UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO TAXONOMIA MULTIFASICA DE HONGOS ENDOFITOS DEL ORDEN HYPOCREALES EN RUBIACEAE DE BOSQUE NATURAL DE COSTA RICA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Posgrado de Doctorado en Ciencias para optar al grado y título de Doctorado en Ciencias EFRAIN ESCUDERO LEYVA Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii DEDICATORIA A mi familia, Patricia y Alejandro. Mis padres. Infinitas gracias por apoyarme en cada paso, en cada etapa. Sin importar la distancia o el tiempo, los llevo presentes a cada lugar con mucho amor. Braulio, Gerardo, Daniel. Mis hermanos. Gracias por compartir esta vida, no importa el rumbo, siempre están ahí. Yayo. Porque algún día este capítulo de mi vida te sirva de inspiración para que alcances los sueños más increíbles que tengas. Algunas cosas pueden parecer nada y lo son todo. Hay que saber ver, aprender a apreciar lo menudo y a despreciar lo que sólo hace bulto. Nada que parece grande ni que reluce en exceso tiene gran validez. Lo bueno es aquello que sin grandes destellos lo llena todo. Carmen Laforet. iii AGRADECIMIENTO El siguiente trabajo fue posible gracias al apoyo financiero de diversas entidades de la Universidad de Costa Rica: Vicerrectoría de la Investigación (VI), Sistemas de Estudios de Posgrado (SEP), Programa de Doctorado en Ciencias (PDC), Centro de Investigación en Productos Naturales (CIPRONA), Escuela de Biología. Fondos adicionales fueron provistos gracias a la beca CeNAT-CONARE de 2017 a 2020, además de realizar parte experimental en el Centro Nacional de Innovaciones Biotecnológicas (CENIBiot). Apoyo económico para asistencia a congresos, experimentos, materiales, entre otros fueron amablemente concedidos por el Centro de Desarrollo de Alternativas Orgánicas (CEDAO-CoopeTarrazú). Agradezco profundamente a mi tutora Priscila Chaverri Echandi, PhD por su guía, enseñanza y todas las increíbles oportunidades brindadas a lo largo de estos años, Agradezco a mi comité de tesis, María del Milagro Montero Granados, PhD por sus lecciones, compañía y asistencia durante los ensayos en campo. Giselle Tamayo Castillo, Dr. rer. Nat. por su paciencia y conocimientos compartidos. A todas las valiosas mujeres en mi comité, gracias por inspirarme y por exigirme alcanzar siempre la excelencia más allá del trabajo. Agradezco la ayuda experta y amistad brindadas por los profesores Max Chavarría, Víctor Vásquez, Lorena Hernández, Alicia Hernández. Con toda la gente que trabaja en CIPRONA y que amablemente me acompaño. Fanny Durán, por siempre ayudar con los trámites administrativos y hacerlos fáciles. Elida Ruballos, por la pronta ayuda en el envío de muestras. A todos en CIPRONA: Gracias por ser primer hogar durante estos años. A las personas en CENIBiot, Randall Loaiza, Emmanuel Araya, Cristofer Orozco, mis agradecimientos por el apoyo y asistencias durante mi estadía. Expresó mi gratitud con el personal de Coopetarrazú, Eduardo Alvarado y Jimmy Porras. Gracias por el apoyo y retroalimentación en los experimentos en campo y por mostrarme el maravilloso mundo del café. A mis amigos en CEDAO, muchas gracias por ayuda y amistad. iv Agradezco profundamente a Laura Aldrich-Wolfe, PhD por brindarme la oportunidad de realizar el intercambio académico en su laboratorio en North Dakota State University (NDSU) y por continuar colaborando en Costa Rica y USA. A Laura y los amigos del laboratorio, Jeffrey, Elena, Ankita, Ethan; así como a los amigos de otros departamentos, Diel, Emma, Eglantina, Abby, infinitas gracias por su amistad y por brindar calor a mi alma durante el duro y no obstante, hermoso invierno. Elena Vásquez, mi compañera, amiga, mi pareja. Mi editora más estricta. Gracias por siempre impulsarme a dar el esfuerzo final. A mis amigos en Costa Rica. Jackie, Laura, Miguel, Tatiana, Cristinina, Pamela, Marvin, Rodrigo, Noelia, Andrés, Antonio, David, Karolina, Cinthia, Andrea, Ernesto, Josué, Stephanie, Blanca….. a todos ustedes, muchas gracias por apoyarme y por brindarme su amistad y sonrisas en los tiempos difíciles. A mis amigos en México, la amistad supera fronteras y tiempo, Rubén, Ismael, Denis, Juan, Emmanuel, Cristóbal, Alfonso. Gracias por renovar mi espíritu en cada visita a casa. A todas las personas que han estado aquí y allá para tenderme su mano, compartir historias y brindar sin importar la razón, GRACIAS. v Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Doctorado en Ciencias de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Doctorado en Ciencias. ______________________________________ Dra. Catalina Salas Durán Representante de la Decana Sistema de Estudios de Posgrado ______________________________________ Dra. Priscila Chaverri Echandi Directora de Tesis ________________________________________ Dra. Giselle Tamayo Castillo Asesora ________________________________________ Dra. María del Milagro Granados Montero Asesora ________________________________________ Dr. Max Chavarría Vargas Representante de la Directora Programa de Doctorado en Ciencias ________________________________________ Efraín Escudero Leyva Candidato vi REFERENCIAS DE LAS PUBLICACIONES A continuación, se enlistan los artículos científicos que conforman el presente documento de tesis. 1. Escudero-Leyva, E., Granados-Montero, MdM., Orozco-Ortíz, C., Araya- Valverde, E., Alvarado-Picado, E., Chaves-Fallas J.M, Aldrich-Wolfe, L. & Chaverri. P. 2023. The endophytobiome of wild Rubiaceae as a source of antagonistic fungi against the American Leaf Spot of coffee (Mycena citricolor). Journal of Applied Microbiology. 134(5). https://doi.org/10.1093/jambio/lxad090 2. Escudero-Leyva, E., Quirós-Guerrero, L., Vásquez-Chaves, V., Pereira-Reyes, R., Chaverri, P. & Tamayo-Castillo, G. 2023. Differential volatile organic compound expression in the interaction of Daldinia eschscholtzii and Mycena citricolor. ACS Omega, 8(34), 31373–31388. https://doi.org/10.1021/acsomega.3c03865 3. Castro-Moretti, F., Cocuron, J-C., Castillo-Gonzales, H., Escudero-Leyva, E., Chaverri, P., Guerreiro-Filho, O., Slot, C.J. & Alonso, A.P. 2023. A metabolomic platform to identify and quantify polyphenols in coffee and related species using liquid chromatography mass spectrometry. Frontiers in Plant Science. 13:1057645. doi: 10.3389/fpls.2022.1057645 4. Escudero-Leyva, E., Alfaro-Vargas, P., Muñoz-Arrieta, R., Charpentier-Alfaro, C., Granados-Montero, MdM., Valverde-Madrigal, K.S., Pérez-Villanueva, M., Méndez-Rivera, M., Rodríguez-Rodríguez, C.E., Chaverri, P. & Mora-Villalobos, J.A. 2022. Tolerance and Biological Removal of Fungicides by Trichoderma Species Isolated from the Endosphere of Wild Rubiaceae Plants. Front. Agron. 3:772170. doi: 10.3389/fagro.2021.772170 5. Zuffa S., Schmid R., Bauermeister A., Gomes PWP., Caraballo-Rodriguez A.M., Abiead Y.E., Aron A.T., Gentry E.C., Zemlin J., Meehan M.J., Avalon N.E., Cichewicz R.H., Buzun E., Terrazas M.C., Hsu C., Oles R., Ayala A.V., Zhao J., Chu H., Kuijpers M.C.M., Jackrel S.L., Tugizimana F., Nephali L.P., Dubery I.A., Madala N.E., Moreira E.A., Costa-Lotufo L.V., Lopes N.P., Rezende-Teixeira P., Jimenez P.C., Rimal B., Patterson A.D., Traxler M.F., de Cassia Pessotti R., Alvarado-Villalobos D., Tamayo-Castillo G., Chaverri P., Escudero-Leyva E, Quiros-Guerrero L., Bory A.J., Joubert J., Rutz A., Wolfender J., Allard P., Sichert A., Pontrelli S., Pullman B.S., Bandeira N., Gerwick W.H., Gindro K., Massana- Codina J., Wagner B.C., Forchhammer K., Petras D., Aiosa N., Garg N., Liebeke M., Bourceau P., Kang K.B., Gadhavi H., de Carvalho L.P.S., dos Santos M.S., Pérez-Lorente A.I., Molina-Santiago C., Romero D., Franke R., Brönstrup M., de León A.V.P., Pope P.B., La Rosa S.L., Barbera G.L., Roager H.M., Laursen M.F., Hammerle F., Siewert B., Peintner U., Licona-Cassani C., Rodriguez-Orduña L., Rampler E., Hildebrand F., Koellensperger G., Schoeny H., Hohenwallner K., Panzenboeck L., Gregor R., O’Neill E.C., Roxborough E.T., Odoi J., Bale N.J., Ding S., Sinninghe Damsté J.S., Guan X.L., Cui J.J., Ju K., Silva D.B., Ribeiro Silva F.M., da Silva G.F., Koolen H.H.F., Grundmann C., Clement J.A., Mohimani H., Broders K., McPhail K.L., Ober-Singleton S.E., Rath C.M., McDonald D., https://doi.org/10.1093/jambio/lxad090 vii Knight R., Wang M., Dorrestein P.C. A Taxonomically-informed Mass Spectrometry Search Tool for Microbial Metabolomics Data. doi:10.1101/2023.07.20.549584. PPR:PPR695223. 6. Montero-Vargas, M., Umaña-Jiménez, J.C., Escudero-Leyva, E. & P. Chaverri. 2020. Análisis filogenético de secuencias ITS provenientes de hongos endófitos utilizando Inferencia Bayesiana Paralela de árboles con Exabayes. Revista Tecnología en Marcha, 33(5), Pág. 74-79. https://doi.org/10.18845/tm.v33i5.5079 7. Montero-Vargas, M., Escudero-Leyva, E., Díaz-Valerio, S. & P. Chaverri. 2020. Step-by-step pipeline for the ecological analysis of endophytic fungi using ITS nrDNA Data. Current Protocols in Microbiology. https://doi.org/10.1002/cpmc.96 Participación en conferencias. Participación oral. 1. 2023. Escudero-Leyva E., Morera-Uribe, D., Rivera-Serracín, K., Sandí-Bolaños, C., Vásquez-Cháves, V., Tamayo-Castillo, G. y Chaverri, P. Diversidad de Trichoderma endófitas de Rubiaceae silvestre y su relación con el volatiloma. 2023. XI Congreso Latinoamericano de Micología. Ciudad de Panamá. Panamá. 2. 2021. Chaverri, P., Slot, J., Alonso, A.P., Castillo-Gonzalez, H., Escudero-Leyva, E., Scott, K., Castro-Moretti, F., Alvarado-Picado, E., Granados-Montero, M.M. The mycobiome of wild Rubiaceae to improve the health of coffee plants. 2021. 28th Conference of the Association for the Science and Information on Coffee (ASIC). Montpellier, France. 3. 2021. Escudero-Leyva E., Chaverri, P. Endophytic fungi: from natural forest to the coffee plantations. Researcher Iberoamerican Night. 4. 2019. Escudero-Leyva E., Granados-Montero, M.M., Alvarado, E., Slot, J.C., Alonso, A.P., Chaverri, P. Endophytic Trichoderma species with fungicide tolerance. Mycological Society of America annual meeting. Minneapolis, MN, USA. Poster. 1. 2022. Scott K., H. Castillo-Gonzalez, G. Valero-David, L. Slattery, E. Escudero- Leyva, P. Chaverri, J. Slot. Genome comparison of 45 fungal endophytes from Rubiaceae. 31st Fungal Genetics Conference. Asilomar, CA, USA. 2. 2018. Escudero-Leyva, E., H. Castillo González, P. Juárez, M. D. M. Granados, E. Alvarado, P. Chaverri. A first look at culture-dependent endophytic fungal diversity of wild Rubiaceae in Costa Rica. International Mycological Congress. San Juan, Puerto Rico. Jul. 2018. 