REVISTA MÉDICA DE LA UNIVERSIDAD DE COSTA RICA.    VOLUMEN 4, NÚMERO 1, ARTÍCULO 8.   MARZO de 2010 
 
Revista electrónica publicada por el Departamento  de Farmacología de la Escuela de Medicina de la 
Universidad de Costa Rica, 2060 San José, Costa Rica.  ® All rights reserved. 
1 
 
Artículo de investigación exploratoria 
 
 
Diagnóstico molecular de Mycobacterium 
tuberculosis en cortes histológicos embebidos 
en parafina: investigación exploratoria. 
 
  
Suárez Sánchez María José1,2  Quiros Alpízar José Luis2, Jiménez Montero 
Ernesto 3, Salazar Sánchez Lizbeth1 
 
1
 Centro de Investigaciones en Hematologías Anormales y Trastornos Afines (CIHATA), Universidad de 
Costa Rica. 
2Laboratorio de Histotecnología, Facultad de Medicina, Universidad de Costa Rica. 
3
 Servicio de Patología, Hospital San Juan de Dios. 
 
 
Resumen:  Se evalúo la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
para el diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis y micobacterias atípicas en tejidos 
parafinados. Para ello se analizaron 7 casos del Hospital San Juan de Dios (HSJD) con 
diagnóstico sugestivo de tuberculosis y se compararon los resultados obtenidos por 
PCR con el diagnóstico histopatológico y la historia clínica de los pacientes. De los  
siete casos analizados, tres resultaron positivos para M. tuberculosis, tres para 
micobacterias atípicas y un caso resultó negativo. Para evaluar la sensibilidad y 
especificidad de la técnica se necesita un estudio con un mayor número de muestras 
pero se pudo demostrar que es posible realizar el diagnóstico molecular de tuberculosis 
en muestras fijadas en nuestro país, sin embargo se debe de considerar ésta como una 
herramienta diagnóstica que se debe complementar con la historia clínica de cada 
paciente. 
 
Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis, PCR, biopsias parafinadas, diagnóstico 
molecular. 
 
Recibido: Febrero 2010.  Aceptado: Marzo 2010. Publicado: Marzo 2010. 
 
http://www.revistamedica.ucr.ac.
cr 
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Abstract: We evaluated the Polimerase Chain Reaction (PCR) tecnique for the 
diagnose of Mycobacterium tuberculosis and non-typical mycobacterias in paraffin-
embedded histologic specimens. We analized 7 cases from the San Juan de Dios 
Hospital (HSJD) with suggestive diagnose of tuberculosis and we compared the 
obtained result from PCR with the histopathological diagnosis and the clinical records. 
Three of the seven patients evaluated resulted positive for M. tuberculosis, other three 
resulted positive for non-typical mycobacterias, and the remaining patient resulted 
negative. In order to evaluate sensibility and specificity of the technique a bigger sample 
research is required but it was possible to prove that molecular diagnosis of tuberculosis 
can be made in fixed samples in our country, even though this technique must be 
considered as a diagnostical tool that is a complement of the clinical record of the 
patient. 
 
Keywords: Mycobacterium tuberculosis, PCR, paraffin-embedded biopsy, 
molecular diagnosis. 
 
