Universidad de Costa Rica Sede Universitaria Rodrigo Facio Facultad de Microbiología Trabajo Final de Graduación sometido a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología para optar por el grado y título de Especialista en Bacteriología Médica Agentes bacterianos asociados al cáncer colorrectal y su potencial uso como biomarcadores Sustentante: Dra. María José Rodríguez González Carné: B15562 Miembros del comité asesor: Dr. Carlos Quesada Gómez. Ph.D Tutor Esteban Chaves Olarte. Ph.D Lector Carlos Chacón Díaz. Ph.D Lector Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2021 II III Dedicatoria Con todo mi amor y cariño a las personas que más han influenciado en mi vida, mis padres Hernán Rodríguez y Fanny González, por su invaluable apoyo y constante motivación este es un logro más de ustedes. A mi jefa y amiga Ana Mora Gómez, quien ha sido parte fundamental en estos dos años de especialidad, sus consejos y disposición me han impulsado a buscar siempre la mejor solución, a ser más asertiva y a perseverar para culminar con éxito, este también es un logro de ella. IV Agradecimientos El presente trabajo de investigación fue realizado bajo la supervisión del Dr. Carlos Quesada a quien expreso mi agradecimiento, por hacer posible la realización de este estudio. Gracias por compartir conmigo sus conocimientos y orientaciones, las cuales han sido fundamentales en la realización de este trabajo y por toda la paciencia, tiempo y dedicación que tuvo para que esto saliera de manera exitosa. A mi familia quienes son los cimientos de mi desarrollo, todos y cada uno de ustedes que siempre han destinado tiempo para enseñarme nuevas cosas y me han brindado aportes invaluables que servirán para toda mi vida. A mi amiga y compañera del posgrado, Iveth Jímenez por haber haberme acompañado y motivado para lograr nuestro gran objetivo. V Índice General Dedicatoria ______________________________________________________________ II Agradecimientos __________________________________________________________ V Índice General ___________________________________________________________ VI Índice de cuadros y figuras _________________________________________________ VIII Índice de abreviaturas _______________________________________________________ IX Justificación ______________________________________________________________ 9 Pregunta _______________________________________________________________ 10 Hipótesis _______________________________________________________________ 10 Objetivos _______________________________________________________________ 10 Objetivo general ______________________________________________________________ 10 Objetivos específicos __________________________________________________________ 10 Metodología _____________________________________________________________ 11 Criterios de inclusión __________________________________________________________ 11 Criterios de exclusión __________________________________________________________ 12 1.Introducción ___________________________________________________________ 13 1.1 Características y diagnóstico del CCR ___________________________________________ 14 1.2 El CCR y su relación con la microbiota___________________________________________ 15 2.Fusobacterium nucleatum _________________________________________________ 19 2.1 Asociación epidemiológica de F. nucleatum y CCR __________________________________ 19 2.1 Fusobacterium nucleatum y su utilidad clínica relacionada al CCR _______________________ 23 2.3 Mecanismo de acción de F. nucleatum sobre las células intestinales ______________________ 27 2.4 Asociación biológica entre F. nucleatum y el pronóstico de los pacientes con CCR. ___________ 31 3.Streptococcus gallolyticus _________________________________________________ 32 VI 3.2 Mecanismo de acción de S. gallolyticus sobre las células intestinales _____________________ 35 3.3 Uso clínico de S. gallolyticus en el diagnóstico del CCR __________________________________ 37 4.Bacteroides fragilis enterotoxigénico _________________________________________ 38 4.1 Asociación epidemiológica con el CCR __________________________________________ 38 4.2 Mecanismo de acción bacteriana sobre las células intestinales __________________________ 39 5.Discusión _____________________________________________________________ 40 6.Conclusiones ___________________________________________________________ 43 Bibliografía _____________________________________________________________ 44 VII Índice de cuadros y figuras Fig 1. Diagrama de flujo de la selección de los artículos utilizada en la revisión sistemática. . 12 Cuadro I. Principales estudios de asociación epidemiológica entre el CCR y F. nucleatum .... 20 Cuadro II. Asociación de la infección por F. nucleatum y la sobrevida de los pacientes con CCR en los principales artículos encontrados del periodo 2009-2019. ............................................ 26 Fig 2. Mecanismo de acción de Fusobacterium nucleatum sobre el enterocito. ..................... 28 Fig 3. Fisiopatología de Fusobacterium nucleatum sobre las del epitelio colorrectal, sobre el cuál induce la carcinogénesis. ...................................................................................................... 30 Cuadro III. Estudios de prevalencia de Streptococcus gallolyticus en pacientes con CCR y el grupo control en el periodo 2009 al 2019. .............................................................................. 34 VIII Índice de abreviaturas ADN: Ácido desoxirribonucleico. AINE: Antiinflamatorio no esteroideo Anti-Fn: Anticuerpos contra Fusobacterium nucleatum ARN: Ácido ribonucleíco Bf: Bacteroides fragilis BFET: Bacteroides fragilis enterotoxigénico CCR: Cáncer colorrectal. CMV: Citomegalovirus COX: Ciclooxigenasa EBV: Vírus de Epstein-Barr EMO: Espermina oxidasa F-Hb: Hemoglobina fecal. FMIP: Fenotipo metilador de Islas CpG Fn: Fusobacterium nucleatum IgG: Inmunoglobulina tipo G. IL: Interleucina INC: Inestabilidad cromosomal. IMS: Inestabilidad microsatelital NK: Natural Killer Microbioma: conjunto de ADN o ARN de microorganismos de determinado sitio (cuerpo humano o parte del cuerpo humano) Microbiota: Conjunto de microorganismos que colonizan cierto nicho. Sg: Streptococcus gallolyticus IX Justificación Algunas malignidades tienen claras asociaciones con un solo microorganismo por ejemplo Helicobacter pylori y cáncer gástrico, o Virus del Papiloma Humano con cáncer de cérvix. Sin embargo, la microbiota intestinal y su ambiente es mucho más diverso y complejo que el estómago o cérvix, por lo tanto puede que múltiples especies estén relacionados con el origen y crecimiento del cáncer colorectal (CCR) (Sobhani et al., 2013). El riesgo relativo de CCR es mayor en personas de 50-75 años, y en personas que hayan tenido familiares con este tipo de cáncer. Curiosamente el riesgo relativo parece ser mayor para cónyuges con historial familiar de CCR en comparación con el resto de la población, esto sugiere un factor de transmisión intrafamiliar (Quintero et al., 2012). A pesar de que existen muchas asociaciones del desarrollo del CCR con la presencia o acción de múltiples bacterias e incluso estudios de determinación de la microbiota bacteriana asociada a pacientes con esta enfermedad. No obstante, no existen revisiones sistemáticas que sinteticen la epidemiología asociada y los mecanismos de acción de agentes bacterianos que estén asociados a la carcinogénesis del CCR por medio de modelos murinos y clínicos. Por lo que es necesario revisar el tema en cuestión para así evaluar los posibles agentes bacterianos asociados con el desarrollo del CCR y si esto pudiese tener algún valor diagnóstico para un eventual mejor abordaje de esta malignidad. 9 Pregunta ¿Existen agentes bacterianos asociados a la carcinogénesis del cáncer colorrectal cuya detección podría ser de utilidad clínica?. Hipótesis El cáncer colorrectal está asociada a agentes bacterianos que pueden ser utilizados como herramienta clínica. Objetivos Objetivo general Determinar la existencia de agentes bacterianos que puedan ser utilizados como herramienta clínica en el abordaje del cáncer colorrectal. Objetivos específicos • Establecer la asociación epidemiológica de agentes bacterianos mayormente relacionados con el desarrollo del cáncer colorrectal. • Definir posibles marcadores bacterianos para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer colorrectal. • Establecer la relación de estos agentes bacterianos con el estado del cáncer colorrectal. 10 Metodología Se realizó una búsqueda sistemática de artículos científicos que estuvieran disponibles en las siguientes bases de datos: MEDLINE, Web of Science y Google Scholar. Para esto, se utilizó el modo de búsqueda avanzada; en el caso de MEDLINE (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/advanced) se utilizó el buscador PubMed, seleccionando PMC y se procedió a realizar tres búsquedas individuales: ((("colorectal cancer"[Title]) AND "Fusobacterium" [MeSH Major Topic]"); ((("colorectal cancer"[Title]) AND "Bacteroides" [MeSH Major Topic]") y ((("colorectal cancer"[Title]) AND "Streptococcus" [MeSH Major Topic]") adicionando como filtro solo artículos clinical trial y clinical study en entre los años 2009- 2019 En el caso de Google Scholar (https://scholar.google.com) se empleó la herramienta de búsqueda avanzada, se establecieron los criterios de búsqueda; en el espacio: “con todas las palabras” se determinó la bacteria de interés: Fusobacterium, Bacteroides o Streptococcus; en el espacio: “con la frase exacta” se estableció “colorectal cancer”; en el espacio: “sin las palabras”: “review, meta- analysis” para limitar la búsqueda a sólo artículos originales, en la opción “donde las palabras aparezcan” se selecciona “en el título” del artículo y finalmente se estableció en periodo de los artículos del 2009 al 2019. En el buscador de Web of Science (apps.webofknowledge.com) en el modo de búsqueda avanzada se buscó con el título “colorectal cancer" y la bacteria de interés: Streptococcus, Bacteroides o Fusobacterium y en el idioma: Inglés y Español, tipo de documentos Article y periodo de tiempo: 2009-2019. Criterios de inclusión Se incluyeron artículos originales del año 2009 al 2019, únicamente ensayos clínicos o preclínicos que determinarán uno o más agentes bacterianos estudiados en este trabajo de investigación y su incidencia sobre el cáncer de colon, así mismo se tomaron en cuenta solamente aquellos que establecen una asociación mecanística, diagnóstica o de prognosis entre los agentes Fusobacterium nucleatum, Streptococcus gallolyticus y Bacteroides fragilis. 11 Criterios de exclusión Se excluyeron duplicados de artículos, así como simposios y revisiones bibliográficas. Estudios publicados en formato carta o resumen fueron excluidos ya que no poseen suficientes datos para efectos de esta revisión. Inicialmente se recuperan 222 artículos a través de bases de datos electrónicas, los cuales comprenden 38 artículos de PubMed, 129 artículos de Google Scholar y 54 artículos de Web of Science. Después de eliminar duplicados, se seleccionan 158 artículos donde se excluyen 24 artículos en la primera lectura de título y resumen por no coincidir con los criterios de inclusión, de los 132 restantes se excluyeron 66 por no cumplir los criterios de inclusión, para finalmente analizar 68 artículos. El procedimiento de selección de estudios se ilustra en la Figura 1. 222 artículos recuperados de MEDLINE, Web of Science y Google Scholar. 64 artículos duplicados. 158 artículos para tamizaje 24 artículos excluidos después de tamizaje de título y resumen. 132 artículos seleccionados 66 artículos excluidos por no cumplir criterios de inclusión. 68 artículos analizados Fig 1. Diagrama de flujo de la selección de los artículos utilizada en la revisión sistemática. 