UNIVERSIDAD DE COSTA RICA FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS ESCUELA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS Proyecto Final de Graduación presentado a la Escuela de Tecnología de Alimentos para optar por el grado de Licenciada en Ingeniería de Alimentos. Evaluación de la incorporación del retenido de la operación de ultrafiltración de leche en la elaboración de un prototipo de producto lácteo estable a temperatura ambiente Estudiante: Michelle Xirinachs Robert B37691 Ciudad Universitaria Rodrigo Facio Febrero 2019 ii TRIBUNAL EXAMINADOR Proyecto de graduación presentado a la Escuela de Tecnología de Alimentos como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en Ingeniería de Alimentos. Elaborado por: Michelle Xirinachs Robert Aprobado por: _______________________________ M. Sc. Ana Isabel Incer González Directora del Proyecto _______________________________ Lic. Diana Víquez Barrantes Asesora del Proyecto _______________________________ Lic. Ana Cristina Azofeifa Sánchez Asesora del Proyecto _______________________________ Ph. D. Eric Wong González Presidente del Tribunal Examinador _______________________________ Ph. D. Marianela Cortés Muñoz Profesora designada iii DERECHOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL El presente proyecto final de graduación posee confidencialidad parcial según los requerimientos de la empresa que financió el proyecto. La confidencialidad parcial representa una protección para la empresa interesada frente a posibles competidores, además de proteger sus productos. Según lo anterior, el presente se publica codificando y restringiendo la información que presente un riesgo. iv DEDICATORIA “A Dios, a mis papas y hermanos” v AGRADECIMIENTOS En primer lugar, agradezco a Dios, por tantas bendiciones a lo largo de mi vida y por darme la mejor familia. A mis papas y hermanos, gracias por estar ahí, por ser el mejor soporte en todas las etapas, por apoyarme en todo momento y por siempre impulsarme a ser mejor persona. Agradezco a la empresa solicitante del presente, por toda la ayuda en la realización de este proyecto, en especial al señor Marco Chaverri, por su dedicación durante todo el proceso. A todo el personal del CITA y la Escuela de Tecnología de Alimentos, por brindar de su ayuda a lo largo del proyecto; en especial a Camacho y Alonso por su atención especializada en la Planta Piloto, a Sandra, Elba y Abel por su ayuda en los paneles sensoriales y a Giova y Luis por su indispensable colaboración en el laboratorio. Gracias especiales a Ana Incer, por ser más que una directora de proyecto. Gracias por guiarme de la mejor manera durante este proceso, por atender mis dudas, por su disponibilidad, su entrega y por siempre estar presente en los altos y bajos. A mis dos asesoras de proyecto, Diana Víquez y Ana Cristina Azofeifa, gracias por su dedicación, apoyo, disponibilidad y aporte tan valioso al proyecto. A todos mis amigos y amigas que estuvieron presentes, en especial a Majo, Mel, Xime, Rody, Jessi, Meme y Rebe porque fueron mi compañía a lo largo de toda mi carrera. Gracias a mis amigas del alma y a Felipe, por ser parte de este logro. A todas las personas que han estado presentes. ¡Muchas gracias! vi ÍNDICE GENERAL TRIBUNAL EXAMINADOR ....................................................................................... ii DERECHOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL ....................................................... iii DEDICATORIA ........................................................................................................ iv AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. v ÍNDICE GENERAL .................................................................................................. vi ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. ix ÍNDICE DE CUADROS ........................................................................................... xi ABREVIATURAS ................................................................................................... xiii RESUMEN ............................................................................................................ xiv 1. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................. 1 2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 3 2.1 Objetivo General ........................................................................................ 3 2.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 3 3. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 4 3.1 Leche ......................................................................................................... 4 3.1.1 Definición ............................................................................................. 4 3.1.2 Normativa ............................................................................................ 4 3.1.3 Composición química .......................................................................... 