en algunos pasos no incluidos en metodologías estándares. De los hallazgos de mayor importancia, se exponen las consecuencias de utilizar un cultivo de Escherichia Email Melissa Solano: melissa.solano_b@ucr.ac.cr coli excesivamente concentrado y se describe la obtención de un cultivo en fase logarítmica en solo 4 horas Email Luz María Chacón: de incubación, ajustando la concentración a una densidad óptica de 0,3 a 600nm (3,1 x 108 UFC/ mL), o a un luz.chacon@ucr.ac.cr McFarland 1 (3,0 x108 UFC/ mL). Se determinó que los controles de colifagos deben ser almacenados a -70 Email Kenia Barrantes: kenia.barrantes@ucr.ac.cr °C para reducir su degradación y que se deben evitar cantidades superiores a 20 mL de mezcla de reacción Email Rosario Achí: por plato de Petri, para reducir las burbujas que pueden interferir con la lectura de unidades formadoras de rosario.achi@ucr.ac.cr placas (UFP). Se demostró que los colifagos de las muestras de agua pueden almacenarse 48 horas a 4 °C sin que sufran degradación y que en las muestras con altas concentraciones de colifagos no se observa UFP porque se da una lisis confluente de la capa bacteriana. No se encontraron diferencias significativas en la recuperación de colifagos al utilizar un método u otro, pero dichos métodos deben ser evaluados por medio de controles, antes de aplicarlos directamente en el análisis de muestras de agua. Palabras clave: colifagos somáticos; capa doble de agar; capa simple de agar; aguas; indicadores virales. Abstract Two plate count methods, double layer and single layer of agar for quantification of somatic coliphages in water, were implemented using standard methodologies. Several variables were tested and provided valuable Presentado: 20/06/2012 information that was not included in standard methodologies. The most important findings are described, such Aceptado: 05/10/2012 as the effect of using an excessively concentrated culture of E. coli and production of a log phase culture in Publicado online: 15/01/2013 only 4 hours of incubation, adjusting the concentration to an optical density of 0.3 at 600 nm (3.1 x 108 CFU / mL), or to McFarland 1 (3.0 x 108 CFU / mL). It was determined that coliphages controls must be stored at -70 °C to reduce its degradation. Quantities of reaction mixture exceeding 20 mL per Petri dish must be avoided to prevent interfere with bubbles during the counting of plate forming units (PFU). It was demonstrated that coliphages isolated from water samples can be stored for 48 hours at 4 °C without any degradation, and PFU are not observed in samples with high concentrations of coliphages, because a confluent lysis of the bacte- rial layer. There was no significant difference in the recovery of coliphages using doble layer or single layer methods, but such methods should be evaluated by means of controls, before applying them directly in the analysis of water samples. Keywords: somatic coliphages; double agar layer; simple agar layer; water; viral indicator. Introducción En décadas pasadas, la mayoría de los estudios sugerían que las infecciones de origen hídrico se encontraban principalmente La contaminación de aguas superficiales con aguas negras, asociados a contaminación con bacterias o protozoarios; sin representa un alto riesgo de transmisión de enfermedades, ya embargo, posteriormente se observó un incremento gradual que las deposiciones fecales humanas y de animales contienen en el número de casos registrados cuyo agente etiológico eran diversos tipos de microorganismos enteropatógenos, entre estos los virus, y en la actualidad se consideran a los virus como los podemos encontrar bacterias, protozoarios y varios tipos de vi- responsables del mayoria de casos de origen hídrico (Bofill et al. rus entéricos (Borrego et al. 1990). De estos últimos se calcula 2005, Sinclair et al. 2009). Posiblemente este incremento fue que más de 100 tipos pueden ser transmitidos a través del agua consecuencia de una mejora en los métodos diagnósticos, como (Fong & Lipp 2005). la aplicación de métodos de biología molecular (v.g. Reacción de La falta de tratamiento de las aguas residuales domésticas Cadena de la