 
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1 
 
 
Introducción 
 
La tuberculosis continúa siendo 
una de las principales causas de muerte 
por agentes infecciosos en el mundo, 
con casi nueve millones de nuevos 
casos al año (1). Actualmente la 
Organización Mundial de la Salud ha 
declarado a la tuberculosis como un 
problema de emergencia mundial 
debido principalmente al sinergismo 
entre Mycobacterium tuberculosis, 
agente causal de la tuberculosis, y el 
virus de la inmunodeficiencia humana 
(2,3); todo esto unido al hecho 
alarmante que representa la aparición 
de cepas multiresistentes al 
tratamiento. En Costa Rica actualmente 
12 de cada 100.000 costarricenses se 
enferman de tuberculosis al año y 2,3 
de cada 100.000 costarricenses fallecen 
por tuberculosis (4). 
Esta enfermedad debe de 
tratarse de forma adecuada para 
disminuir la transmisión a contactos y 
mejorar la calidad de vida del paciente, 
pues es una enfermedad que sin 
tratamiento puede ser fatal. Sin 
embargo, el diagnóstico de tuberculosis 
es complejo, depende de la clínica que 
el paciente presenta, acompañado de 
exámenes radiológicos, 
intradermorreacción y exámenes 
bacteriológicos (5).  
Mycobacterium tuberculosis es 
un bacilo aerobio estricto, que al ser 
teñido es alcohol-ácido resistente, no 
posee movilidad y su crecimiento es 
lento (6). El diagnóstico etiológico de la 
infección depende por lo tanto, de la 
demostración microscópica de los 
bacilos alcohol-ácido resistentes 
(BAAR) y su aislamiento e 
identificación en medios de cultivo (6). 
La sensibilidad de las tinciones BAAR 
oscila entre un 40%  y un 85% y para 
ello se requiere generalmente, al 
menos tres muestras del mismo 
paciente.  Aunque el cultivo es el 
método de confirmación diagnóstica, 
con una sensibilidad de 80% a 96%; 
tiene el inconveniente de presentar 
tiempos de incubación de hasta ocho 
semanas (7). 
Con mucha frecuencia se 
sospecha el diagnóstico de tuberculosis 
en biopsias cuando se observa un 
patrón de inflamación crónica 
granulomatosa con necrosis, no 
obstante, esta condición puede deberse 
a otras causas diferentes a la 
tuberculosis, tales como reacciones  
ante agentes extraños, infecciones 
fúngicas, sarcoidosis, brucelosis, etc. Y 
cuando se realizan tinciones especiales 
para BAAR en el tejido, muchas veces 
no se logra observar el agente causal. 
Así mismo, es importante 
considerar la presencia de 
micobacterias  no tuberculosas o 
atípicas ya que la frecuencia con la que 
se aíslan recientemente ha aumentado 
tanto en pacientes inmunosupresos 
como inmunocompetentes y tanto su 
diagnóstico como tratamiento son 
difíciles, principalmente en casos 
cuando se ven involucradas cepas 
fastidiosas o resistentes al tratamiento 
antimicrobiano (8). 
Actualmente las técnicas 
moleculares se han convertido en una 
herramienta para la identificación de 
micobacterias incluso a nivel de 
especie, para muestras donde los 
métodos tradicionales no resultan 
suficientes.   Dentro de estas técnicas 
moleculares se encuentra la Reacción 
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en Cadena de la Polimerasa (PCR), ya 
que en condiciones óptimas puede 
detectar de 1-10 microorganismos en 
un tiempo mucho menor al cultivo (3-5 
días). Así mismo gracias a los métodos 
de extracción disponibles es posible el 
aislamiento a partir de cualquier 
muestra biológica (5). 
Debido a que el uso de la técnica 
de PCR anidado específico para M. 
tuberculosis permite establecer un 
diagnóstico de tuberculosis rápido y 
sensible; y que en Costa Rica no se ha 
implementado este método para 
analizar las muestras biológicas fijadas 
en parafina, el objetivo de este estudio 
fue analizar por medio de esta técnica 
siete muestras con diagnóstico 
sugestivo de tuberculosis y comparar 
los resultados obtenidos con la clínica y 
evolución de los pacientes respectivos. 
 
Métodos y materiales 
 
Muestras: se realizó una base de 
datos de biopsias con inflamación 
crónica granulomatosa que se 
presentaron en el Servicio de Patología 
del Hospital San Juan de Dios entre los 
años 2003 y 2009. Se seleccionaron 
siete casos de diferentes años y sitios 
anatómicos sospechosos de 
tuberculosis, se observó las láminas 
respectivas para la selección de los 
bloques. 
Extracción de ADN: se realizó de 3 a 
10 cortes de 10µm de cada bloque  
parafinado y se trató con xilol y alcohol 
para su desparafinización, el tejido 
obtenido se digirió con buffer lisis y 
proteinasa K. 
Amplificación de ADN1: Para la 
amplificación de secuencias 
correspondientes a M. tuberculosis se 
realizó un PCR anidado, para el primer 
PCR se utilizó 5 µl del ADN extraído  y 
un volumen final de reacción de 45 µl 
con 5µM dNTP, 0.25 U Taq polimerasa 
(Gold Applied biosystems), 45 µM del 
imprimador FW y 68 µM del RV, la 
secuencia de estos es: FW 
CGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGG
AC y RV  CATCGTGGAAGCGACC 
CGCCAGCCCAGGAT. Las condiciones 
del PCR fueron 20 ciclos con una 
desnaturalización inicial de 94°C por 
90 segundos; una hibridación a 63°C 
por 90 segundos y una extensión a 
75°C por 90 segundos. Se utilizó 1 µl 
del producto del primer PCR para el 
segundo PCR, para éste el volumen 
final de reacción fue de 48 µl con 5µM 
dNTP, 0.25 U Taq polimerasa (Gold 
Applied biosystems), 140 µM del 
imprimador FW y 108 µM del RV, la 
secuencia de estos es:  FW 
CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG y RV 
CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG. Los 
productos se visualizaron en un gel de 
agarosa al 2% marcados con bromuro 
de etidio. A las muestras en que se 
obtuvo un resultado negativo se les 
realizó un PCR específico para el gen 
constitutivo p53 con el fin de evaluar la 
calidad del ADN y otro para 
micobacterias atípicas con el kit 
Atypical Mycobacteria kit de 
Experteam que amplifica secuencias 
correspondientes a M.gordonae, M. 
avium, M. kansasii, M fortuitum y M. 
malmoense. Se realizó nuevamente una 
electroforesis con un gel de agarosa al 
2% con los productos obtenidos. 
                                                 