6 3.1.4 Aporte nutricional ............................................................................... 10 3.2 Procesamiento de la leche ....................................................................... 11 3.2.1 Tratamientos térmicos ....................................................................... 11 3.2.2 Cambios fisicoquímicos y sensoriales inducidos por el tratamiento térmico……………………………………………………………………………….14 vii 3.2.3 Otras técnicas de procesamiento: filtración por membranas ............. 17 3.3 Vida útil de los alimentos .......................................................................... 21 3.3.1 Mecanismos de deterioro de los alimentos ........................................ 24 3.3.2 Determinación de vida útil de los alimentos ....................................... 26 3.3.3 Vida útil de la leche ............................................................................ 32 3.4 Oferta en el mercado: productos alimenticios altos en proteína ............... 37 4. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 40 4.1 Localización del proyecto ......................................................................... 40 4.2 Materia prima ........................................................................................... 40 4.3 Definición del prototipo de producto a elaborar ........................................ 40 4.3.1 Caracterización fisicoquímica ............................................................ 40 4.3.2 Requisitos de la empresa .................................................................. 42 4.4 Evaluación del efecto del tratamiento térmico UHT sobre las características fisicoquímicas y sensoriales del prototipo elaborado ................. 42 4.4.1 Descripción del proceso .................................................................... 42 4.4.2 Medición de variables respuesta ....................................................... 44 4.4.3 Análisis de datos ................................................................................ 46 4.5 Evaluación de la estabilidad de las características fisicoquímicas y sensoriales del prototipo elaborado en la producción industrial durante el almacenamiento ................................................................................................ 47 4.5.1 Medición de variables respuesta ....................................................... 49 4.5.2 Análisis de datos ................................................................................ 52 4.6 Métodos de análisis.................................................................................. 53 4.6.1 Análisis proximal ................................................................................ 53 4.6.2 Análisis de acidez .............................................................................. 53 4.6.3 Color .................................................................................................. 53 viii 4.6.4 pH ...................................................................................................... 54 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 55 5.1 Definición del prototipo de producto a elaborar ........................................ 55 5.1.1 Caracterización fisicoquímica ............................................................ 55 5.1.2 Reglamentación ................................................................................. 58 5.1.3 Definición del prototipo a elaborar ..................................................... 60 5.2 Evaluación del efecto del tratamiento térmico por UHT sobre las variables fisicoquímicas y sensoriales del prototipo elaborado ......................................... 61 5.2.1 Variables fisicoquímicas .................................................................... 61 5.2.2 Variables sensoriales ......................................................................... 64 5.3 Evaluación de la estabilidad de las variables fisicoquímicas y sensoriales del prototipo elaborado en la producción industrial durante el almacenamiento 71 5.3.1 Variables fisicoquímicas .................................................................... 71 5.3.2 Variables sensoriales ......................................................................... 76 5.3.3 Estimación de vida útil ....................................................................... 85 6. CONCLUSIONES .......................................................................................... 89 7. RECOMENDACIONES .................................................................................. 91 8. REFERENCIAS .............................................................................................. 92 9. ANEXOS ...................................................................................................... 101 ix ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Selectividad de los diferentes procesos de membranas aplicados a la leche. ..................................................................................................................... 