12 1. Introducción Actualmente 40% de la población mundial muere a causa del cáncer y se espera que sea un 60% dentro de 15 años, alrededor de 13 millones de muertes para el 2030 (Kuipers et al., 2015). El cáncer colorrectar (CCR) es la tercera malignidad con mayor incidencia mundial seguido solo del cáncer de pulmón y el cáncer de mama; es el segundo más letal con un 9,2% de mortalidad, lo que equivale a 880 792 muertes anuales por esta patología, solo por debajo del cáncer de pulmón (WHO, 2018). Los factores ambientales y genéticos son la causa principal para la adquisición de un comportamiento neoplásico, esto gracias a la progresiva acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas que activan oncogenes e inactivan a genes supresores de tumores. El desarrollo neoplásico posee un comportamiento cíclico donde la pérdida de estabilidad genética en la célula acelera la acumulación de mutaciones derivando una mayor inestabilidad lo cual desencadena una serie de señales distintivos de las células tumorales y eventualmente en un carninoma (Kuipers et al., 2015). Las señales distintivas del cáncer o “hallmarks” por su nombre en inglés son una serie de características de las células tumorales, las cuales aumentan a medida que se conoce más de este fenómeno. Estos “hallmarks” permiten comprender mejor los mecanismos del desarrollo del cáncer, entre estas señales se encuentran: la capacidad de las células neoplásicas de evadir su destrucción por parte del sistema inmune, la evasión de genes supresores de tumores capaces de controlar la replicación de la célula; la inestabilidad del genoma debido a la inactivación de mecanismos de reparación del ADN, la inmortalidad replicativa acelerada, la desregulación energética, la promoción de un estado inflamatorio, la promoción de angiogénesis, la resistencia a la muerte celular y por último, la activación de la invasión llevando a la metástasis (Hanahan & Weinberg, 2011). Estas señales distintivas dan inicio a un grupo heterogéneo de desórdenes cada uno con una base genética policlonal de disrupción de las células madre/progenitoras, mediada por genes progenitores tumorales que evolucionan cada uno con sus características y complejidades particulares según el origen del mismo (Feinberg et al., 2006). La biología molecular de la carcinogénesis colorrectal se mapea con gran detalle y la mayoría de los CCR demuestran la acumulación de mutaciones y cambios epigenéticos de acuerdo con la secuencia adenoma-carcinoma con pérdida de la función de los genes supresores de tumores y ganancia de función en oncogenes (Raskov et al., 2017). 13 1.1 Características y diagnóstico del CCR El CCR surge de un cúmulo de células mutadas que se les denomina pólipo, comienza como una cripta aberrante, luego evoluciona hacia un adenoma temprano (<1 cm de tamaño), el adenoma progresa a un adenoma avanzado (> 1 cm de tamaño) hasta de convertirse finalmente en un carcinoma (Kuipers et al., 2013). La mayoría de los CCR se clasifican como adenocarcinomas (95%), estos comienzan en el epitelio de las glándulas mucosas que recubren el colon y el recto, el 5% restante comprende de cánceres como el carcinoides que surge de células neuroendocrinas, el cáncer de estroma gastrointestinal, linfomas y sarcomas (Marley & Nan, 2016). El diagnóstico de CCR se realiza en paciente con síntomas sugestivos como presencia de sangre en heces, dolor abdominal, cambio en los hábitos intestinales u otros menos específicos como fatiga o pérdida de peso; las técnicas utilizadas para el tamizaje del CCR son principalmente imagenológicas como endoscopías, seguido siempre de una colonoscopía y las respectivas biopsias realizadas de manera simultánea para su confirmación (Kuipers et al., 2015). Florence Bénard et al comparan todos los métodos de tamizaje que se utilizan a nivel mundial, en la mayoría de las guías prefieren la realización de pruebas en cascada según sea su complejidad y de los antecedentes del paciente, sugieren utilizar colonoscopía cada 10 años o una sigmodoscopía flexible cada 5 años y el test de sangre oculta en heces preferiblemente el test inmunoquímico anual o bianual (Bénard et al., 2018). El tiempo de inicio óptimo para el tamizaje se realiza según la recomendación del médico, sin embargo, existe un consenso en que la edad apropiada para iniciar el tamizaje es en personas con más de 50 años (Bénard et al., 2018). Una alternativa de diagnóstico atractiva no invasiva para los pacientes y médicos, son los biomarcadores moleculares, estos consisten en detectar ADN, ARN o proteínas de las células neoplásicas circulantes, idealmente deben ser marcadores genéticos altamente discriminatorios entre el cáncer y los adenomas avanzados de otras lesiones, ser liberado continuamente en la luz intestinal o en la circulación y desaparecer o reducirse después de que la lesión se elimine o se trate (Kuipers et al., 2013). Sin embargo, aún se necesitan grandes ensayos prospectivos para demostrar la sensibilidad y especificidad de estos biomarcadores sanguíneos en el manejo de CCR (Yörüker, et al., 2016) 14 Tanto la extirpación endoscópica de adenomas como el tratamiento del cáncer en etapa temprana tienen un profundo impacto en la mortalidad por CCR, en el National Polyp Study de EE.UU después de 20 años de seguimiento la mortalidad específica por CCR fue aproximadamente un 50% menor entre los sujetos que en el momento basal se habían sometido a la extirpación endoscópica de adenomas e incluso hasta un 90% en un seguimiento de 5 años para pacientes con cáncer en etapa temprana, pero solo un 10% para pacientes diagnosticados con enfermedad metastásica en etapa avanzada (Zauber et al., 2012). El CCR es la malignidad estrella para la creación de tamizajes dado que posee alta incidencia mundial, posee una etapa pre-clínica prolongada, precede de un adenoma colorrectal el cual en individuos sin rasgos hereditarios puede tardar de 5 a 10 años en convertirse en cáncer. Estos precursores primarios son detectables y tratables a diferencia de otros precursores de cánceres como el del pulmón o mama (Kuipers et al., 2015). 1.2 El CCR y su relación con la microbiota El cáncer de colon se ha relacionado con agentes bacterianos que promueven su crecimiento de diversas maneras. Existen cerca de 3.5 - 4x1013 microorganismos que viven en el tracto gastrointestinal, incluso se ha postulado que el colon es el ecosistema microbiano más denso del planeta (Raskov et al., 2017). Se ha estimado que alrededor de un 20% de las neoplasias están ligadas a agentes infecciosos, principalmente aquellos tejidos que están expuestos a gran cantidad de microbiota (Tjalsma et al., 2012). Dado que las perturbaciones de la microbiota pueden cambiar efectivamente el curso de la carcinogénesis directa e indirectamente, ya que las acciones microbianas parecen afectar tanto las alteraciones genéticas como epigenéticas que promueven la displasia, la expansión clonal, el crecimiento tumoral y el cáncer invasivo (Raskov et al., 2017). Durante la eubiosis, la interacción entre las bacterias comensales y las células inmunes constituyen un delicado equilibrio de genes proinflamatorios y protooncogenes en un lado y genes antiinflamatorios y genes supresores de tumores en el otro lado (Raskov et al., 2017). En la disbiosis ese equilibrio desaparece y la microbiota potencia la carcinogénesis. Para explicar esto se ha propuesto el modelo conductor-pasajero, el cual describe la existencia de ciertas bacterias en la microbiota que poseen rasgos especiales de virulencia creando daño en el ADN e impulsan la inestabilidad genómica y dan inicio al CCR (conductores). Posteriormente, la tumorogénesis induce alteraciones intestinales del nicho que promueve el crecimiento de bacterias comensales (pasajeras) 15 con propiedades promotoras o supresoras de tumores como Streptocococcus, Klebsiella y Proteus que desplazan a los conductores (Raskov et al., 2017; Sears & Pardoll, 2011; Tjalsma et al., 2012). Durante la invasión bacteriana, los pasajeros no desempeñan ningún papel activo, están excluidos de la red de comunicación y no se ven afectados por la detección de quórum, pero pueden activarse en una etapa posterior y causar disbiosis, aumentar la permeabilidad, translocarse a través de la mucosa intestinal y con sus toxinas causar inflamación crónica y contribuir a la carcinogénesis (Raskov et al., 2017; Sears & Pardoll, 2011; Tjalsma et al., 2012). El modelo “conductor-pasajero” está muy relacionado con la teoría del patógeno clave (o microorganismo-α) propuesta por Sears y Pardoll, que sugiere que algunas bacterias, aunque están en menor abundancia, son directamente prooncogénicos y tiene la capacidad de remodelar la respuesta inmune de la mucosa y la comunidad bacteriana del colon para promover aún más el cáncer, lo que provoca un cambio en el microambiente debido al crecimiento del tumor y en consecuencia los microorganismos-α son gradualmente superados por los comensales, ambos agentes con un rol temporal e independiente (Raskov et al., 2017; Sears & Pardoll, 2011; Tjalsma et al., 2012). Entre las bacterias conductoras están las que producen componentes que dañan el ADN, por ejemplo Enterococcus fecalis que produce superóxido de forma extracelular, el cual se transforma en peróxido de hidrógeno que causa daño al ADN de las células del colon, Escherichia coli productora de una genotoxina llamada colibactina que forma alquilatos de ADN resultando en aductos de ADN (daño potencialmente mutagénico) en el epitelio colónico (Tjalsma et al., 2012). Otra bacteria conductora puede ser Bacteroides fragilis enterotoxigénico, la cual se ha encontrado formando biopelículas en los CCR humanos y en las lesiones precancerosas, esta bacteria produce una toxina llamada fragilisina, la cual es una metaloproteinasa que ejerce su efecto proteolítico sobre la E-caderina de las células tumorales del epitelio intestinal y con esto causa la proliferación y la permeabilización de la barrera intestinal. Adicionalmente, en modelos murinos se ha encontrado que esta toxina induce la carcinogénesis al incrementar los niveles de interleucina 17 (IL-17) por medio de los linfocitos T cooperadores de la lámina propia, la cual recluta polimorfonucleares cuya explosión respiratoria puede causar daño al ADN e inestabilidad genética a las células humanas (Tjalsma et al., 2012). Con un mecanismo similar son reconocidas como conductoras del CCR bacterias de la familia Enterobacteriaceae causantes de enfermedad diarreica como Shigella sp, Citrobacter sp y Samonella 16 sp, esta idea se ve reforzada por el hecho de que las enterobacterias potencialmente patógenas son raras en el intestino humano sano, mientras que están sobrerrepresentadas en muestras de mucosa colónica de pacientes con adenomas, por lo tanto se han relacionado a etapas tempranas, como conductores que luego desaparecen del tejido canceroso a medida que progresa la enfermedad (Tjalsma et al., 2012). F. nucleatum también se ha reconocido como conductor ya que promueve la proliferación de las células cancerígenas y experimentos en ratones han permitido ver su efecto en el incremento del tamaño del tumor, esto se debe a que esta bacteria posee una adhesina, llamada FadA que se une a la E-cadherina en la superficie de las células de CCR y activa la vía de señalización oncogénica Wnt/β- cadherina. Asimismo F. nucleatum altera la infiltración al tumor de linfocitos y células natural killer (NK), al inhibir al receptor de células inmunes TIGIT a través de otra adhesina Fab2, esta última también se une al azúcar, galactosa N-acetil-D-galactosamina, que se expresa en altos niveles en la superficie de muchas células tumorales de distintos tumores y otros tipos de células (Wu et al., 2019). La alteración inducida por F. nucleatum va más allá de la carcinogénesis ya que también afecta la quimiorresistencia ya que se ha visto en modelos preclínicos los tumores de CCR con altas cargas de esta bacteria estos tumores son más resistentes para los tratamientos comúnmente utilizados como oxalipatina. En una posible explicación de lo anterior es que F. nucleatum activa la autofagia a través de receptores tipo Toll-like 4 expresados en las células del CCR lo cual provoca una mayor resistencia a la muerte inducida por oxalipatina (Wu et al., 2019). Por otro lado las bacterias pasajeras son pobres colonizadoras de la microbiota intestinal sana pero una ventaja en el microambiente tumoral les permite ser buenos colonizadores de tumores (Kwong et al., 2018). Tal es el caso de Streptococcus del grupo bovis específicamente S. gallolyticus subsp gallolyticus se ha asociado por medio de meta-análisis con el cáncer de colon (Kwong et al., 2018). En tamizajes realizados en personas con adenomas se ha detectado que en alrededor de un 43% poseen S. gallolyticus subsp gallolyticus como parte de su microbiota intestinal y un 18% de estos desarrolla carcinomas, porcentajes altos en comparación con las personas que no poseen esta bacteria (Tjalsma et al., 2012). Incluso se ha realizado estudios retrospectivos con donadores de sangre, los cuales han tenido bacteriemias asintomáticas por S. gallolyticus con una fuerte asociación con lesiones colónicas (Lee et al., 2013). 