Polimerasa -PCR) para la detección de patógenos procedentes de ciudades, genera una gran contaminación en ambientales; pero, también podría deberse a un incremento mares y ríos, lo cual merece especial atención, ya que estos real en la incidencia, debido a cambios en la epidemiología de últimos son fuente de abastecimiento de agua para consumo los virus, el aumento de la población y la contaminación de las humano. En general, se estima que en las aguas sometidas a aguas (Bofill et al. 2005, Sinclair et al. 2009). tratamiento para potabilización solamente se logra eliminar Aunque es claro que los virus trasmitidos por vía hídrica, entre el 50 y el 90% de los virus presentes, ya que por lo general representan una amenaza para la salud pública, en la mayoría éstos son muy resistentes a dichos procesos (Bofill et al. 2005, de las normativas su detección no ha sido considerada como Okoh et al. 2010). Rev. peru. biol. 19(3): 335 - 340 (December 2012) 335 Solano Barquero et al. parámetro adicional para garantizar la inocuidad del recurso (UFP), las cuales son zonas de aclaramiento circular que se hídrico. Por lo general, se analiza únicamente la presencia de producen en la capa bacteriana, debido a la lisis o destrucción indicadores bacterianos, cuya desventaja es que no reflejan el de la E. coli mediada por los colifagos. Inicialmente una par- comportamiento de patógenos virales, ni de otros parásitos como tícula de colifagos infecta a su bacteria hospedera, se replica y protozoarios (Borrego et al. 1987, Vivier 2004). posteriormente se disemina, generando una zona circular sin Parte de las razones que han llevado a excluir a los virus en el crecimiento de la bacteria. análisis de aguas, es que estos presentan una baja concentración Existen protocolos estandarizados para el análisis de colifagos aún en grandes volúmenes de agua, lo cual los hace difíciles de somáticos, por capa doble y capa simple de agar, como el 9224 detectar en muestras ambientales (Reynolds 2001). Ademas, C y 9224 E (APHA 2005), el 1602 (EPA 2001), y el método aunque los métodos para la detección de virus en aguas han ISO 10705–2 (ISO 1999), los cuales han sido aplicados en mejorado, ellos suelen ser muy laboriosos, como es el caso del muchos laboratorios con algunas variaciones. Sin embargo, estas cultivo celular, o se encuentran aún en la fase de estandariza- metodologías no explican algunas de las variables a las que se ción como sucede con la Reacción en Cadena de la Polimerasa enfrenta un laboratorio al implementarlas. PCR (Bofill et al. 2005, Mooijmana et al. 2005) además, la implementación de los mismos representa una fuerte inversión El objetivo de este trabajo es describir el proceso con la fi- económica (Campos-Pinilla et al. 2008). nalidad de informar sobre algunos aspectos y recomendaciones que no se incluyen en las metodologías estándar y que son Sin embargo, debido al riesgo para la salud que implica la importantes para la implementación de los ensayos presencia de virus entéricos en las aguas, así como por el in- cremento en los brotes de origen hídrico asociados a virus, es Material y métodos importante contar con metodologías de detección viral, rápidas Microorganismos utilizados.– Se utilizó la bacteria Escheri- y económicas, principalmente en países en desarrollo. Dentro chia coli 13706 ATCC y el colifago Ф174 ATCC. Los controles de las opciones, existen metodologías basadas en el uso de indi- de colifagos se ajustaron a una concentración entre 20 – 80 UFP/ cadores virales, como los colifagos, cuya presencia correlaciona mL y se almacenaron a –70 °C, sin la adición de crioprotector. con la existencia de virus entéricos patógenos de humanos. Metodologías de referencia.