21 Figura 2. Pseudo ploteo del modelo de Arrhenius. ............................................... 30 Figura 3. Porcentaje de rechazo en función del tiempo de almacenamiento utilizando análisis estadístico de supervivencia. ................................................... 31 Figura 4. Gráfico para la determinación del punto de corte. ................................. 32 Figura 5. Esquema de la metodología descrita para la caracterización fisicoquímica de la materia prima. ............................................................................................... 41 Figura 6. Esquema de la metodología descrita para la evaluación del efecto del tratamiento térmico sobre las propiedades sensoriales y fisicoquímicas del prototipo .............................................................................................................................. 43 Figura 7. Esquema de la metodología descrita para la evaluación de la estabilidad de las características fisicoquímicas y sensoriales del prototipo. .......................... 49 Figura 8. Escala CIELab: parámetros L*, a* y b*. ................................................. 63 Figura 9. Dendograma generado a partir de los resultados del panel sensorial de agrado general. ..................................................................................................... 69 Figura 10. Agrado promedio de las muestras de leche comercial y prototipo pasteurizado y UHT de acuerdo al análisis de clusters. ........................................ 70 Figura 11. Cambio de la variable pH en función del tiempo de almacenamiento a 37 °C del prototipo ...................................................................................................... 73 Figura 12. Cambio de la variable L* (a), a* (b), b* (c) y ΔE* (d) en función del tiempo de almacenamiento a 37 °C del prototipo. ............................................................ 74 Figura 13. Cambio de la variable arenosidad (a), recubrimiento bucal (b), sabor a cocido (c), olor a cocido (d) y color pardo (e) en función del tiempo de almacenamiento a 37 °C del prototipo. ................................................................. 78 Figura 14. Dendograma generado a partir de los resultados del panel sensorial de agrado general del prototipo durante el almacenamiento. .................................... 81 Figura 15. Promedio de agrado general del prototipo con diferente grado de almacenamiento y de su leche homóloga comercial de acuerdo al cluster. .......... 82 x Figura 16. Conformación de los clusters según frecuencia de consumo de leche. .............................................................................................................................. 82 Figura 17.Conformación de los clusters según el tipo de leche que consume con mayor frecuencia. .................................................................................................. 83 Figura 18. Agrado general del prototipo durante el almacenamiento a 37 °C. ..... 84 Figura 19. Imagen (vista superior) del prototipo durante el almacenamiento a 37 °C. .............................................................................................................................. 86 Figura 20. Imagen (vista lateral) del prototipo durante el almacenamiento a 37 °C. .............................................................................................................................. 86 Figura 21. Promedio de agrado en función de la intensidad del color pardo para la determinación del punto de corte. ......................................................................... 87 Figura 22. Intensidad de color pardo en función del tiempo de almacenamiento a 37 °C. ......................................................................................................................... 88 xi ÍNDICE DE CUADROS Cuadro I. Características físicas y químicas de la leche fluida de vaca. ................ 5 Cuadro II. Composición química de la leche de vaca. ............................................ 6 Cuadro III. Temperaturas de almacenamiento recomendadas para estudios de vida útil acelerados, según el producto. ........................................................................ 28 Cuadro IV. Vida útil (meses) de diferentes leches comerciales UHT a temperatura ambiente................................................................................................................ 33 Cuadro V. Descripción de bebidas altas en proteína del mercado. ..................... 38 Cuadro VI. Condiciones del tratamiento térmico UHT aplicado. ........................... 43 Cuadro VII. Atributos sensoriales evaluados en el prototipo elaborado mediante pruebas de discriminación 2-AFC ......................................................................... 44 Cuadro VIII. Frecuencia de muestreo, temperatura y tiempo total de almacenamiento para la evaluación de las características fisicoquímicas y sensoriales del prototipo. ...................................................................................... 