UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO VALIDACIÓN EXPERIMENTAL DEL FENÓMENO DE COMPENSACIÓN DE DOSIS GÉNICA DEL ONCOGÉN MYC EN LÍNEAS CELULARES DE CÁNCER DE COLON ANEUPLOIDE DEL PANEL NCI-60 Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Posgrado en Maestría en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología KAROL VIVIANA AGUILAR GUERRERO Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2024 ii DEDICATORIA A mi familia: mamá, papá, Kathy y Silvia, sin ustedes, su amor y apoyo no lo hubiera logrado. Kathy y Silvia, ustedes siempre han sido cómplices en cada paso, en cada experiencia y decisión, han creído en mí y nunca han dejado de impulsarme a seguir adelante, gracias por tanto amor. Mamá y papá, no tengo palabras suficientes para expresarles cuanto los amo y cuanto les agradezco el amor, la paciencia, las enseñanzas y su infinito apoyo, solo pude lograr esto gracias a ustedes, este logro es de ustedes. A Diana por toda la guía y la paciencia y junto con Kim por la amistad que me han ofrecido. A las dos, gracias por escucharme, por guiarme y por siempre ofrecerme su amistad, lo valoro muchísimo y han venido aportar muchísimo cariño y momentos bonitos a mi vida. Gracias por siempre tomarme en cuenta y darme siempre una amistad tan linda y sincera. A Pita que, aunque ya no está, siempre me apoyó. Siempre creyó en mí, escuchaba todo lo que le contaba, pero lo más lindo que me dio, fueron todas sus enseñanzas, me enseño a ser fuerte, a que trabajando se logran las cosas, que detrás de mí estaba el esfuerzo de una mujer fuerte, incansable. Tal vez nunca se lo dije, pero siempre fue una de mis mayores inspiraciones. A Doña Elia y Doña Elizabeth (sin darme cuenta siempre estoy rodeada de mujeres maravillosas, fuertes, capaces, trabajadoras) que, aunque no somos familia, las amo como si lo fueran, y cuando logro algo me encanta contarles porque se que hablan con orgullo de mi y de mi familia. Gracias por quererme, a mi y a mi familia, por cuidarnos, guiarnos, y empujarnos al éxito, por apoyarnos y por sentirse orgullosas de nuestros pequeños logros. A Amanda y Susana por el cariño y el tiempo compartido durante la maestría, y la linda amistad. A Kanin, mi angelito en la tierra y mi conejito en el cielo. A Tootsie, Odin, Fu y Toulouse. iii AGRADECIMIENTO A mi tutor, el Dr. Rodrigo Mora Rodríguez PhD., por la oportunidad y la guía durante todo el proyecto. Gracias Doctor por abrirme las puertas de una institución tan maravillosa como la U y por permitirme ser parte de sus proyectos. A mi comité asesor MSc. Diana Bravo Estupiñan cPhD., y el Dr. Steve Quirós Barrantes PhD., por su apoyo y consejos, los admiro muchísimo y su guía fue imprescindible para lograr finalizar con éxito este proyecto. Al director de posgrado el Dr. Carlos Chacón Diaz PhD., y a Doña Virginia Carmona Ramírez, por toda la ayuda y orientación a través del proceso. Al Dr Ricardo Chinchilla Monge MQC y al Dr Ricardo Gutierrez Cruz PhD. A la Facultad de Microbiología y al Programa de Posgrado en Maestría en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología. Al Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales (CIET) y el Centro de Investigación en Cirugía y Cáncer (CICICA) especialmente al personal por su disponibilidad y amabilidad. Finalmente, al Sistema de Estudios de Posgrado (SEP) y a la Universidad de Costa Rica (UCR). iv v TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA .................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTO .......................................................................................................... iii TABLA DE CONTENIDO .................................................................................................... v RESUMEN EN ESPAÑOL ................................................................................................ viii ABSTRACT ........................................................................................................................... ix LISTA DE CUADROS ........................................................................................................... x LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ xi LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................ xii 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 1.1. Cáncer .......................................................................................................................... 1 1.2. “Hallmarks” del cáncer ............................................................................................... 4 1.3. Oncogenes .................................................................................................................. 10 1.4. micro ARNs ............................................................................................................... 12 1.5.1. Biogénesis canónica de los miARNs .................................................................. 13 1.5.2. Biogénesis no canónica de los miARNs ............................................................. 14 1.5. Compensación de dosis génica .................................................................................. 16 1.6. Biología de Sistemas .................................................................................................. 20 1.7. Justificación ............................................................................................................... 25 1.8. Hipótesis .................................................................................................................... 27 2. OJETIVOS .................................................................................................................... 28 Objetivo general ................................................................................................................ 28 vi Objetivos específicos ........................................................................................................ 28 3. METODOLOGÍA ......................................................................................................... 29 3.1. Estandarización de la técnica de tug-of-war en las líneas celulares HT29 y SW620 wild-type y estables ........................................................................................................... 30 3.1.1. Diseño del plásmido “exo-Myc”. .................................................................. 30 3.1.2. Cebadores y sondas ....................................................................................... 31 3.1.3. Extracción de ARN ....................................................................................... 32 3.1.4. RT qPCR ....................................................................................................... 33 3.1.5. Análisis de información ................................................................................ 33 3.2. Implementación de la técnica génica tug-of-war para determinar experimentalmente la compensación de dosis génica de Myc. ......................................... 33 3.3. Evaluación del efecto inhibitorio de los anti mi-ARNs sobre la compensación de dosis génica. ...................................................................................................................... 34 3.3.1. Transfección con anti - miARNs .................................................................. 34 4. RESULTADOS ............................................................................................................ 36 4.1. Estandarización de la técnica tug-of-war en las líneas celulares HT29 y SW60 wild- type y estables. .................................................................................................................. 36 4.1.1. Corroboración de la transfección de las líneas celulares con exo-Myc ........ 36 4.1.2. Cebadores y sondas. ...................................................................................... 38 4.1.3. Extracción de ARN ....................................................................................... 39 4.1.4. RT qPCR ....................................................................................................... 41 4.2. Implementación de la técnica génica tug-of-war para determinar experimentalmente la compensación de dosis génica de Myc. ......................................... 44 4.3. Evaluación del efecto inhibitorio de los anti-miRs sobre la compensación de dosis génica en las líneas celulares transfectadas con exo-Myc. ................................................ 45 4.3.1. Determinación de la concentración optima de un pool de anti mi-ARNs para evidenciar el efecto inhibitorio ..................................................................................... 46 vii 4.3.2. Efecto inhibitorio de los anti-miRs a concentraciones específicas, para las líneas wild type y estables. ............................................................................................ 51 4.4. Resultados adicionales .......................................................................................... 53 4.4.1. Artículo de revisión: Compensación de Dosis Génica ................................. 53 4.4.2. Análisis estadístico de los valores de citotoxicidad en células wt. ............... 55 5. DISCUSIÓN ................................................................................................................. 57 6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 64 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 65 8. ANEXOS ...................................................................................................................... 69 8.1. Anexo 1. Secuencia optimizada de nucleótidos para el gen Myc ......................... 69 8.2. Anexo 2. Código R ............................................................................................... 70 viii RESUMEN EN ESPAÑOL El cáncer se caracteriza por una proliferación celular descontrolada, capacidad propagativa y alteraciones genómicas significativas, como mutaciones en proto-oncogenes. Entre estos, Myc destaca por su sobreexpresión en la mayoría de los tipos de cáncer, donde actúa como un poderoso factor transcripcional, regulando la proliferación, diferenciación y metabolismo celular. En tumores con alta inestabilidad genómica y aneuploidía, las células tumorales parecen emplear mecanismos compensatorios para evitar los efectos perjudiciales de la poliploidía, controlando su expresión a niveles no letales. Investigaciones in silico han propuesto que oncogenes como Myc están sujetos a mecanismos de compensación mediados por microARNs (miARNs), los cuales forman circuitos de retroalimentación negativa que estabilizan su expresión. A partir de este marco teórico, el objetivo principal de este estudio fue validar experimentalmente si el bloqueo de los miR17, miR19a y miR20a altera la compensación Myc en células aneuploides de cáncer. Estas células, con poliploidías para Myc, fueron transfectadas con un plásmido, buscando una expresión estable, que contenía una versión exógena de Myc sin la región 3'UTR, para evitar el control por miARNs y una codificación diferencial de los nucleótidos, lo que permitió diferenciar entre los transcritos endógenos y exógenos. Mediante la adaptación de la técnica génica de tug-of-war, se evaluó cómo la sobreexpresión de exo-Myc afecta la expresión relativa endógena y si el bloqueo de estos miARNs con anti-miRs interfiere con el mecanismo de compensación. Los resultados mostraron que el bloqueo de los miR17, miR19a y miR20a mediante un pool de anti-miARNs produjo un aumento en la expresión de Myc endógeno en las líneas celulares wild-type (HT29 y SW620), apoyando la hipótesis de que estos miARNs son clave en la regulación de la compensación de dosis génica y al inhibirlos son incapaces de ejercer su función regulatoria. En las células wild-type, el aumento en la expresión de Myc fue dosis-dependiente, observándose