– A continuación se describen Los colifagos son virus que infectan y se replican en Esche- brevemente las metodologías de referencia utilizadas para la richia coli (Armon & Kott 1996) del tracto gastrointestinal implementación de los ensayos de capa doble de agar y capa de organismos de sangre caliente (Paz 2003). Los colifagos simple de agar. somáticos incluyen una gran variedad de fagos que pertenecen Capa doble de agar: a las familias Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Microviridae (Okafor 2011). Estos fagos han sido utilizados como indicadores -Protocolo 9224 B, Standard Methods for the Examination of de virus entéricos, ya que comparten muchas características con Water and Wastewater (SMEWW) (APHA 2005). Se preparó un estos virus, como lo es su composición, morfología y modo de cultivo bacteriano en fase logarítmica, inoculando una asada del replicación, lo cual los hace comportarse de manera similar en cultivo congelado de E. coli (ATCC 13706) en caldo tripticasa cuanto a su persistencia ambiental, su comportamiento ante las soya (CTS) que se incubó a 36,5±2 °C, 16 horas y se transfirió tensiones ambientales, variación estacional y grado de resistencia un inóculo a CTS fresco incubándolo 6 horas más. Para replicar a la cloración. De esta forma, una muestra positiva por colifagos los fagos el cultivo de la bacteria se inoculó con 1 mL del colifago reúne las condiciones para la presencia de virus entéricos y por rehidratado y fueron incubados juntos durante 4 horas. Posterior lo tanto, la probabilidad de que también sea positiva para estos a esto, la suspensión colifagos-bacteria o la muestra de agua a virus es alta (Cole 2003). analizar, fueron filtrados con filtros de 0,22 µm pretratados con extracto de carne. Se realizó diluciones seriadas del filtrado y se El análisis de colifagos somáticos también ha sido utilizado mezcló 1 mL de las mismas, 0,1 mL del cultivo de la bacteria y como indicador de contaminación fecal y marcador en el proceso 3 mL de Agar Tripticasa Soya (ATS) al 0,7%, se homogenizó, de tratamiento de aguas, ya que provienen del tracto gastrointes- se vertió en platos de Petri que contenían una capa de ATS al tinal de organismos de sangre caliente y se ha observado que tras 1,5 % y fueron incubados toda la noche. El procedimiento se el proceso de tratamiento de las aguas, se eliminan a un ritmo realizó por quintuplicado para cada dilución. comparable a los virus entéricos (Skraber et al. 2004, Campos- Pinilla et al. 2008). Los colifagos son además, más resistentes a Capa simple de agar: los procesos de tratamiento de agua, por lo cual algunos autores -Protocolo 1602, Agencia de Protección Ambiental de los sugieren que su detección es de mayor utilidad que las bacterias Estados Unidos (EPA 2001). Este método de referencia difiere fecales (Okoh et al. 2010, Brezina & Baldini 2008). del anterior en cuanto a la preparación del cultivo bacteriano ya Para la detección de colifagos se han desarrollado métodos que utiliza ácido nalidíxico, que al inhibir el crecimiento de otras como la inducción de liberación de β–galactosidasa (Stanek bacterias hace que se pueda evitar la filtración de la muestra. Sin & Falkinham 2001), bioluminiscencia (Guzmán et al. 2009) embargo, los pasos de esta metodología que se siguieron fueron y fluorescencia (Salter et al. 2010), entre otros. Sin embargo, los siguientes: se preparó un cultivo bacteriano en CTS a partir los protocolos de referencia siguen siendo los métodos de capa de una asada de cultivo congelado y se incubó 18 – 20 horas doble de agar y capa simple de agar, que son más económicos. a 36±1 °C. A partir de este cultivo se transfirió una alícuota a CTS fresco y se incubó durante 4 horas o hasta que alcanzó una Los métodos de conteo en placa, como capa doble y capa densidad óptica (DO) de 0,1 – 0,5. Se preparó 100 mL de ATS simple de agar, se basan en la determinación de la concentración 1,2 % el cual fue inoculado con 0,5 mL de cloruro de magnesio, viral, mediante el conteo de unidades formadoras que placas 10 mL del cultivo de E.coli y 100 mL de la muestra de agua. 336 Rev. peru. biol. 19(3): 335 - 340 (Diciembre 2012) Implementación de dos métodos para la detección de colifagos somático s La mezcla fue homogenizada y dispensada en 8 a 10 en platos una asada del cultivo congelado de E.coli en CTS y se incubó de Petri. Los platos se incubaron 36±1 °C por 16 – 24 horas. durante 16 horas a 36,5 ±1 °C, posteriormente se transfirió una -Protocolo 9224 E, SMEWW (APHA, 2005). La bacteria se alícuota a CTS fresco y se incubó 4 horas a la misma tempera- preparó