48 Cuadro IX. Descriptores generados por el panel entrenado para la evaluación sensorial del prototipo durante el almacenamiento. .............................................. 50 Cuadro X. Análisis proximal, pH, acidez y color de la materia prima en estudio y de leche descremada y pasteurizada. ........................................................................ 55 Cuadro XI. Promedios de las variables fisicoquímicas evaluadas en el prototipo para determinar el efecto del tratamiento térmico por UHT sobre las mismas. ............. 61 Cuadro XII. Determinación del efecto del tratamiento térmico por UHT sobre las características sensoriales del prototipo elaborado utilizando pruebas sensoriales de discriminación 2 AFC con n=40. ....................................................................... 65 Cuadro XIII. Promedio de agrado general de leches comerciales y muestras de prototipo pasteurizado y prototipo UHT. ................................................................ 68 Cuadro XIV. Promedio de agrado de las muestras de leche comercial y prototipo pasteurizado y UHT para cada grupo obtenido del análisis de clusters. ............... 70 Cuadro XV. Probabilidad asociada obtenida del análisis de regresión lineal para cada una de las variables fisicoquímicas analizadas al prototipo durante el tiempo de almacenamiento. .............................................................................................. 72 xii Cuadro XVI. Parámetros estimados para la regresión lineal de las variables L*, a*, b* y ΔE* en función del tiempo de almacenamiento. ............................................. 75 Cuadro XVII. Probabilidad asociada obtenida del análisis de regresión lineal para cada una de los descriptores sensoriales analizados al prototipo durante el tiempo de almacenamiento. .............................................................................................. 77 Cuadro XVIII. Parámetros estimados para la regresión lineal de los descriptores sensoriales en función del tiempo de almacenamiento a 37 °C del prototipo. ...... 79 Cuadro XIX. Promedio de agrado general del prototipo con diferente tiempo de almacenamiento y de su leche homóloga comercial. ............................................ 80 Cuadro XX. Parámetros estimados de la regresión lineal del agrado del prototipo durante el almacenamiento a 37 °C. ..................................................................... 85 xiii ABREVIATURAS AFC: Alternative Forced Choice ANDEVA: Análisis de varianza AOAC: Association of Official Analytical Chemists Aw: Actividad de agua CITA: Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos ETA: Escuela de Tecnología de Alimentos FRV: Factor de reducción volumétrica GMP: Glicomacropéptido HTST: High Temperature – Short Time IFT: Institute of Food Technology LTLT: Low Temperature - Long Time MF: Microfiltración MPC: Milk Protein Concentrate NF: Nanofiltración OI: Ósmosis Inversa RTCA: Reglamento Técnico Centroamericano RTCR: Reglamento Técnico de Costa Rica UAT: Ultra Alta Temperatura UF: Ultrafiltración UHT: Ultra High Temperature WPC: Whey Protein Concentrate xiv RESUMEN El presente proyecto buscó darle valor agregado al retenido de la operación de ultrafiltración de leche, mediante la evaluación de la incorporación de dicha materia prima en el desarrollo de un prototipo de producto lácteo estable a temperatura ambiente. Se realizó la caracterización fisicoquímica de la materia prima en estudio, donde se evidenció que el retenido de ultrafiltrado de leche presenta una composición fisicoquímica similar a la de una leche comercial descremada, con mayor contenido de proteína y calcio, producto de la concentración de la operación de ultrafiltración. El retenido caracterizado cumplió con las especificaciones que debe reunir la leche según el Reglamento Técnico de Costa Rica (RTCR), de manera que se procedió a definir la formulación del prototipo haciendo uso de un X% de retenido que cumple con la especificación. Se evaluó el efecto del tratamiento térmico por Ultra Alta Temperatura (UHT) sobre las variables fisicoquímicas y sensoriales del prototipo elaborado, donde el pH, la acidez y el parámetro de color L* no presentaron diferencia significativa, con un 95 % de confianza. Los parámetros de color a* y b* presentaron un aumento significativo (p<0,001; α=0,05) indicando la presencia de coloraciones pardeadas, producto de la reacción de Maillard, luego de aplicar el tratamiento. Los resultados son esperados para el tipo de producto evaluado, según los cambios que experimenta la leche al exponerse a tratamientos térmicos. El perfil sensorial se vio alterado de manera significativa al aplicar el tratamiento UHT, ocasionando la aparición de coloraciones pardeadas y de off- flavours, los cuales fueron detectados por los consumidores. Sin embargo, su agrado no presentó diferencia significativa respecto al agrado de una leche comercial descremada, indicando una aceptabilidad comparable con este tipo de leche, la cual es la de mayor consumo en la población costarricense. Por último, se realizó un estudio de almacenamiento exploratorio, donde se observó un aumento significativo en el color pardo del prototipo, siendo ésta la variable crítica de deterioro. Además, se observó un cambio significativo en el perfil sensorial del prototipo, así como una disminución significativa en el pH. Se estimó una vida útil preliminar a una temperatura de 37 °C de 72,72 días (2,4 meses) y de 218,16 días (7,3 meses) a 25 °C, tomando un valor referencia de Q10 de 2,5. 