los mayores efectos a concentraciones de 20 y 30 μM, respectivamente. Sin embargo, en las líneas celulares estables transfectadas con Myc exógeno, el efecto fue menos pronunciado, lo que sugiere un sistema de compensación más robusto o la necesidad de dosis más altas de inhibidores. Estos hallazgos sugieren que el bloqueo de la compensación de dosis génica podría ser una estrategia terapéutica prometedora en el tratamiento de tumores con amplificaciones de Myc, al inducir desequilibrios letales en la expresión del oncogén. ix ABSTRACT Cancer is characterized by uncontrolled cellular proliferation, invasive capacity, and significant genomic alterations, such as mutations in proto-oncogenes. Among these, Myc is particularly notable for its overexpression in most cancer types, where it functions as a potent transcription factor regulating cellular proliferation, differentiation, and metabolism. In tumors with high genomic instability and aneuploidy, tumor cells appear to employ compensatory mechanisms to mitigate the detrimental effects of gene overexpression, maintaining expression levels within non-lethal ranges. In silico studies have proposed that oncogenes such as Myc are regulated through compensation mechanisms mediated by microRNAs (miRNAs), which form part of negative feedback circuits that stabilize their expression. Building upon this theoretical framework, the primary objective of the present study was to experimentally validate whether the inhibition of miR17, miR19a, and miR20a disrupts the compensation of Myc in aneuploid cancer cells. These cells, exhibiting varying levels of Myc amplification, were transfected with a plasmid encoding an exogenous version of Myc lacking the 3'UTR, allowing for the differentiation between endogenous and exogenous transcripts. By adapting the tug-of-war gene technique, this study assessed how exogenous Myc overexpression affects the relative expression of endogenous Myc, and whether the inhibition of these miRNAs using anti-miRs interferes with the compensation mechanism. The results indicated that the inhibition of miR17, miR19a, and miR20a through a pool of anti-miRNAs resulted in an increase in endogenous Myc expression in wild-type (HT29 and SW620) cell lines, supporting the hypothesis that these miRNAs are critical for the regulation of gene dosage compensation. Upon inhibition, the miRNAs failed to exert their regulatory functions. In wild-type cells, the increase in Myc expression was dose- dependent, with the most significant effects observed at concentrations of 20 and 30 μM, respectively. However, in stable cell lines transfected with exogenous Myc, the effect was less pronounced, suggesting the presence of a more robust compensation system or the requirement for higher inhibitor concentrations. These findings suggest that disrupting gene dosage compensation represents a promising therapeutic strategy for treating tumors with Myc amplifications by inducing lethal imbalances in oncogene expression. x LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Secuencias de primers y sondas diseñados para la amplificación de Myc endógeno, Myc exógeno y Gapdh……………………………………………………….. 38 Cuadro 2. Concentraciones de “primers + probe” en función del volumen utilizado para la amplificación………………………………………………………………… 38 Cuadro 3. Resultados de cosecha y pureza de ARN medidos mediante Qubit y Nanodrop …………………………………………………………………………… 40 Cuadro 4. Resumen de los promedio y desviaciones estándar de expresión relativa para el gen exógeno y endógeno en líneas celulares estables HT29 y SW620 wt y estables ……………………………………………………………….…………….. 43 Cuadro 5. Resumen de los valores de expresión relativa para el gen exógeno y endógeno en líneas celulares estables HT29 y SW620 wt y estables ………………. 43 Cuadro 6. Expresión relativa de Myc endógeno con anti-miRs ……………………. 48 Cuadro 7. Análisis de Viabilidad, Tasa de Proliferación, Conteo de Células y Área Total de las Líneas Celulares HT29 E y SW620 E mediante Software ImageJ……… 50 Cuadro 8. Expresión relativa de Myc endógeno a concentración específica de anti- miRs ………………………………………………………………………………… 53 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Todos los cáncer (“all cancers”).…………………………………………………3 Figura 2. Hallmarks del cáncer, 2000……………………………………..………………...5 Figura 3: Hallmarks del cáncer, 2011…………………………………………………….....7 Figura 4. Hallmarks del cáncer, 2022………………………………………………………..8 Figura 5. Biogénesis de los miARNs……………………………………………………….14 Figura 6. Tug-of-war………………………………………………………………………..19 Figura 7. Red miARNs-FT…………………………………………………………………22 Figura 8. Modelo mínimo de compensación………………………………………………..23 Figura 9. Compensación Myc y Stat3……………………………………………………….24 Figura 10. Citotoxicidad en células aneuploides……………………………………………25 Figura 11. Myc tug-of-war………………………………………………………………….27 Figura 12. Plásmido exo-Myc………………………………………………………………31 Figura 13. Incorporación del plásmido exo-Myc……………………………………………37 Figura 14. Población celular con exo-Myc incorporado……………………………………38 Figura 15. Integridad del ARN extraído…………………………………………………….39 Figura 16. Expresión relativa de Myc en líneas wt…………………………………………..41 Figura 17. Expresión relativa de Myc en líneas estables……………………………………42 Figura 18. Comparación de la expresión relativa de endo-Myc entre líneas wild type y estables……………………………………………………………………...……………...45 Figura 19. Titulación del efecto inhibitorio de los anti-miRs………………………………47 Figura 20. Ensayo de viabilidad en las líneas HT29 E y SW620 E………………………...49 Figura 21. Efecto inhibitorio de los anti-miRs……………………………………………..52 Figura 22. TACNAS: oncogenes con adaptación…………………………………………..61 Figura 23. Secuencia de nucleótidos optimizada para el gen Myc…………………………69 xii LISTA DE ABREVIATURAS ADN: Ácido Desoxirribonucleico AGO2: Argonauta 2 ARN: Ácido Ribonucleico ATP: Adenosín Trifosfato BF: Brightfield (Campo brillante) cADN: ADN Complementario CCLE: Cancer Cell Line Encyclopedia (Enciclopedia de líneas celulares de cancer) CNA: Copy Number Alterations (Alteraciones en el número de copias) E: estable FT: Factor de Transcripción GFP: Green Fluorescent Protein (proteína verde fluorescente) miARNs: Micro ARNs miR: Micro ARN mARN: ARN mensajero NCBI: National Center for Biotechnology Information ORF: Open Reading Frame (marco de lectura abierto) PCR: Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa) PD-L1: Programmed Death-Ligand 1 (Ligando de muerte programada 1) pre-miARN: Precursor de micro ARN pri-miARN: Micro ARN primario qPCR: Quantitative PCR (PCR Cuantitativa) RISC: RNA-Induced Silencing Complex (Complejo de silenciamiento inducido por ARN) RT qPCR: Reverse Transcription Quantitative PCR (PCR cuantitativa con transcriptasa inversa) SFB: Suero Fetal Bovino (Serum Fetal Bovine) TACNAs: Transcriptional Alterations Profiling of Copy Number Alterations TAP: Transporter Associated Protein (Proteína asociada al transportador) UTR: Untranslated Region (Región no traducida) wt: wild type (nativo ) 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Cáncer La historia humana no se puede separar de la búsqueda de respuestas ante lo desconocido. Es fácil entender como las enfermedades y los decesos cautivaron la curiosidad humana y en consecuencia incentivaron la búsqueda para poder conocer el qué, cómo y por qué de los padecimientos. Expertos en paleopatología tienen evidencia de que el cáncer pudo estar presente en animales en la prehistoria, pero es necesario remontarse al antiguo Egipto para encontrar los primeros papiros con una escritura racional y lo más cercana a un abordaje médico de las enfermedades de la época (papiro Edwin Smith y papiro de Ebers) donde se encuentra lo que puede ser la primera descripción escrita del cáncer. (1) No obstante, la identificación del cáncer como una enfermedad en sí misma y la capacidad de separarla del misticismo y la superstición fue un proceso que demoró mucho tiempo, en gran medida debido a la extraordinaria diversidad de esta enfermedad. Alrededor del año 400 a.C., Hipócrates publicó sus observaciones sobre el origen y las características de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer. A lo largo de los siglos, numerosos esfuerzos científicos se han dedicado a comprender sus complejos orígenes y a explorar posibles tratamientos, lo que ha requerido una dedicación continua y valiosa. (1) Los primeros abordajes sobre tratamiento incluían recomendaciones de la remoción del tejido afectado y/o del tumor a través de cirugía, cauterización e inclusive, para ciertos tipos de cáncer era más recomendable no tratarlos, pues el tratamiento podría matar al paciente más rápido que el mismo padecimiento. Fue a inicios del siglo XV que Paracelsus, un médico- químico de Suiza, implementó remedios de origen químico como el mercurio, plomo, sulfuro, hierro, zinc, cobre, arsénico, entre otros para tratar de manera interna el cáncer; haciendo hincapié que la diferencia entre una sustancia tóxica para el organismo y una no tóxica, era la dosis. (2) 2 Es posible entender que la identificación precisa y concreta del cáncer y sus orígenes no puede vincularse a un momento específico de la historia. En cambio, lo que observamos es que, a lo largo de la historia, las observaciones médicas y patológicas contribuyeron continuamente al acumulativo científico sobre las características, posibles causas, diagnósticos, tratamientos, estadios de desarrollo y la población más vulnerable a los diversos tipos de cáncer. Es esencial resaltar que la recopilación de este conocimiento se realizó en una época en la que aún no se tenía plena comprensión de que cada organismo vivo está intrínsecamente formado por la unidad fundamental de la vida: la célula. (2) Fue Johannes Mueller, un científico y patólogo de Berlín, que posterior a la implementación de la teoría de la célula, describe por primera vez el cáncer como un grupo “anormal” de células, dando origen al concepto más cercano al que hoy manejamos como cáncer: un conjunto de células “nuevas” (en división) que tiene potencial destructivo en los órganos que afecta y con potencial de distribuirse a otras partes del cuerpo por medio de la vía vascular. Siendo el final del siglo XIX y la implementación del uso de microscopio de gran importancia en temas de identificación celular del cáncer y la caracterización de los muchos tipos que hoy en día reconocemos. (3) A principios de 1900, gracias a la integración de las observaciones generadas por los patólogos a nivel microscópico, las investigaciones médicas se fueron acercando más a lo que hoy sabemos del cáncer, donde las primeras propuestas del origen incluían un factor endógeno y más adelante se incluiría que las afectaciones exógenas también tenían participación en la biogénesis tumoral. Además de la observación de su poder angiogénico y el aprovechamiento de un “microambiente” óptimo para el desarrollo neoplásico. (4) A pesar de que la historia del acumulativo de conocimiento del cáncer es cautivador, también es vasto, y hay trabajos de revisión enteros que se dedican a explicar a detalle el conglomerado de esfuerzos que realizaron científicos para poder entender lo que hoy sabemos de este padecimiento tan heterogéneo, donde a pesar de que las características fisiológicas y anatómicas pueden variar en dependencia del tejido u órgano que afecten, el 3 patrón del crecimiento anómalo celular y su capacidad propagativa, prevalece de tejido entre tejido afectado. (4) Un intento sostenido a lo largo de la historia ha apuntado por comprender este padecimiento, que, a pesar de los esfuerzos, aún alberga numerosos aspectos por entender. El cáncer persiste como la segunda causa de mortalidad a nivel mundial y las proyecciones no anticipan una mejora en las estadísticas; se estima que no solo va a aumentar el número de diagnósticos por año, sino también en la pérdida de vidas humanas asociadas a esta enfermedad. La magnitud de esta problemática escala a que son cerca 20 