y la muestra se filtró según lo descrito en el Protocolo tura, el cultivo se almacenó en refrigeración y al día siguiente se 9224 B SMEWW para capa doble de agar. Los 100 mL de transfirió otra alícuota a CTS fresco, se incubó durante 4 horas la muestra fueron inoculados con 5 mL de cloruro de calcio y se le ajustó la DO a 0,3. (CaCl2), 10 mL de la bacteria en fase logarítmica y 100 mL de (3) Aplicabilidad del rango de densidad óptica del cultivo ATS 1,2 %, la mezcla se dispensó en platos de Petri. Los platos bacteriano, para la amplificación y el recuento de colifagos. Se fueron incubados a 36,5 ±1 °C toda la noche. realizó el recuento de colifagos por capa doble de agar utilizando Metodologías implementadas.– En esta sección se detallan cultivos de bacteria hospedera con DO= 0,1, DO= 0,5 y DO= 0,3. las metodologías implementadas en nuestro laboratorio. La (4) Importancia de la concentración de bacterias en fase implementación de los métodos se realizó inicialmente con logarítmica, en el proceso de replicación y filtración de los muestras de agua destilada inoculada y posteriormente utilizando colifagos. Posterior a la replicación de los colifagos se determinó agua de río, en este caso se utilizó el agua del río Purires, ubicado el título de la suspensión, por el método capa doble de agar. La en la provincia de Cartago, Costa Rica. Todas las muestras fue- suspensión de colifagos sobrante, se hizo pasar nuevamente por ron analizadas en dos momentos distintos: el día en que fueron el sistema de filtración cuyos filtros se encontraban tapizados con colectadas y posterior a un almacenamiento de 48 horas a 4 °C. la bacteria hospedera E. coli. Lo anterior con el fin de establecer Capa doble de agar si existía disminución en el conteo de UFP debido a la captura de los fagos entre los restos bacterianos. Para preparar el cultivo de la bacteria en fase logarítmica, se colocó 3 asadas del cultivo congelado de la bacteria en CTS y (5) Temperatura de almacenamiento de los colifagos. se incubó a 35 °C (incubadora Lab–line® Imperial III modelo Concentrados de colifagos con título conocido fueron almace- 310) en agitación hasta obtener una densidad óptica DO= 0,3. nados a tres temperaturas distintas: temperatura ambiente, 4 °C Para replicar los colifagos, uno de los cultivo de la bacteria fue y –70 °C. Esta última temperatura se ensayó con la adición de inoculado con 1 mL del colifago Ф174 ATCC rehidratado y glicerol (Sigma®) al 20% y sin añadir este crioprotector. Después fueron incubados a 35 °C durante 4 horas, posteriormente se de 30 días se realizó nuevamente el recuento de colifagos. A los filtró en un sistema de filtración al vacío (Sartorius Stedim®) tubos a –70 °C también se les realizó el recuento tras 7 meses con filtros de acetato de celulosa (Sartorius®) de 0,22 µm, pre- de almacenamiento. tratados con extracto de carne (OXOID®) al 1,5%. El filtrado (6) Concentración del colifago. Se realizó el recuento de se distribuyó en alícuotas de 1 mL, en tubos cónicos tipo colifagos en filtrados altamente concentrados del virus, así como, Eppendorff, y almacenadas a –70 °C. Posteriormente para el en diluciones de los mismos, para determinar posibles diferencias recuento del título de colifagos se realizó diluciones decimales en la distribución y forma de las UFP. seriadas las cuales fueron mezcladas con la E. coli y con el agar y distribuidas en platos Petri como se especifica en el Protocolo (7) Volumen de mezcla de reacción. En cada plato de Petri 9224 B del SMEWW para capa doble de agar. Para el análisis de 10 cm de diámetro, se vertió volúmenes de mezcla de reacción de muestras de agua se siguió el mismo procedimiento pero sin de 15, 20, 25, 30, 35, 40 y 45 mL, con el fin de evaluar si el replicación de los colifagos, por lo que el procedimiento inició grosor de la capa de agar afecta la observación de UFP. con la filtración de la muestra. Análisis estadístico.