1 1. JUSTIFICACIÓN El sector lácteo costarricense representa una parte importante de la economía de Costa Rica, así mismo tiene un fuerte impacto en el sector social del país. Según información recopilada por la Cámara Nacional de Productores de Leche (2017), la producción de leche durante el período de 1980 a 2016 estimada en millones de kilogramos, creció desde los 308 en el año 1980 a los 1135 en el año 2016. Lo anterior representa un crecimiento del 268,5% o bien un crecimiento anual promedio del 7,5%. Se estima que, de la producción total anual de leche, un 60% se destina al sector formal de Costa Rica, mientras que el 40% restante es destinado al sector informal. Con respecto al sector formal, la Cámara Nacional de Productores de Leche (2013), indica que el 62% se industrializa formalmente en el país como leche fluida. Además, el consumo per cápita de leche en Costa Rica en promedio es de 188,51 kg/año, siendo uno de los más altos de América Latina, nivel que se alcanza gracias a la autosuficiencia del país en la producción de leche (Barrientos & Villegas, 2010). Es por las razones anteriores, además de la tendencia actual de consumo de alimentos para bienestar y prevención de enfermedades según Zegler (2018), que el desarrollo de productos a partir de leche y/o derivados toma importancia en el mercado costarricense. Actualmente, la empresa solicitante del proyecto, dispone de un equipo de ultrafiltración tangencial para leche, con el cual se obtiene un permeado que es utilizado para la estandarización de la leche destinada al proceso de elaboración de leche en polvo. Según lo anterior, el retenido obtenido representa entonces un subproducto para la empresa, por lo que el presente proyecto pretende evaluar la posibilidad de atribuirle un valor agregado o aplicación a nivel industrial. La fracción de interés en este caso, el retenido, se compone de altas concentraciones de proteína de leche (Chacón, 2006), por lo que representa una buena opción para el desarrollo de productos gracias a su alto valor nutricional, principalmente debido a la concentración de la caseína de la leche. Sin embargo, 2 factores de procesamiento y almacenamiento deben ser evaluados previo al desarrollo de un producto de dicha naturaleza. Estudios han demostrado que la exposición de la leche o sus derivados al calor puede afectar los componentes termolábiles y el equilibrio fisicoquímico, así como afectar sus propiedades sensoriales y nutritivas. Como consecuencia, ocurre la precipitación de las proteínas solubles sobre las caseínas, cambios estructurales en las membranas de los glóbulos de grasa, desmineralización, cambios oxidativos, degradación de la lactosa, entre otros. Así mismo, se señala que los cambios ocurridos dependerán de la intensidad del tratamiento térmico aplicado (Barrera, 2012). Además, Datta & Deeth (2003) señalan que los principales cambios durante el almacenamiento de leche UHT se debe a reacciones proteolíticas, oxidativas y de Maillard, dando como resultado el desarrollo de sabores indeseables (off-flavours), precipitaciones y cambios de acidez, los cuales afectan la vida útil del producto. Según lo anterior, las condiciones de procesamiento y almacenamiento constituyen un factor crítico a considerar a la hora de desarrollar un producto a partir del retenido de la operación de ultrafiltración de leche. El desarrollo de un producto de dicha naturaleza aumentaría la competitividad, la diversificación y el valor agregado del mercado nacional. Además, al utilizar nuevas tecnologías, como la tecnología de filtración tangencial por membranas, abre las puertas a la tecnificación de procesos y a la versatilidad de producción en la industria de alimentos de Costa Rica. Por lo tanto, el objetivo de la investigación consistió en evaluar la incorporación del retenido de la operación de ultrafiltración de leche en la elaboración de un prototipo de producto lácteo estable a temperatura ambiente, mediante pruebas fisicoquímicas y sensoriales a lo largo de sus etapas de procesamiento y almacenamiento. Los resultados servirán como base para un posible desarrollo de producto por parte de la empresa solicitante del proyecto. 3 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo General Evaluar la incorporación del retenido de la operación de ultrafiltración de leche en la elaboración de un prototipo de producto lácteo estable a temperatura ambiente, mediante caracterización fisicoquímica del retenido y evaluación del efecto del tratamiento térmico y el tiempo de almacenamiento sobre las características sensoriales y fisicoquímicas del prototipo. 