millones los casos diagnosticados para el año 2020, con un índice de alrededor del 50% de los pacientes que culminan con la muerte, tal y como se muestra en la Figura 1. (5) Figura 1. Todos los cáncer (“all cancers”). Representación de gráfico circular para el número de nuevos casos en el 2020, para ambos sexos y todas las edades (izquierda) y número de muertes en el 2020, para ambos sexos y todas las edades (derecha). (Breast: pecho/mama; lung: pulmón; colorectum: colorectal; prostate: próstata; stomach: estómago; liver: hígado; cervical uteri: cuello uterino; oesophagus: esófago; other cancers: otros cáncer). Fuente Globocon 2020. Se proyecta que para el 2030, la cantidad de decesos llegue a los 13 millones mundialmente. En la actualidad el cáncer ha abarcado el interés en áreas de salud, social, económico e incluso alcanzando instancias políticas donde se requiere un compromiso integral para continuar con 4 las investigaciones que permitan un abordaje más personalizado para mejorar la prognosis del paciente. (6) Desde el conocimiento actual, el cáncer puede ser descrito como un conjunto de enfermedades caracterizadas por la proliferación descontrolada de células y su capacidad propagativa hacia otros tejidos del organismo. (7,8) Su origen se atribuye a cambios genéticos y moleculares inducidos por agentes endógenos y/o exógenos. (6). Sin embargo, los cambios genéticos que desencadenan ciclos desregulados de división celular no se producen de manera súbita, sino que resultan de acumulaciones progresivas de alteraciones que van otorgando inestabilidad en un proceso progresivo. Este proceso finalmente lleva a puntos de daño irreparable, donde la célula pierde su capacidad de mantener la homeostasis, afectando la capacidad de senescencia y muerte regulada. (9) 1.2. “Hallmarks” del cáncer A pesar de que se cuenta con una definición del cáncer, su heterogeneidad promovió que los investigadores se refirieron a la necesidad de encontrar una racionalización de las características distintivas de este padecimiento. A principios de la década de los 2000, dos científicos especializados en el área de genética y biología molecular del cáncer, Hanahan & Weinberg, propusieron una serie de características o “hallmarks” que van a estar presentes en todos los tipos de cáncer, creando un marco más integral para poder entender el cáncer y su fisiopatología. (10) En la primera edición de su revisión, fueron propuestas seis características distintivas que incluyen: la mantención sostenida de señales de crecimiento, evasión de las señales anti- crecimiento, invasión del tejido y metástasis, potencial replicativo ilimitado, angiogénesis sostenida y evasión de la apoptosis (Figura 2). Cada una de estas capacidades representa una modificación crucial en los mecanismos regulatorios celulares que, en condiciones normales, previenen la transformación de células sanas en malignas. (10) 5 Figura 2. Hallmarks del cáncer, 2000. Se establece por primera vez seis rasgos o “hallmarks” esenciales para caracterizar el cáncer (evading apoptosis: evación de apoptosis; self-suficiency in growth signals: mantención sostenida de señales de crecimiento; insensitivy to anti-growth signals: evasión de las señales anti-crecimiento; sustained angiogenesis: angiogénesis sostenida; limitless replicative potential: potencial replicativo ilimitado; tissue invasion & metastasis: invasión de tejido y metástasis). (10) La mantención sostenida de señales de crecimiento describe la capacidad de las células cancerosas para promover su replicación sin necesidad de estímulos externos normales. Este rasgo se facilita principalmente por la activación de proto-oncogenes, los cuales, a través de factores endógenos y exógenos, mutan a oncogenes y alteran las vías de señalización del ciclo celular. Además, en condiciones de homeostasis, las células sanas cuentan con mecanismos intrínsecos que les permiten detener su proliferación ante anomalías en el proceso mitótico y condiciones ambientales adversas, lo que garantiza la regulación del ciclo celular. Pero parte de la transformación hacia la malignidad implica la insensibilidad a las señales inhibitorias del crecimiento que refleja la pérdida en la función de estos mecanismos, que normalmente evitarían la proliferación descontrolada. La evasión de la regulación celular y la mantención sostenida de señales proliferativas son aspectos clave en la génesis tumoral favoreciendo el potencial replicativo ilimitado. (10) Parte de las estrategias celulares ante daños del ADN o alteraciones irreversibles del ciclo celular es la apoptosis: un tipo de muerte celular programada que actúa como una defensa natural frente al daño celular irreparable. Sin embargo, en células cancerosas, se observan alteraciones en estos mecanismos de muerte celular programada que permiten la resistencia 6 a señales apoptóticas, favoreciendo su supervivencia aun en condiciones de estrés celular y daño genético. (10) El estrés celular inducido por hipoxia, causado por el crecimiento descontrolado de células malignas, resulta incompatible con la supervivencia celular a medio y largo plazo aun cuando los mecanismos ya mencionados han emergido, y el éxito de la sobrevida tumoral va a depender de que las células medien la secreción de sustancias promoviendo la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) y así suplir de los recursos necesarios las células cancerosas. Finalmente, las células con estados de malignidad ya establecidos tienen la capacidad de migrar vía vascular venosa o linfática a tejidos distintos al punto de origen primario de la neoplasia y favorecer el establecimiento de tumores secundarios (10) Para la segunda década de los 2000, los avances en el estudio del cáncer permitieron que una segunda revisión literaria de los 'hallmarks' propusiera una comprensión más amplia de las neoplasias, no solo como una enfermedad celular, sino también considerando factores exógenos. Para esta segunda edición se identificaron cuatro nuevas características, divididas en dos grupos: los “hallmarks emergentes” que incluyen la desregulación del metabolismo celular y la evasión del sistema inmune; y los “enabling hallmarks” que “hacen posible” el desarrollo del cáncer, como la inestabilidad genómica y la inflamación pro-tumoral (Figura 3). (11) 7 Figura 3. Hallmarks del cáncer, 2011. Se incluye dentro del marco de la caracterización del cáncer las características emergentes (emerging hallmarks): desregulación del metabolismo energético (deregulating cellular energetics), y evasión del sistema inmune (avoiding inmune destruction), y las características “habilitadoras” (enabling characteristics): inestabilidad genómica y mutación (genome inestability and mutation), e inflamación pro-tumoral (tumor-promoting inflammation). (11) Dentro de las características emergentes se encuentra la capacidad de las células cancerosas a tolerar situaciones de hipoxia entre tanto se media la selección de aquellas células que promueven la angiogénesis. Parte de las adaptaciones celulares en entornos pobres en oxígeno o nutrientes es la desregulación del metabolismo energético. En condiciones normales, las células dependen de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias para generar energía en forma de ATP. Sin embargo, muchas células cancerosas tienden a favorecer la glicólisis aeróbica, un proceso menos eficiente energéticamente pero que facilita la producción de precursores biosintéticos necesarios para la mantención de altas tasas de proliferación. Este fenómeno es conocido como el efecto Warburg. (11) Los errores en la duplicación del ADN y en la división celular son inevitables. Aunque las células disponen de mecanismos de corrección de errores, algunos pueden pasar inadvertidos y acumularse con el tiempo. El sistema inmunitario desempeña un papel fundamental en la vigilancia celular, identificando células con acumulaciones de errores potencialmente neoplásicos y mediando las señales para inducir la muerte celular programada. Sin embargo, los autores destacan la capacidad de las células cancerosas para evadir la respuesta inmunitaria. Estas células han desarrollado diversos mecanismos para escapar de la vigilancia inmune, como la secreción de factores inmunosupresores, la expresión de proteínas inhibidoras como PD-L1, y la creación de un microambiente tumoral que suprime la actividad de los linfocitos T y otras células inmunitarias. (11) En cuanto a las características que “hacen posible” el cáncer, la inflamación juega un papel crucial en la progresión tumoral. En particular, la inflamación persistente, a menudo provocada por infecciones, enfermedades crónicas o respuestas inmunitarias exacerbadas o no resueltas, genera un entorno que favorece la proliferación celular y la angiogénesis, además de contribuir a señales antiapoptóticas. Células con fenotipos inflamatorias presentes 8 en el microambiente tumoral secretan factores de crecimiento, citoquinas y enzimas que promueven la remodelación tisular y el crecimiento del tumor. Asimismo, la inflamación crónica puede contribuir a la inestabilidad genómica al generar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, que dañan el ADN. (11) Finalmente, la inestabilidad genómica es una característica que subyace a la mayoría de los tipos de cáncer, es decir, esta característica sugiere ser causa inicial de los eventos de la biogénesis tumoral. No obstante, aún está en debate si las mutaciones por defectos en los mecanismos de reparación del ADN, son lo que origina la inestabilidad genómica, o es en sí la inestabilidad genómica la que promueve mutaciones en genes clave como los oncogenes y los genes supresores de tumores. (11) La revisión más reciente, denominada “nuevas dimensiones”, introduce los conceptos de plasticidad fenotípica desbloqueada, células senescentes, reprogramación epigenética no mutacional y microbiomas polimórficos, todos ellos considerados componentes clave en el desarrollo y la progresión del cáncer (Figura 4). (12) Figura 4. Hallmarks del cáncer, 2022. Todas las características del cáncer hasta la actualidad, resumidas en un esquema gráfico donde se incluyen los cuatro nuevos hallmarks. Se plantea que la plasticidad fenotípica (unlocking phenotypic plasticity) podría considerarse un nuevo hallmark del cáncer. Además, la reprogramación 9 epigenética (nonmutational epigenetic reprogramming) y los microbiomas polimórficos (polymorphic microbiomes) pueden considerarse como características que permiten a las células cancerosas adquirir otras capacidades malignas. Por último, las células senescentes (senescent cells) tienen potencial como células clave en el microambiente tumoral. (12) Ampliar la comprensión del cáncer ha revelado que factores previamente considerados protectores, o al menos ajenos a la dinámica tumoral, en realidad juegan un papel clave en la progresión y desarrollo del cáncer. Entre estos, las células senescentes, previamente vistas como reguladoras del ciclo celular y, por ende, de la proliferación descontrolada, se ha descubierto que a través de su fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), liberan citoquinas y otros factores que favorecen la inflamación y el microambiente tumoral, contribuyendo a la proliferación y progresión de las células maligna. (12) Como se mencionó anteriormente, la inflamación de bajo grado es fundamental para la biogénesis y el desarrollo de neoplasias. Investigaciones recientes han destacado la importancia de los microbiomas en la salud y la enfermedad. Actualmente se sabe que los microorganismos residentes de nuestro sistema juegan un papel crucial en la modulación del sistema inmune. Un microbioma desequilibrado puede inducir la liberación de mensajeros químicos que promueven la inflamación crónica, creando un entorno propicio para el desarrollo tumoral. (12) Además, la reprogramación epigenética no mutacional desempeña un rol crucial en la remodelación de la expresión