- Para los análisis estadísticos se aplicó ANOVA o t-Student, con el programa SPSS Statistics versión 17.0. Capa simple de agar En todos los casos se trabajó con un nivel de confianza de 95%. El cultivo de la bacteria se preparó y la muestra se filtró como se especificó para la implementación de los ensayos de capa Resultados doble de agar. Para determinar el título de colifagos, 100 mL (1) Optimización del cultivo bacteriano en fase logarítmi- de la muestra de agua filtrada fueron inoculados con CaCl , el ca, para la replicación y recuento de los colifagos.- Al aplicar 2 cultivo de la bacteria hospedera y el agar, como se describió en la metodología original de APHA la densidad de la sobrecapa el Protocolo 9224 E del SMEWW. bacteriana obtenida impidió la observación de UFP. El cultivo de la bacteria hospedera en fase logarítmica se logró optimizar, Variables ensayadas.– regulando su concentración al comparar con un McFarland 1 8 (1) Optimización del cultivo bacteriano en fase logarítmi- (3,0x10 UFC/ mL) o midiendo una densidad óptica de 0,3 8 ca, para la replicación y recuento de los colifagos. Inicialmente (3,1x10 UFC/ mL), con la ayuda de un biofotómetro. El el cultivo en fase logarítmica se preparó según el protocolo de inóculo bacteriano obtenido con las modificaciones aplicadas, APHA, posteriormente se ajustó para que el cultivo primario generó una capa bacteriana menos densa que permitió la ob- tuviera una concentración semejante a McFarland 1, lo cual servación de las UFP. equivale a aproximadamente a 3x108 UFC/ mL. Por último, (2) Optimización de la edad del cultivo bacteriano.- Se se preparó un cultivo bacteriano en fase logarítmica con una realizó un ensayo en el que se comparó los resultados del re- DO=0,3 a 600 nm, utilizando un biofotómetro. cuento al utilizar cultivos bacterianos con 4 horas y con 24 (2) Edad del cultivo bacteriano. Se prepararon cultivos horas de incubación, obteniéndose 4,5 x 1010 UFP/ mL y 4,6 x bacterianos con 4 horas de incubación y otros con 24 horas 1010 UFP/ mL respectivamente, para lo cual se determinó que de incubación. Para preparar el cultivo de 24 horas, se inoculó tampoco existe diferencia estadísticamente significativa (p= 0,5). Rev. peru. biol. 19(3): 335 - 340 (December 2012) 337 Solano Barquero et al. Tabla 1. Repetitividad del método capa doble de agar evaluado mediante 3 ensayos. Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Dilución # UFP # UFP # UFP 10-2 47 52 45 50 47 50 48 45 47 46 45 53 48 50 47 Título promedio 4,82 x 103 UFP/mL 4,72 x 103 UFP/mL 4,86 x 103 UFP/mL (3) Aplicabilidad del rango de densidad óptica (0,1 – 0,5), plato de Petri o superior, la sobrecapa bacteriana desaparece para la generación del cultivo en fase logarítmica.- Al utilizar por completo (lisis confluente), obteniéndose un plato de Petri la DO más baja sugerida por el método de la EPA (DO= 0,1), se con una superficie de agar brillante y traslúcido. Debido a esta obtuvo una sobrecapa bacteriana menos confluente en el plato de lisis de la capa bacteriana, el recuento máximo obtenido por el Petri, que no delimita bien las UFP, por lo cual estas tienden a método capa doble de agar fue de 200 UFP en cada plato de traslaparse unas con otras. Cuando se utilizó DO= 0,5 se obtuvo Petri, mientras que por el método capa simple de agar fue de UFP bien definidas, pero de menor tamaño que las observadas 350 UFP por plato de Petri. cuando la DO fue cercana a 0,3. (7) Estandarización del volumen de mezcla de reacción, (4) Importancia de la concentración de bacterias en fase vertido en cada plato de Petri.- En el método de capa simple logarítmica en el proceso de replicación y filtración de los de agar se observó que volúmenes de 30, 35, 40 y 45 mL por colifagos.- El título de la suspensión de colifagos replicados fue plato generaron gran cantidad de burbujas que interfirieron en inicialmente de 3,8 x 103 UFP/ mL, dicho conteo disminuyó a la lectura de las UFP, mientras que con volúmenes de 15, 20 y 3,4 x 101 UFP/ mL, cuando la suspensión se hizo pasar nueva- 25 mL, la cantidad de burbujas generadas es mínima, de manera mente por el sistema de filtración cuyos filtros se encontraban que no limita la lectura de las UFP tapizados con restos de la bacteria hospedera. (8) Repetibilidad de los métodos.- No hubo diferencias (5) Temperatura de almacenamiento de los colifagos.