2.2 Objetivos Específicos 2.2.1 Definir el prototipo de producto lácteo a elaborar que incorpora el retenido de la operación de ultrafiltración de leche, a partir de la caracterización fisicoquímica del retenido, revisión bibliográfica y requisitos de la empresa. 2.2.2 Evaluar el efecto del tratamiento térmico por ultra alta temperatura sobre las características sensoriales y fisicoquímicas del prototipo elaborado mediante pruebas a nivel piloto, para la realización de una producción a escala en la empresa. 2.2.3 Evaluar la estabilidad de las características fisicoquímicas y sensoriales del prototipo elaborado en la producción industrial, en el tiempo, mediante un estudio de almacenamiento exploratorio, para el posible desarrollo de producto por parte de la empresa. 4 3. MARCO TEÓRICO 3.1 Leche 3.1.1 Definición La leche, en su aceptación general, hace referencia a un líquido fisiológico secretado por las glándulas mamarias de los mamíferos, con la finalidad de satisfacer los requerimientos específicos de las crías en su primera fase de vida (Zavala, 2005). Así mismo, el Reglamento Técnico de Costa Rica define “leche” como “la secreción mamaria de animales bovinos sanos, obtenida mediante el ordeño, sin ningún tipo de extracción y/o adición, destinada al consumo en forma de leche fluida o a elaboración ulterior, debiéndose establecer su origen si se trata de otra especie animal” (RTCR, 2006). La denominación de “leche”, sin indicación de la especie animal de que procede, se reserva a la leche de vaca. Toda leche que proceda de una hembra lechera, que no sea la vaca debe designarse por la denominación “leche” seguida de la especie animal de la que procede; por ejemplo “leche de cabra” (Gómez & Mejía, 2005). Desde el punto de vista físico, la leche es una suspensión coloidal de partículas en un medio acuoso dispersante, de color blanco opalescente característico. En general, las partículas pueden presentar forma globular y estar constituidas por lípidos; o ser más pequeñas y corresponder a micelas proteicas que llevan unidas sales minerales (Quirós, 2016). 3.1.2 Normativa Según la normativa que aplique en el lugar de procesamiento y comercialización de la leche, así son las características que ésta debe reunir. En el Cuadro I se resumen las especificaciones, según el Reglamento Técnico de Costa Rica para los diferentes tipos de leche fluida. 5 Cuadro I. Características físicas y químicas de la leche fluida de vaca. Característica Leche descremada1 Leche semidescremada1 Leche entera1 Grasa (%) Menor a 1 Mayor o igual a 1 y menor de 3 Mayor o igual a 3 Sólidos totales mínimos (%) 8,0 10,0 11,0 Sólidos no grasos mínimos (%) 8,0 8,0 8,0 Acidez (expresada como ácido láctico) 0,13-0,17 0,13-0,17 0,13-0,17 Cenizas máximo (%) 0,8 0,8 0,8 Proteína mínimo (N*6,38 %) 3,0 3,0 3,0 Densidad (Valores mínimos a T=15°C) 1,029 1,030 1,032 Punto de congelación (°C) Min: -0,513 Max: -0,541 Min: -0,513 Max: -0,541 Min: -0,513 Max: -0,541 1Reglamento Técnico CR N°33812-401 (RTCR, 2006). Además de las características fisicoquímicas, se establecen especificaciones sensoriales, donde se indica que la leche debe estar limpia y libre de calostro, así como presentar un color blanco o marfil. Debe contener un aspecto uniforme, salvo en la leche no homogenizada, en donde la grasa forma una capa de color amarillo tenue, cuando se deja en reposo. La viscosidad debe ser normal sin desfase del estado coloidal y debe presentar olor y sabor propios, considerándose anormal cualquier otro sabor u olor ajeno que dé lugar a duda (RTCR, 2006). 6 3.1.3 Composición química La leche de las distintas especies, directamente o en forma de producto derivado, puede considerarse fuente de macronutrientes y micronutrientes que juegan un papel nutritivo importante. La leche de vaca es una de las matrices más complejas de la naturaleza y está constituida principalmente por agua, proteínas, lactosa, grasa, vitaminas, minerales y enzimas (Gómez & Mejía, 2005). Las moléculas de menor tamaño, representadas por las sales, vitaminas y lactosa se presentan en un estado de disolución verdadera; mientras que las moléculas mayores como los lípidos, proteínas y enzimas aparecen en estado coloidal (Zavala, 2005). Estos constituyentes varían entre sí por su naturaleza, tamaño molecular y solubilidad, entre otros parámetros propios del animal como la edad, especie, tipo de alimentación, medio ambiente y estado sanitario (Quirós, 2016). En el Cuadro II se presenta la composición química de la leche de vaca. Cuadro II. Composición química de la leche de vaca. Componente Rango1 Valor promedio2 Agua (%) 85,3-88,7 87,50 Proteína (%) 2,3-4,4 3,2 Grasa (%) 2,5-5,5 3,7 Lactosa (%) 3,8-5,3 4,8 Cenizas (%) 0,7-0,9 0,8 1(WingChing & Mora, 2013) 2(Bidot, 2017) 3.1.3.1 Proteína La composición de la proteína de la leche es un factor de suma importancia dentro de la industria láctea, ya que influye directamente sobre el rendimiento y la aptitud tecnológica de la leche (García et