génica sin necesidad de cambios genéticos, lo que permite a las células cancerosas adaptarse dinámicamente a su entorno. Factores como la hipoxia inducen estas modificaciones epigenéticas, haciendo que el cáncer sea un proceso aún más complejo y adaptable. Por último, la plasticidad fenotípica permite a las células tumorales escapar de su estado de diferenciación y adaptarse a diversas trayectorias de desarrollo, lo que les confiere una mayor capacidad de proliferación descontrolada y adaptación a diferentes entornos. (12) En conclusión, los “hallmarks” del cáncer, proporcionan abordaje más integral para entender la complejidad de este padecimiento. Estos rasgos distintivos han demostrado ser 10 fundamentales para explicar cómo las células sanas se convierten en malignas por medio de capacidades que les permiten evadir las barreras de regulación, proliferar de manera descontrolada y adaptarse a su entorno. Dentro de este panorama, la inestabilidad genómica sugiere ser un facilitador de la acumulación de mutaciones que impulsan la transformación maligna. Su relación con la activación de oncogenes refuerza la idea de que los procesos mutacionales no solo inician, sino que también perpetúan la progresión tumoral, destacando la importancia de estos mecanismos interconectados en la biogénesis y el crecimiento del cáncer 1.3. Oncogenes Como se mencionó en la revisión de los hallmarks, los mecanismos antitumorales desarrollados por los organismos multicelulares a lo largo de la evolución pueden ser superados por eventos que favorecen la transformación maligna, destacando la activación de oncogenes. (9) La heterogeneidad del cáncer hace que la identificación precisa del inicio de los procesos neoplásicos sea incierta. No obstante, la inestabilidad genómica puede considerarse el motor del desarrollo de ciertos cariotipos malignos que impulsan la evolución del cáncer. Esto se debe a que investigaciones han identificado genes impulsan la proliferación celular descontrolada al promover señales de crecimiento sostenidas, lo que requiere que las células premalignas bloqueen vías de muerte celular, como la apoptosis, y toleren altos niveles de estrés. (13) En condiciones normales (de salud y/o homeostasis) las células transcriben genes que regulan el mantenimiento, el control y la estimulación del crecimiento celular, adaptándose a las demandas del organismo para conservar un estado saludable. Dentro de nuestro genoma, hay un grupo de genes que se conocen como “proto-oncogenes” que se expresan de manera controlado en células sanas, pero que al verse afectadas por factores endógenos o exógenos pueden mutar a “oncogenes”, un estado que generalmente se caracteriza por la hiperactivación, y mediar procesos de oncogénesis. (14) 11 Un oncogén que ha sido ampliamente estudiado es Myc, que actúa principalmente como un regulador maestro de la transcripción, controlando directamente la expresión de miles de otros genes. Pertenece a una familia que codifican factores de transcripción esenciales para la regulación de programas biológicos fundamentales, como la proliferación celular, diferenciación, apoptosis, metabolismo y crecimiento. Sus efectos son vastos, abarcando tanto la biología intrínseca de las células tumorales como su capacidad para influir en el microambiente tumoral y evadir las respuestas inmunitarias del huésped, características que ya se mencionaron como “hallmarks” claves para la biogénesis tumoral. (15) La familia de proteínas Myc está compuesta por c-Myc, n-Myc y l-Myc, donde c-Myc regula procesos fundamentales en la mayoría de las células, mientras que n-Myc y l-Myc son genes de expresión específica en determinados tejidos. (16) Ensayos de deleción en modelos knockout han demostrado que la pérdida de estos genes es letal en embriones pequeños, provocando crecimiento retardado y una proliferación celular descontrolada. (17) Como factores de transcripción, los miembros de la familia Myc regulan procesos clave como la proliferación, diferenciación, adhesión y supervivencia celular, siendo esenciales en la regulación transcripcional de otros genes. Por este motivo, su propia transcripción, traducción y modificaciones postraduccionales están estrictamente controladas para mantener el equilibrio celular. (18) En la mayoría de los cánceres humanos, Myc está activado a través de diversos mecanismos genéticos, epigenéticos y postraduccionales, como amplificaciones génicas, translocaciones cromosómicas y mecanismos que incrementan la estabilidad de la proteína MYC. Además de su papel en la regulación de la proliferación celular, Myc es un regulador esencial del metabolismo celular, facilitando una reprogramación metabólica que permite a las células tumorales satisfacer sus altas demandas energéticas. Este proceso incluye un incremento en la captación de glucosa y glutamina, la activación de la glicólisis aeróbica y la modificación de otras vías metabólicas para sustentar el rápido crecimiento tumoral. La sobreexpresión de Myc también está relacionada con la inestabilidad genómica, lo que favorece la acumulación de mutaciones que impulsan la progresión del cáncer. (15) 12 Los oncogenes han venido siendo evaluados por los científicos como potenciales blancos para terapias moleculares. No obstante, con lo mencionado anteriormente, es fácil entender que los genes no trabajan en líneas individuales de acción-reacción, sino que su expresión esta mediada por redes complejas, y a su vez estos van a colaborar con retroalimentaciones positivas y negativas en las interacciones biomoleculares. (13) Acón-Chan y colaboradores (13), han demostrado en base a modelos matemáticos que los genes Myc, Stat3, Stat5b y Foxc1 están sujetos a modelos regulación de dosis génica en redes complejas de regulación mediada por micro ARNs (miARNs) y factores de transcripción (FT). Estas redes o circuitos han demostrado ser muy robustas ante cambios ambientales, permitiendo adaptarse ante de las variaciones inherentes en los procesos tumorales. 1.4. micro ARNs Los miARNs son moléculas de ARN endógenas especializadas en la supresión y silenciamiento de genes. Desde su descubrimiento en 1993 los miARNs se han convertido en potenciales blancos de tratamiento al mostrar correlaciones (positivas y negativas) con diferentes condiciones de salud, desde el mantenimiento homeostático de la célula, control sobre el proceso de proliferación y ciclo celular hasta la asociación con la gestación, infecciones virales y cáncer. (19) Se estima que un solo miARN puede regular varios cientos de genes al unirse a la región 3' UTR (untranslated region o regiones no traducidas de los genes) del ARN mensajero (mARN) blanco. Para poner en perspectiva su influencia en los procesos regulatorios del genoma, estudios recientes han confirmado que hasta un 30% de los mARN humanos pueden estar regulados por miARNs. Este porcentaje podría ser aún mayor si se considera que los miARN también pueden unirse a la región 5' UTR e incluso a las regiones ORF (open reading frame o marcos de lectura abierto) -aunque estas interacciones son menos frecuentes y se cree que su efectividad es menor, no dejan de ser relevantes en la regulación génica. (19) Aproximadamente la mitad de los miARNs identificados hasta ahora son intragénicos, lo que significa que se procesan principalmente a partir de intrones y, en menor medida, de exones 13 de genes codificadores de proteínas. La otra mitad son intergénicos, es decir, se transcriben de manera independiente de un gen huésped y están regulados por sus propios promotores. En algunos casos, los miARNs se transcriben como un solo transcrito largo, conocido como clústeres, que pueden compartir regiones semilla similares y, en tal caso, se consideran una familia. La biogénesis de los miARNs se clasifica en vías canónicas y no canónicas (Figura 5). (20) 1.5.1. Biogénesis canónica de los miARNs La biogénesis canónica de los miARNs se inicia en el núcleo celular, donde los genes huéspedes se transcriben en un miARN primario, conocido como pri-miARN. El pri-miARN es una molécula de ARN de doble hebra que adopta una estructura de horquilla característica y puede alcanzar longitudes de hasta mil nucleótidos, presentando características típicas de un mARN, como un cap en el extremo 5' y una cola poli-A en el extremo 3'. En el núcleo, es reconocido y procesado por un complejo proteico denominado complejo microprocesador, compuesto por la ribonucleasa de tipo III Drosha y la proteína DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8) que actúa como cofactor. Drosha corta el pri-miARN, liberando un precursor más corto llamado pre-miARN. (20) El pre-miARN es transportado desde el núcleo al citoplasma por una proteína llamada exportina-5 (XPO5). En el citoplasma, el pre-miARN, que aún conserva la estructura de horquilla, es reconocido y procesado por otra ribonucleasa de tipo III: Dicer. Dicer corta el pre-miARN para generar un miARN de doble hebra más corto, que es conocido como miARN duplex. De las dos hebras resultantes, solo una se incorpora en el complejo de silenciamiento inducido por miARN (RISC), que es el complejo funcional responsable de la actividad de los miARNs. La proteína Argonauta (AGO), que es componente clave del complejo RISC, juega un papel esencial en la selección de la hebra guía (la hebra que se incorpora en el RISC) y en la mediación de la interacción entre el miARN y su mARN. Una vez que el miARN guía se une al mARN objetivo, puede inducir la degradación del mARN o inhibir su traducción, modulando así la expresión génica. (20) 14 Figura 5. Biogénesis de los miARNs. Los miARNs tienen dos vías de procesamiento: la vía canónica a partir de genes independientes, y las vías no canónicas donde los miARNs pueden derivar de secciones intrónicas de ARN mensajeros inmaduros con la colaboración de proteínas de procesamiento en el núcleo o ser procesados directamente en el citoplasma por la proteína AGO2. Imagen de elaboración propia con Biorender.com. 1.5.2. Biogénesis no canónica de los miARNs Además de la vía canónica, existen varias rutas no canónicas que permiten la maduración de los miARNs, y estas rutas no siguen el mismo esquema estricto que la vía canónica. Una de las rutas no canónicas más estudiadas es la de los miARNs derivados de intrones, conocidos como mirtrones. A diferencia de los miARNs canónicos, los mirtrones no requieren procesamiento por Drosha. En su lugar, se derivan directamente de intrones que han sido removidos y empalmados del mARN precursor durante el proceso de splicing. Estos intrones en forma de horquilla son exportados al citoplasma, donde son procesados por Dicer de manera similar a los pre-miARNs en la vía canónica. (19) Otra ruta no canónica incluye miARNs que son procesados directamente en el citoplasma por la proteína Argonauta 2 (AGO2), sin la intervención previa de Drosha o Dicer. En este caso, AGO2 corta directamente los precursores de miARN en el citoplasma, generando miARNs funcionales que pueden ser incorporados en el complejo RISC. (19) Vía canónica Vías no canónicas Prim-miARN Pre-miARN Pre-miARN Hebra guía Degradación Inhibición Hebra pasajera Mirtron 2 mARN mARN 15 Adicionalmente, existen otras rutas no canónicas que involucran diferentes nucleasas, como la exoribonucleasa XRN2, que participa en la degradación de transcritos específicos antes de que se formen los miARNs maduros. Aunque estas rutas no canónicas son menos comunes y comprendidas que la vía canónica, desempeñan un papel importante en la diversificación de la regulación genética mediada por miARNs, permitiendo la generación de miARNs en contextos específicos y bajo condiciones particulares. (19) A través de este mecanismo de regulación y silenciamiento, los miARNs regulan procesos biológicos esenciales como el ciclo celular, la apoptosis, el metabolismo y la respuesta al estrés celular, todos procesos son críticos tanto en el desarrollo normal como en la patogénesis de