1
 El protocolo corresponde al utilizado en el 
Hospital de Santa Clara, Trento, Italia. 
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Presentación de resultados 
 
De las  siete muestras analizadas tres 
resultaron positivas para M. 
tuberculosis (Fig 1), de las cinco 
muestras restantes se obtuvo un 
producto de amplificación en una 
muestra después de realizar el PCR 
para p53 y en las tres restantes al 
realizar el PCR específico para 
micobacterias atípicas (Gráfico 1) 
(Cuadro 1). 
 
 
 
 
Figura 1. Electroforesis del PCR para 
Mycobacterium tuberculosis en los siete 
casos analizados. Carril 1 blanco de 
amplificación, carriles 2, 7 y 8 muestras 
positivas, carriles 3, 4, 5 y 6 muestras 
negativas. 
 
 
 
 
Figura 2. Microfotografía de intestino 
que muestra BAAR. Tinción de FITE-
Faraco (100x). 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 3. Microfotografía de pared 
intestinal que muestra la formación de 
un granuloma con necrosis caseosa. 
Tinción de Hematoxilina-Eosina (20x). 
 
 
 
 
 
 
43%
43%
14%
Gráfico 1. Resultados obtenidos tras analizar las 8 muestras 
por PCR para M. tuberculosis y Micobacterias atípicas
Micobacterias atípicas
M.tuberculosis
Negativas
1   2   3   4   5   6   7   
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1 
 
Cuadro 1. Casos de pacientes con enfermedad crónica 
granulomatosa, características clínicas, histopatológicas y 
moleculares. 
 
 
Caso Caracterización clínica Diagnóstico 
histopatoló
gico 
PCR 1 PCR 2 PCR 3 Resultado 
1 Masculino, 56 años, 
hipertenso y diabético, 
tabaquista, antecedente de 
TB tratada hace 14 años, 
quien consulta por un 
cuadro de disnea de 
esfuerzo asociado a dolor 
torácico y malestar 
general,  a quien se le 
documenta masa en 
segmento basal anterior 
del pulmón derecho.  
 
Pulmón  
Granulomas 
caseosos 
compatibles 
con TB  
 
P -- -- Muestra 
con M. 
tuberculosi
s  
 
Caso Caracterización clínica Diagnóstico 
histopatoló
gico 
PCR 1 PCR 2 PCR 3 Resultado 
2 Femenina, 79 años, con 
hipertensión riesgo C, 
cardiopatía hipertensiva, 
insuficiencia cardiaco 
congestiva NYHA III- IV, 
diabética, reacción con 
infiltrado basal derecho. 
Derrame Pleural  con 
cultivo (-) y cor pulmonale 
con acidosis respiratoria 
compensada con 
hipoxemia y dímero D (+). 
Biopsia 
pleural 
P -- -- Muestra 
con M. 
tuberculosi
s  
 
4 Masculino de 51 años  
 nicaragüense, con 
factores de riesgo social, 
alcohólico, tabaquista, 
diagnosticado con TB hace 
8 días con tx antifímico, 
consulto por epigastralgia 
y somnolencia, presentó 
Pulmón ICG 
compatible 
con TB  
 
N N P Muestra 
con 
Micobact. 
atip.  
 