al. 2014). Las proteínas de la leche están compuestas por una mezcla de numerosas fracciones proteicas, de pesos moleculares diferentes. Estas se pueden clasificar en dos grandes grupos, que 7 corresponden a las caseínas, en un 80%, y a las proteínas séricas, en un 20% (Gómez & Mejía, 2005). Las caseínas, son proteínas que se encuentran unidas principalmente a fosfato de calcio en una estructura sólida y esponjosa, llamada micela, que precipita cuando se acidifica la leche a un pH de 4,6 (punto isoeléctrico). Se han propuesto varios modelos de micelas de caseínas a lo largo de los años, indicando la presencia de una matriz compleja de proteínas con grupos de fosfatos de calcio dispersos en las micelas, con diámetros promedio de 150 a 200 nm y canales de agua en el interior de su estructura (Dalgleish, 2011). Las caseínas se clasifican en función de su movilidad electroforética como α- caseína, β-caseína y κ-caseína (García et al. 2014). El valor tecnológico de las caseínas obedece a su alto contenido de aminoácidos esenciales que se separan de la fase acuosa por acción de enzimas como la renina y la quimosina, que son responsables de la precipitación de la caseína en la elaboración de quesos (Gómez & Mejía, 2005). Por otra parte, las proteínas séricas o también conocidas como proteínas del suero, contienen sulfuro en lugar de fósforo en su estructura y permanecen en disolución aun cuando la leche se acidifica. El nitrógeno proteico del lactosuero incluye a la β-lactoglobulina, α-lactoalbúmina, inmunoglobulinas, albúmina de suero, y otros compuestos nitrogenados minoritarios como la lactoferrina (García et al. 2014). Las proteínas del lactosuero tienen una estructura típica de proteínas globulares compactas, con una secuencia en la que los grupos no polares, polares y cargados tienen una distribución relativamente uniforme. Las proteínas sufren un plegamiento intramolecular como resultado de la formación de puentes bisulfuro entre los grupos sulfhidrilo de las cisteínas, quedando la mayor parte de los grupos hidrofóbicos encerrados en el interior de la molécula. Es por esta razón que las proteínas del lactosuero no se agregan fuertemente, ni interactúan con otras proteínas, en estado nativo (Díaz, 2010). 8 3.1.3.2 Grasa El contenido de grasa en la leche representa un costo energético importante para la producción de leche y desempeña un papel central en la determinación de la calidad de los productos lácteos, así como en el desarrollo de las propiedades físicas y sensoriales. Se presenta principalmente en forma de glóbulos rodeados por una membrana de naturaleza lipoproteica, compuesta por fosfolípidos y glicoproteínas y cuyo núcleo está constituido mayoritariamente por triglicéridos (Calvo et al. 2014). La composición lipídica de la leche de vaca, se encuentra constituida por aproximadamente 78% de triglicéridos, mientras que el 12% restante está compuesto por colesterol, carotenoides, vitaminas liposolubles y lípidos estructurales. Dentro de los ácidos grasos, se han logrado identificar más de 416 ácidos diferentes, sin embargo, solo 10 de ellos están presentes por encima del 1,0%, los cuales son el butírico, caproico, caprílico, cáprico, laúrico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico y linoleico. En términos generales, se compone de 70% ácidos grasos saturados; de los cuales un 11% corresponden a ácidos grasos saturados de cadena corta, 26% ácidos monoinsaturados y 4% ácidos poliinsaturados (García et al. 2014). 3.1.3.3 Lactosa El hidrato de carbono de la leche es la lactosa, un disacárido constituido por glucosa y galactosa. Es el principal azúcar de la leche y único glúcido libre en cantidad importante. Para su absorción, la lactosa debe ser hidrolizada en el intestino delgado por la enzima lactasa, la cual está localizada en el borde de los enterocitos apicales de las vellosidades del intestino. Sin embargo, algunas personas presentan intolerancia basadas en alteraciones del metabolismo que impiden su digestión (Blanco, 2016). 9 3.1.3.4 Minerales, cenizas y sales De los minerales presentes en la leche, el calcio es el más significativo desde el punto de vista nutricional, ya que está presente en forma abundante y fácilmente asimilable por el organismo. El fósforo también es considerable en la leche, pero de menor importancia nutritiva que el calcio ya que puede ser proveído por otras fuentes alimentarías comunes, además de bajas concentraciones de hierro y cobre (Zavala, 2005). Las cenizas de la leche hacen referencia al residuo blanco que permanece después de la incineración de la leche a 600 ºC y están compuestas principalmente por óxidos de sodio, potasio, calcio, hierro, fósforo y azufre. El azufre y fracciones de fósforo y hierro, proceden de las proteínas. Por otro lado, las sales de la leche son fosfatos, cloruros y citratos de potasio, sodio, calcio y magnesio. Los cloruros de sodio y los de potasio están totalmente ionizados, mientras que los fosfatos de calcio, magnesio y citrato están, una parte en forma soluble y otra en forma de complejos coloidales en equilibrio, muy débil, con el complejo caseína (Zavala, 2005). 