enfermedades, incluido el cáncer. Además, se ha estudiado que se pueden transcribir como clusters de miARNs que son un conjunto de miARNs que están codificados en una misma región cromosómica y que generalmente se expresan juntos actuando de manera coordinada para regular la expresión de múltiples genes diana. (19) En el contexto del cáncer, la expresión desregulada de miARNs puede alterar la expresión de genes clave, contribuyendo a la transformación maligna. Algunos miARNs actúan promoviendo la carcinogénesis al inhibir genes supresores de tumores, mientras que otros funcionan como supresores al regular oncogenes. Esta doble funcionalidad les confiere un papel crucial en la homeostasis celular y en la progresión del cáncer, dependiendo de los genes diana afectados y del contexto celular específico. Además, los miARNs tienen la capacidad de regular varios genes simultáneamente, creando redes complejas de control que pueden coordinar múltiples procesos biológicos a la vez. (19,21) Un aspecto clave donde los miARNs demuestran su importancia es en la compensación de dosis, particularmente en cáncer que presentan aneuploides. En estos casos, los miARNs actúan como reguladores homeostáticos, asegurando que la sobreexpresión de genes críticos no conduzca a un desbalance potencialmente tóxico. Los miARNs logran esto mediante la formación de circuitos de retroalimentación negativa con factores de transcripción que regulan la expresión de estos genes, lo que permite una compensación efectiva de la dosis génica. (19,21) 16 Un ejemplo de esto es que las investigaciones han podido elucidar que a pesar de que oncogenes como Myc presentan poliploidías en múltiples cáncer, los niveles de ARNm y proteína pueden mantenerse estables gracias a la acción de miARNs como miR-17, miR-19a y miR-20a (parte de un clúster llamado OncomiR-1), que forman parte de estos circuitos de regulación. Este mecanismo es esencial para mitigar los efectos perjudiciales que podrían resultar del exceso de copias de oncogenes, previniendo la proteotoxicidad celular y permitiendo la supervivencia de células cancerosas con aneuploidía, mediado por la compensación de dosis génica. (21) 1.5. Compensación de dosis génica La compensación de dosis génica es un mecanismo esencial que los organismos han desarrollado para corregir los desequilibrios en la expresión génica provocados por variaciones en el número de copias de los cromosomas o segmentos cromosómicos, conocidos como alteraciones en el número de copias (CNA, por sus siglas en inglés). Estas variaciones se definen como aneuploidía, condición en la que las células poseen un número anómalo de cromosomas, con potenciales alteraciones de la expresión génica. (22) La compensación génica es un proceso esencial y altamente conservado en la biología de los organismos, permitiendo la estabilidad fenotípica a pesar de las fluctuaciones en la dosis génica. Este mecanismo es particularmente relevante en especies donde existen diferencias en el número de cromosomas sexuales entre machos y hembras, como en Drosophila melanogaster, donde los machos compensan la dosis aumentando la transcripción del cromosoma X, o en Caenorhabditis elegans, donde las hembras disminuyen la transcripción de sus dos cromosomas X y en situaciones de CNA variable en plantas, como en Arabidopsis thaliana. Y es que la compensación de dosis génica permite a los organismos gestionar eficazmente las disparidades en la expresión génica no mutacional, asegurando la viabilidad y funcionalidad a nivel celular y del organismo completo. (22) 17 En humanos, el cariotipo está conformado por 23 pares de cromosomas diploides, y cualquier alteración en el número de cromosomas generalmente resulta letal. (23) Este riesgo se debe a que en células normales en desarrollo, la aneuploidía conduce a la pérdida de capacidad de proliferación, disminuye la viabilidad celular debido al incremento del estrés proteotóxico, altera los requerimientos metabólicos y compromete los procesos de recombinación genética Como resultado, muchas de las monosomías y trisomías son incompatibles con la vida, siendo la trisomía del cromosoma 21 (Síndrome de Down) una de las pocas excepciones que permite la sobrevivencia postnatal (13) En el contexto oncológico, la aneuploidía ha sido detectada en el 90% de las células tumorales. (24) Aunque podría pensarse que esta condición comprometería la viabilidad celular, en realidad parece favorecer la progresión tumoral y empeorar el pronóstico clínico. (25) Las células cancerosas se han adaptado para utilizar la aneuploidía en su beneficio, convirtiendo lo que podría ser una carga genómica en una característica adaptativa que les permite sobrevivir y evadir las terapias convencionales. Este fenómeno puede entenderse como parte de la extraordinaria capacidad de las células tumorales para adaptarse a condiciones adversas, incluida la variabilidad genómica. (23) Las células tumorales han usado el proceso de compensación de dosis génica para facilitar su crecimiento y supervivencia. Las células cancerosas a menudo presentan aneuploidías y múltiples CNAs, lo que resulta en un perfil genómico altamente inestable. A través de la compensación génica, estas células pueden sobreexpresar oncogenes o reducir la expresión de genes supresores de tumores, adaptándose a las condiciones cambiantes de su entorno y resistiendo las terapias dirigidas. Este proceso les permite mantener la proliferación celular descontrolada, invadir tejidos circundantes y, en última instancia, metastatizar. La manipulación de la compensación de dosis génica es, por lo tanto, una estrategia clave mediante la cual las células cancerosas optimizan su ventaja selectiva en un entorno hostil, subvirtiendo los mecanismos naturales que, en circunstancias normales, protegerían a las células del daño por toxicidad proteica. (22) 18 Acón-Chan y colaboradores (24) exponen que el fenómeno de compensación de dosis génica puede ser explicado porque algunos genes clave, a pesar de la aneuploidía, están regulados dentro de un rango controlado de expresión para que la célula pueda sobrevivir. Aunque la cantidad de mARN a menudo se correlaciona con la cantidad de copias del gen, estos cambios no siempre se reflejan a nivel proteico. Esto sugiere que los mecanismos de compensación pueden actuar a diferentes niveles, ya sea en la transcripción, en la traducción proteica o incluso a nivel epigenético, siendo este último el más eficiente en términos de costo energético. (13) Investigaciones sobre CNAs y sus mecanismos compensatorios han encontrado que la mayoría de las veces la compensación se da a nivel de proteína. (26,27) Tal es el caso de Ishikawa y colaboradores (28), que utilizando el método de “tug-of-war” en levaduras, explican la compensación de proteínas a nivel post-traduccional. Tug-of-war es una técnica que busca estimar el límite máximo de expresión de un gen, aumentando su número de copias, antes de que la célula muera. (27) Los autores identificaron los genes que presentaban algún tipo de compensación en Saccharomyces cerevisiae (26) y explicaron el mecanismo de compensación en levaduras. (28) En la Figura 6., ellos esquematizan como es que hay genes que al estar sometidos a presión evolutiva van a estar compensados cuando el número de copias del gen aumenta, de lo contrario podría llegar a ser fatal para la célula. Es importante tomar en cuenta que los mecanismos de compensación no distinguen, y en el caso del experimento, pueden compensar la expresión endógena y exógena. (28) 19 Figura 6. Tug-of-war. Representación gráfica para la validación de la compensación génica utilizando el método de “tug-of-war”. En el esquema se observa que el gen objetivo (target gen) tiene una etiqueta TAP fluorescente, esta cepa de S. cerevisiae trae de manera endógena en su genoma la etiqueta. De esta manera, las proteínas a partir de este gen van a presentar la fluorescencia por TAP. En el panel de la izquierda (single) se observa que al introducir plásmidos de expresión multicopia vacíos, la cantidad de proteína es estable. En el panel del centro (multi/uncompensated) esquematiza que aquellos genes que no cuenten con mecanismos de compensación, al agregar plásmidos multicopia, la cantidad de proteína va a estar sobre expresada. Mientras que los genes que tienen mecanismos de compensación (panel derecho multi/compensated) van a presentar una cantidad regulada de proteínas a pesar de tener múltiples copias de este introducidos por los plásmidos multicopia y la compensación es demostrada por una disminución de la presencia del TAP que está unido a la proteína endógena. (28) Ishikawa y colaboradores (28) explican que para la proteína POP5 de S. cerevisiae los niveles de mARN aumentan significativamente al aumentar el número de copias del gen introducido mediante plásmidos. En este caso, la regulación no es a nivel traduccional. Ellos encontraron que el responsable de la compensación era el sistema proteasomas-ubiquitinización. Las proteínas producidas en exceso por el aumento en el número de copias que están sujetos a los mecanismos de compensación eran “marcadas para su degradación con “ubiquitina” y posteriormente transportadas al proteasoma para su desintegración. Sin embargo, a pesar de que se estima que el 10% del genoma de la levadura podría estar sujeto a la compensación a nivel de proteína (28), desde el punto de vista metabólico, la derivación evolutiva debería optar por aquellos mecanismos compensatorios a nivel epigenético o pre-transcripcional para evitar incurrir en todo el gasto energético. Pero otros 20 autores también hay constatado que los circuitos biológicos entre los miARNs y factores de transcripción tienen la capacidad de adaptarse ante los cambios de concentraciones de las biomoléculas en la célula, por lo que la compensación a este nivel no solo involucra la ventaja de evolutiva de ahorro energético, sino también plasticidad para adaptarse las condiciones cambiantes de los microambientes tumorales. (13) El avance en la biología molecular ha facilitado el desarrollo de nuevas herramientas y objetivos terapéuticos, prometiendo mejorar los diagnósticos oportunos y reducir el bajo pronóstico del cáncer. En este contexto, se ha observado que los miARNs podrían ser responsables de la compensación de dosis génica de Myc en células poliploides. Esto ha llevado a considerar que los miARNs tienen un potencial aún no explorado, que podría ser de gran alcance en el diseño de terapias alternativas contra esta enfermedad. 