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1 
 
neumotórax derecho a 
repetición por lo que 
requirió neumonectomía.  
 
5 Femenina, 69 años, 
hipertensa, antecedente 
heredo familiares de TB en 
madre y hermana, 
consulta por lumbalgia de 
1 mes de evolución, TAC: 
aplastamiento de L2 con 
rarefacción ósea. 
 
Hueso con  
ICG 
compatible 
con TB 
N N P Muestra 
con 
Micobact. 
atip.  
 
6 Masculino, 65 años, 
agricultor, tabaquista, 
consulta por dolor 
abdominal, abdomen 
muestra múltiples nódulos 
en bazo y esplenomegalia. 
Bazo 
Granulomat
osis 
esplénica 
tipo 
sarcoidosis  
 
N N P Muestra 
con 
Micobact. 
atip.  
 
7 Masculino, 72 años, 
antecedente de carcinoma 
 renal hace 15 años. 
 Presenta radiografía de 
 tórax con lesiones 
 sospechosas de 
 metástasis. 
Pulmón 
Lesiones 
granulomato
sas  
caseificantes  
 
N P N Muestra 
negativa 
para 
Micobacte 
rias  
 
*PCR1 corresponde al PCR para M.tuberculosis; PCR2 al PCR para p53; PCR3 al PCR 
para micobacterias atípicas; ICG, inflamación crónica granulomatosa; TB, tuberculosis;  
N, negativo; P, positivo. 
 
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1 
 
Discusión 
 
 Los estudios moleculares para el 
diagnóstico de tuberculosis constituyen 
una nueva y valiosa herramienta que 
puede facilitar y mejorar la velocidad del 
diagnóstico y manejo de los pacientes (3, 
9). En el caso del PCR, éste se puede 
realizar tanto en muestras de esputo 
como muestras parafinadas, las muestras 
de esputo tienen la ventaja de que pueden 
ser cultivadas, no así las muestras 
parafinadas por lo que en estos casos, el 
diagnóstico en nuestro país, se limita  a la 
tinción de láminas histológicas. 
 Diversos reportes muestran que la 
técnica de PCR constituye una forma 
rápida y sensible que permite amplificar 
fragmentos de ADN de M. tuberculosis en 
tejidos parafinados aún cuando éste se 
encuentre en cantidades muy pequeñas 
(5, 9). Los principales factores que 
intervienen en la amplificación de ADN en 
estos tejidos son tamaño de fragmento 
diana a amplificar, copias del fragmento 
en el genoma, concentración de ADN, 
fijación de la muestra (10, 11).  
En el presente estudio se utilizó un 
PCR anidado cuyo producto de 
amplificación es de aproximadamente 180 
pares de bases, la principal ventaja del 
PCR anidado es que la combinación de las 
dos reacciones en secuencia permiten 
alcanzar una alta sensibilidad sin afectar 
su especificidad, esto sumado a la 
amplificación de un fragmento diana 
pequeña permite obtener mejores 
resultados (12). 
 La implementación del método de 
PCR puede presentar algunas limitaciones 
como lo son las alteraciones en el ADN por 
cambios estructurales debido  a la fijación 
deficiente del tejido en formalina y esto 
varía según el tratamiento que reciba la 
muestra (13). Así por ejemplo un estudio 
anterior presentó un porcentaje de 
amplificación de 50% en biopsias tratadas 
en el HSJD (13). En el presente estudio, se 
asumió que la calidad de ADN de los casos 
positivos por M. tuberculosis era adecuado 
puesto que se obtuvo un producto de 
amplificación; a las 5 muestras que 
resultaron negativas se les realizó un PCR 
para el gen p53, un gen constitutivo, con el 
fin de evaluar la calidad del ADN, 3 de 
estas resultaron negativas. Sin embargo, 
estas 3 mismas muestras fueron positivas 
para micobacterias atípicas (cuadro 1) lo 
que implica que en este PCR se pueden 
obtener productos aún cuando el ADN se 
encuentre degradado. 
Las sensibilidades y 
especificidades reportadas varían entre 
los diversos estudios, Barrón y 
colaboradores reportan una sensibilidad 
de 96, 6 % y una especificidad de 100% en 
muestras de biopsias pleurales en 
parafina mientras que Park y 
colaboradores presentan una sensibilidad 
de 78% y una especificidad de 88%, que al 
igual que este estudio, se realizó en 
muestras de diferentes sitios anatómicos 
también en parafina. Por ser este un 
estudio exploratorio no se realizó un 
análisis de sensibilidad y especificidad, 
pero se demostró que es posible la 
detección de micobacterias por PCR en los 
casos valorados.  
En nuestro estudio tres de los siete 
casos fueron positivos en la PCR para M. 
tuberculosis, de los cuales dos presentan 
correlación con la clínica y uno de ellos, 
además, presentó identificación 
histológica de BAAR positivos en la 
tinción de FITE (el único de todos los 
casos analizados en donde se pudo 
observar). El tercero de estos casos no 
presenta correlación evidente con la 
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1 
 