3. 2018. Castillo-González H., M. Steward, P. Juárez, Escudero-Leyva, E., J. Slot, A. P. Alonso, P. Chaverri. Effect of the leaf developmental stage on the chemical and fungal endophytic composition in wild Rubiaceae. International Mycological Congress. San Juan, Puerto Rico. Jul. 2018. viii TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA .................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... iii REFERENCIAS DE LAS PUBLICACIONES ..................................................................... vi TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................ viii RESUMEN ............................................................................................................................. x ABSTRACT ........................................................................................................................... xi LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................ xii CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1 CAPÍTULO II. HIPOTESIS Y OBJETIVOS ......................................................................... 4 CAPÍTULO III. MATERIALES Y METODOS .................................................................... 5 3.1 Aislamiento, caracterización y pruebas de antagonismo de los hongos endófitos provenientes de Rubiaceae contra Mycena citricolor. ............................................................ 5 3.1.1 Sitios de estudio. .................................................................................................... 5 3.1.2 Aislamiento e identificación de hongos endófitos de Rubiaceae. ......................... 5 3.1.3 Pruebas de antagonismo in vitro contra Mycena citricolor. .................................. 5 3.1.4 Pruebas de antagonismo en planta. ........................................................................ 6 3.1.5 Pruebas estadísticas. ............................................................................................... 6 3.2 Tolerancia de los endófitos a fungicidas. .......................................................................... 7 3.2.1 Pruebas en medio sólido. ....................................................................................... 7 3.2.2 Pruebas en medio líquido. ...................................................................................... 7 3.2.3 Pruebas estadísticas. ............................................................................................... 8 3.3 Diferencias en el volatiloma de un endófito durante su interacción con el patógeno de café Mycena citricolor. ........................................................................................................... 8 3.3.2 Experimento en co-cultivo. .................................................................................... 8 ix 3.3.3 HS y HS-SPME-GCMS. ........................................................................................ 9 3.3.4 Procesamiento de datos. ......................................................................................... 9 3.3.5 Análisis estadísticos para el dataset de GCMS. ................................................... 10 3.3.6 Actividad in vitro de los compuestos sintéticos contra estructuras de M. citricolor. ...................................................................................................................... 10 3.3.7 Análisis en UHPLC-HRMS. ................................................................................ 10 3.3.8 Procesamiento de datos UHPLC-HMRMS/MS. ................................................. 11 3.4 Identificación de polifenoles en plantas de café y especies de Rubiaceae afines. .......... 12 3.4.1 Recolección de hojas. .......................................................................................... 12 3.4.2 Extracción de metabolitos secundarios. ............................................................... 12 3.4.3 Metabolómica no dirigida. ................................................................................... 13 3.4.4 Metabolómica dirigida. ........................................................................................ 13 3.4.5 Análisis estadísticos. ............................................................................................ 14 CAPÍTULO IV. RESULTADOS ......................................................................................... 15 4.1 Aislamiento y caracterización de hongos endófitos. ...................................................... 15 4.2 Actividad antagonista contra el patógeno de café Mycena citricolor. ............................ 35 4.3 Tolerancia a fungicidas. .................................................................................................. 48 4.4 Diferencias en el volatiloma de un endófito durante su interacción con el patógeno de café Mycena citricolor. ......................................................................................................... 64 4.5 Metabolómica en plantas de café y parientes silvestres de Rubiaceae. .......................... 83 4.6 Herramienta para la anotación de compuestos derivados de microorganismos. .......... 117 CAPÍTULO V. DISCUSION GENERAL .......................................................................... 134 CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES GENERALES ........................................................... 139 BIBLIOGRAFIA GENERAL ............................................................................................. 141 x RESUMEN Los problemas fitosanitarios relacionados al café en Latinoamérica y otras áreas en el mundo, han registrado un aumento en la frecuencia y la severidad de las enfermedades producidas por hongos como Hemileia vastatrix ó Mycena citricolor. Los hongos endófitos son importantes simbiontes de plantas, conocidos por tener un amplio rango de papeles ecológicos, habitando los tejidos internos sin causar efectos negativos aparentes o inmediatos en la salud del hospedero. Basados en la hipótesis de que los hongos endófitos aislados de bosques prístinos pueden conferir protección a las plagas a través de diferentes mecanismos, el presente trabajo comprende el aislamiento de hongos endófitos de plantas silvestres de Rubiaceae de áreas naturales de Costa Rica para probarlos contra patógenos que afectan al café. Se presentó un protocolo para analizar datos ITS fúngicos, desde el preprocesamiento de calidad de secuencias hasta la clasificación taxonómica, asignación de rasgos funcionales y análisis filogenético, clasificando 1400 aislamientos de hongos endófitos de Rubiaceae silvestre en aproximadamente 800 especies. Para comenzar a generar una alternativa verde para el control de M. citricolor, se seleccionaron los hongos endófitos Daldinia eschscholzii GU11N, Nectria pseudotrichia GUHN1, Purpureocillium aff. lilacinum CT24, Sarocladium aff. kiliense CT25, Trichoderma rifaii CT5, T. aff crassum G1C, T. aff. atroviride G7T, T. aff. strigosellum GU12 y Xylaria multiplex GU14T. Los aislamientos de Trichoderma spp. produjeron los mayores porcentajes de inhibición del crecimiento in vitro. Posteriormente, se verificó la colonización endofítica, seguida de ensayos de promoción y antagonismo del crecimiento in planta, demostrando que Trichoderma CT5 y G1C tienen potencial para promover el crecimiento de las plantas y antagonizar contra M. citricolor, reduciendo la incidencia, la severidad y previniendo la mortalidad de las plantas. Estos dos aislamientos posteriormente mostraron tolerancia a fungicidas, obteniendo que CT5 tiene capacidad de remoción de hasta 89% para clorotalonil, 46,4% para ciproconazol y 33,1% para trifloxistrobina. En el caso de la azoxistrobina, la mayor remoción (82,2%) se produjo por adsorción a la biomasa fúngica, al mismo tiempo que detoxifica la matriz acuosa. Posteriormente, se compararon los perfiles volátiles de GU11N con y sin la presencia del patógeno M. citricolor mediante ensayos sin contacto y de cultivo dual, utilizando métodos de GC- MS-HS-SPME y UHPLC-HRMS/MS para identificar compuestos no volátiles de extractos orgánicos de los micelios involucrados en la interacción. Los resultados mostraron más compuestos volátiles usando HS-SPME (39 componentes) que con la técnica HS (13 componentes), compartiendo solo 12 compuestos. Las pruebas estadísticas sugirieron que D. eschscholtzii inhibe el crecimiento de M. citricolor a través de la liberación de COVs que contienen una combinación de 1,8-dimetoxinaftaleno y compuestos terpénicos afectando las estructuras reproductivas del patógeno, por lo que se corroboraron los efectos nocivos del 1,8-dimetoxinaftaleno en una prueba in vitro confirmando el daño estructural con fotografías SEM. Los datos de UHPLC-HRMS/MS, revelaron un predominio de derivados de ácidos grasos entre los compuestos identificados. Como parte del estudio de las plantas de Rubiaceae de donde provenían los endófitos, se desarrolló un flujo de trabajo de alto rendimiento para identificar diversos fitoquímicos. El estudio de metabolitos secundarios se realizó en hojas de una variedad comercial de café y dos especies silvestres de Rubiaceae, siendo la cafeína, la trigonelina y la teobromina muy abundantes en las hojas de café, mientras que las moléculas relacionadas con la defensa química, como los fenilpropanoides, el ácido giberélico y el monolignol sinaldehído se encontraron más abundantemente en las hojas silvestres de Rubiaceae. Finalmente, se colaboró integrando datos taxonómicos y metabolómicos a la plataforma MicrobeMASST, una herramienta de búsqueda de espectrometría de masas con información taxonómica altamente curada para la anotación de metabolitos microbianos en experimentos de metabolómica no dirigidos. Esta plataforma contiene 60 000 monocultivos microbianos, permitiendo buscar espectros de MS/MS conocidos y desconocidos y vincularlos con sus respectivos productores microbianos a través de patrones de fragmentación de MS/MS. xi ABSTRACT The phytosanitary problems related to the coffee in Latin America and other producer regions around the globe, have experienced an increase in the frequency and severity of the diseases produced by fungi like Hemileia vastatrix or Mycena citricolor, in part, because of the climate change. The endophytic fungi are important plant symbionts, known because of their wide ecological guilds, inhabiting the internal tissues without causing immediate negative