1.6. Biología de Sistemas Sintetizando la información anterior, el análisis de la compensación de dosis génica en células cancerosas ha revelado mecanismos complejos mediante los cuales ciertos genes mantienen niveles de expresión relativamente constantes a pesar de presentar CNA. Acon y colaboradores (2021) (21) con herramientas in silico y el panel NCI-60, que abarca 59 líneas celulares de cáncer, identificaron genes candidatos bajo compensación de dosis génica al observar una alta variabilidad en el número de copias de ADN, pero una baja variabilidad en la expresión de ARN. Esto sugiere que hay genes están sujetos a mecanismos de regulación que amortiguan los efectos de la poliploidía. Para identificar estos genes, se implementó un criterio basado en la comparación de los niveles de CNA, la expresión de ARN y los niveles proteicos, revelando que genes como Myc presentaban una alta frecuencia de amplificación sin un correspondiente aumento en los niveles de ARN. Este comportamiento, observado también en otros genes, refuerza la hipótesis de un proceso de compensación de dosis en el que se regula la expresión para mantener la homeostasis celular, a pesar de los cambios genómicos. La limitación de la variabilidad en la expresión sugiere 21 un proceso de regulación activo, posiblemente relacionado con interacciones complejas entre factores de transcripción y miARN. Para comprender mejor el mecanismo de compensación de dosis, con biología de sistemas se propuso un modelo matemático que simula las interacciones entre los FT y miARNs, estableciendo una red de regulación que podría explicar el fenómeno de compensación en las células aneuploides. Se analizaron las correlaciones entre la variación en el número de copias y los niveles de expresión de miARN y TF, lo que permitió construir una red de 47,122 interacciones reguladoras que conectan a 21 genes candidatos con 163 miARN y 428 FT. Dentro de esta red, se identificaron varios bucles de retroalimentación y circuitos “feedforward”, tanto coherentes como incoherentes, que sugieren la existencia de mecanismos regulatorios complejos. Sin embargo, se determinó que solo los genes con función de FT, como Myc, Stat3 y Znf217, pueden desencadenar respuestas que permitan compensar las variaciones en su número de copias, lo que llevó a la simplificación del modelo, reduciéndolo a una red de 65 nodos y 506 arcos. Los nodos incluyen un total de 45 FT y 20 miARN. Para identificar motivos regulatorios con propiedades sistémicas, se analizaron bucles de retroalimentación tanto positiva como negativa, junto con circuitos de alimentación directa coherentes e incoherentes. El análisis reveló la presencia de 16 bucles de retroalimentación, 28 circuitos de alimentación directa coherente y 45 de tipo incoherente (Figura 7). (21) 22 Figura 7. Red miARNs – FT. Red simplificada de las interacciones entre los miARNs y FT para los genes Myc, Stat3, Stat5A y Stat5B. (21) Parte de la investigación también incluyo el desarrollo de un modelo mínimo compensación de dosis para Myc y Stat3, que incluyó interacciones críticas entre estos genes y varios miARN, como miR17, miR19a, miR20a y miR21. Este modelo permitió reproducir in silico el mecanismo de compensación de dosis observado en modelos más grandes y detallados, confirmando que las interacciones de retroalimentación negativa con estos miARN son esenciales para la compensación. Además, se observó que la compensación de Myc y Stat3 es redundante (Figura 8), lo que sugiere que múltiples miARN pueden actuar simultáneamente para mantener la estabilidad de la expresión génica. Estos resultados proporcionaron una base sólida para intervenciones terapéuticas, ya que la inhibición de 23 algunos de estos miARN podría alterar la compensación de dosis en células con amplificaciones de Myc, lo que ofrece un potencial blanco terapéutico en el tratamiento del cáncer. (21) Figura 8. Modelo mínimo de compensación. (A) Los modelos in silico simularon las interacciones de compensación de los miARNs con Myc, donde el control cuenta con la presencia de los tres miRs propuestos como parte del sistema de compensación Myc – Stat3 y aunque haya números de copia elevados (myc copy number = número de copia Myc), la expresión se mantiene compensada, mientras la simulación quitando uno o combinaciones de miARNs demuestra cambios a la alza de la expresión de Myc (Myc expression = expresión de Myc; fold change = cambio de expresión). (B) Esquema gráfico del modelo mínimo de compensación entre FT-miARNs para el gen Myc y Stat3. (21) Finalmente, para evaluar la amplitud de este fenómeno en diferentes tipos de cáncer, se utilizó un conjunto de datos más grande proveniente del Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), que incluye 898 líneas celulares. Los resultados mostraron que Myc exhibe una compensación de dosis robusta en la mayoría de los tipos de cáncer, mientras que Stat3 mostró una compensación más débil y limitada (Figura 9). Este patrón se observó al comparar la variabilidad del número de copias y los niveles de expresión de MYC en múltiples tipos de cáncer, confirmando la robustes de la su red de compensación, incluso en tumores con alta heterogeneidad genética, sugiriendo a Myc y el modelo mínimo de compensación como un posible objetivo terapéutico. (21) 24 Figura 9. Compensación Myc y Stat3. Escaneo del parámetro del número de copias (copy number) para Myc (superior) y Stat3 (inferior), en diferentes tipos de tumor. En rojo se observa un aumento en la expresión (fold increase) mayor para tumores óseos, colorectal, gástrico, hepático, próstata, células plasmáticas, tejido blando, y tracto urinario con Stat3, es decir, su compensación se presenta en menor medida y frecuencia. Por el contrario, Myc presenta un comportamiento de compensación para todos los tumores evaluados excepto el de próstata y útero, sugiriendo una red mucho más robusta de regulación ante CNA. (bille duct: ducto biliar; blood: sangre; bone: hueso; breast: pecho; CNS: Sistema nervioso central; colorectal: colorrectal; esophagus: esófago; fibroblast: fibrablasto; gastric: gástrico; kidney: riñón; liver: hígado/hepático; lung: pulmón; lymphocytes: linfocitos; ovary: ovario; pancreas: páncreas; PNS: senos para nasales; plasma cell: células plasmáticas; prostate: próstata; soft tissue: tejido blando; thyroid: tiroides; upper aerodigestive: aerodigestivo superior; urinary tract: tracto urinario; uterus: útero). (21) Con la propuesta del modelo mínimo de compensación (Figura 8B), un experimento evaluó el efecto citotóxico de bloquear la compensación de la dosis génica de Myc en tres líneas celulares de cáncer de colon con diferentes números de copias de este oncogén: HCT15 (2 copias), HT29 (4 copias) y SW620 (7 copias). Para lograr la inhibición de la compensación génica, las células fueron transfectadas con concentraciones crecientes (10–30 μM) de una mezcla de anti-miR17, anti-miR19a y anti-miR20a, los mi-ARNs propuesto como responsables de regular la expresión de Myc. La citotoxicidad fue monitoreada mediante microscopía de fluorescencia en tiempo real durante un periodo de 72 horas. Los resultados sugieren que las células con mayor amplificación del gen podrían ser más vulnerables a la inhibición de los mecanismos de compensación de dosis génica (Figura 10), lo que plantea un potencial terapéutico en el tratamiento de cánceres aneuploides que presentan amplificación de Myc. (21) 25 Figura 10. Citotoxicidad en células aneuploides. (A) Imagen por microscopia de fluorescencia de las líneas celulares de cáncer de colon aneuploide del panel NCI-60 a las 24, 48 y 72 horas post transfección con anti- miRs propuestos en el modelo mínimo de compensación. Con diferencias cualitativas para el numero de células muertas a término del experimento vs células control. (B) Datos cualitativos extraídos de las imágenes de microscopia de fluorescencia con el software CellProfiler, con evidencias significativas entre el número de células muertas de la población transfectada con el pool de anti-miRs vs la muestra control transfectada con ARN de control negativo. (21) 1.7. Justificación El cáncer es una enfermedad compleja y dinámica, caracterizada por alta inestabilidad genómica y alteraciones moleculares en constante evolución. Cada célula cancerosa presenta un conjunto único de mutaciones, lo que resulta en patrones mutacionales distintos entre los A B 26 pacientes y dentro de un mismo tumor. Esta heterogeneidad tumoral es un factor clave en la resistencia a las terapias oncológicas, lo que con frecuencia lleva al fracaso o perdida de efectividad de los tratamientos convencionales que actualmente incluye la cirugía, radioterapia y/o administración de fármacos. (29) La quimioterapia es el método que se administra en la mayoría de los casos con tumores ya desarrollados, pero los efectos secundarios a nivel físico y psicológicos prevalecen aún después de terminado el tratamiento alterando considerablemente la calidad de vida del paciente. (30) En este contexto, se han explorado nuevas tecnologías, como el uso de biología en sistemas para predecir redes de interacción entre genes, factores de transcripción y sus reguladores. Un ejemplo de esto es el estudio de Acon y colaboradores (2021), donde se evaluó el modelo mínimo de compensación del oncogén Myc (Figura 8) mediante la transfección transitoria de un plásmido diseñado para sobre expresar un gen Myc exógeno en células de glioblastoma humano (NCH82). Este plásmido incluía la secuencia de GFP fusionada con Myc, y con la región 3' UTR eliminada, ya que se postula que esta región es clave para la interacción con los miARNs reguladores. Al eliminarla, se buscaba evitar la acción reguladora de los miARNs, incrementando así la presión sobre los mecanismos de compensación. La eficiencia de la transfección y la viabilidad celular revelaron que las células transfectadas con exo-Myc mostraron una disminución progresiva de la fluorescencia de GFP y un aumento significativo en la mortalidad celular, alcanzando más del 50% a las 72 horas. (21) Además, los investigadores evaluaron el efecto inhibitorio de los anti-miARNs del modelo de compensación del Myc en las líneas celulares HCT15, HT29 y SW620 nativas (Figura 10). Los resultados sugieren una posible causalidad entre la inhibición de los anti-miARNs, la subsecuente sobreexpresión de MYC y la muerte celular mediada por proteotoxicidad. Estos hallazgos resaltan el potencial citotóxico de la sobreexpresión de Myc en un sistema de transfección transitoria en células aneuploides, lo que podría ser fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas específicamente a este tipo de células. (21) 27 En el presente proyecto de investigación se propone implementar un sistema similar a tug- of-war para estudiar la compensación de dosis génica a nivel transcripcional. Para esto se busca estandarizar la técnica tug-of-war en células de cáncer aneuploides, con un método de transfección estable y optimizando un protocolo de PCR de tiempo real capaz de distinguir los transcritos endógenos y exógenos de Myc. Este enfoque permitirá demostrar el fenómeno de la compensación de dosis mediante la reducción del transcrito endógeno de Myc cuando se sobre expresa el transcrito exógeno (Figura 11). Con esta técnica, nuestro objetivo es primero determinar experimentalmente si el oncogén Myc está efectivamente bajo compensación de dosis génica. Segundo, se investigará si la inhibición de los miARNs miR- 17, miR-19a y miR-20a es capaz de bloquear dicha compensación en las células nativas y las transfectadas de manera estable, lo que validaría experimentalmente su papel en los circuitos de regulación de Myc identificados in silico, donde se espera observar expresión relativa no diferencial entre gen endógeno y exógeno. Figura 11. Myc Tug-of-war. Se propone un método para determinar de manera experimental que la compensación de dosis génica de Myc esta mediada por los tres mi-ARNs propuestos en el modelo mínimo de compensación. (21) 1.8. Hipótesis Un modelo mínimo de compensación propone que los miR17, miR19a y miR20a conforman un circuito de compensación de dosis génica de Myc y su inhibición se puede evidenciar por el cambio en la transcripción de transcritos endógenos y exógenos del gen Myc en un sistema estable. 28 2. OJETIVOS Objetivo general Determinar si el bloqueo de los miR17, miR19a y miR20a altera la compensación de dosis génica en el gen Myc ocasionando el desbalance en la expresión génica en células aneuploides de cáncer de colorrectal. Objetivos específicos 1. Verificar la presencia de la red de compensación del gen Myc descrita en el modelo mínimo, optimizando el protocolo tug-of-war en las líneas celulares HT29 y SW620. 2. Evaluar el comportamiento de Myc endógeno en las líneas celulares HT29 y SW620 transfectadas con un gen exógeno de Myc sin la parte 3’UTR, corroborando que la compensación está mediada por los mi-ARNs propuestos en el modelo mínimo. 3. Determinar el efecto de inhibitorio de los anti-miARNs sobre la compensación de dosis génica en líneas celulares transfectadas con exo-Myc para comprobar los circuitos de compensación propuestos in silico. 