clínica, esto se puede interpretar de la 
siguiente manera:  
• Que sea un verdadero positivo. Beige y 
colaboradores  continuaron realizando 
cultivos a muestras cuyo PCR era 
positivo pero no se contaba con otras 
características diagnósticas y lograron 
obtener cultivos positivos. Ellos 
concluyeron que el PCR es una técnica 
más sensible que permite un 
diagnóstico más temprano (3). 
• Que sea un falso positivo por 
contaminación. En un estudio 
multicéntrico se encontró altos niveles 
de falsos positivos en diferentes 
laboratorios (de 3% a 20%) debido 
principalmente a contaminación 
cruzada (14). 
• Que el ADN amplificado corresponda a 
fragmentos de ADN de M. tuberculosis 
degradado o latente que no presente 
relevancia clínica  (3, 9). 
 
A los cuatro casos negativos para 
M.tuberculosis por PCR se les realizó el 
PCR para el gen p53, en tres de ellos fue 
negativo confirmando la mala calidad del 
ADN. Es importante tomar en cuenta que 
un resultado negativo para p53 implica 
que el ADN se encuentra degradado y por 
lo tanto no se puede concluir que sea 
negativo para M. tuberculosis. Sin 
embargo, el PCR para micobacterias 
atípicas puede ser aplicado en este tipo de 
muestras ya que los productos de 
amplificación son pequeños y pueden 
estar conservados. Pero, cuando el ADN 
está degradado y el resultado es negativo, 
no se puede descartar la infección.  
Los tres casos positivos para 
micobacterias atípicas presentan 
correlación clínica e histopatológica pero 
al tener ADN degradado no se puede 
descartar la presencia también de M. 
tuberculosis. 
Llama la atención, que el único 
caso negativo para los diversos tipos de 
micobacterias presentó amplificación 
para p53, pero una clínica altamente 
sospechosa para tuberculosis apoyado 
además en la histopatología por lo que 
concluimos que podría ser un falso 
negativo. 
 
Conclusiones 
 
• El protocolo empleado permite el 
diagnóstico molecular de micobacterias 
en los tejidos estudiados pero es 
importante realizar un estudio de 
mayores dimensiones para evaluar su 
sensibilidad y especificidad. 
• Cuando el ADN está degradado se 
puede obtener resultados positivos 
para micobacterias, pero un resultado 
negativo no se puede descartar 
infección. 
• Se debe de tomar en cuenta la 
existencia de falsos positivos para 
optimizar el protocolo de diagnóstico. 
• Las discrepancias entre PCR y la clínica 
deben ser valoradas con cuidado y de 
forma individualizada. 
• Aunque se ha descrito que la técnica de 
PCR es sensible para el diagnóstico de 
micobacterias, siempre se debe de 
correlacionar con la clínica y  hallazgos 
histopatológicos. 
 
 
 
 
 
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Agradecimientos 
 
Esta investigación se llevó a cabo gracias a 
la colaboración del Dr. Barbareschi, a 
Girlando Salvatore, Ana María Piccolo y el 
Servicio de Patología del Hospital de Santa 
Clara, Italia, al Dr. Porras y el Servicio de 
Patología del Hospital San Juan de Dios, el 
Dr. Marco Zuñiga Director Departamento 
Anatomía UCR y a Kenneth Ernest y 
Emmanuelle Vargas. 
 
 
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Correspondencia  
 
Ing. María José Suárez 
Centro de Investigaciones en Hematologías Anormales y Trastornos Afines (CIHATA), 
UCR. 
Laboratorio de Histología, Facultad de Medicina, UCR 
majosu@gmail.com 
 
Dr. José Luis Quirós 
Laboratorio de Histología, Facultad de Medicina, UCR 
 
 
 
 
 
 
 
 
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