- estadísticamente significativas para los 3 ensayos realizados por Un concentrado de colifagos de título 2,2 x 104 UFP/ mL, fue el método capa doble de agar (p= 0,7) (Tabla 1). Todos los re- evaluado para determinar su estabilidad después de un mes de cuentos realizados por el métodos capa simple de agar mostraron almacenamiento a diferentes temperaturas (4 °C, temperatura el mismo orden de magnitud 1,7x 107 UFP/mL, 1,6 x 107; 2,4 ambiente y –70 °C). En el caso de –70 °C se evaluó bajo dos x 107 y 3,8x107 UFP/mL. condiciones, una utilizando 20% de glicerol y otra sin glicerol. Se obtuvo como resultados 6,1 x 101 UFP/ mL a temperatura Comparación de métodos.- Para un concentrado de colifa- ambiente; 2,8 x 103 UFP/ mL a 4° C; 2,1 x 104 UFP/ mL a –70° C gos se realizó 3 ensayos por el método capa doble de agar y en sin adicionar glicerol y 2,1 x 104 UFP/ mL a –70 °C adicionando paralelo se realizó 4 repeticiones por el método capa simple de glicerol. El almacenamiento durante un mes a temperatura am- agar, obteniendo como promedios 3,8 x 10 7 UFP/ mL y 2,4 x 7 biente y a 4 °C fueron significativamente menores (p<0,0001), 10 UFP/ mL, respectivamente. No hubo diferencias estadística- en tanto que a –70 °C utilizando glicerol y sin la adición del mente significativas en la recuperación de colifagos, por ambos mismo, la pérdida de colifagos no fue significativa (p= 0,8 y p= métodos (p= 0,1). 0,9 respectivamente) independientemente de si se aplica o no Análisis y conservación de las muestras de agua de río.- crioprotector (p= 0,9) (Fig. 1). En el primer muestreo del río Purires se obtuvo un título de colifagos de 2,5 x 102 Después de 7 meses de almacenamiento a –70 °C y sin añadir UFP/100 mL el día del muestreo y pos- crioprotector, el título disminuyó de 2,2 x 104 UFP/ mL a 7,2 terior a un almacenamiento de 48 h a 4 °C se obtuvo el mismo x 102 UFP/ mL. resultado. Para el segundo muestreo el recuento de colifagos se realizó por triplicado, tanto el día del ensayo como posterior al (6) Observación de resultados según la concentración de almacenamiento de 48 h (Tabla 2). No se encontró diferencia colifagos.- Cuando la cantidad de colifagos fue 103 UFP por significativa entre los resultados obtenidos antes y después de almacenar la muestra (p= 0,8). 25000 En un tercer muestreo realizado en el Río Purires se deter- 20000 minó tanto la concentración de coliformes fecales, como la de colifagos, obteniéndose los siguientes resultados: 280 NMP/100 15000 mL y 233 UFP/100 mL respectivamente. 10000 Tabla 2. Título de colifagos obtenido por el método capa simple de agar, en las muestras del segundo muestreo del río Purires, Cartago, 5000 Costa Rica, el día del muestreo y después de 48 horas de almace- namiento a 4 ºC. 0 UFP/100 mL Antes de -70 ºC sin -70 ºC con 4 ºC Temperatura Ensayo Día del Posterior a 48 h almacenar glicerol glicerol ambiente muestreo a 4 °C Temperatura de almacenamiento de los colifagos 1 301 248 2 280 217 Figura 1. Título de una suspensión de colifagos somáticos Ф174 ATCC antes de su almacenamiento y posterior a un mes de almacenaje a 3 253 268 distintas temperaturas. Título promedio 278 244,3 338 Rev. peru. biol. 19(3): 335 - 340 (Diciembre 2012) Título del concentrado de colifagos (UFP/mL) Implementación de dos métodos para la detección de colifagos somático s Discusión hospedera en fase logarítmica en 4 horas, obteniendo los mismos Los métodos de capa simple y capa doble de agar descritos en resultados que al utilizar un cultivo con más días de incubación SMEWW (APHA 2005) y EPA (EPA 2001) han sido amplia- que también se encuentre en fase logarítmica. Esto es de gran mente utilizados con algunas modificaciones en diferentes labora- importancia ya que de esta manera el tiempo de preparación torios (Paz et al. 2003, Muniesa & Jofre 2004). En el caso de esta del cultivo bacteriano se reduce de 3 días (24 horas en total, investigación, se determinó que los métodos se ven afectados por según protocolo APHA) a 4 horas. La preparación de la bacte- muchas variables como la densidad óptica del cultivo bacteriano, ria hospedera el mismo día del ensayo, ha sido descrito para la temperatura de almacenamiento del fago, condición