17 Asimismo, otros agentes se han asociado al modelo conductor-pasajero, con un mayor riesgo relativo de tener cáncer de colon, son Clostridium septicum, C. perfringens, Gemella morbillorum y especies de Peptostreptococcus, (Kwong et al., 2018). Sin embargo, existe mayor evidencia de la relación del CCR con las especies F. nucleatum, S. gallolyticus y a la toxina de Bacteroides fragilis por lo que este estudio se limitará a buscar artículos originales que determinen o descarten una asociación epidemiológica y un mecanismo de acción en relación con la patología anteriormente mencionada con el fin de determinar su utilidad clínica. 18 2. Fusobacterium nucleatum En el presente trabajo para la revisión sobre Fusobacterium nucleatum se utilizaron 43 artículos, de los cuales 17 investigaban una asociación epidemiológica, 8 establecían un mecanismo de acción bacteriana sobre la célula tumoral en conjunto con una pequeña una asociación epidemiológica previa y 3 artículos determinaban la factibilidad de una posible aplicación serológica para el diagnóstico de CCR utilizando la infección por F. nucleatum. 2.1 Asociación epidemiológica de F. nucleatum y CCR Es importante tener en cuenta que cualquier impacto de la infección por F. nucleatum en el desarrollo de adenoma y la progresión a lesiones más neoplásicas es considerable, ya que el 95% de todos los cánceres surgen de adenomas, pero solo un pequeño número de adenomas se vuelve canceroso (Flanagan et al., 2014). Fusobacterium se ha descrito principalmente como patógeno de la cavidad oral e intestinal ya que se encuentra comúnmente como parte de ambas microbiotas, por esto se ha planteado la hipótesis de que su invasión al microbiota intestinal podría causar o contribuir a la tumorogénesis (Warren et al., 2013; Zeller et al., 2014). Al comparar muestras de tejido colónico tumoral y tejido adyacente no neoplásico, se ha visto que existe una diferencia significativa entre la cantidad de F. nucleatum en el tejido tumoral y el tejido sano, esto tomando poblaciones con distintas características ambientales, la asociación epidemiológica es clara y sistemática, principalmente en la carga de ARN bacteriano, se ha encontrado hasta 415 veces mayor que en tejido colónico sano, ver cuadro I (Castellarin et al., 2012; Kostic et al., 2012; Li et al., 2016; Mima et al., 2015; Zhou et al., 2016). 19 Cuadro I. Principales estudios de asociación epidemiológica entre el CCR y F. nucleatum. Tejido sano Adenoma CCR adyacente Referencia Región Tipo de muestra* N Total* Alta carga Alta carga Alta carga Técnica utilizada Fn** Fn** Fn** (%) n (%) n (%) n Kostic et al., Tejido WGS*** y qPCR de España 95 30% 29 NA NA 65% 62 2012 Tumoral/Sano Applied Biosystems Castellarin et Tejido Secuenciación Canadá 99 21% 21 NA NA 60% 60 al., 2012 Tumoral/Sano Illumina de ARN Mima et al., Estados Tejido N control: 558 qPCR de Applied 3.4% 19 NA NA 13% 76 2015 Unidos Tumoral/Sano N CCR: 598 Biosystems Tejido Li et al., 2016 China 101 10% 11 NA NA 87.1% 88 FQ-PCR Tumoral/Sano Chen et al., Tejido China 98 37.7% 37 NA NA 62.2% 61 FISH 2017 Tumoral/Sano N control: 65 Eklöf et al., Suecia Heces N adenoma: 134 24.3% 15 20.1% 27 69.2% 27 qPCR de Qiagen 2017 N CCR 39: N control: 231 Amitay et al., PCR Multiplex de Alemania Heces N adenoma: 170 25.1% 58 31.2% 53 54.3% 25 2017 Qiagen N CCR: 46 20 qPCR de Applied Tejido N control: 22 18% 4 18% 5 60% 15 Tunsjø et al., Biosystems Noruega N adenoma: 25 2019 Secuenciación Heces N CCR: 25 0% 0 0% 0 35% 9 MiSeq Illumina Can Guven et N normal: 77 qPCR de Applied Turquía Saliva 96.1% 74 NA NA 97.2% 69 al., 2019**** N CCR: 71 Biosystems qPCR: PCR cuantitativa. FQ-PCR: PCR con fluorescencia cuantitativa. NA: No aplica debido a que no se realizaron estudios comparativos entre este grupo. Fn: Fusobacterium nucleatum * En tejido: Diferencia significativa con el método de 2−ΔΔCt, donde los niveles de F. nucleatum y la toxina de E. coli fueron relacionados con los niveles de ß-globina humana: ΔCt = CtFn/E.coli − Ctβ-globin. En saliva: A pesar de los resultados similares fue mayor en las muestras de saliva de los pacientes comparado con los de los controles la carga (6.89 ± 1.07 vs 6.35 ± 0.78 log10 copias/mL, p = 0.001). En heces: En 69% (9/13) de los pacientes con cáncer analizados con resultados positivos por F. nucleatum en las biopsias de tumor, se identificaron con altos niveles en sus heces. **Los niveles de F. nucleatum en cada muestra está dado por una cuantificación relativa del ADN microbiano por medio del ARNr 16s en cada muestra de referencia 2^(-ΔCq), ΔCq = CqF. nucleatum - Cq16s gen ARNr , el punto de corte fue de 12. *** Secuenciación del genoma completo (WGS, por sus siglas en ingles), realiza un análisis de abundacia relativa con un análisis discriminante lineal (LDA) que realiza un análisis no parametrico llamado Wilcoxon que evalua el tamaño de cada taxón diferencialmente abundante **** Los conteos totales del estudio fueron similares entre los pacientes y el grupo control (p = 0,549) la media de carga bacteriana de F. nucleatum fue mayor en la saliva de los pacientes comparado con el grupo control (6.89 ± 1.07 vs 6.35 ± 0.78 log10 copias/mL, p = 0.001). 21 El cuadro I realiza una síntesis de las asociaciones encontradas, la correlación de alta carga de F. nucleatum con CCR se observa de manera reiterativa desde el 2012 en múltiples países. Es importante recalcar que se ha encontrado más de una especie dominante de Fusobacterium, entre ellas F. nucleatum, F. necrophorum, F. mortiferum, y F. perfoetens, en algunos casos se encontró que el 89% del microbiota total eran bacterias relacionadas a este género (Kostic et al., 2012). No se han observado diferencias significativas entre la presencia de F. nucleatum y su progresión de displasia epitelial, a los diferentes tipos de adenomas, de tubular a tubulovillosos para llegar a alto grado de displasia, no obstante se ha observado diferencias significativas en comparaciones del epitelio cancerígeno y el adenoma de alto grado de displasia, esto nos indica que podría existir un aumento de esta bacteria según la progresión del adenoma pero que se hace significativo cuando se encuentra cerca del estado cancerígeno (Flanagan et al., 2014). Si se ha encontrado una asociación positiva de la bacteria con los tumores de pobre diferenciación y con la presencia de metástasis en los nódulos linfáticos (Li et al., 2016; Chen et al., 2017). Aunque no se describen diferencias significativas con adenoma temprano o avanzado, estos hallazgos posicionan a F. nucleatum como un agente pasajero que se promueve por el ambiente tumoral y se posiciona su rol carcinogénico en etapas tardías de la malignidad (Eklöf et al., 2017; Amitay et al., 2017; Tunsjø et al., 2019). 22 2.2 Fusobacterium nucleatum y su utilidad clínica relacionada al CCR Debido a esta asociación entre la presencia de F. nucleatum y CCR, varios estudios determinan alternativas al tejido para la cuantificación de la bacteria según la presencia o ausencia del CCR, Zeller et al estudiaron la microbiota fecal para detectar el CCR y encontraron que efectivamente miembros del filo de Fusobacterias y en menor proporción Proteobacterias se encontraron en números significativamente incrementados en pacientes enfermos, en menor medida en comparación con las muestras de tejido pero con una diferencia significativa contra los pacientes sanos, lo que sugiere un efecto de dilución (Zeller et al., 2014). Los estudios en muestras fecales poseen múltiples ventajas, como la facilidad de recolección de la muestra, es representativa de todo el colon, es una muestra no invasiva sin riesgos de complicaciones al paciente y requiere mínima preparación previa del paciente, sin embargo, también posee ciertas limitaciones ya que la microbiota puede verse afectada por el uso de antibióticos (Eklöf et al., 2017). La saliva también es una muestra fácil de tomar, transportar y almacenar, su microbiota se considera más estable en el tiempo lo cual brinda la posibilidad de evaluar efectos a largo plazo; en el estudio de Can Guven et al se encontró F. nucleatum y S. gallolyticus en pacientes y controles, la carga bacteriana en saliva fue significativamente mayor en pacientes versus el grupo control por lo que podría ser una herramienta efectiva en la determinación de F. nucleatum (Can Guven et al., 2019). Así mismo, se han establecido marcadores microbianos para el diagnóstico de CCR, como clbA, marcador genético encontrado en Eschericha coli de la microbiota intestinal que indica la presencia de la isla de patogenicidad de pks y la producción de colibactina (genotoxina capaz de inducir rupturas en el ADN de doble banda e inducir senescencia celular); que junto con F. nucleatum pueden predecir el CCR, con una especificidad del 63,1% y una sensibilidad del 84,6%; además si se realiza junto con la prueba inmunoquímica de F-Hb la sensibilidad aumenta ligeramente (89.7%), al mismo tiempo que la especificidad (61.0%) disminuye ligeramente (Eklöf et al., 2017). Por lo que F. nucleatum aportaría como un marcador en el tamizaje inicial que permitiría seleccionar mejor a los pacientes sospechosos y realizar en menor medida colonoscopías las cuales tienen un riesgo asociado. Por otro lado, se han explorado alternativas serológicas con F. nucleatum para el diagnóstico del CCR, la infección por F. nucleatum provoca un aumento en el título de anticuerpos tipo IgA en 23 pacientes con CCR. El suero con estos anticuerpos en combinación con marcadores tumorales como CEA y CA19-9 aumenta la sensibilidad de detección temprana de CCR (Wang et al., 2016). Así mismo, la proteína Fap2 de F. nucleatum, proteína de la membrana externa que conforma un sistema de secreción tipo Va, reconocida por inducir apoptosis en linfocitos e inhibir la actividad de los linfocitos NK contra células tumorales, se ha evaluado como epitopo inmunogénico, mostrando reactividad contra sueros en pacientes con CCR (Guevarra et al., 2018). Sin embargo, en el 2019 Butt et al ha evaluado 11 diferentes antígenos para evaluar el riesgo de producir CCR en pacientes sanos. Evaluando las respuestas de anticuerpos en muestras pre- diagnosticas obtenidas de casos de CCR (media entre la toma de la muestra y el diagnóstico, 3.4 años) y controles pareados, la seroprevalencia de cada antígeno individualmente rondó entre 3 y 10% en el grupo control y no se identificó aumento entre los casos de CRC (2-11%), por lo tanto no se determinó una asociación positiva entre anticuerpos contra estos 11 antígenos, incluyendo Fap2, y el riesgo de padecer CCR, por lo tanto se ha dejado de lado el desarrollo de pruebas de diagnóstico serológico de CCR utilizando F. nucleatum (Butt et al., 2019). La mayor utilidad clínica de F. nucleatum se ha encontrado en su uso como predictor de severidad, se han realizado diversos estudios con un seguimiento de hasta 12 años (Cuadro II), se han determinado diferencias en la sobrevida de pacientes sin F. nucleatum en el tejido tumoral o bajas cargas en comparación con aquellos que tenían altas cargas (Flanagan et al., 2014; Kunzmann et al., 2019). Los pacientes con cáncer de estadío tardío (III/IV) han sido significativamente asociados con altos niveles de colonización por Fusobacterium y B. fragilis enterotoxigénico (BFET) (Flanagan et al., 2014). Igualmente se ha determinado menor sobrevida en pacientes metastásicos con diferencias significativamente mayores de F. nucleatum que aquellos con metástasis pero con menor o nula colonización de esta bacteria (Bullman et al., 2017; D.-W. Lee et al., 2018; Li et al., 2016; Sun et al., 2016). Yamaoka et al proponen a F. nucleatum como un marcador pronóstico, determinando así un punto de corte de 4.9 copias ADN/ng de F. nucleatum. con una sensibilidad 90.9% y especificidad de 88.9% en pacientes en estadío IV del CCR. Por lo que se ha sugerido a F. nucleatum para determinar un subtipo de CCR más agresivo y de peor pronóstico (de Carvalho et al., 2019; Yamaoka et al., 2018). 