damages in their hosts. Based in the hypothesis that, endophytic fungi isolated from pristine areas can confer protection against pathogens through different mechanisms, the current work, includes the endophytic fungi isolation from wild Rubiaceae plants in natural areas in Costa Rica to test them against coffee pathogens. A protocol to analyze fungal ITS data is presented, including the steps from the pre-processing of raw sequences up to the taxonomical classification, ecological guilds and phylogenetic analyses. With this, 1400 endophytic isolates from wild Rubiaceae plants were classified in nearly 800 species. Later, to propose a green alternative against M. citricolor, the following fungi were selected Daldinia eschscholzii GU11N, Nectria pseudotrichia GUHN1, Purpureocillium aff. lilacinum CT24, Sarocladium aff. kiliense CT25, Trichoderma rifaii CT5, T. aff crassum G1C, T. aff. atroviride G7T, T. aff. strigosellum GU12 and Xylaria multiplex GU14T. From this, the isolates belonging to Trichoderma spp. obtained the better inhibition values on in vitro conditions. Later, thee endophytic colonization was confirmed and Trichoderma CT5 and G1C resulted with growth promotion and antagonistic capacities against M. citricolor, reducing incidence, severity and preventing mortality, in tests with coffee plantlets. These two isolates also resulted with tolerance to fungicides, where CT5 had a remotion capacity of 89% for clorotalonil, 46.4% for ciproconazol and 33.1% for trifloxistobine, according to available biomass. For azoxistrobine, the remotion (82.2%) occurred as a result of absorption to the fungal biomass, while detoxification of the matrix was a simultaneous process. In the third part of the results, the volatile profiling of GU11N with and in the absence of M. citricolor was done through contactless and in coculture experiments, using GC-MS-HS-SPME and UHPLC-HRMS/MS to identify the non- volatile compounds from the organic extractions from mycelia recovered from the interaction zone. Results showed more volatile compounds using HS-SPME (39 components) rather than HS (13 components), sharing only 12 compounds. The statistical tests suggested that D. eschscholtzii was inhibiting the growth of M. citricolor trough the release of VOCs containing a combination of 1,8- dimethoxynaphtalene and terpenic compounds, affecting the reproductive structures of the pathogen, this was confirmed with an-in vitro test, obtaining SEM photographs with evidence of the structural damage in the pathogen. The UHPLC-HRMS/MS data revealed many fatty acids among the determined compounds. As part of the study related to the Rubiaceae plants from where the endophytes were retrieved, a pipeline for identification and quantification of polyphenols was done. The workflow was optimized to extract over 40 families of phytochemicals and the developed metabolomic platform was able of identification and quantification of 184 polyphenols in 15 minutes. The study of secondary metabolites was performed in leaves of coffee and two wild species of Rubiaceae. Caffeine, trigonelline and theobromine were abundant in the coffee leaves, while compounds related to the chemical defense, like phenylpropanoids, gibberellic acid and monolignol sinaldehyde were found abundantly in the wild Rubiaceae. Finally, as part of the collaboration with the MicrobeMASST platform, the taxonomic and metabolomic data related to the endophytes was integrated. This is a tool for the search of mass spectrometry with highly curated taxonomic data for the annotation of microbial metabolites in non-targeted metabolomic experiments. This platform contains 60 000 microbial monocultures, allowing to search for known and unknown MS/MS spectra and link them with their current microbial producer’s trough the MS/MS fragmentation patterns. xii LISTA DE ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico. CVOs Compuestos volátiles orgánicos. ITS Subregión interna de transcripción. PDA Papa-Dextrosa-Agar. PDB Caldo-Papa-Dextrosa. PCR Reacción en cadena de la polimerasa. RPB2 gen de la RNA polimerasa II. TEF Factor de traslación de la elongación. GCMS Cromatografía Gaseosa acoplada a Masas (Gas Chromatography Mass Spectrometry). HS Espacio de cabeza (Headspace). SPME Microextracción de Fase Sólida (Solid Phase Microextraction). UHPLC-HMRMS/MS Cromatografía Líquida de Ultra Alto Rendimiento acoplada a Masas (Ultra High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry). 1 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Los problemas fitosanitarios relacionados al café en Latinoamérica, así como en otras áreas productoras en el mundo, han registrado un aumento en la frecuencia y la severidad debido entre varias causas, a los efectos derivados del cambio climático como lo son las alteraciones en los ciclos de lluvia y sequía (Alpízar et al., 2020). Esto ha disparado la presencia de hongos patógenos como la roya (Hemileia vastatrix Berk. and Broome), la cual es considerada actualmente como la enfermedad causante de las mayores pérdidas de café en el mundo (Libert Amico et al., 2020; Talhinhas et al., 2017); o como el “ojo de gallo”, enfermedad restringida al continente Americano causada por Mycena citricolor Berk. and Broome; la cual es particularmente severa durante períodos de lluvia prolongados, registrando pérdidas de hasta 60 millones de dólares solamente en Costa Rica (Granados-Montero et al., 2020). Aunado a otras plagas, la investigación científica enfocada en reducir el impacto en este importante cultivo puede considerarse como prioritaria no sólo en Costa Rica sino en todos los países productores como Brasil, Colombia y México. Actualmente, el uso de agroquímicos como los fungicidas es una práctica ampliamente común ya que reduce la severidad de las plagas, sin embargo, existen efectos negativos relacionados a la contaminación del agua y suelo, así como alteraciones en la salud humana (Alpízar et al., 2020), lo que está generando presión en la transición hacia una agricultura con mejores prácticas por el ambiente (Lee et al., 2015). Algunas de las estrategias involucran la detección temprana de los patógenos, mejora en las varietales del café, uso de microorganismos como controladores biológicos y la aplicación de compuestos derivados de los mismos (Avelino et al., 2015). Dichas estrategias, han atraído la atención de los productores y consumidores, quienes se preocupan cada vez más por prácticas más verdes, especialmente aquellas que incluyen microorganismos con potencial antagonista (Pinto et al., 2014). No obstante, existen retos para la utilización intensiva de microbios, como la tolerancia a los agroquímicos o los factores ambientales (por ejemplo, radiación UV, exposición al viento, etc.) que podrían afectar la efectividad de estos en campo (Gharieb et 2 al., 2004). Dentro de las alternativas mejor estudiadas, los hongos endófitos conforman un grupo interesante de organismos con una alta diversidad por descubrir en los trópicos (Pujade-Renaud et al., 2019b). La evidencia sugiere que los hongos endófitos son importantes simbiontes de plantas con registros que datan de más de 400 millones de años (Rodriguez et al., 2009); estos organismos son conocidos por tener un amplio rango de papeles ecológicos, habitando los tejidos internos de la planta sin causar efectos negativos aparentes o inmediatos en la salud del hospedero. Además, algunas especies endófitas han sido exitosamente inoculadas en plantas hospedero y puestas en pruebas de resistencia a la sequía, promoción del crecimiento, inducción en la tolerancia a metales pesados, entre otros (Barberis et al., 2021; Busby et al., 2016; Hubbard et al., 2014). El proceso de colonización puede ocurrir a través de aperturas naturales en las plantas, alcanzando la albura, hojas e incluso semillas (Bernardi-Wenzel et al., 2010). La trasmisión de hongos endófitos puede ocurrir de manera horizontal o bien, de la planta madre a la hija durante la formación de las semillas (trasmisión vertical), dependiendo de la planta hospedero y la Clase a la cual pertenece el endófito (Rodriguez et al., 2009). La comparación de la diversidad de hongos endófitos entre plantas usadas en monocultivos y aquellas habitando bosques prístinos ha demostrado patrones de riqueza biológica que favorecen a aquellas especies de bosque (Evans et al., 2003; Sternhagen et al., 2020). Esto se ha observado en monocultivos de árboles del género Hevea, que, comparados con sus parientes silvestres, sufren una pérdida de riqueza en el endobioma (Gazis & Chaverri, 2010). De acuerdo con esto, la Familia Rubiaceae, donde se encuentra Coffea arabica L., es una Familia altamente diversa en los trópicos (Manns et al., 2012); y basados en la hipótesis de que los hongos endófitos aislados de bosques prístinos pueden conferir protección a las plagas a través de diferentes mecanismos, como el antagonismo, posterior a la colonización de los tejidos internos de la planta hospedera (De Souza et al., 2008a; Pujade-Renaud et al., 2019), y con datos que sostienen que aquellos endófitos provenientes de plantas filogenéticamente cercanas tendrán mayores rangos de colonización y protección, el presente trabajo comprende el aislamiento de hongos endófitos de plantas 3 silvestres de Rubiaceae de áreas naturales de Costa Rica para probarlos contra patógenos concernientes al café. Como parte del proyecto, se propuso la utilización de metabolómica no dirigida en ciertas especies de hongos seleccionadas para detectar los posibles compuestos involucrados en la actividad antagonista. Por ejemplo, se sabe que los endófitos son capaces de producir compuestos volátiles orgánicos (CVOs) con actividad biológica (Liarzi et al., 2016). Algunos efectos benéficos en las plantas producidos por los CVOs son: promoción del crecimiento, efectos antimicrobianos y antifúngicos (Morath et al., 2012; Wang et al., 2017). La producción de estos CVOs y otros metabolitos secundarios, derivan de relaciones diversas e intrincadas entre los endófitos y sus hospederos, resultando en profundas interacciones ecológicas (Flores-Reséndiz et al., 2021). Por ello, este trabajo también comprende el estudio de los metabolitos secundarios volátiles y no volátiles de ciertas especies de hongos y de especies de plantas de Rubiaceae silvestre, para futuras hipótesis sobre las relaciones intra e inter-especie. 