fisiológica determinación de colifagos somáticos según el manual de ISO de la bacteria hospedera, relación en la concentración colifagos-E. 10705–2 (ISO, 1999) y para la evaluación los bacteriófagos de coli, entre otros aspectos; pero una vez que se tienen controladas Bacteriodes fragilis (Araujo et al. 2001). estas variables, los resultados se comportan de manera repetible. La temperatura óptima para el almacenamiento de colifagos La bacteria hospedera E.coli debe encontrarse en fase loga- es de –70 °C, lo cual es un hallazgo de importancia ya que esta rítmica para que el virus se replique adecuadamente, ya que la información no se especifica en los métodos de referencia (APHA generación de nuevas partículas virales depende de la replicación 2005, EPA 2001, ISO 1999), los datos que se encuentran en del material genético bacteriano (Breitbart et al. 2005). Para la la literatura son escasos y basados en ensayos con otros tipos de reproducción de colifagos por el método capa doble de agar des- bacteriófagos (Feng et al. 2003, Méndez et al. 2002). A pesar de crito por APHA, el cultivo secundario de E. coli se incuba 6 horas que –70 °C fue la temperatura más adecuada para almacenar los antes de inocularlo con los colifagos; sin embargo, si se compara colifagos, si se observó una pérdida de los mismos tras 7 meses este tiempo de incubación con las curvas de crecimiento descritas de almacenamiento. para E. coli (Ramírez et al. 2005), estas sugieren que dicha bacteria Para una adecuada lectura de los resultados es importante re- no se encuentra en fase de crecimiento exponencial, sino en fase visar minuciosamente los platos de Petri para notar las diferencias estacionaria, en la cual hay equilibrio entre la muerte y división entre un plato negativo y uno con una alta concentración de de la bacteria o ella simplemente deja de dividirse (Prescott 2002), colifagos, ya que ninguno presenta UFP; además es importante lo que podría afectar la replicación del fago. Además, períodos que cada plato contenga entre 15 y 25 mL de agar para evitar de incubación prolongados generan cultivos bacterianos muy la formación de burbujas producto del metabolismo de E. coli densos, como sucedió al aplicar el método de APHA, esto hace (McFaddin 2003) que interfieren en la lectura de las UFP. que las filtraciones sean más lentas y que aumenten las pérdidas en la recuperación de los colifagos, porque éstos pueden quedar Una vez que variables como tiempo de incubación de la atrapados entre los restos bacterianos dispuestos sobre los filtros bacteria, y temperatura de almacenamiento de fagos se han de 0,22 µm; y como se observa en nuestros resultados, al hacer optimizado, los métodos de capa doble y capa simple de agar pasar una solución de colifagos por filtros tapizados con los restos se comportan de manera repetible. Capa simple de agar es una de la bacteria hospedera, la concentración de los fagos disminuye técnica más rápida y más económica, sin embargo, su utilidad 2 logaritmos en el título de los colifagos, de aquí la importancia es limitada cuando la contaminación de la fuente de agua es alta de que la incubación de la E. coli-colifago se realice entre 4 y 6 y no se ha diluido la muestra previamente. horas para evitar un cultivo excesivamente denso. En los ensayos realizados para esta investigación no se en- La alta densidad bacteriana también afecta el recuento de contró diferencias significativas al comparar los recuentos de colifagos, ya que cuando el cultivo es muy denso, la sobrecapa colifagos obtenidos por ambos métodos. bacteriana es confluente, por lo cual aunque el virus logre la lisis El protocolo de la EPA (EPA 2001) menciona que la muestra de las de E. coli, el exceso de bacterias impide la observación de de agua debe ser analizada como máximo 48 horas posterior a las zonas de aclaramiento (UFP). El ajuste de la concentración su recolección, otros autores han mencionado que la muestra de bacteriana mediante la aplicación de McFarland 1 (aproximada- agua puede mantenerse a 5 – 8 °C incluso por 3 días sin presentar mente 3x108 UFC/ mL), mejoró la lectura de la prueba, ya que se una pérdida