24 En Estados Unidos se han realizado dos estudios cohortes llamados The Nurses Health Study y el Health Professional Follow-up Study en donde cada dos años se enviaban cuestionarios a los participantes y estudian sus respectivas biopsias para un total de 1069 casos de carcinoma diagnosticados del 2008 en adelante. De las 578 muertes, incluidas 375 específicas del CCR con una media de seguimiento de 10,7 años, detectaron mediante un modelo de regresión una asociación de la carga de ADN de F. nucleatum con mayor mortalidad especifica por CCR comparado con los casos F. nucleatum negativos o con baja carga (Mima et al., 2017). En el Cuadro II se realiza una síntesis de los estudios donde evalúan la utilización de F. nucleatum como marcador pronóstico, en todos se han encontrado diferencias significativas con una menor sobrevida en los pacientes con altas cargas de esta bacteria, por lo tanto, se considera que este es el punto donde mayor aporte clínico hace el uso de F. nucleatum, más allá de su uso en el diagnóstico o en la determinación de riesgo de CCR. 25 Cuadro II. Asociación de la infección por F. nucleatum y la sobrevida de los pacientes con CCR en los principales artículos encontrados del periodo 2009-2019. Tipo de N total de Años de Porcentaje de supervivencia Valor Referencia Región muestra participantes seguimiento Alta carga* de Fn Baja/nula carga de Fn de p** 40% Flanagan et República Tejido 32 3 Promedio de sobrevida: 24 100% 0,008 al., 2014 Checa meses Tejido de 20% 40% Lee et al., Corea CCR 93 5 Promedio de sobrevida: Promedio de 0,042 2018 metastásico 26,4meses sobrevida: 30,7 meses Tejido de 0% Yamaoka et Japón CCR estadío 100 12 Promedio de sobrevida: 24 80% 0,0415 al., 2018 IV meses Carvalho et Brasil Tejido 152 5 63.5% 76.5% 0,037 al., 2019 Kunzmann et República Tejido 190 2.34 35% 43% 0,040 al., 2019 Checa Sun et al., 23% 42% China 2019 Tejido 118 5 Promedio de sobrevida: Promedio de sobrevida: 0,027 32,7 meses 39,5 meses Fn: Fusobacterium nucleatum *Alta carga de Fn: >4.9 ADN copias/ng; Baja carga de Fn <4.9 ADN copias/ng. ** Valor de p para una significancia estadística de 0,05. 26 2.3 Mecanismo de acción de F. nucleatum sobre las células intestinales 2.3.1 Relación bacteriana de F. nucleatum con la célula tumoral F. nucleatum tiene distintos mecanismos de unión celular por medio de los cuales activa cascadas en la célula intestinal i) mediante Fap2, proteína en la superficie bacteriana, la cual reconoce a la lectina Gal-GalNAC sobreexpresada en las células de CCR, ii) con la unión de FadA, una adhesina expresada en la superficie bacteriana, a E-cadherina y iii) por medio de la activación de β-catenina a través del LPS de la bacteria (Abed et al., 2016; Chen et al., 2017; Rubinstein et al., 2013). El primero Fap2 media la unión especifica con el epitelio del adenocarcinoma mediante la lectina Gal-GalNAC, la cual se ve sobreexpresada en altos niveles en las células de CCR (Abed et al., 2016). La unión de Fap2 a la lectina favorece la de FadA a la E-cadherina presente en el enterocito, esto suficiente para activar la vía de Wnt y oncogenes lo cual promueve el crecimiento del tumor; la invasión bacteriana no se requiere, sin embargo, es esencial para producir la inducción de la inflamación característico del ambiente tumoral. (Rubinstein et al., 2013). Dado el hecho de que FadA media en la unión de F. nucleatum a células tanto de CCR como tejido sano, no es sorprendente que esta bacteria pueda colonizar gran cantidad de sitios distintos en el colón. La colonización elevada de F. nucleatum en los tejidos normales puede predisponer al hospedero al desarrollo de adenomas y/o adenocarcinoma, y acelerar la carcinogénesis cuando ocurre una mutación (Rubinstein et al., 2013). Sin embargo, si se ha descrito un estímulo selectivo de crecimiento de F. nucleatum hacia las células cancerígenas colorrectales mediante la activación de Anexina A1 seguido de la formación del complejo FadA+E-cadherina+ Anexina A1+β-catenina. (Rubinstein et al., 2019). Es importante tomar en cuenta que la Anexina A1 es una proteína de unión a fosfolípidos dependientes de Ca+2 la cual se encuentra en núcleo, citoplasma y la membrana plasmática de una variedad de células y la E-cadherina, α-catenina y β-catenina son una gran familia de glicoproteínas de adhesión, ampliamente distribuidas en células humanas tanto tumorales como no tumorales, en células sanas son encargadas de la restringir la movilidad celular por medio de una cola citoplasmática de la E-cadherina adherida a α-catenina y al citoesqueleto de actina e interactuando con β-catenina forman un complejo de interacciones entre células así como receptores importantes en las vías celulares. (Rubinstein et al., 2019). 27 La unión de FadA con Anexina A1, modula de la vía Wnt/β-catenina y un estimulador de crecimiento del CCR, cuya expresión se incrementa en células tumorales en proliferación, pero no en células no neoplásicas, esto establece una retroalimentación positiva en el que F. nucleatum induce la expresión de Anexina A1 y a su vez mejora la unión bacteriana a este tipo de célula (Rubinstein et al., 2019). Así mismo, el complejo FadA+E-cadherina+ Anexina A1+β-catenina activa la vía Wnt/β-catenina al fosforilarse E-cadherina en la membrana, seguidamente se internaliza y se disocia de β-catenina, esta última se acumula en el citoplasma y se transloca al núcleo, resultando en la activación de la transcripción regulada por β-catenina, lo cual provoca un aumento en la expresión del factor de células T, NF-kB, oncogenes Myc y ciclina D1 propiciando un efecto en la proliferación de las células epiteliales (Rubinstein et al., 2013). Por otro lado, la vía canónica de señalización de Wnt/β-catenina, en la cual β-catenina regula negativamente la expresión de E-cadherina e induce la transición epitelial mesenquimal (TEM), el cual es un importante proceso biológico para que el tumor con células epiteliales polarizadas adquiera el fenotipo de célula mesenquimal. En CCR se da la perdida de las E-cadherinas epiteliales, hasta en un 75% con respecto a las células no tumorales, lo cual se traducen clínicamente en mayor probabilidad de migración celular y aumento en el riesgo de metástasis (Ma et al., 2018). Ver Figura 2 como ilustración de la interacción de la bacteria con el enterocito. Fig 2. Mecanismo de acción de Fusobacterium nucleatum sobre el enterocito. Elaboración propia Así mismo, se ha asociado a F. nucleatum con la inducción de mutaciones que inactivan el gen apc (Adenomatous polyposis coli), el cual es un gen supresor tumoral que codifica para una proteína de gran tamaño con numerosos dominios y diferentes sitios de interacción con otras proteínas, la 28 mutación en esta proteína es el evento más tempranamente identificado relacionado con el cáncer de colon. La inactivación de la proteína de apc puede contribuir al desarrollo de defectos de barrera epiteliales, que presentan la pérdida de uniones estrechas, contactos entre células, polaridad epitelial y la capa de moco (Kostic et al., 2013). 2.3.2 Relación bacteriana de F. nucleatum con el sistema inmune Aunque aún hay mucho que dilucidar en el mecanismo subyacente de F. nucleatum en la carcinogénesis colorrectal. La evidencia indica un vínculo complejo entre el microbioma intestinal, la inmunidad y la tumorogénesis intestinal. Este vinculo con la inmunidad inicia con uno de los componentes característicos de las bacterias Gram Negativas, el Lipopolisacarido (LPS) se ha observado un aumento de procesos proinflamatorios y de patogenicidad, dado principalmente por un aumento en la expresión del LPS asociado a tumores con altas cantidades de bacterias Gram Negativas como F. nucleatum o B. fragilis (Zeller et al., 2014). El LPS de F. nucleatum, activa a β-catenina, la cual estimula la respuesta inmune por medio del receptor tipo Toll 4 (TLR4) presente tanto en granulocitos como en células de CCR. Estudios en ratones han demostrado que altos niveles del TLR4 induce colitis asociada a tumor, mientras que los ratones TLR4 knock-out se ven protegidos contra la enfermedad (Chen et al., 2017). Otro de los mecanismos en que F. nucleatum puede estar relacionada con la inducción de células cancerígenas es mediante la expansión selectiva de las células del sistema inmune derivadas de la línea mieloide. En un estudio en ratones realizado por Kostic y et al se observó un aumento en las células infiltrantes de la línea mieloide en los tumores de ratones tratados con F. nucleatum; ellos observaron que las células mieloides CD11b+ (marcador de la línea mieloide) aumentan (número de células promedio 4.03% más alta) en los tumores de ratones ApcMin/+ alimentados con F. nucleatum en comparación con los controles; mientras que el número de linfocitos T CD3+ CD4+ y CD3+ CD8+ no fueron significativamente diferentes (Kostic et al., 2013). F. nucleatum es una bacteria anaerobia asacarolítica por lo tanto utiliza aminoácidos y péptidos provenientes del microambiente tumoral incluida la formil-metionil-leucil-fenilalanina y los ácidos grasos de cadena corta que son quimioatrayentes de la línea mieloide. Este fenómeno podría explicar que exista una retroalimentación positiva en el crecimiento de bacteriano y expansión de estas células inmunes intratumoralmente (Kostic et al., 2013). 29 Dado que las líneas de los Monocitos y Granulocitos ejercen una supresión en las células T CD4+ gracias a la expresión de Arginasa-1 y iNOS. Las células T están implicadas en la respuesta inmune antitumoral, altos niveles de células T están asociados con mejor sobrevida del paciente por el contrario menor densidad de las células CD4+ lleva a la progresión tumoral y a metástasis, modulando así el microambiente inmunitario del tumor. F. nucleatum (Kostic et al., 2013; Mima et al., 2015). Así mismo, se ha demostrado que la proteína Fap2 de F. nucleatum se acopla a TIGIT, un receptor inmune inhibitorio presente en algunos linfocitos T y células NK, lo cual interfiere con la respuesta inmune contra F. nucleatum, es decir, la proteína Fap2 puede proteger a los tumores colonizados con F. nucleatum de la respuesta inmune del hospedero, lo cual es uno de los hallmarks del cáncer, la evasión inmune (Gur et al., 2015). Fig 3. Fisiopatología de Fusobacterium nucleatum sobre las del epitelio colorrectal, sobre el cuál induce la carcinogénesis. Elaboración propia 30 2.4 Asociación biológica entre F. nucleatum y el pronóstico de los pacientes con CCR. En general se ha encontrado que la asociación con el grado de severidad de los tumores colonizados con F. nucleatum se explica gracias a la asociación con características clínicas y moleculares clave del CCR: ubicación proximal del tumor, mayor profundidad de invasión, etapas clínicas más altas, tumores poco diferenciados, estado positivo para inestabilidad microsatelital (IMS), tumores mutados por el gen braf (oncogén) y la pérdida de proteínas de reparación de ADN (de Carvalho et al., 2019; Sun, et al, 2016). El mecanismo biológico para la asociación entre F. nucleatum y la supervivencia del paciente no se ha dilucidado completamente, sin embargo se sabe que esta bacteria persiste por mayor tiempo en las células cancerosas de lesiones metastásicas del CCR y se ha visto que los tumores positivos por cultivo de Fusobacterium resultan en xenoinjertos más exitosos en ratones (Kunzmann et al., 2019). Adicionalmente el uso de antibióticos en estos animales ha demostrado una disminución de los niveles de F. nucleatum así como una empobrecimiento del crecimiento del tumor, lo cual sugiere una asociación de esta bacteria con enfermedades de estadíos más avanzados y más severos (Kunzmann et al., 2019). Se ha descrito un aumento de inflamación intestinal y quimiorresistencia a tratamientos quimioterapéuticos como 5-fluorouraci mediada por F. nucleatum, a través de la señalización inmune y la activación de la autofagia (Bullman et al., 2017). Dado que F. nucleatum puede invadir las células tumorales podría llevar a exacerbar la respuesta inflamatoria y oncogénica vinculadas a la progresión tumoral del CCR (Kostic et al., 2013; Zhang et al., 2019). Los modelos utilizados para la determinación del mecanismo de acción se basan en el uso de animales y cultivos celulares y aún no ha sido demostrado en humanos por lo que F. nucleatum podría no afectar directamente la gravedad de la enfermedad del CCR, sino simplemente prosperar en el microambiente tumoral cada vez más hostil de tumores agresivos que estén asociados con un peor pronóstico (Kostic et al., 2013). 