4 CAPÍTULO II. HIPOTESIS Y OBJETIVOS 1. Hipótesis Las especies de Rubiaceae en bosques prístinos de Costa Rica contienen especies fúngicas endófitas con potencial para controlar plagas a través de diversos mecanismos y colonizan los tejidos internos de las plantas de café gracias a su cercanía filogenética dentro de la Familia botánica. Al ocurrir la colonización, son observados efectos benéficos en las plantas de café. 2. Objetivo general Resolver la clasificación taxonómica de hongos endófitos aislados plantas de Rubiaceae silvestre a través de un acercamiento multifásico y correlacionar sus propiedades antifúngicas contra problemas fitosanitarios del café. 2.1 Objetivos específicos 2.1.1 Aislar e identificar una colección de hongos endófitos de Rubiaceae silvestre de áreas naturales de Costa Rica. 2.2.2 Obtener una filogenia selecta de hongos con potencial como biocontroladores. 2.2.3 Determinar si los caracteres químicos (metabolitos secundarios) se correlacionan con la actividad antifúngica. 5 CAPÍTULO III. MATERIALES Y METODOS 3.1 Aislamiento, caracterización y pruebas de antagonismo de los hongos endófitos provenientes de Rubiaceae contra Mycena citricolor. 3.1.1 Sitios de estudio. Se muestrearon plantas de Rubiaceae silvestre provenientes de bosques naturales de Costa Rica: Volcán Miravalles y Rincón de la Vieja en el Área de Conservación Guanacaste (ACG) (10.7477 N, 85.1612 W) y bosques privados en los alrededores de Río Claro en el Área del Pacifico Sur (PSA) (8.6389 N, 83.0914 W) en Costa Rica. 3.1.2 Aislamiento e identificación de hongos endófitos de Rubiaceae. Los aislamientos se obtuvieron a partir de hojas de plantas de Rubiaceae silvestre, siguiendo los protocolos descritos en (Gazis & Chaverri, 2010). Los aislamientos se conservaron en glicerol 20% a –80 °C y a temperatura ambiente en el Centro de Investigación en Productos Naturales (CIPRONA) de la Universidad de Costa Rica. Estos aislamientos se cultivaron en placas Petri de 10 cm de diámetro con PDA (Difco Laboratories, USA). Después de siete días el micelio se cosechó de la superficie y se realizó la extracción de ADN con el kit PrepMan Ultra (Applied Biosystems, USA). Se realizaron PCR usando los primers ITS4 e ITS5 (Schoch et al., 2012), posteriormente se usaron los primers EF728Mf y EF1R para obtener la región TEF (Carbone & Kohn, 1999), finalmente, se amplificó la región RPB2 usando los primers RPB2-5F y RPB2-7CR (Liu et al., 1999). El proceso de edición, alineamiento, comparación con bases de datos y construcción de la filogenia se describen en (Montero-Vargas et al., 2020a) y (Montero Vargas et al., 2020b). 3.1.3 Pruebas de antagonismo in vitro contra Mycena citricolor. Se seleccionaron nueve endófitos basados en la relación filogenética de los taxa con su habilidad antagonista: Daldinia eschscholtzii GU11N, Nectria pseudotrichia GUHN1, Purpureocillium aff. lilacinum CT24, Sarocladium aff. kiliense CT25, Trichoderma rifaii CT5, T. aff. crassum G1C, T. aff. atroviride G7T, T. aff. strigosellum GU12 y Xylaria multiplex GU14T. El patógeno Mycena citricolor se aisló de plantas de café infectadas en 6 San Marcos de Tarrazú. Se colectaron los pseudopileos y se transfirieron a placas Petri con medio PDA. Para los experimentos de confrontación in vitro, patógeno y endófito fueron colocados de manera yuxtapuesta a 5 mm del borde de una placa Petri y su crecimiento se midió cada 24 h por 5 días a temperatura ambiente hasta registrar el contacto. Se midieron rangos de crecimiento control para cada hongo y se calculó el porcentaje de inhibición. 3.1.4 Pruebas de antagonismo en planta. Para este ensayo se trabajó con plántulas de café (Coffea arabica cv. caturra). Se utilizaron 20 plántulas por tratamiento y se trasladaron a contenedores herméticos previamente esterilizados con 700 g de sustrato Berger Custom Blend (Canadá). Los tratamientos fueron i) plantas con el endófito CT5; ii) plantas con el endófito G1C y iii) plantas sin endófito. Cada una de las plántulas dentro de los tratamientos (i) y (ii) se inocularon con 15 mL de una suspensión de esporas a una concentración de 1 × 107 conidios/mL. Las plantas sin endófito se irrigaron únicamente con 15mL de agua destilada estéril. Para confirmar la colonización de endófitos en diferentes tejidos (tallos y hojas), se siguió el procedimiento detallado en (Escudero-Leyva et al., 2023). El experimento de antagonismo se realizó utilizando bloques de 10 plantas por tratamiento, para un total de 30 plantas por tratamiento. Las plantas fueron infectadas con el patógeno Mycena citricolor en cada tratamiento. Cada semana, las plantas fueron monitoreadas para detectar síntomas de infección y signos del patógeno, y para mantener la humedad >90%. Después de 4 semanas, se midieron los diámetros de las lesiones causadas por M. citricolor (en mm). También se registraron otros parámetros, como el número de hojas infectadas (se inocularon tres hojas/planta con el patógeno), la defoliación (%), el número de pseudopilei y la mortalidad de las plantas. 3.1.5 Pruebas estadísticas. Las variables medidas en el proceso de colonización de endófitos y el ensayo de antagonismo se sometieron a pruebas de normalidad y los datos se transformaron en consecuencia: transformación log10 para altura de planta y raíz cuadrada para longitud de raíz y número de hojas en el experimento de colonización; raíz cuadrada para hojas infectadas. Luego, se utilizaron modelos mixtos lineales generalizados (GLMM) para 7 inferir el efecto de los tratamientos utilizando el paquete lmer v.3.1.3 debido al diseño del modelo de parcelas divididas derivado del arreglo del experimento. Los modelos consideraron los bloques y contenedores como efectos aleatorios y tratamientos como el efecto fijo. La significación entre los tratamientos se determinó mediante la prueba post hoc Tukey HSD. Todas las pruebas y gráficos se realizaron utilizando el software R v.4.1.3 (R Core Team, 2020). 3.2 Tolerancia de los endófitos a fungicidas. Para esta etapa se trabajó solo con los aislamientos pertenecientes al género Trichoderma: Trichoderma rifaii CT5, T. aff. crassum G1C, T. aff. atroviride G7T, T. aff. strigosellum GU12. 3.2.1 Pruebas en medio sólido. Se ensayó la capacidad de crecimiento en medio sólido que contenía fungicidas residuales para cuatro aislamientos. Se probaron siete fungicidas de uso común en cafetales: azoxistrobina (sistémico), clorotalonil (no sistémico), ciproconazol (sistémico), propineb (sistémico), tolclofos-metil (no sistémico), trifloxistrobina (sistémico) y validamicina-A. (no sistémico). Los fungicidas se agregaron al PDA después de la esterilización de los medios para evitar su degradación. Se colocaron discos de micelio (∼5 mm de diámetro) a 5 mm del borde de la placa. Como se observó tolerancia fúngica con las dosis completas, no se realizaron concentraciones ni diluciones adicionales. El crecimiento radial (mm) se midió cada 24 h durante 5 días con un fotoperíodo de 12 h a 25◦C ± 2. 3.2.2 Pruebas en medio líquido. Para este ensayo, solo se usaron los aislamientos T1, T2 y T4 debido a su capacidad para producir abundantes conidios para la producción de biomasa. Se evaluó su capacidad de biodegradación frente a los ingredientes activos de los fungicidas azoxistrobina, clorotalonil, ciproconazol y trifloxistrobina. Se realizó un experimento independiente para cada fungicida con tres aislados por separado. Se agregaron fungicidas comerciales a los medios PDB de acuerdo con la dosis recomendada para el café. Los experimentos se realizaron por triplicado, incluyendo: (i) controles abióticos (sin inocular) para evaluar la 8 degradación por factores abióticos; (ii) controles muertos por calor (HKC; que contienen biomasa esterilizada en autoclave cultivada previamente en condiciones idénticas, pero sin el fungicida) para evaluar la adsorción; y (iii) control de crecimiento (biomasa fúngica viable sin fungicida) para determinar el peso seco final. Todos los cultivos se cultivaron durante 14 días en un agitador rotatorio (250 rpm) a 21°C en la oscuridad. Las pruebas analíticas, así como de citotoxicidad se detallan en (Escudero-Leyva et al., 2022). 3.2.3 Pruebas estadísticas. Todas las estadísticas y gráficos se realizaron utilizando R Core Team (2020). El efecto de los fungicidas sobre los diferentes aislados de Trichoderma en fase sólida se analizó mediante un Análisis de Varianza (ANOVA) de una vía para cada fungicida. Los datos de biodegradación de cada fungicida se procesaron para generar un gráfico múltiple de concentración frente al tiempo y la variabilidad de la muestra se calculó como una desviación estándar (±SD). 3.3 Diferencias en el volatiloma de un endófito durante su interacción con el patógeno de café Mycena citricolor. 3.3.1 Experimento sin contacto para Daldinia eschscholtzii y Mycena citricolor. Se siguió la técnica del “sándwich”, descrita previamente (Liarzi et al., 2016), cultivando ambos hongos en cajas de Petri independientes de 90 mm con PDA. El inóculo consistió en discos de micelio (~5 mm) colocados a 5 mm del borde de la placa de Petri. Los discos de micelio de Daldinia se colocaron en la placa inferior y los de Mycena citricolor en la placa superior, frente a Daldinia. Se midió el crecimiento radial (mm) de M. citricolor cada 24 h durante 10 días. Se realizaron diez repeticiones para el experimento. Todas las placas se incubaron a 25ºC con ciclos de luz/oscuridad de 12h. 3.3.2 Experimento en co-cultivo. Para este experimento se utilizaron cajas de Petri de 90 mm con 20 mL de PDA para cultivar los aislados de Daldinia y Mycena de forma independiente y en un experimento dual con ambos hongos (“co-cultivo”) en la misma placa. Después de diez días, se recolectaron cinco discos de micelio del borde de cada cultivo independiente y tres de la 9 línea de confrontación del grupo experimental de cocultivo y se colocaron dentro de viales con tapa de rosca de 20 ml con tapones de PTFE/silicona durante 24 horas. h a 25ºC. La mitad de los micelios de los cultivos independientes y los micelios adyacentes de la línea de confrontación se recolectaron con un bisturí estéril y se almacenaron en viales de 20 ml prepesados y se liofilizaron inmediatamente durante 24 horas. 