significativa, ni aumento de colifagos (Méndez et logró obtener un cultivo bacteriano menos concentrado. Por esta al. 2002, Muniesa & Jofre 2004, Jofre 2009). Para el caso de razón se propone como un método alternativo, principalmente esta investigación se demostró que las muestras de agua de río, para laboratorios que no cuenten con biofotómetro. Otros mé- pueden ser almacenadas durante 48 horas, a 4 °C posterior a su todos de referencia como el ISO 10705-2, propone la reducción filtración, sin que se reduzca el número de colifagos. de los tiempos de incubación de la bacteria (ISO 1999). Por otro lado la similitud encontrada entre el número de El uso del biofotómetro fue de utilidad para ajustar de manera colifagos y el número de coliformes fecales concuerda con los exacta la concentración de bacterias en el medio de cultivo. Los resultados encontrados para aguas crudas, en otras investigacio- resultados de recuento de colifagos en las dos densidades ópticas nes (Paz-y-Miño et al. 2003, Campos et al. 2008, Skraber et al. extremas recomendadas por el método de la EPA (0,1 y 0,5), no 2004). Sin embargo, no se cuenta con una interpretación de los produjeron resultados adecuados para la ejecución del ensayo, resultados obtenidos para las aguas de río, debido a que no se ha mientras que al utilizar un cultivo de bacteria hospedera con establecido un valor límite para colifagos en aguas crudas. Las valores de DO cercanos a 0,3 produjo una sobrecapa bacteriana Guías para la Calidad del Agua de Bebida, de la Organización óptima que permitió una adecuada delimitación de las UFP; aún Mundial de la Salud, indican que se han encontrado concentra- cuando el recuento de las UFP era alto. ciones de colifagos somáticos de 109 UFP/100 mL en aguas de En cuanto a la optimización de la edad del cultivo bacte- desecho y de 10 4 UFP/100 mL en aguas de ríos y lagos (OMS riano, se demostró que se puede lograr un cultivo de bacteria 2008). Por otro lado, estudios realizados en ríos de diferentes regiones han encontrado concentraciones de colifagos en un Rev. peru. biol. 19(3): 335 - 340 (December 2012) 339 Solano Barquero et al. orden de magnitud de 101 UFP/100 mL, 103 UFP/100 mL Feng Y., S. Ong & J. Hu. 2003. Effects of pH and temperature on (Paz-y-Miño et al. 2003, Skraber et al. 2004). the survival of coliphages MS2 and Qb. J Ind Microbiol Biotechnol. 30:549–552. En este trabajo, las concentraciones más altas de colifagos Fong T. & E. Lipp. 2005. Enteric viruses of humans and animals in (102/100 mL) fueron encontradas en los puntos más lejanos a aquatic environments: health risks, detection, and potential la naciente del río Purires, donde se observó captación directa water quality assessment tools. Microbiol Mol Biol Rev. del agua para el riego de lechugas. Esto representa un riesgo para 69:357–371. la salud debido a elevada probabilidad de que virus entéricos y Guzmán C., A. Costán, F. Lucena & Jofre J. 2009. Detection of otros agentes patógenos estén presentes en esta agua, lo cual es de somatic coliphages through a bioluminescence assay especial importancia siendo la lechuga un alimento de consumo measuring phage mediated release of adenylate kinase and adenosine 5–triphosphate. J Virol Methods. 161:107–113. crudo. A pesar de esta situación, en Costa Rica no hay estudios ISO/DIS 10705–2. 1999. Water Qualyty– Detection and enumeration of epidemiológicos de las aguas, ni controles sobre las captaciones bacteriophages– Part 2: Enumeration of somatic coliphages. directas que se hacen en los ríos, aún cuando estas se realizan Jofre J. 2009. Is the replication of somatic coliphages in water envi- en zonas evidentemente contaminadas. Por lo tanto, la imple- ronments significant? J Appl Microbiol. 106:1059–1069. mentación y ensayo de estos métodos de conteo en placa viene McFaddin FJ. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación a ser un paso inicial para realizar estudios de contaminación de de bacterias de importancia clínica. 3ª ed. Buenos Aires: estas fuentes de agua. Editorial Médica Panamericana. Pp 302. Mendez J., J. Jofre, F. Lucena, et al. 2002. 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