31 3. Streptococcus gallolyticus De la búsqueda de literatura sobre Streptococcus gallolyticus (S. gallolyticus) se seleccionaron 13 artículos que cumplían los criterios de inclusión, 3 establecían una asociación epidemiológica, 3 determinaban el mecanismo de acción de la bacteria en el entorno tumoral, uno mostraba tanto asociación epidemiológica como mecanística sobre la célula intestinal y 6 mostraron evidencia serológica que asocia a esta bacteria con el CCR. S. gallolyticus se ha asociado desde 1951 con CCR por medio de bacteriemias y endocarditis, en la mayoría de los casos de manera incidental (Lee et al., 2013). Gracias a la capacidad de translocación bacteriana de S. gallolyticus y su capacidad de producir sepsis, se ha estudiado la posible asociación entre el diagnóstico de CCR (Butt et al., 2017). 3.1 Asociación epidemiológica entre S. gallolyticus y el CCR. En el 94% de las bacteriemias de S. gallolyticus asociadas a CCR se ha determinado a S. gallolyticus subspecie gallolyticus, anteriormente denominado como S. bovis biotipo I, mientras que solo un 18% se ha asociado a S. gallolyticus subspecie pasterianus y S. gallolyticus subspecie macedonicus (S. bovis biotipo II) (Abdulamir et al., 2010). Corredoira-Sánchez et al realizaron un análisis de todas las bacteriemias por S. gallolyticus durante el período 1988-2011 con un total de 109 casos, de estos a 98 pacientes se les realizó la colonoscopía detectando neoplasia colorreactal en 69 casos (70%) de estos: 19% adenomas no avanzados; 39% adenoma avanzado y 12% adenocarcinoma, sin embargo, solo en 4 casos habían sospechado de neoplasia antes del hemocultivo, lo que sugiere un probabilidad aumentada de la presencia de CCR al detectar esta bacteria en sangre (Corredoira-Sanchez et al., 2012). La prevalencia de neoplasias colorrectal es mayor significativamente en pacientes con bacteriemia de S. gallolyticus contra el grupo control (pacientes sin bacteriemia con factores de riesgo de CCR) (70% vrs 32%; p=0.001). Esta diferencia no es significativa al comparar pacientes con bacteriemia y adenomas no avanzados versus el grupo control (19% frente a 12%), pero si en los casos con adenomas avanzados (40% frente a 16%; p=0.001) y carcinomas invasivos (12% vs 5%; p=0.001) (Corredoira-Sanchez et al., 2012). 32 Otros estudios como el Abdulamir et al no han encontrado diferencias significativas entre la prevalencia de S. gallolyticus en heces en pacientes con CCR con y sin bacteriemia pero sí comparándolo con el grupo control (rango normal 2.5% a 15%) 02/03/2021 2:21:00. Así mismo, se ha descrito una prevalencia en heces de S. gallolyticus, Andres-Franch et al de 3.2% en una muestra de pacientes aleatorizada, sin embargo, se logró asociar que los pacientes positivos tenían cáncer colorrectal en estadío II y III (Al-Jashamy et al., 2010; Andres-Franch et al., 2017). Ver cuadro III. Por otro lado, se ha hipotetizado que el estadío del cáncer lleva a la colonización de la bacteria o esta puede dirigir el adenoma a un estado más avanzado, es por esto que se ha recomendado la detección molecular de S. gallolyticus subsp gallolyticus en el tejido del colon como un método complementario para evaluar su presencia en pacientes con CCR (Boleij & Tjalsma, 2013). La respuesta inmune a las infecciones subclínicas de esta bacteria podría ayudar en la detección temprana del CCR, sin embargo la precisión ha sido inferior a los estándares de detección temprana (Boleij & Tjalsma, 2013). Es por esto que hacen falta estudios cohortes con muestras más grandes que logren determinar la prevalencia de S. gallolyticus y su asociación con el cáncer colorrectal. De igual manera, existe poca información que determine diferencias significativas entre la cantidad de S. gallolyticus y características como tipo de tejido (normal o tumoral), localización del tumor, estadío del tumor, vías relacionadas con la carcinogénesis; la única característica en la cual se ha demostrado diferencia significativa en los pacientes con infección por S. gallolyticus y CCR contra los pacientes sanos es la infección conjunta de Virus de Epstein Barr detectado en 52.4% de los casos (Andres-Franch et al., 2017). 33 Cuadro III. Estudios de prevalencia de Streptococcus gallolyticus en pacientes con CCR y el grupo control en el periodo 2009 al 2019. Grupo CCR c/bac CCR s/bac control positvo por Sg positvo por Sg (n) Referencias Región Muestra No No Tumoral Tumoral tumoral N tumoral N % (n) % (n) % (n) % (n) 17.3% 11,5% Tejido 20,5 (8) 12,8 (5) (9) (6) Abdulamir* et 8% (4)N Malasia 10,2% 39 al., 2010 Heces NA 9,6% (5) NA 52 N=50 (4) Mucosa 5,1 (2) 5,1 (2) 7,6% (4) 3,8% (2) Al-Jashamy et 46.3% 7.3% (96) Malasia Heces NA NA NA NA 41 al., 2010 (19) p<0,05 Correidora- 30% 98 Sánchez et al., España Tejido 70% (71) NA NA NA NA (27) p<0,05 2012 Andres- 3,2 (190) Franch**et al., España Tejido NA NA NA 1,6% (6) 0 (0) NA p = 0,03 2017 CCR c/bac: Muestras de tejido en pacientes con bacteriemia; CCR s/bac: Muestras de tejido en pacientes sin bacteriemia. NA: No aplica debido a que no realizaron estudios comparativos entre distintas poblaciones. N: corresponde al número de pacientes participantes del estudio. Sg: Streptococcus gallolyticus. *En el estudio de Abdulamir et al, 2010 no se describen diferencias significativas entre los grupos de CCR c/bac y CCR s/bac, sin embargo, sí comparando estos grupos con el grupo control. ** Estudio cohorte el cual se utilizó una muestra aleatorizada de pacientes, se encuentra una diferencia significativa entre pacientes sanos y pacientes con CCR y la presencia de S. gallolyticus p = 0,03. 34 3.2 Mecanismo de acción de S. gallolyticus sobre las células intestinales S. gallolyticus ingresa al intestino humano a través de la dieta y puede sobrevivir en el entorno rico en carbohidratos del íleon, al pasar al ambiente pobre en nutrientes de un colon sano, la bacteria es superada por la microbiota residente y sale a través de la excreción fecal, sin embargo, una neoplasia en el colon proporciona un segundo sitio de colonización de S. gallolyticus debido a la disponibilidad alterada de nutrientes y la exposición de fibras de colágeno, lo cual le permite pasar a la circulación y superar las barreras del sistema inmune (Boleij & Tjalsma, 2013). La naturaleza de la colonización por S. gallolyticus se ve determinada por la expresión de ARNm codificantes de citocinas, quimiocinas y oncogenes. El ARNm de c-Myc y bcl-2 se encuentra aumentado en tejido tumoral, sin diferencias significativas entre los grupos de pacientes con o sin bacteriemia. Así mismo la expresión de interleucinas como IL-8 y IL-1 es mayor en tejido tumoral versus el tejido no tumoral en todos los grupos de pacientes con CCR más S. gallolyticus positivos a diferencia de los pacientes con CCR más S. gallolyticus negativos Las propiedades mayormente descritas en S. gallolyticus subsp gallolyticus como promotoras de tumores son la inducción de la vía proinflamatoria de la ciclo-oxigenasa-2 (COX-2), esta vía es clave en la carcinogénesis del epitelio del colon, ya que promueve la proliferación celular, la inhibición de la apoptosis y el aumento de la angiogénesis; la sobreexpresión de COX-2, un marcador de inflamación crónica, se detecta en el 43% de los adenomas y el 85% de los carcinomas, mientras que la inhibición de esta vía por medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) puede reducir en gran medida el riesgo de CCR (Boleij & Tjalsma, 2013). Por el contrario, INF-γ no presenta niveles significativamente diferentes en ningún grupo por tipo de tejido (tumoral/no tumoral), presencia/ausencia de S. gallolyticus o presencia/ausencia de bacteriemia (Abdulamir et al., 2010). El primer paso importante para establecer una infección intestinal es la adherencia de las células bacterianas al tejido colónico; Boleij et al determinaron en S. gallolyticus una adherencia a las células adenocarcinoides (Caco-2 y HT-29) de menos del 15%. Sin embargo, a pesar de la poca adherenia en modelos murinos estas bacterias fueron capaces de cruzar paracelularmente un epitelio diferenciado sin inducir respuestas epiteliales de IL-8 o IL-1(Boleij et al., 2011). Esto debido a su capacidad de translocación por la barrera intestinal y su capacidad de formar biopelículas en colágenos tipo I y IV lo cual explica su alta asociación con la producción de endocarditis (Boleij & Tjalsma, 2013; Abdulamir et al., 2010). 35 Por otro lado, S. gallolyticus contiene una cápsula de polisacáridos que reduce sus capacidades adhesivas a las células epiteliales, esta misma cápsula le permite permanecer invisible para el sistema inmunitario del huésped durante un período prolongado de tiempo. Además, S. gallolyticus subsp gallolyticus contiene estructuras similares a pilos que facilitan la colonización de pólipos y epitelio, la translocación paracelular y la formación de vegetaciones resistentes a sustancias tóxicas en sitios ricos en colágeno (Boleij et al., 2011). Del mismo modo, la producción de una bacteriocina, peptido antimicrobiano, llamado gallocina se ve fuertemente potenciada en condiciones asociadas con el CCR, inhibe el crecimiento de E. faecalis, uno de los primeros colonizadores bacterianos del intestino de mamíferos, lo cual permite la colonización exitosa de S. gallolyticus en el tracto intestinal (Aymeric et al., 2018; Aymeric et al., 2017). La actividad de la gallocina se potenciaba fuertemente en un ambiente enriquecido con ácidos biliares, un factor de riesgo ampliamente reconocido para el CCR, lo cual establece un ciclo vicioso entre acidos biliares, actividad de gallocina, promoción de la colonización de S. gallolyticus que a su vez promueve la proliferación de células tumorales (Aymeric et al., 2018; Aymeric et al., 2017). Kuma et al establece el papel de S. gallolyticus sobre la carcinogénesis, demostrando que la cepa S. gallolyticus TX2005 puede promover el desarrollo de tumores colorrectales a través del aumento de la proliferación de células epiteliales a través de la regulación positiva de la vía de señalización Wnt/β-catenina a igual que F. nucleatum (Kumar et al., 2017). La activación de la vía Wnt y el aumento de los ácidos biliares secundarios promueven el desarrollo de CCR. El ambiente tumoral permite que S. gallolyticus prevalezca y colonice el tracto intestinal del hospedero actuando como un patógeno oportunista que se beneficia de un nicho ecológico favorable ofrecido por el ambiente oncogénico intestinal, eventualmente ocurre su translocación y su diseminación sistémica provocando bacteriemia (Aymeric et al., 2017). 36 3.3 Uso clínico de S. gallolyticus en el diagnóstico del CCR Se ha descrito que la heterogeneidad del tipo de CCR puede relacionarse a los tipos de bacterias que predisponen o protegen de esta patología, debido a que el microbioma intestinal es estable a lo largo del todo el tracto digestivo se ha sugerido determinar el microbioma oral con el fin de ofrecer una pantalla alternativa para detectar el CCR (Flemer et al., 2018). En este entendido Guven et al publicaron un estudio donde establecen una asociación entre Porphyromonas gingivalis, F. nucleatum y S. gallolyticus en pacientes con CCR versus pacientes sanos. En este estudio se encontró que la cantidad de S. gallolyticus y F. nucleatum es mayor en el grupo de persona con CCR que en los controles sanos, en cambio, P. gingivalis fue similar en ambos grupos. Además, se determinó que el mejor predictor diagnóstico del CCR es S. gallolyticus con 82% de sensibilidad y 76% de especificidad, lo cual ofrece una buena alternativa diagnóstica (Guven et al., 2019). Por otro lado, se ha sugerido la serología como herramienta diagnóstica, al comparar niveles de IgG en pacientes con CCR, adenomas, voluntarios aparentes sanos y controles (pacientes que se someten a colonoscopía sin hallazgos de lesiones cancerígenas ni pólipos), presentan niveles más altos de anticuerpos IgG contra S. gallolyticus los pacientes con CCR y adenomas en comparación con los voluntarios sanos y sujetos de control (p <0.05) (Abdulamir et al., 2009). Butt et al buscaron examinar la temporalidad de la respuesta de anticuerpos contra distintos antígenos S. gallolyticus de muestras prediagnósticas al CCR de un gran consorcio de cohortes de Estados Unidos con un seguimiento de hasta 18 años. Gallo2178, proteína que conforma la flagelina C de la bacteria S. gallolyticus, fue el único antígeno determinado cuyos niveles se asociaron con mayor riesgo de padecer CCR en un incremento del 40% (Butt et al., 2019). Finalmente, Butt et al a lo largo de múltiples estudios publicados desde el 2016 al 2019, determinan la asociación de los anticuerpos contra las proteínas de flagelina y pilus llamadas Gallo2178 y Gallo2179 respectivamente con CCR los cuales indican que la serología podría ser útil para identificar un subgrupo de individuos con mayor riesgo de CCR (Butt et al., 2016, 2019). 