29 3. METODOLOGÍA Los experimentos se llevaron a cabo con las líneas celulares del panel NCI-60, SW620 y HT29 aneuploides para Myc con 7 y 4 copias del gen, respectivamente. HT29 es una línea derivada de un adenocarcinoma primario del colon rectosigmoides, con aneuploidías y alteraciones genómicas bien descritas (31). SW620 es una línea celular de adenocarcinoma colorrectal colectada a partir de una metástasis en un ganglio linfático del mismo paciente de donde se originó SW480, que proviene del tumor primario. De manera diferencial con SW480, SW620 muestra características genotípicas que le permiten sobrevivir en ausencia de adhesión celular (evasión a anoikis) y una maquinaria de traducción más eficiente. (32) Para el mantenimiento y cultivo se utilizó medio completo con el medio base RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) suplementado al 10% con suero fetal bovino (SFB) de Gibco®, el antibiótico-antimicótico constituido por penicilina, estreptomicina, y anfotericina B (Gibco®) y GlutaMAXTM (Gibco®) que es una alternativa de L-glutamina para mejorar el crecimiento celular. Ambas líneas celulares fueron transfectadas con el plásmido “pSBbi-mCardinal-P2A-T2A- cMyc-Puro” que contiene el gen Myc con la sección 3’UTR eliminada. La transfección fue realizada por el investigador Jorge Arias-Arias, tal y como se explica en Acón et al. (2021). (21) En adelante, se va a hacer referencia de las células transfectadas con el plásmido recién mencionado como “líneas estables” (E) ya que tienen incorporado de manera estable el gen Myc exógeno. Ambas condiciones (wild type y estables) fueron mantenidas en alícuotas de 1.5 mL en nitrógeno líquido a -200°C hasta su uso, usando medio completo RPMI 1640 con DMSO al 5% para su congelación. El protocolo de descongelación se realizó de manera rápida para evitar la formación de cristales que puedan dañar la integridad de las células congeladas, proceso que sucede entre los -50°C a 0°C. Una vez que se sacó el vial del tanque de nitrógeno líquido se descomprimió 30 la tapa y se colocó en el baño maría a 37°C hasta su descongelación. En cámara de flujo laminar se transfirió la muestra a un tubo cónico de 15 mL que contenía 1 mL de medio completo y se centrifugó por 5 minutos a 300 gravedades. Con cuidado de no perder el botón de células se decantó el sobrenadante en desechos y se resuspendieron -las células- en 1 mL de medio completo. Las células se cultivaron en botellas de T25 o T75 según las necesidades del experimento y se incubaron a 37°C a 5% CO2. Las líneas celulares estables se cultivaron con el antibiótico Puromicina de Sigma-Aldrich como método de selección, durante todo el periodo de cultivo para asegurarse la homogeneidad de la población celular. Con una concentración de 6 μg/mL para HT29 y 12 μg/mL para SW620 (Puromicina a 10,000 μg/mL). 3.1. Estandarización de la técnica de tug-of-war en las líneas celulares HT29 y SW620 wild-type y estables 3.1.1. Diseño del plásmido “exo-Myc”. La secuencia nucleotídica del gen Myc fue obtenida de la base de datos NCBI en formato de cADN (mARN) con el código NM_002467.6, y las regiones 3’UTR se identificaron utilizando la plataforma GeneCopoeia, accesada a través de GeneCards.org/cgi-bin con el código HmiT088534 3'UTR. Posteriormente, se llevó a cabo un “double alignment Blast” para comparar las secuencias obtenidas y determinar la porción del gen excluyendo la región 3’UTR. El plásmido fue sintetizado por la empresa Genscript empleando vectores basados en transposones, y se designó como "pSBbi-mCardinal-P2A-T2A-cMyc-Puro" (Figura 12). (21) Para confirmar la correcta inserción del plásmido en las células, se realizaron observaciones mediante microscopía automatizada de fluorescencia con el equipo Cytation 3 (BIOTEK), utilizando láser Cy5 y Texas Red. 31 Figura 12. Plásmido exo-Myc. Diagrama del plásmido pSBbi-mCardinal-P2A-T2A-cMycPuro: exo-Myc por Genscript. 3.1.2. Cebadores y sondas Se utilizó el método de expresión relativa, que requiere de un gen constitutivo para normalizar los valores de expresión. Entre los genes más comúnmente utilizados para las líneas celulares utilizadas en este experimento, según la literatura revisada, se encuentran ACTB (actina) y GAPDH, siendo este último el seleccionado para llevar a cabo los experimentos. Todos los juegos de primers fueron obtenidos utilizando la herramienta "Primer Designing Tool" del NCBI, mientras que las sondas se diseñaron con "Primer3Plus - Bioinformatics". Para validar los primers y las sondas, se alinearon con la secuencia de 32 cADN de Myc y con la secuencia optimizada de Myc exógeno utilizando el software MEGA, asegurando un alineamiento completo y específico con los genes blanco correspondientes. Además, se confirmó la ausencia de alineaciones parciales con otros genes y se verificó la longitud del segmento amplificado. 3.1.3. Extracción de ARN Las células (wt y E) se mantuvieron en cultivo durante al menos dos semanas posterior a descongelamiento. Antes de proceder con el protocolo de extracción y amplificación mediante PCR, se sembraron en frascos de 25 cm2, permitiendo su crecimiento durante un mínimo de 3 días o hasta alcanzar una confluencia del 80-90%, preferiblemente de jueves a lunes. Según los requerimientos experimentales (estandarización o determinación de la expresión relativa) las líneas celulares (wt y E) se sembraron en botellas 25 cm2, placas de 12 o 24 pocillos y se dejaron en crecimiento y fijación por 48 horas. Posteriormente, se trataron las células con TRIzol™ Plus RNA Purification Kit de Invitrogen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para cada muestra, se midió la concentración de ARN y su pureza mediante el espectrofotómetro NanoDrop™ de Thermo Scientific. Posteriormente, las muestras de ARN se almacenaron a -80°C en tubos Eppendorf hasta su uso. La integridad de los ARNs extraídos fue verificada mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Para este procedimiento, se preparó un gel de agarosa al 1.5% disolviendo 1.5 g de agarosa en 100 mL de buffer TAE 1X o TBE 1X. La mezcla fue calentada en un horno de microondas con pulsos de 30 segundos hasta obtener una solución homogénea. Una vez que la solución alcanzó una temperatura de 37-40°C, se añadió hipoclorito de sodio en la cantidad necesaria para alcanzar una concentración final del 1.5%, utilizado como agente desnaturalizante. El gel se dejó solidificar antes de cargar las muestras. La corrida electroforética se realizó a 100 V durante 60 minutos y los resultados se visualizaron en un transiluminador. 33 3.1.4. RT qPCR El ensayo de PCR se llevó a cabo utilizando la técnica TaqMan. Después de la extracción, las muestras de ARN se descongelaron y se procedió con el montaje de la PCR usando el kit Thermo Scientific Verso 1-Step qRT-PCR Low ROX Kit de ThermoFisher Scientific en el equipo StepOne System de Applied Biosystems. El sistema se configuró con la opción de "expresión génica", empleando el método 2-∆∆Ct para el análisis de la expresión relativa. Cada set de primers y sondas (para los genes exo-Myc, endo-Myc y gen de referencia), se corrieron en pocillos por separado. Esta disposición se adoptó debido a que ensayos previos mostraron interferencias competitivas por reactivos cuando se colocaban dos o más juegos de primers en el mismo pozo. El protocolo de termociclador fue el recomendado por el fabricante del kit, y tras la finalización de los ciclos, se analizaron los valores de Ct. 3.1.5. Análisis de información Los datos obtenidos mediante PCR se registraron y analizaron en Excel, donde se realizó el cálculo de la expresión relativa, así como el promedio y la desviación estándar de los valores. Además, se llevaron a cabo análisis estadísticos, específicamente pruebas de t-Student, y se generaron los gráficos correspondientes. Las imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia fueron seleccionadas para su análisis y descripción en los resultados, destacando las observaciones más relevantes. 3.2. Implementación de la técnica génica tug-of-war para determinar experimentalmente la compensación de dosis génica de Myc. Con la adaptación de la técnica genética tug-of-war, se buscó determinar experimentalmente la compensación de dosis génica de Myc. Para ello, se cultivaron las líneas celulares HT29, HT29 E, SW620 y SW620 E en frascos de 25 cm² bajo las condiciones previamente descritas. El proceso de evaluación de la expresión génica comenzó con la siembra de células en placas de 12 pocillos, preferiblemente utilizando triplicados biológicos y técnicos para asegurar la 34 reproducibilidad de los resultados. A las 48 horas post-siembra, se procedió a la extracción de ARN, seguida de la cuantificación de la expresión génica mediante RT-qPCR, conforme a los protocolos previamente establecidos. Finalmente, se realizó el análisis correspondiente de los datos obtenidos para evaluar la compensación de dosis de Myc en cada línea celular. 3.3. Evaluación del efecto inhibitorio de los anti mi-ARNs sobre la compensación de dosis génica. 3.3.1. Transfección con anti - miARNs Para evaluar la reversión del efecto compensatorio de los miARNs sobre Myc, se utilizaron los siguientes inhibidores de miARNs: • mirVana® miRNA inhibitor, hsa-miR-17-5p (assay ID: MH12412, ThermoFisher Scientific, 4464084) • mirVana® miRNA inhibitor, hsa-miR-19a-3p (assay ID: MH10649, ThermoFisher Scientific, 4464084), y • mirVana® miRNA inhibitor, hsa-miR-20a-5p (assay ID: MH10057, ThermoFisher Scientific, 4464084) Se incluyó el control negativo, mirVana® miRNA inhibitor Negative Control #1 (ThermoFisher Scientific, 4464076). Los inhibidores son específicos para los miARNs 17, 19a y 20a, que se han propuesto como mediadores en la red miARNs-FT de la compensación de Myc. Las líneas celulares HT29, HT29E, SW620 y SW620E se mantuvieron en cultivo en frascos de 25 cm² durante al menos dos semanas para asegurar su estabilización. Posteriormente, fueron sembradas en placas de 12 pocillos y a las 48 horas post siembre fueron transfectadas con un pool de los inhibidores de miARN utilizando el protocolo “Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Protocol”. Las concentraciones del pool de inhibidores de miARNs variaron desde 0 µM hasta 30 µM para las líneas wild type y estables, agregando una concentración adicional 60µM para las líneas estables seleccionado a partir de una análisis 35 con ImageJ de conteo de células, cálculo de viabilidad y tasa de proliferación en un tiempo 0 (T = 0) inmediato a la transfección, y 24 horas posterior a la transfección (T = 24). El protocolo de transfección incluyó ocho horas de incubación con la Lipofectamina junto con los anti-miARNs, seguido de un lavado con PBS y cambio de medio al 10% de SFB. Las células se dejaron en incubación por 18 horas y al día siguiente de la transfección con el pool de inhibidores, se procedió a la extracción de ARN, seguida de la cuantificación de la expresión génica mediante RT-qPCR, conforme a los protocolos previamente establecidos. Finalmente, se realizó el análisis correspondiente de los datos obtenidos para evaluar la compensación de dosis de Myc en cada línea celular. 36 4. RESULTADOS 4.1. Estandarización de la técnica tug-of-war en las líneas celulares HT29 y SW60 wild- type y estables. 4.1.1. Corroboración de la transfección de las líneas celulares con exo-Myc La propuesta inicial incluía las líneas celulares: HCT15, HT29 y SW620 que fueron transfectadas de manera estable con el plásmido pSBbi-mCardinal-P2A-T2A-cMycPuro: exo-Myc, por el investigador Jorge Arias-Arias, tal y como se específica en el protocolo de Acón et al., (2021). (21) Sin embargo, la línea HCT15 que es diploide para el gen Myc no sobrevivió a la transfección con exo-Myc. Lo que podría arrojar los primeros resultados de que aquellas células que aún no han presentado proceso de aneuploidía para ciertos genes no cuentan con los mecanismos de adaptación y compensación desarrollados para lidiar con cargas potencialmente tóxicas de ciertas proteínas. Por lo que a partir de ahora solo se van a presentar los resultados con las dos líneas celulares que sobrevivieron la transfección estable del plásmido que contiene el gen exo-Myc. Al exponer las líneas celulares HT29 y SW620 wt y estables al laser Cy5 en el Cytation 3 de Biotek, se observó (Figura 13) que la selección de células estables fue exitosa. Las líneas celulares estables se mantuvieron en cultivo con el antibiótico Puromicina para garantizar una población homogénea de células transfectadas. 