3.3.3 HS y HS-SPME-GCMS. Los viales con el disco dentro se preequilibraron durante 15 min a 45 °C. Se expuso una fibra PDMS SPME de 100 µm al espacio libre de la muestra durante 15 min a la misma temperatura con agitación en el muestreador automático. Posteriormente, la fibra SPME se desorbió térmicamente a 250 °C durante 10 min en el inyector GC-MS. Las mediciones de compuestos volátiles se realizaron con un cromatógrafo de gases Trace 1310 (Thermo Scientific) con un sistema detector de masas de triple cuadrupolo TSQ 9000 (Agilent Technologies, EE. UU.), equipado con una columna capilar TG-5MS (30 m de longitud × 25 µm de diámetro interno × 1 espesor de la película, Thermo Scientific, EE. UU.). El inyector de cada muestra estaba en modo dividido con un radio dividido de 10 y el caudal del gas portador (helio, 99,999 % de pureza) era de 1,2 ml/min. El programa de temperatura se fijó de la siguiente manera: inicialmente 60°C durante 3 min, se aumentó a 200°C a razón de 10°C/min, luego se aumentó a 290°C a razón de 15°C/min, y finalmente, mantenido durante 2 min. El cromatógrafo de gases se ajustó al modo de ionización EI, flujo de 1 ml/min, rango de masas de 33-550 amu, línea de transferencia a 280 ºC y fuente de iones a 260 ºC. 3.3.4 Procesamiento de datos. Los archivos provenientes de las corridas de GCMS se procesaron y analizaron usando los softwares MZMine (Smirnov et al., 2018), AMDIS y la plataforma GNPS (Global Natural Products Social Network) (Allegra et al., 2020). Los detalles de los parámetros y otras condiciones pueden consultarse en (Escudero-Leyva, Quirós-Guerrero, et al., 2023). 10 3.3.5 Análisis estadísticos para el dataset de GCMS. La tabla de cuantificación en formato .csv obtenida de los experimentos HS y HS-SPME se normalizó por la suma de cada muestra para realizar pruebas ANOVA en R v.4.1.3 88. Debido a la mayor cantidad de características detectadas para el HS-SPME experimento, se realizaron las siguientes pruebas multivariadas aplicando una escala de Pareto: Análisis de Componentes Principales (PCA) usando los paquetes R FactoMineR v.2.4 89 y FactoExtra v.1.0.7 90 seguido de un Análisis Dependiente de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS-DA) con el paquete mixOmics v.6.6.2 91 en R v.3.5.1. Se realizó un análisis secundario de PCA y PLSDA para los datos de HS-SPME utilizando solo las características detectadas también en el experimento de HS para comparar de manera justa las detecciones de ambas herramientas. 3.3.6 Actividad in vitro de los compuestos sintéticos contra estructuras de M. citricolor. Se saturaron discos de papel filtro (0,5 mm de diámetro) con 1, 10 y 100 µL de la mezcla de terpenos (Supelco, CRM40937, EE. UU.) por duplicado. El 1,8-dimetoxinaftaleno se resuspendió en 509 µL de éter. Los discos de filtro se saturaron por triplicado con 10, 50 y 100 µL usando una jeringa de 100 µL. Los discos se secaron al aire y se colocaron en placas de Petri (6 cm de diámetro) junto con fragmentos de estructuras de M. citricolor; las placas se sellaron con Parafilm y se dejaron en temperatura ambiente (25 ºC). Después de 24 h, tres pseudopileos de cada tratamiento se retiraron al azar y se inocularon en cajas de Petri con PDA para evaluar la germinación y el crecimiento. El control negativo para el 1,8-dimetoxinaftaleno consistió en papeles de filtro saturados con 500 µL de éter y los de la mezcla de terpenos con la misma cantidad de metanol, ambos grupos de control se realizaron por triplicado. Los detalles de la obtención del 1,8-dimetoxinaftaleno aparecen en Escudero-Leyva et al., 2023. 3.3.7 Análisis en UHPLC-HRMS. Las muestras previamente liofilizadas se prepararon como se menciona en Escudero-Leyva et al., 2023b. Los análisis se realizaron con un sistema UHPLC Vanquish Duo (Thermo, ScientificTM, Alemania) acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 120 (Thermo ScientificTM, Alemania). El analizador de masas se calibró con una mezcla de 11 cafeína, metionina-arginina-fenilalanina-alanina-acetato (MRFA), dodecilsulfato de sodio, taurocolato de sodio y Ultramark 1621 en una solución de acetonitrilo/metanol/agua que contenía ácido fórmico al 1 % mediante inyección directa. El control de los instrumentos se realizó mediante el software Thermo Scientific Xcalibur 3.1 v. 4.6.67.17. Se adquirieron escaneos completos a una resolución de 60 000 FWHM (a m/z 200) y escaneos MS2 a 17 500 FWHM en el rango de 100 a 1000 m/z, con 1 microescaneo, tiempo (ms): 200 ms, una lente RF (% ) :70; Estándar objetivo AGC. Los eventos de adquisición de escaneo de MS2 (dd-MS2) dependientes de los datos del centroide se realizaron en modo de descubrimiento, activados por la detección de Apex con una detección de activación (%): 75. Los 3 principales precursores abundantes (estado de carga 1 - 2) dentro de una ventana de aislamiento de 2 m/z se consideraron para el análisis MS/MS. La exclusión dinámica se fijó en 2 s. Se permitió una tolerancia de masa de ±10 ppm y el umbral de intensidad del precursor se fijó en 150 × 103. Para la fragmentación del precursor en modo HCD, se utilizó una energía de colisión normalizada del 30 %. La separación cromatográfica se realizó en una columna Waters BEH C18 (50 × 2,1 mm de d.i., 1,7 μm, Waters, Milford, MA, Estados Unidos) utilizando un gradiente lineal de 5–100 % de B durante 13,50 min, seguido de un paso isocrático a 100% B hasta 15.50 min. Las fases móviles fueron: (A) agua con 0,1% (Merck, grado HPLC-MS), ácido fórmico (Merck, grado HPLC-MS) y (B) acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico (Merck, grado HPLC-MS). El caudal se fijó en 500 μL/min, el volumen de inyección fue de 2 μL y la columna se mantuvo a 40 °C. 3.3.8 Procesamiento de datos UHPLC-HMRMS/MS. Los archivos crudos se transformaron a un formato compatible con MZMine3 para su análisis. Los parámetros utilizados aparecen en Escudero-Leyva et al., 2023. De aquí se obtuvo un archivo cuantitativo que fue tratado con un script personalizado en Python para agrupar las variables acordes al Ion Identity Network. El mismo archivo cuantitativo se normalizó por la suma de cada muestra y se aplicó un escalado de Pareto para realizar un análisis de componentes principales (PCA) usando los paquetes R FactoMineR v.2.4 89 y FactoExtra v.1.0.7 90 en R v.4.1.3 88. Luego, se realizó un Análisis Dependiente de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS-DA) con el paquete mixOmics v.6.6.2 91 en R v.3.5.1. 12 Los archivos cuantitativos y espectrales derivados de MZMine se subieron a la plataforma GNPS para generar la red molecular. 3.4 Identificación de polifenoles en plantas de café y especies de Rubiaceae afines. 3.4.1 Recolección de hojas. Se realizaron análisis metabolómicos dirigidos y no dirigidos con hojas de café comercial (Coffea arabica) que fueron colectadas en San José, Costa Rica, en plantaciones de Coopetarrazú. Se recolectaron hojas silvestres de Rubiaceae de las dos especies Isertia hankeana y Simira maxonii en una finca privada de la región de Golfito (Puntarenas) de Costa Rica. Por cada especie de planta, tres hojas maduras fueron cortadas de cuatro árboles y mantenidas en hielo durante el transporte al laboratorio, una vez ahí, fueron liofilizadas. Para optimizar la extracción y el método LC-MS/MS, se usaron hojas maduras de la especie de café silvestre Coffea liberica var. dewevrei y Coffea salvatrix, ambas plantas cultivadas en condiciones de campo provenientes del Instituto Agronómico de Campinas (São Paulo, Brasil), las cuales siguieron el mismo procedimiento de liofilización. 3.4.2 Extracción de metabolitos secundarios. La extracción de los metabolitos secundarios de las hojas se realizó después de triturar y pesar 10 mg de material foliar en polvo. Los metabolitos se extrajeron agregando 10 μL de ácido transcinámico-b,2,3,4,5,6-d6 1 mM y 490 μL de metanol al 100 %, seguido de molienda con una perla de metal de 5 mm a 30 Hz durante 5 min. usando un molino mezclador MM400 de Retsch (Haan, Alemania). Luego, los extractos se sonicaron a 35-40 °C durante 20 min y se centrifugaron a 9600 g durante 5 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Los sedimentos restantes se resuspendieron en 500 μL de metanol/agua (30:70, v/v), se sonicaron durante 20 min a 35-40 °C y se centrifugaron en las mismas condiciones que se mencionaron anteriormente. Los sobrenadantes se combinaron a los primeros y luego se filtraron 500 μL de extractos a través de dispositivos de filtración Amicon de 3 kDa (MilliporeSigma, Burlington, MA) a 14.000 g durante 60 min a temperatura ambiente. Los eluatos resultantes se almacenaron a -20 °C hasta el análisis LC-MS/MS. 13 3.4.3 Metabolómica no dirigida. El análisis de los metabolitos se realizó mediante un Sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento Exion junto con un espectrómetro de masas de alta resolución TripleTOF6600+ de AB Sciex (Framingham, MA). El espectrómetro de masas se ajustó para escanear metabolitos desde m/z 100-1500 amu en modo negativo o positivo. Para la polaridad negativa, el voltaje de rociado de iones fue de 4500 V, el tiempo de acumulación fue de 100 ms, el potencial de desagrupamiento y la energía de colisión fueron de 60 V y 10 V, respectivamente. Los espectros MS/MS se adquirieron sobre m/z 30-1500 amu con un tiempo de acumulación de 25 mseg. Los parámetros como el potencial de desagrupamiento, la energía de colisión y la dispersión de la energía de colisión se establecieron en 60 V, 45 V y 15 V, respectivamente. Los parámetros para el modo positivo fueron muy similares a los del modo negativo excepto por el voltaje de rociado de iones y el potencial de desagrupamiento que fueron de 5000 V y 35 V, respectivamente. El tiempo de ciclo total fue de 0,65 seg. Los parámetros para la ionización de la fuente de electrospray tales como gas de cortina (nitrógeno), gas de nebulización, gas de calentamiento y la temperatura de la fuente se fijaron en 40 psi, 70 psi, 70 psi y 650 °C, respectivamente. Las condiciones de la fuente fueron las mismas para las polaridades negativa y positiva. Se entregó una solución de calibración positiva o negativa de ionización química a presión atmosférica (APCI) mediante un sistema de entrega de calibrante cada 5 muestras para corregir cualquier desviación de masa que pudiera ocurrir durante la ejecución. Los espectros de MS se adquirieron utilizando el software Analyst TF 1.8.1 (AB Sciex, Framingham, MA). Es importante señalar que la adquisición dependiente de datos (DDA) se ejecutó en modos negativo y positivo, en una mezcla compuesta por extractos CC, WR1 y WR2. Los iones precursores presentes en esta mezcla se usaron luego para la adquisición de ventanas secuenciales de todos los espectros de masas teóricos (SWATH-MS). Los detalles de la adquisición de datos en DDA y el procesamiento están disponibles en la publicación de (Castro-Moretti et al., 2023). 