37 4. Bacteroides fragilis enterotoxigénico B. fragilis enterotoxigénico (BFET) fue el agente bacteriano del cual se encontró menos literatura científica, 4 artículos originales, los cuales propusieron a este agente como patógeno “clave” o “impulsor” que facilita el establecimiento de comunidades microbianas disbióticas e inducen en conjunto la carcinogénesis por medio de respuestas inflamatorias desde etapas tempranas de la tumorogénesis (Hajishengallis et al., 2012; Lamont & Hajishengallis, 2015). 4.1 Asociación epidemiológica con el CCR Purcell et al establecieron una asociación epidemiológica significativas de BFET con adenomas tubulares, pólipos serrados y displasias de bajo grado que buscan respaldar su asociación con etapas tempranas de la carcinogénesis colorrectal, sin embargo, no encontraron una asociación significativa entre adenocarcinoma, adenoma tubulovelloso o lesiones con alto grado de displasia y la colonización de BFET, lo cual sugiere un papel temprano en la formación del carcinoma pero poca participación en los estadíos más avanzados (Purcell et al., 2017). El estudio de Purcell et al difiere de dos estudios publicados anteriormente que examinaron la expresión del gen bft, productor de la toxina fragilisina, en el tejido de la mucosa del colon, en ambos estudios informaron una asociación del gen bft con el CCR, en particular con la enfermedad en estado tardío, sin embargo los tres artículos concuerdan que la colonización de B. fragilis enterotoxigénico es generalizada en todo el intestino cuando está presente y la disbiosis ocurre tanto en el tejido colorrectal no tumoral como el tumoral, lo cual resta especificidad si el objetivo es utilizarlo como marcador diagnóstico (Boleij et al., 2011; Purcell et al., 2017; Viljoen et al., 2015). Asimismo, en un análisis del porcentaje medio de colonias bft-positivas reveló una tendencia no significativa, entre la presencia del gen bft en tejido no tumoral versus el tumoral, los pares de tumor/no tumoral de pacientes fueron concordantes para el estado bft en el 75% de los casos y el 67% de los controles. Estos datos respaldan lo mencionado anteriormente, que la presencia de bft en la mucosa no se limita a los tumores, sino que abarca una porción más grande de la mucosa del colon (Butt et al., 2016). Por otro lado, al igual que ha S. gallolyticus, también se ha asociado la presencia de bacteriemia por B. fragilis con CCR, en este caso los pacientes con bacteriemia tendían a tener carcinoma colorrectal, 38 el sitio de infección primario, en cuatro de los seis casos asociados con el carcinoma colorrectal la hospitalización del paciente condujo a la detección del carcinoma colorrectal, lo cual lo límita al diagnóstico a etapas tardías, sin embargo, existe poca información (Yoshino et al., 2012). 4.2 Mecanismo de acción bacteriana sobre las células intestinales Se ha sugerido a BFET como una fuente importante de inflamación crónica e implicado como un factor de riesgo para el CCR. Es por esto que Godwin et al purificaron la toxina de B. fragilis y demostraron que en modelos murinos regula positivamente la espermina-oxidasa (EMO) resultando en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) dependiente de EMO que inducen γ-H2A.x, un marcador de daño en el ADN (Goodwin et al., 2011). Asimismo, la EMO es una enzima catabólica de poliamina altamente inducible por estímulos inflamatorios provocando un aumento de ROS y daños en el ADN. Un inhibidor del catabolismo de poliaminas, N1 N4-bis (2,3-butandienil)-1,4-butanodiamina (MDL 72527) reduce significativamente la inflamación crónica y la proliferación de las células colónicas inducida por BFET lo cual reduce la tumorigénesis en un 69% (p <0,001) y ofrece un objeto de estudio para la quimioprevención del cáncer de colon (Goodwin et al., 2011). Es importante señalar que no se puede establecer una utilidad de BFET para el diagnóstico o abordaje del CCR, sin embargo, posee estudios prometedores que lo posicionan como un modelo bacteriano útil para el estudio de las interacciones bacterianas con las células intestinales y el descubrimiento de nuevas herramientas terapeúticas. 39 5. Discusión El cáncer colorrectal es una enfermedad común de alto costo en países desarrollados. Un buen entendimiento de los factores que promueven la carcinogénesis en el CRC permite crear mejores estrategias para prevenir esta malignidad así como realizar mejores protocolos de detección temprana. Los pacientes con CCR tiene en común la perdida de la diversidad bacteriana por ello la disbiosis de la microbiota intestinal; la carcinogénesis del cáncer colorrectal puede depender de la estructura y los metabolitos de comunidades microbianas, un solo factor virulencia o un solo agente bacteriano, la alteración de la mucosa intestinal o la duración de la inflamación no van a definir el inicio o progresión de la carcinogénesis sino una combinación de estos elementos (Rasvov et al., 2017). Sin embargo, la evidencia encontrada permite establecer una asociación bacteriana con ciertas estado del epitelio displasico, por ejemplo en el caso de bacteriemias por S. gallolyticus y altas cargas de F. nucleatum con displasias más avanzadas y B.fragilis con lesiones precancerosas. Es importante tomar en cuenta que las diferencias de la microbiota, encontradas por los estudios incluidos en esta revisión, entre el tejido colónico cancerígeno y el sano se han observado principalmente a nivel de carga de ARN bacteriano, especialmente en el caso de F. nucleatum dado a que a pesar de ser un colonizador común se encuentra en mayor cantidad en tejidos tumorales e incluso su carga bacteriana se ha asociado a un peor pronóstico, sin embargo para S. gallolyticus si se encontraron estudios de prevalencia que indicaban mayor presencia de esta bacteria en la población con CCR. Otro factor importante a discutir es la bacteriemia dada por S. gallolyticus y B. fragilis y su asociación con el CCR, el estudio más relevante por el tamaño de la muestra para el primero es el de Correidora- Sánchez et al., 2012 donde si encuentra una asociación entre la presencia de S. gallolyticus en sangre y el CCR, en el caso del segundo hay pocos estudios, por ello si existe evidencia que permite sugerir un estudio en busca de esta malignidad cuando se ha encontrado este microorganismo en hemocultivos, sin embargo, ambos tanto S. gallolyticus y B. fragilis se han asociado con estadíos avanzados de CCR, por lo tanto no es recomendable como herramienta diagnóstica y lo adecuado es realizar una detección temprana que evite que un paciente llegue a estos estadíos sin un diagnóstico acorde previo. 40 Por otro lado, los artículos estudiados han mostrado un uso más allá del diagnóstico para cada agente bacteriano, en el caso de S. gallolyticus ofrece una alternativa serológica, lo cual disminuiría mucho el costo monetario y la preparación previa física para el paciente en comparación con los métodos actuales, sin embargo, existen pocos antígenos demostrados efectivos como marcadores de riesgo en pacientes con lesiones precancerosas, por lo que podría ser util para su inclusión en un algoritmo diagnóstico pero no en sustitución de los métodos diagnósticos existentes. En el caso de F. nucleatum y su asociación a tejido carcinoide poco diferenciado relacionado menor sobrevida, su utilidad clínica se ve enfocada en la determinación de este subtipo de carcinoma más invasivo; los altos niveles de ARN microbiano de esta especie que se han encontrado en heces y saliva facilita la toma de muestra para la detección de este patógeno en la microbiota y poder así evaluar el posible pronóstico del CCR con muestras no invasivas lo cual permitiría minimizar las complicaciones asociadas a las tomas de muestras con técnica de la colonoscopía. La detección de marcadores genéticos bacterianos específicos y su relación con el CCR no ha sido ampliamente estudiado; el gen bft de Bacteroides fragilis se ha encontrado poco específico a tejido tumoral y en general existe la necesidad de estudiar más a este agente bacteriano y su relación con esta malignidad. Las bacterias estudiadas son relativamente pobres colonizadores de un colon sano, pero tienen una ventaja competitiva en el microambiente del tumor en el cual promueven un ambiente oxidativo que facilitan la generación de mutaciones (Goodwin et al., 2011). Por lo tanto, su impacto sobre el tejido tumoral no se circunscribe a un efecto en específico, sino que tiene injerencia a lo largo de todo el proceso de carcinogénesis hasta la propagación. La evidencia encontrada en los artículos revisados sobre la fisiopatología sobre los agentes bacterianos coincide con el modelo de “dos golpes” propuesto por Rubistein et al donde la acumulación de mutación(s) del conductor del huésped, por ejemplo, el aumento de la expresión de Anexina A1, actúa como el primer "golpe", y microorganismos, como en el este caso de F. nucleatum, como el segundo "golpe" para exacerbar la progresión del cáncer (Rubistein et al., 2019). De este modo los 3 microorganismos estudiados siguen el modelo anterior al promover una respuesta inflamatoria lo cual induce especies reactivas de oxigeno que induce mutaciones, al mismo tiempo se promueve el crecimiento celular. Esto en todo el proceso de la carcinogénesis, sin embargo en el caso F. nucleatum mayormente en etapas tardías de la displasia, y para S. gallolyticus que está 41 presente en todo el tejido epitelial intestinal, después de que se haya formado una lesión precursora inicial, actúa como un promotor del cáncer; aumentando el riesgo del CCR una vez que la tumorigénesis ya ha comenzado, así como puede favorecer la progresión y metástasis de un carcinoma avanzado (Boleij et al., 2011). De esta misma manera B. fragilis y S. gallolitycus sup. gallolyticus tienen una ventaja competitiva en el microambiente tumoral, poseen una toxina que en el caso del primero permite al aumentar la permeabilidad de la barrera intestinal y para el segundo de toxicidad a otras bacterias colonizadoras. Así tambien a F. nucleatum y su capacidad de modular el sistema inmune suprimiento la respuesta celular de macrofagos, células T y células NK contribuyen a la progresión del tumor (Tjalsma et al., 2012; Aymeric et al., 2018; Wu et al., 2019). Aunque aún falta mucho por conocer en la interacción bacteria-célula tumoral. existen factores de virulencia bien caracterizados como FadA, Fap2, LPS para F. nucleatum y toxinas en el caso de B. fragilis y S. gallolitycus sup. gallolyticus de las cuales se sabe que actúan como moléculas efectoras en el cambio de células epiteliales normales a células tumorales. Estás moléculas podrían ser la clave para proporcionar nuevas drogas, dianas o estrategias en el tratamiento contra el CCR. Como perspectiva a futuro se recomienda el uso de herramientas de biología molecular que permita tener una perspectiva más amplia de la microbiota intestinal, su injerencia en el epitelio colónico, y su dinámica en la asociación bacteria-enterocito, con el fin de poder definir cuáles y en qué cantidad estos agentes bacterianos ponen en riesgo al paciente de desarrollar adenomas que se transformen en carcinomas, esto en combinación con los factores de riesgo del hospedador. Es importante señalar que el objetivo de determinar la existencia de agentes bacterianos que puedan ser utilizados en la práctica clínica, el alcance de este estudio es limitado dado que solo abarca 3 agentes bacterianos, actualmente existen mucho más agentes bacterianos y virus asociados a esta patología e incluso, dado la magnitud de la microbiota del epitelio colónico, filos y subgrupos microbianos que se han asociado como posible marcador diagnóstico. 