37 Figura 13. Incorporación del plásmido exo-Myc. Líneas celulares HT29 y SW620 (wt y E) en placas de 96 pocillos expuestas al filtro Cy5 para corroborar la presencia del gen reportero mCardinal presente en el plásmido pSBbi-mCardinal-P2A-T2A-cMycPuro que incorpora exo-Myc. En la Figura 14., se puede observar que casi la totalidad de la población celular en ambas líneas celulares estables ha sido transfectada con el plásmido que contiene el gen “exo-Myc”. H T2 9 SW 6 2 0 E SW 6 2 0 H T2 9 E 38 Figura 14. Población celular con exo-Myc incorporado. Líneas celulares HT29 E y SW620 E observadas con el filtro Cy5 y “brightfield” (BF) en placas de 96 pocillos para corroborar cuanto de la totalidad de la población celular incorporó el plásmido pSBbi-mCardinal-P2A-T2A-cMycPuro con exo-Myc. 4.1.2. Cebadores y sondas. El Cuadro 1., muestra los sets de primers obtenidos utilizando el Primer Designing Tool de NCBI. Para el gen Myc endógeno, se empleó el código NM_002467.6, mientras que para Myc exógeno se utilizó la secuencia correspondiente extraída secuencia optimizada de nucleótidos (Anexo 10.1.). Para el gen de referencia Gapdh, se utilizó el código NM_002046.7 del cADN. Las sondas también se muestran en el cuadro y fueron obtenidas de “Primer3Plus – Bioinformatics”. Cuadro 1. Secuencias de primers y sondas diseñados para la amplificación de Myc endógeno, Myc exógeno y Gapdh. Gen Primer forward Primer reverse Sonda Gapdh 5’CTCAGACACCATGGGGAAGG3’ 5’TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC3’ VIC-GAGTCAACGGATTTGGTCGT Endo Myc 5’AAACTTTGCCCATAGCAGCG3’ 5’CGGGAGGCTGCTGGTTTT3’ VIC-CTGAAAGGCTCTCCTTGCAG Exo Myc 5’GGCCGTGACACCTTTCAGCC3’ 5’TCGGACACCAGCTTTGCTGC3’ 6FAM-ACAGAGCTGCTGGGCGGCGA Durante el proceso de optimización, se evaluaron distintos volúmenes de la dilución de “primers + probe” (0.55, 0.60 y 0.65 μL) para cada gen. Los valores de Ct más bajos se obtuvieron con un volumen de 0.65 μL, lo que sugiere que esta cantidad es la más eficiente para la amplificación. Las concentraciones finales de los primers y sondas pueden consultarse en el Cuadro 2, mientras que las concentraciones iniciales corresponden a las especificadas por el fabricante. Cuadro 2. Concentraciones de “primers + probe” en función del volumen utilizado para la amplificación Concentración inicial Volumen inicial Volumen final Concentración final Primers 18,000 nM 0.65 μL 25 μL 468 nM Sonda 5,000 nM 0.65 μL 25 μL 130 nM 39 4.1.3. Extracción de ARN La electroforesis desnaturalizante mostró que los ARN extraídos a partir de las líneas celulares wt y estables presentaban una integridad adecuada, evidenciada por la visualización de dos bandas bien definidas correspondientes al RNA ribosomal 60S y 40S. En caso de haber observado un barrido continuo en lugar de bandas discretas, esto sugeriría la degradación del ARN. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 15. Figura 15. Integridad del ARN extraído. Se observan dos bandas bien definidas correspondientes al ARN ribosomal 60S y 40S en las muestras cargadas en un gel de agarosa al 1.5% bajo condiciones desnaturalizantes. Para la corroboración de la pureza y cosecha las muestras extraídas de ARN se analizaron con el equipo Quibit y NanoDrop, obteniendo los resultados del Cuadro 3. 40 Cuadro 3. Resultados de cosecha y pureza de ARN medidos mediante Qubit y Nanodrop. Qubit (ng/μL) Nanodrop ABS (ng/μL) 260/280 260/230 R ep li ca 1 HT29 696 665 1,88 2,40 HT29 E 624 683 1,92 2,36 SW620 888 895 1,89 2,34 SW620 E 620 701 1,89 2,38 R ep li ca 2 HT29 690 829 1,88 2,34 HT29 E 820 845 1,87 2,32 SW620 730 816 1,86 2,40 SW620 E 330 337 1,88 2,38 R ep li ca 3 HT29 926 911 1,88 2,38 HT29 E 872 950 1,88 2,36 SW620 928 900 1,88 2,32 SW620 E 682 738 1,86 2,41 R ep li ca 1 HT29 606 610 1,88 2,23 HT29 E 554 587 1,88 2,33 SW620 440 466 1,88 2,41 SW620 E 738 743 1,89 2,24 R ep li ca 2 HT29 962 992 1,89 2,26 HT29 E 790 748 1,89 2,37 SW620 1000 1058 1,90 2,38 SW620 E 730 749 1,91 2,30 R ep li ca 3 HT29 880 856 1,86 2,40 HT29 E 806 878 1,90 2,33 SW620 872 877 1,90 2,33 SW620 E 518 551 1,87 2,36 Tal y como se observa en el Cuadro 3., los resultados de cosecha obtenidos a partir de las mediciones realizadas con el equipo Qubit y el espectrofotómetro Nanodrop se consideran altos. Además, los valores obtenidos para los radios 260/280 y 260/230 indicaron una alta pureza en las muestras de ARN extraído. El radio 260/280 fue superior a 1.8 en todas las muestras, lo que sugiere la ausencia significativa de contaminantes como proteínas. El radio 260/230, por su parte, fue mayor a 2.2 en todas las muestras, lo que confirma la mínima 41 presencia de contaminantes como fenol, comúnmente difícil de eliminar por completo durante el proceso de aislamiento del ARN. Estos resultados demuestran que las muestras de ARN eran de alta calidad y aptas para su uso en experimentos moleculares posteriores. Para todos los experimentos futuros, se midieron tanto la cosecha como la pureza de las muestras de ARN, y solo se procedió con el experimento de qPCR si los valores obtenidos cumplían con los parámetros de aceptación previamente establecidos (radio 260/280 ≥ 1.8, radio 260/230 ≥ 2.2). Por razones de practicidad, los valores específicos de estas mediciones no se incluyen en los resultados, ya que únicamente se utilizaron muestras que cumplían con dichos estándares. 4.1.4. RT qPCR El último paso de la adaptación de la técnica génica tug-of-war a las líneas celulares de cáncer de colon colorrectal en humanos corresponde a la corroboración de la expresión del gen Myc tal y como se observa en la Figura 16 y Figura 17. Figura 16. Expresión relativa de Myc en líneas wt. Se observa que endo Myc se expresa aproximadamente 1.5 veces más que el gen de referencia para ambas líneas celulares (n=6). Gen de referencia: Gapdh La amplificación del gen Myc mostró una expresión constante en ambas líneas celulares, HT29 y SW620, bajo condiciones nativas. Sin embargo, se observó una alta variabilidad en 0,0 0,3 0,5 0,8 1,0 1,3 1,5 1,8 2,0 2,3 2,5 2,8 3,0 Gapdh HT29 wt E x p re si ó n r el at iv a (2 -( Δ Δ C t) ) Gen amplificado HT29 wt 0,0 0,3 0,5 0,8 1,0 1,3 1,5 1,8 2,0 2,3 2,5 2,8 3,0 Gapdh SW620 wt E x p re si ó n r el at iv a (2 -( Δ Δ C t) ) Gen amplificado SW620 wt Endo-Myc Endo-Myc 42 los resultados, lo que sugiere una estrecha coordinación con los requerimientos celulares durante el ciclo celular y la regulación de sus niveles de expresión. Como era de esperar, los resultados de amplificación para el gen exógeno en las células wt mostraron que no fue posible detectar señal (undetermined Ct), corroborando que los primers diseñados para el Myc endógeno no presentan especificidad cruzada con el gen exógeno, como se observa en el Cuadro 4. Figura 17. Expresión relativa de Myc en líneas estables. Se observa la expresión de endo Myc y de exo Myc, con escala exponencial (n=6). Gen de referencia: Gapdh Durante la amplificación de los genes blanco en las líneas celulares estables, se observó una sobreexpresión del gen exógeno. Para representar los resultados de manera clara y comprensible, fue necesario emplear una escala logarítmica en el gráfico, debido a que los niveles de expresión relativa del gen exógeno fueron considerablemente altos. Esto es común en experimentos con genes foráneos, ya que suelen estar bajo el control de promotores fuertes. En este caso, además, la hipótesis sugiere que, al carecer de la región 3'UTR, el gen exógeno no está sujeto a los mecanismos de compensación propuestos por las tecnologías in silico discutidas previamente. Los resultados en bruto se presentan en el Cuadro 4 y el Cuadro 5 es el cuadro resumen. 0 1 10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000 E x p re si ó n r el at iv a (2 -( Δ Δ C t) ) Gen amplificado HT29 E 0 1 10 100 1 000 10 000 100 000 1 000 000 E x p re si ó n r el at iv a (2 -( Δ Δ C t) ) Gen amplificado SW620 E 43 Cuadro 4. Resultados de amplificación y expresión del gen exógeno y endógeno en líneas celulares estables HT29 y SW620 wt y estables. Línea celular GAPDH Myc Endo ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt Myc Exo ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt HT29 wt 18,925 25,514 6,589 1,921 0,264 - - - - 18,947 23,887 4,939 0,271 0,829 - - - - 19,512 23,011 3,499 -1,169 2,249 - - - - 19,274 25,007 5,733 1,064 0,478 - - - - 19,923 23,565 3,642 -1,026 2,037 - - - - 20,191 23,798 3,608 -1,061 2,086 - - - - HT29 E 19,099 27,233 8,134 3,329 0,099 22,497 3,398 -16,439 109760,540 19,921 26,022 6,102 1,297 0,407 25,521 5,600 -14,237 19309,190 19,829 23,483 3,654 -1,151 2,220 26,041 6,211 -13,626 12642,550 19,022 26,919 7,897 3,092 0,117 22,133 3,111 -16,726 108399,000 19,204 26,159 6,955 2,151 0,225 - -19,837 19,968 24,829 4,861 0,056 0,962 23,646 3,678 -16,159 73171,790 SW620 wt 18,925 25,514 6,589 1,921 0,264 - - - - 18,947 23,887 4,939 0,271 0,829 - - - - 19,512 23,011 3,499 -1,169 2,249 - - - - 19,274 25,007 5,733 1,064 0,478 - - - - 19,923 23,565 3,642 -1,026 2,037 - - - - 20,191 23,798 3,608 -1,061 2,086 - - - - SW620 E 18,892 27,197 8,305 3,636 0,080 22,667 3,775 -16,763 111222,859 19,390 26,637 7,247 2,579 0,167 20,871 1,481 -19,057 545461,398 19,924 25,269 5,345 0,677 0,626 21,714 1,790 -18,748 440378,418 18,902 27,333 8,431 3,763 0,074 22,380 3,478 -17,060 136614,525 20,307 28,903 8,596 3,927 0,066 22,724 2,417 -18,121 285148,444 20,902 27,353 6,451 1,782 0,291 23,539 2,637 -17,901 244767,688 Cuadro 5. Resumen de los promedio y desviaciones estándar de expresión relativa para el gen exógeno y endógeno en líneas celulares estables HT29 y SW620 wt y estables. Línea Celular Condición Promedio Gapdh Myc Endo Myc Exo HT29 Nativa 1.000 ± 0.000 1.441 ± 1.156 - Estable 1.000 ± 0.000 0.672 ± 0.823 64656.614 ± 46856.484 SW620 Nativa 1.000 ± 0.000 1.324 ± 0.898 - Estable 1.000 ± 0.000 0.217 ± 0.218 293932.222 ± 170492.985 44 Estos resultados permiten concluir que la adaptación de la técnica génica tug-of-war puede ser extendida a otras especies, lo que ofrece una valiosa herramienta para estudiar los mecanismos de compensación de dosis génica, los cuales han sido propuestos como potenciales blancos terapéuticos del cáncer. En el Cuadro 5, se observa que la expresión relativa promedio del Myc endógeno en las células wild type es discretamente mayor en comparación con el gen de referencia, aunque los datos muestran una considerable variabilidad. En las líneas celulares estables, se aprecia un patrón de posible "supresión" del Myc endógeno en presencia del gen exógeno y una altísima expresión relativa de exo-Myc. Asimismo, la elevada carga transcripcional del Myc exógeno en las células refuerza la hipótesis de que las células cancerosas diploides para un gen específico, como, por ejemplo, las células HCT15 diploides para Myc, requieren de adaptaciones preestablecidas para afrontar el estrés derivado de la poliploidía. 4.2. Implementación de la técnica génica tug-of-war para determinar experimentalmente la compensación de dosis génica de Myc. Seguidamente se evaluó si la propuesta del modelo mínimo de compensación para el gen Myc, desarrollado a través de biología de sistemas, es válida. Este modelo sugiere que Myc está regulado por la acción compensatoria de tres miARNs específicos. Si esto es correcto, se esperaría que exo-Myc, al carecer de la región 3'UTR, no esté sujeto a dicha compensación. Para poner esto a prueba, se cuantificaron los transcritos génicos de ARN mediante RT-qPCR en nuestras líneas celulares estables. A partir de los datos presentados en el Cuadro 4, se generó la Figura 18, donde se comparan las expresiones relativas del gen