3.4.4 Metabolómica dirigida. La detección y cuantificación de fitoquímicos fue realizado como se describió anteriormente por (Cocuron et al., 2019) con modificaciones relacionadas con el gradiente 14 de LC y el uso de monitoreo de reacción múltiple programado (sMRM). Los 184 fitoquímicos considerados en este estudio fueron optimizados uno a uno por infusión directa después de haber sido diluidos a 1 μM con una solución de acetonitrilo/agua (50:50; v/v) que contiene 0,1% de ácido acético como aditivo. El flujo para la infusión directa se ajustó a 10 μl/min y se determinaron parámetros como el potencial de desagrupamiento (DP), la energía de colisión (CE) y el potencial de salida celular (CXP) para los cinco iones de producto más abundantes derivados de cada ion precursor. La lista de los compuestos, así como las particularidades de la adquisición en el equipo aparecen en (Castro-Moretti et al., 2023). 3.4.5 Análisis estadísticos. El análisis de componentes principales (PCA), el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), el mapa de calor y el análisis de componentes simultáneos ANOVA (ASCA), tanto para análisis no dirigidos como dirigidos, se realizaron después de la transformación logarítmica y el escalado automático, utilizando MetaboAnalyst 5.0 (Chong et al., 2018). 15 CAPÍTULO IV. RESULTADOS 4.1 Aislamiento y caracterización de hongos endófitos. El espaciador de transcripción interno (ITS) del ADN ribosómico nuclear se acepta como marcador genético o código de barras de elección para la identificación de muestras fúngicas. Aquí, presentamos un protocolo para analizar datos ITS fúngicos, desde el preprocesamiento de calidad de secuencias sin procesar hasta la identificación de unidades taxonómicas operativas (OTU), clasificación taxonómica y asignación de rasgos funcionales. La canalización se basa en recopilaciones de datos bien establecidas y seleccionadas manualmente, a saber, la base de datos UNITE y el script FUNGuild. Como ejemplo, se analizaron datos ITS reales de hongos endófitos cultivables, brindando descripciones detalladas para cada paso, parámetro y análisis posterior, y finalizando con un análisis filogenético de las secuencias y roles ecológicos asignados. Este artículo constituye una guía completa para investigadores que están poco familiarizados con el análisis bioinformático de los pasos esenciales requeridos en estudios ecológicos adicionales de comunidades fúngicas. A partir de los resultados obtenidos con este flujo de trabajo, fue posible catalogar los 1400 aislamientos de hongos endófitos de Rubiaceae silvestre en aproximadamente 800 especies. La colección se encuentra en el CIPRONA, Universidad de Costa Rica. Publicaciones: A) Montero-Vargas, M., Escudero-Leyva, E., Díaz-Valerio, S. & P. Chaverri. 2020. Step- by-step pipeline for the ecological analysis of endophytic fungi using ITS nrDNA Data. Current Protocols in Microbiology. https://doi.org/10.1002/cpmc.96 B) Montero-Vargas, M., Umaña-Jiménez, J.C., Escudero-Leyva, E. & P. Chaverri. 2020. Análisis filogenético de secuencias ITS provenientes de hongos endófitos utilizando Inferencia Bayesiana Paralela de árboles con Exabayes. Revista Tecnología en Marcha, 33(5), Pág. 74-79. https://doi.org/10.18845/tm.v33i5.5079 https://doi.org/10.1002/cpmc.96 https://doi.org/10.18845/tm.v33i5.5079 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 4.2 Actividad antagonista contra el patógeno de café Mycena citricolor. La mancha americana de la hoja, causada por Mycena citricolor, es una enfermedad importante del café (Coffea arabica), principalmente en América Central. Actualmente, existen alternativas limitadas de control de patógenos que son amigables con el medio ambiente y económicamente accesibles. El uso de hongos aislados de la endomicobiota vegetal en sus hábitats nativos está en aumento porque los estudios muestran su gran potencial para el control biológico. Para comenzar a generar una alternativa verde para el control de M. citricolor, los objetivos del presente estudio fueron (i) recolectar, identificar, evaluar (in vitro e in planta) y seleccionar hongos endófitos de Rubiaceae silvestres recolectados en bosques maduros. de Costa Rica; (ii) confirmar la colonización endófita en plántulas de café; (iii) evaluar los efectos de los endófitos en el desarrollo de las plántulas; y (iv) corroborar la capacidad antagónica in planta. A través de ensayos de antagonismo in vitro e in planta, encontramos que de los aislados seleccionados (i.e. Daldinia eschscholzii GU11N, Nectria pseudotrichia GUHN1, Purpureocillium aff. lilacinum CT24, Sarocladium aff. kiliense CT25, Trichoderma rifaii CT5, T. aff crassum G1C, T. aff. atroviride G7T, T. aff. strigosellum GU12 y Xylaria multiplex GU14T), Trichoderma spp. produjo los mayores porcentajes de inhibición del crecimiento in vitro. Los aislados de Trichoderma CT5 y G1C se probaron luego usando plántulas de Coffea arabica cv. caturra. Se verificó la colonización endofítica, seguida de ensayos de promoción y antagonismo del crecimiento in planta. Los resultados muestran que los aislados de Trichoderma CT5 y G1C tienen potencial para promover el crecimiento de las plantas y antagonizar contra M. citricolor, reduciendo la incidencia y la severidad, y previniendo la mortalidad de las plantas. Publicación: Escudero-Leyva, E., Granados-Montero, MdM., Orozco-Ortiz, C., Araya-Valverde, E., Alvarado-Picado, E., Chaves-Fallas J.M, Aldrich-Wolfe, L. & Chaverri. P. 2023. The endophytobiome of wild Rubiaceae as a source of antagonistic fungi against the American Leaf Spot of coffee (Mycena citricolor). Journal of Applied Microbiology. 134(5). https://doi.org/10.1093/jambio/lxad090 https://doi.org/10.1093/jambio/lxad090 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 4.3 Tolerancia a fungicidas. La transición de la agricultura convencional a la orgánica a menudo se ve desafiada por la adaptación de los agentes de control biológico a entornos muy expuestos a contaminantes agroquímicos. Estudiamos especies de Trichoderma aisladas de tejidos de hojas vivas de plantas silvestres de Rubiacaeae para determinar su tolerancia a fungicidas y su potencial de eliminación biológica. Evaluamos la tolerancia in vitro a los fungicidas de cuatro aislamientos de Trichoderma (T1, T2, T3 y T4) colocando discos de micelio en medios sólidos suplementados con siete fungicidas sistémicos y no sistémicos diferentes. Después de una semana, la mayoría de los fungicidas no inhibieron significativamente el crecimiento de los aislados, excepto en el caso del ciproconazol, donde el único aislado capaz de crecer fue el T1; sin embargo, la morfología de la colonia se vio afectada por la presencia de fungicidas. En segundo lugar, se estableció el potencial de eliminación biológica para aislamientos seleccionados. Para este experimento, los aislamientos T1, T2 y T4 se inocularon de forma independiente en medios líquidos con los fungicidas azoxistrobina, clorotalonil, ciproconazol y trifloxistrobina. Después de 14 días de incubación, se logró una remoción de hasta 89% para clorotalonil, 46,4% para ciproconazol y 33,1% para trifloxistrobina usando biomasa viable. En el caso de la azoxistrobina, la mayor remoción (82,2%) se produjo por adsorción a la biomasa fúngica. Las pruebas ecotoxicológicas en Daphnia magna revelaron que T1 tiene el mayor potencial de remoción, logrando una eliminación significativa de todos los fungicidas, al mismo tiempo que detoxifica la matriz acuosa (excepto en el caso del ciproconazol). El aislado T4 también exhibió una eficiencia intermedia, mientras que el aislado T2 no pudo detoxificar la matriz en la mayoría de los casos. La eliminación y desintoxicación de ciproconazol fracasó con todos los aislamientos. Estos hallazgos sugieren que la endosfera de plantas silvestres podría ser un gremio atractivo para encontrar nuevas especies de Trichoderma con capacidades prometedoras de biorremediación. Además, los resultados demuestran que se debe prestar atención al combinar ciertos tipos de agroquímicos con hongos antagónicos en estrategias de Manejo Integrado de Plagas y Enfermedades o al hacer la transición a la agricultura orgánica. 49 Publicación: Escudero-Leyva, E., Alfaro-Vargas, P., Muñoz-Arrieta, R., Charpentier-Alfaro, C., Granados-Montero, MdM., Valverde-Madrigal, K.S., Pérez-Villanueva, M., Méndez- Rivera, M., Rodríguez-Rodríguez, C.E., Chaverri, P. & Mora-Villalobos, J.A. 2022. Tolerance and Biological Removal of Fungicides by Trichoderma Species Isolated from the Endosphere of Wild Rubiaceae Plants. Front. Agron. 3:772170. doi: 10.3389/fagro.2021.772170 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 4.4 Diferencias en el volatiloma de un endófito durante su interacción con el patógeno de café Mycena citricolor. Los hongos exhiben una amplia gama de gremios ecológicos, pero aquellos que viven dentro de los tejidos internos de las plantas son particularmente relevantes debido a los beneficios que brindan a sus huéspedes, como disuasión de herbivoría, protección contra enfermedades y promoción del crecimiento. Recientemente, los endófitos han ganado interés como posibles agentes de biocontrol contra patógenos de cultivos, por ejemplo, las plantas de café. Los resultados publicados de la investigación realizada en nuestro laboratorio mostraron que los hongos endófitos aislados de plantas silvestres de Rubiaceae fueron efectivos para reducir los efectos de la mancha americana de la hoja del café (Mycena citricolor). Uno de los aislamientos de la planta Randia grandifolia fue identificado como Daldinia eschscholtzii GU11N. Para investigar más a fondo los mecanismos de antagonismo, los efectos y la química de GU11N contra M. citricolor, se compararon los perfiles volátiles de GU11N con y sin la presencia del patógeno mediante ensayos sin contacto y de cultivo dual. El diseño experimental utilizado involucró el muestreo directo de tapones de agar en viales utilizando métodos de espectrometría de masas de cromatografía de gases (GC-MS) y espacio de cabeza (HS) y microextracción en fase sólida de espacio de cabeza (HS-SPME). Además, utilizamos UHPLC-HRMS/MS para identificar compuestos no volátiles de extractos orgánicos de los micelios involucrados en la interacción. Los resultados muestran que se detectaron más compuestos volátiles usando HS-SPME (39 componentes) que con la técnica HS (13 componentes), compartiendo solo 12 compuestos. Las pruebas estadísticas sugieren que D. eschscholtzii inhibe el crecimiento