42 6. Conclusiones • Existe una asociación epidemiológica del CCR con los tres agentes bacterianos tratados en esta revisión. Estos se han encontrado en tejido epitelial tumoral y en menor medida en tejido colónico adyacente sano, así como en otros tipo de microbiomas como el salivar. F. nucleatum es la bacteria con mayor evidencia científica asociada al CCR, sin embargo, S. gallolyticus se ha encontrado en pacientes con CCR determinado en estudios de prevalencia y B. fragilis se ha asociado solo incidentalmente en pacientes con bacteriemias y carcinoma invasivos. • La mejor aplicación clínica actual de F. nucleatum es como marcador pronóstico de mortalidad en el cáncer de colon, así como el uso de serología para la determinación de riesgo de padecer el cáncer utilizando antígenos de S. gallolitycus. En el caso de B. fragilis no se estableció una utilidad clínica para el diagnóstico de CCR, sin embargo la investigación en este campo podría facilitar la determinación de nuevas moléculas diana para el tratamiento o detección molecular de esta patología. • Estos agentes bacterianos promueven la carcinogénesis a través de diferentes mecanismos de virulencia, como la adhesión o translocación intestinal e inducción de la respuesta inflamatoria del hospedero, lo que facilitan un microambiente con factores de crecimiento tumorales que estimulan la progresión del CCR. 43 Bibliografía Abdulamir, A. S., Hafidh, R. R., & Bakar, F. (2010). Molecular detection, quantification, and isolation of Streptococcus gallolyticus bacteria colonizing colorectal tumors: Inflammation- driven potential of carcinogenesis via IL-1, COX-2, and IL-8. Molecular Cancer, 9(1), 249. https://doi.org/10.1186/1476-4598-9-249 Abdulamir, A. S., Hafidh, R. R., Mahdi, L. K., Al-jeboori, T., & Abubaker, F. (2009). Investigation into the controversial association of Streptococcus gallolyticus with colorectal cancer and adenoma. BMC Cancer, 9(1), 403. https://doi.org/10.1186/1471-2407-9-403 Abed, J., Emgård, J. E. M., Zamir, G., Faroja, M., Almogy, G., Grenov, A., Sol, A., Naor, R., Pikarsky, E., Atlan, K. A., Mellul, A., Chaushu, S., Manson, A. L., Earl, A. M., Ou, N., Brennan, C. A., Garrett, W. S., & Bachrach, G. (2016). Fap2 Mediates Fusobacterium nucleatum Colorectal Adenocarcinoma Enrichment by Binding to Tumor-Expressed Gal- GalNAc. Cell Host & Microbe, 20(2), 215-225. https://doi.org/10.1016/j.chom.2016.07.006 Al-Jashamy, K., Murad, A., Zeehaida, M., & Rohaini, M. (2010). Prevalence of Colorectal Cancer Associated with Streptococcus bovis among Inflammatory Bowel and Chronic Gastrointestinal Tract Disease Patients. 4. Amitay, E. L., Krilaviciute, A., & Brenner, H. (2018). Systematic review: Gut microbiota in fecal samples and detection of colorectal neoplasms. Gut Microbes, 9(4), 293-307. https://doi.org/10.1080/19490976.2018.1445957 Amitay, E. L., Werner, S., Vital, M., Pieper, D. H., Höfler, D., Gierse, I.-J., Butt, J., Balavarca, Y., Cuk, K., & Brenner, H. (2017). Fusobacterium and colorectal cancer: Causal factor or passenger? Results from a large colorectal cancer screening study. Carcinogenesis, 38(8), 781-788. https://doi.org/10.1093/carcin/bgx053 Andres-Franch, M., Galiana, A., Sanchez-Hellin, V., Ochoa, E., Hernandez-Illan, E., Lopez-Garcia, P., Castillejo, A., Castillejo, M. I., Barbera, V. M., Garcia-Dura, J., Gomez-Romero, F. J., Royo, G., & Soto, J. L. (2017). Streptococcus gallolyticus infection in colorectal cancer and association with biological and clinical factors. PLOS ONE, 12(3). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174305 44 Aymeric, L., Donnadieu, F., Mulet, C., du Merle, L., Nigro, G., Saffarian, A., Bérard, M., Poyart, C., Robine, S., Regnault, B., Trieu-Cuot, P., Sansonetti, P. J., & Dramsi, S. (2018). Colorectal cancer specific conditions promote Streptococcus gallolyticus gut colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences, 115(2), E283-E291. https://doi.org/10.1073/pnas.1715112115 Bénard, F., Barkun, A. N., Martel, M., & Renteln, D. von. (2018). Systematic review of colorectal cancer screening guidelines for average-risk adults: Summarizing the current global recommendations. World Journal of Gastroenterology, 24(1), 124-138. https://doi.org/10.3748/wjg.v24.i1.124 Boleij, A., Hechenbleikner, E. M., Goodwin, A. C., Badani, R., Stein, E. M., Lazarev, M. G., Ellis, B., Carroll, K. C., Albesiano, E., Wick, E. C., Platz, E. A., Pardoll, D. M., & Sears, C. L. (2015). The Bacteroides fragilis Toxin Gene Is Prevalent in the Colon Mucosa of Colorectal Cancer Patients. Clinical Infectious Diseases, 60(2), 208-215. https://doi.org/10.1093/cid/ciu787 Boleij, A., Muytjens, C. M. J., Bukhari, S. I., Cayet, N., Glaser, P., Hermans, P. W. M., Swinkels, D. W., Bolhuis, A., & Tjalsma, H. (2011). Novel Clues on the Specific Association of Streptococcus gallolyticus subsp gallolyticus With Colorectal Cancer. The Journal of Infectious Diseases, 203(8), 1101-1109. https://doi.org/10.1093/infdis/jiq169 Boleij, A., & Tjalsma, H. (2013). The itinerary of Streptococcus gallolyticus infection in patients with colonic malignant disease. The Lancet. Infectious Diseases, 13(8), 719-724. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70107-5 Bullman, S., Pedamallu, C. S., Sicinska, E., Clancy, T. E., Zhang, X., Cai, D., Neuberg, D., Huang, K., Guevara, F., Nelson, T., Chipashvili, O., Hagan, T., Walker, M., Ramachandran, A., Diosdado, B., Serna, G., Mulet, N., Landolfi, S., Ramon y Cajal, S., Meyerson, M. (2017). Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science, 358(6369), 1443-1448. https://doi.org/10.1126/science.aal5240 Butt, J., Jenab, M., Pawlita, M., Overvad, K., Tjonneland, A., Olsen, A., Boutron-Ruault, M.-C., Carbonnel, F., Mancini, F. R., Kaaks, R., Kühn, T., Boeing, H., Trichopoulou, A., Karakatsani, A., Palli, D., Pala, V. M., Tumino, R., Sacerdote, C., Panico, S., Hughes, D. J. (2019). Antibody Responses to Fusobacterium nucleatum Proteins in Prediagnostic Blood 45 Samples are not Associated with Risk of Developing Colorectal Cancer. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 28(9), 1552-1555. https://doi.org/10.1158/1055- 9965.EPI-19-0313 Butt, J., Romero-Hernández, B., Pérez-Gómez, B., Willhauck-Fleckenstein, M., Holzinger, D., Martin, V., Moreno, V., Linares, C., Dierssen-Sotos, T., Barricarte, A., Tardón, A., Altzibar, J. M., Moreno-Osset, E., Franco, F., Requena, R. O., Huerta, J. M., Michel, A., Waterboer, T., Castaño-Vinyals, G., Pawlita, M. (2016). Association of S treptococcus gallolyticus subspecies gallolyticus with colorectal cancer: Serological evidence: S. gallolyticus subsp. gallolyticus Antibody Responses and Colorectal Cancer. International Journal of Cancer, 138(7), 1670-1679. https://doi.org/10.1002/ijc.29914 GLOBOCAN. (2020). Recuperado 7 de febrero de 2020, de https://gco.iarc.fr/today/home Castellarin, M., Warren, R. L., Freeman, J. D., Dreolini, L., Krzywinski, M., Strauss, J., Barnes, R., Watson, P., Allen-Vercoe, E., Moore, R. A., & Holt, R. A. (2012). Fusobacterium nucleatum infection is prevalent in human colorectal carcinoma. Genome Research, 22(2), 299-306. https://doi.org/10.1101/gr.126516.111 Chen, Y., Peng, Y., Yu, J., Chen, T., Wu, Y., Shi, L., Li, Q., Wu, J., & Fu, X. (2017). Invasive Fusobacterium nucleatum activates beta-catenin signaling in colorectal cancer via a TLR4/P- PAK1 cascade. Oncotarget, 8(19). https://doi.org/10.18632/oncotarget.15992 Corredoira-Sanchez, J., Garcia-Garrote, F., Rabunal, R., Lopez-Roses, L., Garcia-Pais, M. J., Castro, E., Gonzalez-Soler, R., Coira, A., Pita, J., Lopez-Alvarez, M. J., Alonso, M. P., & Varela, J. (2012). Association Between Bacteremia Due to Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus (Streptococcus bovis I) and Colorectal Neoplasia: A Case-Control Study. Clinical Infectious Diseases, 55(4), 491-496. https://doi.org/10.1093/cid/cis434 De Carvalho, A. C., de Mattos Pereira, L., Datorre, J. G., dos Santos, W., Berardinelli, G. N., Matsushita, M. de M., Oliveira, M. A., Durães, R. O., Guimarães, D. P., & Reis, R. M. (2019). Microbiota Profile and Impact of Fusobacterium nucleatum in Colorectal Cancer Patients of Barretos Cancer Hospital. Frontiers in Oncology, 9, 813. https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00813 Eklöf, V., Löfgren-Burström, A., Zingmark, C., Edin, S., Larsson, P., Karling, P., Alexeyev, O., 46 Rutegård, J., Wikberg, M. L., & Palmqvist, R. (2017). Cancer-associated fecal microbial markers in colorectal cancer detection: Fecal microbial markers in colorectal cancer detection. International Journal of Cancer, 141(12), 2528-2536. https://doi.org/10.1002/ijc.31011 Flanagan, L., Schmid, J., Ebert, M., Soucek, P., Kunicka, T., Liska, V., Bruha, J., Neary, P., Dezeeuw, N., Tommasino, M., Jenab, M., Prehn, J. H. M., & Hughes, D. J. (2014). Fusobacterium nucleatum associates with stages of colorectal neoplasia development, colorectal cancer and disease outcome. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 33(8), 1381-1390. https://doi.org/10.1007/s10096-014-2081-3 Feinberg, A., Ohlsson, R., Henikoff., S. The epigenetic progenitor origin of human cancer (2006). The epigenetic progenitor origin of human cancer. Genetics. (7), 21-33. https://doi:10.1038/nrg1748 Flemer, B., Warren, R. D., Barrett, M. P., Cisek, K., Das, A., Jeffery, I. B., Hurley, E., O‘Riordain, M., Shanahan, F., & O‘Toole, P. W. (2018). The oral microbiota in colorectal cancer is distinctive and predictive. Gut, 67(8), 1454-1463. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2017-314814 Goodwin, A. C., Shields, C. E. D., Wu, S., Huso, D. L., Wu, X., Murray-Stewart, T. R., Hacker- Prietz, A., Rabizadeh, S., Woster, P. M., Sears, C. L., & Casero, R. A. (2011). Polyamine catabolism contributes to enterotoxigenic Bacteroides fragilis-induced colon tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(37), 15354-15359. https://doi.org/10.1073/pnas.1010203108 Gur, C., Ibrahim, Y., Isaacson, B., Yamin, R., Abed, J., Gamliel, M., … Mandelboim, O. (2015). Binding of the Fap2 Protein of Fusobacterium nucleatum to Human Inhibitory Receptor TIGIT Protects Tumors from Immune Cell Attack. Immunity, 42(2), 344–355. doi:10.1016/j.immuni.2015.01.010 Guevarra, L. A., Afable, A. C. F., Belza, P. J. O., Dy, K. J. S., Lee, S. J. Q., Sy-Ortin, T. T., & Albano, P. M. S. P. (2018). Immunogenicity of a Fap2 peptide mimotope of Fusobacterium nucleatum and its potential use in the diagnosis of colorectal cancer. Infectious Agents and Cancer, 13(1), 11. https://doi.org/10.1186/s13027-018-0184-7 Guven, D. C., Dizdar, O., Alp, A., Akdoğan Kittana, F. N., Karakoc, D., Hamaloglu, E., Lacin, S., 47 Karakas, Y., Kilickap, S., Hayran, M., & Yalcin, S. (2019). Analysis of Fusobacterium nucleatum and Streptococcus gallolyticus in saliva of colorectal cancer patients. Biomarkers in Medicine, 13(9), 725-735. https://doi.org/10.2217/bmm-2019-0020 Hajishengallis, G., Darveau, R. P., & Curtis, M. A. (2012). The keystone-pathogen hypothesis. Nature Reviews. Microbiology, 10(10), 717-725. https://doi.org/10.1038/nrmicro2873 Hanahan, D., & Weinberg, R. A. (2011). Hallmarks of cancer: The next generation. Cell, 144(5), 646-674. https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.02.013 Ito, M., Kanno, S., Nosho, K., Sukawa, Y., Mitsuhashi, K., Kurihara, H., Igarashi, H., Takahashi, T., Tachibana, M., Takahashi, H., Yoshii, S., Takenouchi, T., Hasegawa, T., Okita, K., Hirata, K., Maruyama, R., Suzuki, H., Imai, K., Yamamoto, H., & Shinomura, Y. (2015). Association of Fusobacterium nucleatum with clinical and molecular features in colorectal serrated pathway: F. nucleatum and molecular features of serrated lesions. International Journal of Cancer, 137(6), 1258-1268. https://doi.org/10.1002/ijc.29488 Kaz, A., Kim, Y.