de M. citricolor a través de la liberación de COV que contienen una combinación de 1,8-dimetoxinaftaleno y compuestos terpénicos que afectan a M. citricolor pseudopilei. Se corroboraron los efectos nocivos del 1,8-dimetoxinaftaleno en una prueba in vitro contra estructuras reproductivas de M. citricolor, confirmando el daño estructural con fotografías SEM. Por otro lado, tras analizar los datos de UHPLC-HRMS/MS, se encontró un predominio de derivados de ácidos grasos entre los compuestos identificados. A pesar de los esfuerzos para anotar la mayoría de las señales utilizando GNPS y SIRIUS/Canopus, una proporción considerable (37,3 %) permaneció sin ningún tipo de 65 anotación. En conclusión, nuestro estudio sugiere que Daldinia eschscholtzii tiene potencial como agente de biocontrol contra Mycena citricolor y que el 1,8-dimetoxinaftaleno producido por el hongo endófito podría ser responsable del daño observado en las estructuras reproductivas del patógeno. Publicación: Escudero-Leyva, E., Quirós-Guerrero, L., Vásquez-Chaves, V., Pereira-Reyes, R., Chaverri, P. & Tamayo-Castillo, G. 2023. Differential volatile organic compound expression in the interaction of Daldinia eschscholtzii and Mycena citricolor. ACS Omega, 8(34), 31373–31388. https://doi.org/10.1021/acsomega.3c03865 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 4.5 Metabolómica en plantas de café y parientes silvestres de Rubiaceae. Los productos del metabolismo secundario de las plantas, como los compuestos fenólicos, los flavonoides, los alcaloides y las hormonas, juegan un papel importante en el crecimiento, el desarrollo y la resistencia al estrés de las plantas. La familia de plantas Rubiaceae es extremadamente diversa y abundante en América Central y contiene varios géneros económicamente importantes. Estos son conocidos por la producción de polifenoles bioactivos (por ejemplo, cafeína y quinina), que han tenido un gran impacto en la sociedad humana. El objetivo general de este estudio fue desarrollar un flujo de trabajo de alto rendimiento para identificar y cuantificar los polifenoles vegetales. Primero, se optimizó un método para extraer más de 40 familias de fitoquímicos. Luego, se desarrolló una plataforma metabolómica de alto rendimiento para identificar y cuantificar 184 polifenoles en 15 minutos. El estudio de metabolitos secundarios se realizó en hojas de una variedad comercial de café y dos especies silvestres que también pertenecen a la familia Rubiaceae. El perfilado global se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas de tiempo de vuelo. Las características cuya abundancia fue significativamente diferente entre las especies de café se discriminaron mediante análisis estadístico y se anotaron mediante bases de datos espectrales. La cafeína, la trigonelina y la teobromina fueron muy abundantes en las hojas de café, como se esperaba. Curiosamente, las hojas silvestres de Rubiaceae tenían una mayor diversidad de fitoquímicos en comparación con el café comercial: las moléculas relacionadas con la defensa, como los fenilpropanoides, el ácido giberélico y el monolignol sinaldehído se encontraron más abundantemente en las hojas silvestres de Rubiaceae. Publicación: Castro-Moretti, F., Cocuron, J-C., Castillo-Gonzales, H., Escudero-Leyva, E., Chaverri, P., Guerreiro-Filho, O., Slot, C.J. & Alonso, A.P. 2023. A metabolomic platform to identify and quantify polyphenols in coffee and related species using liquid chromatography mass spectrometry. Frontiers in Plant Science. 13:1057645. doi: 10.3389/fpls.2022.1057645 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 4.6 Herramienta para la anotación de compuestos derivados de microorganismos. MicrobeMASST, una herramienta de búsqueda de espectrometría de masas (MS) informada taxonómicamente, aborda anotación de metabolitos microbianos en experimentos de metabolómica no dirigidos. Aprovechando una base de datos seleccionada de más de 60 000 monocultivos microbianos, los usuarios pueden buscar espectros de MS/MS conocidos y desconocidos y vincularlos con sus respectivos productores microbianos a través de patrones de fragmentación de MS/MS. La identificación de metabolitos derivados de microbios y productores relativos, sin conocimiento a priori, mejorará enormemente la comprensión del papel de los microorganismos en la ecología y la salud humana. Publicación: Zuffa S., Schmid R., Bauermeister A., Gomes PWP., Caraballo-Rodriguez A.M., Abiead Y.E., Aron A.T., Gentry E.C., Zemlin J.., Meehan M.J., Avalon N.E., Cichewicz R.H., Buzun E., Terrazas M.C., Hsu C., Oles R., Ayala A.V., Zhao J., Chu H., Kuijpers M.C.M., Jackrel S.L., Tugizimana F., Nephali L.P., Dubery I.A., Madala N.E., Moreira E.A., Costa-Lotufo L.V., Lopes N.P., Rezende-Teixeira P., Jimenez P.C., Rimal B., Patterson A.D., Traxler M.F., de Cassia Pessotti R., Alvarado-Villalobos D., Tamayo-Castillo G., Chaverri P., Escudero-Leyva E, Quiros-Guerrero L., Bory A.J., Joubert J., Rutz A., Wolfender J., Allard P., Sichert A., Pontrelli S., Pullman B.S., Bandeira N., Gerwick W.H., Gindro K., Massana-Codina J., Wagner B.C., Forchhammer K., Petras D., Aiosa N., Garg N., Liebeke M., Bourceau P., Kang K.B., Gadhavi H., de Carvalho L.P.S., dos Santos M.S., Pérez-Lorente A.I., Molina-Santiago C., Romero D., Franke R., Brönstrup M., de León A.V.P., Pope P.B., La Rosa S.L., Barbera G.L., Roager H.M., Laursen M.F., Hammerle F., Siewert B., Peintner U., Licona-Cassani C., Rodriguez-Orduña L., Rampler E., Hildebrand F., Koellensperger G., Schoeny H., Hohenwallner K., Panzenboeck L., Gregor R., O’Neill E.C., Roxborough E.T., Odoi J., Bale N.J., Ding S., Sinninghe Damsté J.S., Guan X.L., Cui J.J., Ju K., Silva D.B., Ribeiro Silva F.M., da Silva G.F., Koolen H.H.F., Grundmann C., Clement J.A., Mohimani H., Broders K., McPhail K.L., Ober-Singleton S.E., Rath C.M., McDonald D., Knight R., Wang M., Dorrestein P.C. A Taxonomically-informed Mass Spectrometry Search Tool for Microbial Metabolomics Data. doi:10.1101/2023.07.20.549584. PPR:PPR695223. 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 CAPÍTULO V. DISCUSION GENERAL La selección de los hongos endófitos basados en registros conocidos de bases de datos permite el estudio acelerado de especies con actividad antagonista contra patógenos de café. Claramente, la correcta clasificación taxonómica es compleja, resultando el uso de herramientas de biología molecular la forma más rápida para identificación de hongos (Molina et al., 2011). Actualmente, la base de datos UNITE (Abarenkov et al., 2010) resulta ser aquella con información mejor curada para hongos basándose en el marcador ITS. Si esta información se complementa con la encontrada en FUNGuild (Nguyen et al., 2016), en donde, es posible realizar anotaciones sobre la ecología de las especies que se han identificado, entonces, se tiene un panorama más amplio sobre una determinada colección de hongos y así, acelerar las pruebas usando los organismos con un mejor potencial para cumplir el objetivo deseado. En el caso de este trabajo, la aplicación de un flujo de trabajo bioinformático optimizado (Montero-Vargas et al., 2020), permitió seleccionar los mejores organismos para realizar pruebas de antagonismo contra el patógeno de café Mycena citricolor. La colección de endófitos de Rubiaceae cuenta con alrededor de 1400 aislamientos correspondientes a 800 especies. A partir de la aplicación del flujo bioinformático, se procedió con la selección de las especies más adecuadas para realizar pruebas de antagonismo. Como se aprecia en (Escudero-Leyva, Granados-Montero, et al., 2023), Nectria pseudotrichia (GUHN1), Trichoderma rifaii (CT5), T. aff. crassum (G1C), T. aff. atroviride (G7T) y T. aff. strigosellum (GU12) inhibieron de manera in vitro al patógeno Mycena citricolor siendo los porcentajes de inhibición obtenidos con las especies de Trichoderma, similares a las de ciertos fungicidas. De las especies probadas, solamente T. rifaii había sido reportada como endófita de Thobroma gileri en Ecuador (Gazis & Chaverri, 2015). Los mecanismos implicados en la respuesta antagónica de T. rifaii se proponen como micoparasitismo directo similar a los aislados de Trichoderma probados con éxito contra Corynespora cassiicola (De Souza et al., 2008b) y Pujade-Renaud et al. (2019), o contra Colletotrichum spp. (Gazis y Chaverri, 2015). La otra especie resultante como micoparásita, Trichoderma aff. crassum no ha sido ampliamente estudiada como 135 agente de control biológico y, por lo tanto, los mecanismos de antagonismo aún no están dilucidados (Hoyos-Carvajal et al., 2009; Mendoza et al., 2015; Sumida et al., 2018; Zhang et al., 2015). Con respecto a las restantes especies de Trichoderma probadas in vitro, existen reportes que indican que T. viride tiene habilidades antagónicas contra Fusarium graminearum, F. solani y Macrophomina phaseolina; sin embargo, el porcentaje de inhibición fue menor en comparación con otras especies de Trichoderma probadas en ese estudio. Respecto a los ensayos in planta, ambos grupos de plantas inoculadas con Trichoderma tenían al menos el doble de altura que las plantas sin endófitos. Futuros experimentos podrían dilucidar los reguladores de la promoción del crecimiento derivados de los hongos endófitos o provocados por la infección. Por ejemplo, los reguladores mejor reconocidos que participan en la promoción del crecimiento de las plantas son las citoquininas, el ácido indolacético y las giberelinas (Deng & Cao, 2017; Rana et al., 2020). De igual manera, ambos grupos de plantas con endófitos resultaron más resistentes a la infección con M. citricolor, y cuando esta ocurrió, la severidad de la enfermedad fue reducida en comparación con el grupo de plantas control. Resalta de manera particular que las especies T. rifaii y T. aff. crassum, las cuales promovieron el crecimiento en plantas de café y proveyeron de defensa contra M. citricolor, son también las especies con mejores resultados en las pruebas de tolerancia y remoción de fungicidas. Los microorganismos con potencial de control biológico deben tolerar los agroquímicos para prevalecer con éxito en los sistemas agrícolas en transición y brindar beneficios a las plantas contra las enfermedades (Sun et al., 2019). El ciproconazol y el clorotalonil fueron los más tóxicos para Trichoderma, contrario a lo observado con el propineb y la validamicina-A. La tolerancia a pesticidas por parte de especies de Trichoderma relacionadas con el complejo T. harzianum recuperado del suelo se ha reportado previamente para compuestos como el pentaclorofenol (Rigot & Matsumura, 2002) o el glifosato (Levesque & Rahe, 1992). En general, el potencial de remoción más alto entre los aislamientos fue observado para T. rifaii, que logró una eliminación considerable de todos los fungicidas, mientras que simultáneamente detoxificaba la matriz 136 acuosa (excepto en el caso del ciproconazol). Por otro lado, el aislamieno T. aff. crassum, a pesar de poder remover los fungicidas en cierta medida, en la mayoría de los casos no pudo detoxificar la matriz, haciendo de este hongo una opción inadecuada para la biodegradación. Como se ha hecho con los probióticos en humanos, la manipulación o la gestión del fitobioma de un cultivo para incluir microorganismos beneficiosos para las plantas, desempeñará un papel clave en la revolución de la agricultura moderna (Hyde et al., 2019; Tilocca et al., 2020). Dentro de las preguntas que surgen alrededor de los mecanismos de protección conferidos de los endófitos a sus hospederos, la producción de metabolitos secundarios, especialmente los CVOs, llaman la atención por la capacidad de producir efectos fungistáticos y fungicidas. En los resultados obtenidos en el trabajo con Daldinia eschscholtzii en confrontación sin contacto contra M. citricolor (Escudero-Leyva et al., 2023c), se detectaron 39 compuestos mediante HS-SPME y 13 usando solamente HS. El ANOVA reveló diferencias significativas en las composiciones de CVOs entre el grupo de Daldinia (D) y el grupo de cocultivo. El grupo D mostró niveles más altos de 4,4-dimetil-1,3- ciclopentanodiona, 1,2-dimetil-4-oxociclohex-2-enecarbaldehído, α-selineno y pogostole, todos los cuales fueron estadísticamente significativos (p < 0,05). Por el contrario, el grupo de cocultivo mostró niveles significativamente más altos de 9-epi-β-cariofileno y 1,8- dimetoxinaftaleno. Estos hallazgos sugieren que la interacción entre D. eschscholtzii y el patógeno en el experimento de cocultivo influye en la producción de CVOs específicos, lo que lleva a perfiles químicos distintos en comparación con D. eschscholtzii solo. Al utilizar el conjunto completo de variables, las 10 mejores detectadas como VIP en el PLS-DA difieren de las cargas obtenidas del PCA. Sin embargo, al realizar el ANOVA de los datos, se alineó mejor con los resultados de PCA. Por lo tanto, las variables como significativas por ANOVA también contribuyen significativamente a la separación entre los grupos en el gráfico PCA. El PCA consideró al compuesto 1,8-dimetoxinaftaleno como la única carga asociada con las muestras de cocultivo, los VIP del PLS-DA incluyeron 9-epi-β-cariofileno y 1,8-dimetoxinaftaleno. Lo último nos lleva a probar el efecto de estos compuestos contra las estructuras reproductivas de M. citricolor, encontrando que los pseudopileos del patógeno colocados en las cajas Petri junto con los discos filtrantes cargados con 500 y 137 1000 μg del compuesto 1,8-dimetoxinaftaleno experimentaron el efecto de “quemado” después de 24 h a temperatura ambiente, lo que fue similar al daño observado cuando el patógeno se enfrentó a D. eschscholtzii. Ninguno de los controles negativos produjo un efecto sobre los pseudopileios. Esto sugiere que el 1,8-dimetoxinaftaleno producido en el grupo de cocultivo es responsable del efecto fungicida. Se ha registrado una actividad inhibitoria baja para el compuesto 1,8-dimetoxinaftaleno obtenido de un endófito de D. eschscholtzii de un manglar en Tailandia contra Microsporum gypseum y Staphylococcus aureus (Kongyen et al., 2015). Hay resultados de pruebas de herbicidas realizadas en plantas mono y dicotiledóneas también registradas como bajas, retrasando la germinación de las semillas (Dai et al., 2006). Aunque uno de los desafíos actuales en la metabolómica no dirigida es la confianza y la disponibilidad de los espectros en las bases de datos, especialmente los derivados de microorganismos como los hongos (Theodoridis et al., 2023), pudimos producir una anotación de características putativas hasta el nivel de clase química para los extractos obtenidos de los grupos Daldinia, cocultivo y Mycena. Asumiendo que el cocultivo podría contener compuestos derivados de ambos hongos que crecen en el ensayo, y dado que la membrana celular del hongo difiere en su composición de plantas y animales, los compuestos relacionados con esta estructura pueden ser pigmentos, por ejemplo, 1,8-dihidroxinaftaleno, común en Aspergillus spp., (Hanson, 2008) o lípidos, de los cuales el ergosterol es un componente principal de la membrana celular fúngica (Thevissen et al., 2003). Debido a que los endófitos son productores de metabolitos secundarios, poco se sabe sobre cómo estos se expresan según el hospedero al que pertenecen. Por ello, se hace necesario conocer el perfil de metabolitos de sus hospederos para posteriormente hipotetizar y llevar a cabo experimentos que permitan comprender mejor las relaciones entre los endófitos y sus hospederos. La aplicación de metabolómica no dirigida y dirigida sobre Coffea sp. podría diferenciar los perfiles metabólicos de especies de extractos de hojas y frutos. Adicionalmente, se identificaron cinco fitoquímicos (cafeína, mangiferina y tres ácidos cafeoilquínicos), corroborando la identidad de los metabolitos diferenciados entre especies y tejidos. Los resultados mostraron que una extracción se puede realizar en menos de dos horas y se optimizó para recuperar una amplia variedad de compuestos (más de 40 familias 138 de fitoquímicos), de estos, el 90% tuvieron una recuperación superior al 50%, cuantificando 184 fitoquímicos de manera sensible y específica en una sola ejecución de LC-MS/MS de 15 min con cambio de polaridad, lo que es particularmente adecuado para análisis de alto rendimiento (Castro-Moretti et al., 2023). Como se menciona anteriormente, los mayores retos dentro de los experimentos de LC-MS, está la anotación de compuestos provenientes de microorganismos. Por ello, la colaboración con el grupo de Pieter Dorrestein resulta de gran interés. Al integrar los datos de experimentos de LC-MS a la herramienta microbeMASST (Zuffa et al., 2023), integrada dentro de la plataforma GNPS (Communication, 2019), permitirá buscar espectros MS/MS en tándem obtenidos de sus experimentos contra espectros MS/MS detectados previamente en otros extractos de monocultivos bacterianos, fúngicos o arqueales. Ningún otro recurso o herramienta disponible permite vincular espectros MS/MS no caracterizados con microorganismos caracterizados. La base de datos de referencia microbeMASST de monocultivos se ha generado a través de años de contribuciones comunitarias y conservación de metadatos, y contiene microorganismos aislados de plantas, suelos, océanos, lagos, peces, animales terrestres y humanos (Zuffa et al., 2023). 139 CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES GENERALES En conclusión, se obtuvieron 1400 aislamientos clasificados en 800 especies, de los cuales, posterior a la selección de las especies fúngicas con mejores cualidades basados en su relación filogenética, se procedieron a realizar experimentos de antagonismo contra el patógeno de café, Mycena citricolor. De la selección original que incluía géneros como Sarocladium o Fusarium, se optó por el uso in vitro e in planta de aislamientos de dos especies de Trichoderma provenientes de Rubiaceae silvestre. Estos tuvieron efectos positivos en la promoción del crecimiento de las plantas de café y el antagonismo contra Mycena citricolor. Los dos aislamientos también fueron capaces de colonizar los tejidos internos de las plántulas, aumentar el tamaño de las plantas, reducir la incidencia y severidad y prevenir la mortalidad de las plantas. Los aislamientos de Trichoderma endófitas fueron capaces de tolerar y prevalecer bajo la presencia de fungicidas. Sin embargo, Trichoderma rifaii CT5 sería la opción principal con respecto a la promoción del crecimiento, el manejo de enfermedades, la tolerancia a los fungicidas y la capacidad de biorremoción/biorremediación no tóxica. El endófito Daldinia eschscholtzii GU11N produjo daño en las estructuras reproductivas del patógeno del café M. citricolor en un ensayo sin contacto. Usando HS-SPME, el perfil de D. eschscholtzii fue más diverso, detectando las clases encontradas con HS además de cromonas y policétidos, así como otros componentes sesquiterpenoides. La composición de este perfil reveló cambios significativos cuando el endófito fue expuesto a M. citricolor en los experimentos de cocultivo. El 1,8-dimetoxinaftaleno tuvo una correlación estadística con el experimento de cocultivo y produjo el daño sobre las estructuras reproductivas de M. citricolor respaldado por observaciones con microscopía electrónica. El estudio de metabolómica dirigida y no dirigida para Coffea spp. y especies silvestre de Rubiaceae consiguió la optimización de un procedimiento de extracción para recuperar 42 familias distintas de fitoquímicos de las hojas, un método LC-MS/MS robusto y sensible para cuantificar 184 metabolitos secundarios. Este trabajo describe un proceso sensible y completo para la detección, clasificación y cuantificación de metabolitos secundarios en 140 hojas de café y otras rubiáceas pudiéndose aplicar a otros órganos y especies de plantas. De manera similar, la colaboración en la plataforma microbeMASST será un recurso clave para mejorar la comprensión del papel de metabolitos microbianos en una amplia gama de ecosistemas, incluidos océanos, plantas, suelos, insectos, animales y humanos. Este recurso en expansión permitirá obtener valiosos conocimientos taxonómicos y funcionales sobre diversas poblaciones microbianas en diversas aplicaciones, que van desde la acuicultura y la agricultura hasta la biotecnología y el estudio de las condiciones de salud humana mediadas por microbios, profundizando la comprensión de las intrincadas relaciones entre los microorganismos y sus ecosistemas. 141 BIBLIOGRAFIA GENERAL Abarenkov, K., Nilsson, R. H., Larsson, K. H., Alexander, I. J., Eberhardt, U., Erland, S., Høiland, K., Kjøller, R., Larsson, E., Pennanen, T., Sen, R., Taylor, A. F. S., Tedersoo, L., Ursing, B. M., Vrålstad, T., Liimatainen, K., Peintner, U., & Kõljalg, U. (2010). The UNITE database for molecular identification of fungi - recent updates and future perspectives. New Phytologist, 186(2), 281–285. https://doi.org/10.1111/j.1469- 8137.2009.03160.x Allegra, A., Gentry, E. C., McPhail, K. 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