-H., Dzieciatkowski, S., Lynch, H., Watson, P., Washington, M. K., Lin, L., & Grady, W. M. (2007). Evidence for the role of aberrant DNA methylation in the pathogenesis of Lynch syndrome adenomas. International Journal of Cancer, 120(9), 1922-1929. https://doi.org/10.1002/ijc.22544 Kostic, A. D., Gevers, D., Pedamallu, C. S., Michaud, M., Duke, F., Earl, A. M., Ojesina, A. I., Jung, J., Bass, A. J., Tabernero, J., Baselga, J., Liu, C., Shivdasani, R. A., Ogino, S., Birren, B. W., Huttenhower, C., Garrett, W. S., & Meyerson, M. (2012). Genomic analysis identifies association of Fusobacterium with colorectal carcinoma. Genome Research, 22(2), 292-298. https://doi.org/10.1101/gr.126573.111 Kostic, Aleksandar D., Chun, E., Robertson, L., Glickman, J. N., Gallini, C. A., Michaud, M., Clancy, T. E., Chung, D. C., Lochhead, P., Hold, G. L., El-Omar, E. M., Brenner, D., Fuchs, C. S., Meyerson, M., & Garrett, W. S. (2013). Fusobacterium nucleatum Potentiates Intestinal Tumorigenesis and Modulates the Tumor-Immune Microenvironment. Cell Host & Microbe, 14(2), 207-215. https://doi.org/10.1016/j.chom.2013.07.007 Kuipers, E. J., Grady, W. M., Lieberman, D., Seufferlein, T., Sung, J. J., Boelens, P. G., van de Velde, C. J. H., & Watanabe, T. (2015). Colorectal cancer. Nature Reviews Disease Primers, 48 1(1), 15065. https://doi.org/10.1038/nrdp.2015.65 Kuipers, E. J., Rösch, T., & Bretthauer, M. (2013). Colorectal cancer screening—Optimizing current strategies and new directions. Nature Reviews. Clinical Oncology, 10(3), 130-142. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2013.12 Kumar, R., Herold, J. L., Schady, D., Davis, J., Kopetz, S., Martinez-Moczygemba, M., Murray, B. E., Han, F., Li, Y., Callaway, E., Chapkin, R. S., Dashwood, W.-M., Dashwood, R. H., Berry, T., Mackenzie, C., & Xu, Y. (2017). Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus promotes colorectal tumor development. PLOS Pathogens, 13(7), e1006440. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006440 Kunzmann, A. T., Proença, M. A., Jordao, H. W., Jiraskova, K., Schneiderova, M., Levy, M., Liska, V., Buchler, T., Vodickova, L., Vymetalkova, V., Silva, A. E., Vodicka, P., & Hughes, D. J. (2019). Fusobacterium nucleatum tumor DNA levels are associated with survival in colorectal cancer patients. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 38(10), 1891-1899. https://doi.org/10.1007/s10096-019-03649-1 Kwong, T. N. Y., Wang, X., Nakatsu, G., Chow, T. C., Tipoe, T., Dai, R. Z. W., Tsoi, K. K. K., Wong, M. C. S., Tse, G., Chan, M. T. V., Chan, F. K. L., Ng, S. C., Wu, J. C. Y., Wu, W. K. K., Yu, J., Sung, J. J. Y., & Wong, S. H. (2018). Association Between Bacteremia From Specific Microbes and Subsequent Diagnosis of Colorectal Cancer. Gastroenterology, 155(2), 383-390.e8. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.04.028 Lamont, R. J., & Hajishengallis, G. (2015). Polymicrobial synergy and dysbiosis in inflammatory disease. Trends in Molecular Medicine, 21(3), 172-183. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2014.11.004 Lee, C. K., Chan, H. M. H., Ho, P. L., Wong, H. K., Leung, J. N. S., Tsoi, W. C., & Lin, C. K. (2013). Long-term clinical outcomes after Streptococcus bovis isolation in asymptomatic blood donors in Hong Kong. Transfusion, 53(10), 2207-2210. https://doi.org/10.1111/trf.12087 Lee, D.-W., Han, S.-W., Kang, J.-K., Bae, J. M., Kim, H.-P., Won, J.-K., Jeong, S.-Y., Park, K. J., Kang, G. H., & Kim, T.-Y. (2018). Association Between Fusobacterium nucleatum, Pathway Mutation, and Patient Prognosis in Colorectal Cancer. Annals of Surgical Oncology, 25(11), 3389-3395. https://doi.org/10.1245/s10434-018-6681-5 49 Li, Y.-Y., Ge, Q.-X., Cao, J., Zhou, Y.-J., Du, Y.-L., Shen, B., Wan, Y.-J. Y., & Nie, Y.-Q. (2016). Association of Fusobacterium nucleatum infection with colorectal cancer in Chinese patients. World Journal of Gastroenterology, 22(11), 3227. https://doi.org/10.3748/wjg.v22.i11.3227 Ma, C., Luo, H., Gao, F., Tang, Q., & Chen, W. (2018). Fusobacterium nucleatum promotes the progression of colorectal cancer by interacting with E‑cadherin. Oncology Letters. https://doi.org/10.3892/ol.2018.8947 Marley, A. R., & Nan, H. (2016). Epidemiology of colorectal cancer. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics, 7(3), 105-114. Mima, K., Sukawa, Y., Nishihara, R., Qian, Z. R., Yamauchi, M., Inamura, K., Kim, S. A., Masuda, A., Nowak, J. A., Nosho, K., Kostic, A. D., Giannakis, M., Watanabe, H., Bullman, S., Milner, D. A., Harris, C. C., Giovannucci, E., Garraway, L. A., Freeman, G. J., Ogino, S. (2015). Fusobacterium nucleatum and T Cells in Colorectal Carcinoma. JAMA Oncology, 1(5), 653. https://doi.org/10.1001/jamaoncol.2015.1377 Mima K, Nishihara R, Qian ZR, Cao Y, Sukawa Y, Nowak JA, Yang J, Dou R, Masugi Y, Song M, Kostic AD, Giannakis M, Bullman S, Milner DA, Baba H, Giovannucci EL, Garraway LA, Freeman GJ, Dranoff G, Garrett WS, Huttenhower C, Meyerson M, Meyerhardt JA, Chan AT, Fuchs CS, Ogino S (2016) Fusobacterium nucleatum in colorectal carcinoma tissue and patient prognosis. Gut 65(12):1973–1980. https://doi.org/10.1136/gutjnl- 2015-310101 Pasquereau-Kotula, E., Martins, M., Aymeric, L., & Dramsi, S. (2018). Significance of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus Association With Colorectal Cancer. Frontiers in Microbiology, 9, 614. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00614 Purcell, R. V., Pearson, J., Aitchison, A., Dixon, L., Frizelle, F. A., & Keenan, J. I. (2017). Colonization with enterotoxigenic Bacteroides fragilis is associated with early-stage colorectal neoplasia. PLOS ONE, 12(2), e0171602. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171602 Quintero, E., Castells, A., Bujanda, L., Cubiella, J., Salas, D., Lanas, A., Andreu, M., Carballo, F., Morillas, J., Hernández, C., Jover, R., Montalvo, I., Arenas, J., Laredo, E., Hernández, V., Iglesias, F., Cid, E., Zubizarreta, R., Sala, T., Ponce, M., Andrés, M., Teruel, G., Peris, A., 50 Roncales, M., Polo-Tomás, M., Bessa, X., Ferrer-Armengou, O., Grau, J., Serradesanferm, A., Ono, A., Cruzado, J., Pérez-Riquelme, F., Alonso-Abreu, I., De la Vega-Prieto, M., Reyes-Melian, J., Cacho, G., Díaz-Tasende, J., Herreros-de-Tejada, A., Poves, C., Santander, C., González-Navarro, A and COLONPREV Study Investigators. (2012) Colonoscopy versus fecal immunochemical testing in colorectal-cancer screening [published correction appears in N Engl J Med. 2016 May 12;374(19):1898]. N Engl J Med.;366(8):697-706. doi:10.1056/NEJMoa1108895. Rane, C.K Minden, A. P21 activated kinasa signaling in cancer. Semin Cancer Biol. 2019; 54:40-49. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2018.01.006 Raskov, H., Burcharth, J., & Pommergaard, H.-C. (2017). Linking Gut Microbiota to Colorectal Cancer. Journal of Cancer, 8(17), 3378-3395. https://doi.org/10.7150/jca.20497 Rubinstein, M. R., Baik, J. E., Lagana, S. M., Han, R. P., Raab, W. J., Sahoo, D., Dalerba, P., Wang, T. C., & Han, Y. W. (2019). Fusobacterium nucleatum promotes colorectal cancer by inducing Wnt/β‑catenin modulator Annexin A1. EMBO Reports, 20(4). https://doi.org/10.15252/embr.201847638 Rubinstein, M. R., Wang, X., Liu, W., Hao, Y., Cai, G., & Han, Y. W. (2013). Fusobacterium nucleatum Promotes Colorectal Carcinogenesis by Modulating E-Cadherin/β-Catenin Signaling via its FadA Adhesin. Cell Host & Microbe, 14(2), 195-206. https://doi.org/10.1016/j.chom.2013.07.012 Sears, C. L., & Pardoll, D. M. (2011). Perspective: Alpha-Bugs, Their Microbial Partners, and the Link to Colon Cancer. The Journal of Infectious Diseases, 203(3), 306-311. https://doi.org/10.1093/jinfdis/jiq061 Siegel R, Desantis C, Jemal A. Colorectal Cancer Statistics, (2014). CA Cancer J Clin 2014;64:104- 17. Sobhani, I., Amiot, A., Le Baleur, Y., Levy, M., Auriault, M.-L., Van Nhieu, J. T., & Delchier, J. C. (2013). Microbial dysbiosis and colon carcinogenesis: Could colon cancer be considered a bacteria-related disease? Therapeutic Advances in Gastroenterology, 6(3), 215-229. https://doi.org/10.1177/1756283X12473674 51 Sun, Y., An, Q.-M., Tian, X.-Y., Wang, Z.-L., Guan, X.-Y., Dong, B., Zhao, M., & Hao, C.-Y. (2016). Fusobacterium nucleatum infection is correlated with tumor metastasis and postoperative survival of colorectal cancer patients in China. Translational Cancer Research, 5(5), 579-588. https://doi.org/10.21037/tcr.2016.10.45 Tjalsma, H., Boleij, A., Marchesi, J. R., & Dutilh, B. E. (2012). A bacterial driver–passenger model for colorectal cancer: Beyond the usual suspects. Nature Reviews Microbiology, 10(8), 575- 582. https://doi.org/10.1038/nrmicro2819 Townsend, T., Burkitt, M., & Pritchard, D. M. (2017). Infection with Streptococcus gallolyticus Increases Apoptosis in the Murine Colon. Gastroenterology, 152(5), S621. https://doi.org/10.1016/S0016-5085(17)32208-4 Tunsjø, H. S., Gundersen, G., Rangnes, F., Noone, J. C., Endres, A., & Bemanian, V. (2019). Detection of Fusobacterium nucleatum in stool and colonic tissues from Norwegian colorectal cancer patients. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 38(7), 1367-1376. https://doi.org/10.1007/s10096-019-03562-7 Viljoen, K. S., Dakshinamurthy, A., Goldberg, P., & Blackburn, J. M. (2015). Quantitative Profiling of Colorectal Cancer-Associated Bacteria Reveals Associations between Fusobacterium spp., Enterotoxigenic Bacteroides fragilis (ETBF) and Clinicopathological Features of Colorectal Cancer. PLOS ONE, 10(3), e0119462. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119462 Wang, H.-F., Li, L.-F., Guo, S.-H., Zeng, Q.-Y., Ning, F., Liu, W.-L., & Zhang, G. (2016). Evaluation of antibody level against Fusobacterium nucleatum in the serological diagnosis of colorectal cancer. Scientific Reports, 6(1), 33440. https://doi.org/10.1038/srep33440 Warren, R. L., Freeman, D. J., Pleasance, S., Watson, P., Moore, R. A., Cochrane, K., Allen-Vercoe, E., & Holt, R. A. (2013). Co-occurrence of anaerobic bacteria in colorectal carcinomas. Microbiome, 1(1), 16. https://doi.org/10.1186/2049-2618-1-16 Wu, J., Li, Q., & Fu, X. (2019). Fusobacterium nucleatum Contributes to the Carcinogenesis of Colorectal Cancer by Inducing Inflammation and Suppressing Host Immunity. Translational Oncology, 12(6), 846-851. https://doi.org/10.1016/j.tranon.2019.03.003 52 Yamaoka, Y., Suehiro, Y., Hashimoto, S., Hoshida, T., Fujimoto, M., Watanabe, M., Imanaga, D., Sakai, K., Matsumoto, T., Nishioka, M., Takami, T., Suzuki, N., Hazama, S., Nagano, H., Sakaida, I., & Yamasaki, T. (2018). Fusobacterium nucleatum as a prognostic marker of colorectal cancer in a Japanese population. Journal of Gastroenterology, 53(4), 517-524. https://doi.org/10.1007/s00535-017-1382-6 Yörüker, E. E., Holdenrieder, S., & Gezer, U. (2016). Blood-based biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment of colorectal cancer. Clinica Chimica Acta, 455, 26–32. doi:10.1016/j.cca.2016.01.016 Yoshino, Y., Kitazawa, T., Ikeda, M., Tatsuno, K., Yanagimoto, S., Okugawa, S., Ota, Y., & Yotsuyanagi, H. (2012). Clinical features of Bacteroides bacteremia and their association with colorectal carcinoma. Infection, 40(1), 63-67. https://doi.org/10.1007/s15010-011- 0159-8 Yu, J., Feng, Q., Wong, S. H., Zhang, D., Liang, Q. Y., Qin, Y., Tang, L., Zhao, H., Stenvang, J., Li, Y., Wang, X., Xu, X., Chen, N., Wu, W. K. K., Al-Aama, J., Nielsen, H. J., Kiilerich, P., Jensen, B. A. H., Yau, T. O., Wang, J. (2017). Metagenomic analysis of faecal microbiome as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for colorectal cancer. Gut, 66(1), 70-78. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2015-309800 Zauber, A. G., Winawer, S. J., O’Brien, M. J., Lansdorp-Vogelaar, I., van Ballegooijen, M., Hankey, B. F., Shi, W., Bond, J. H., Schapiro, M., Panish, J. F., Stewart, E. T., & Waye, J. D. (2012). Colonoscopic polypectomy and long-term prevention of colorectal-cancer deaths. The New England Journal of Medicine, 366(8), 687-696. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1100370 Zeller, G., Tap, J., Voigt, A. Y., Sunagawa, S., Kultima, J. R., Costea, P. I., Amiot, A., Böhm, J., Brunetti, F., Habermann, N., Hercog, R., Koch, M., Luciani, A., Mende, D. R., Schneider, M. A., Schrotz‑King, P., Tournigand, C., Tran Van Nhieu, J., Yamada, T., Bork, P. (2014). Potential of fecal microbiota for early‑stage detection of colorectal cancer. Molecular Systems Biology, 10(11), 766. https://doi.org/10.15252/msb.20145645 Zhou, Y., He, H., Xu, H., Li, Y., Li, Z., Du, Y., He, J., Zhou, Y., Wang, H., & Nie, Y. (2016). Association of oncogenic bacteria with colorectal cancer in South China. Oncotarget, 7(49). https://doi.org/10.18632/oncotarget.13094 53