3.1.3.5 Vitaminas La mayor parte de la leche para consumo humano es tratada con calor para prevenir riesgos de salud pública causados por microorganismos patógenos presentes en la leche cruda. Estos procesos industriales destruyen algunos nutrientes, especialmente las vitaminas que están presentes naturalmente en la leche, y la magnitud de las pérdidas depende del nutriente y el método de procesamiento usado. Además de las altas temperaturas, el almacenamiento de la leche, así como las radiaciones lumínicas, producen pérdidas vitamínicas. Sin embargo, estos nutrientes destruidos durante el procesamiento se pueden reemplazar mediante la fortificación de la leche (Gómez & Mejía, 2006). La leche contiene vitaminas liposolubles como la A, D, E y K, además de otras hidrosolubles como la B1, B2, B6, B12, C y ácido fólico (Zavala, 2005). Por lo general, la concentración de las vitaminas hidrosolubles se conserva 10 constantemente, sin embargo, en la vitamina C se observan fluctuaciones dependiendo de la alimentación del animal (Gómez & Mejía, 2006). 3.1.3.6 Enzimas Las enzimas contenidas en la leche se aprovechan para efectos de inspección y control, ya que muchas de ellas influyen en la calidad de la leche y en el origen de distintas alteraciones (Gómez & Mejía, 2006). Éstas se encuentran distribuidas en toda la matriz alimentaria, sobre la superficie de los glóbulos grasos, asociadas a las micelas de caseínas y en forma simple en suspensión coloidal (Zavala, 2005). En la leche de vaca se han detectado alrededor de 60 enzimas, donde su origen es difícil de determinar. Sin embargo, el estudio de dichas enzimas ha permitido controlar tratamientos térmicos debido a la sensibilidad al calor de algunas de ellas, mientras que otras funcionan como indicadoras de contaminación y actividad microbiana. Dentro de las enzimas de mayor importancia de la leche se encuentran las fosfatasas alcalinas, las lipasas, proteasas, xantinaoxidasas, peroxidasas y catalasas. De las anteriores, las fosfatasas alcalinas son utilizan en la industria como indicadores de pasteurización deficiente (Arias, 2009). 3.1.4 Aporte nutricional La leche tradicionalmente se ha considerado como un alimento completo y equilibrado, proporcionando un elevado contenido de nutrientes en relación al contenido calórico que presenta. Aporta proteínas de alto valor biológico, hidratos de carbono (fundamentalmente en forma de lactosa), grasas, vitaminas liposolubles, vitaminas del complejo B y minerales, especialmente calcio y fósforo (Fernández et al. 2015). Las proteínas presentes en la leche son fácilmente digeribles y de alto valor biológico, ya que aportan los aminoácidos, incluidos los esenciales, para cubrir los requerimientos humanos, contribuyendo al desarrollo, recuperación y mantenimiento de los músculos (Gómez & Mejía, 2005). 11 Por otra parte, la lactosa participa en la síntesis de glucolípidos cerebrósidos, esenciales en el desarrollo neurológico temprano, y de glicoproteínas. Además, actúa facilitando la absorción de calcio (Fernández et al. 2015). Tanto la leche, como los derivados, se consideran la mejor fuente dietética de calcio, gracias al contenido y biodisponibilidad que presenta, de manera que contribuye al desarrollo óptimo de masa ósea, así como favorece procesos de señalización celular, transmisión neuromuscular y secreción glandular (Rovira, 2015). Además de su valor nutricional, la leche se ha demostrado como un factor de primer orden en la prevención de patologías afluentes como la enfermedad cardiovascular, el cáncer y la osteoporosis. Puede contribuir también en la lucha frente al sobre peso y a la obesidad infantil (Fernández et al. 2015). 3.2 Procesamiento de la leche 3.2.1 Tratamientos térmicos La leche, como fuente importante de macro y micro nutrientes, es uno de los alimentos más vulnerables a las alteraciones fisicoquímicas y de deterioración por microorganismos, limitando la durabilidad de la leche y sus derivados, además de causar problemas económicos y de salud pública (Barrera, 2012). Debido a esto, existen múltiples tecnologías para el procesamiento de la leche que permiten asegurar su inocuidad y aumentar su durabilidad. El procesamiento térmico es una de las técnicas empleadas, cuyo objetivo radica en la destrucción total o parcial de la flora microbiana presente, según el tratamiento térmico que se aplique. Existen cuatro tipos de tratamientos térmicos más comunes aplicados a la leche; la pasteurización tradicional por largo tiempo (LTLT; “Low Temperature – Long Time”), la pasteurización rápida a alta temperatura (HTST; “High Temperature – Short Time”), la ultra pasteurización y la esterilización por ultra alta temperatura (UHT; Ultra High Temperatura) (Watts, 2016). 12 3.2.1.1 Pasteurización LTLT y HTST El proceso de pasteurización fue desarrollado por Louis Pasteur y consiste en un método de calentamiento, donde los alimentos son sometidos a la aplicación de calor a una temperatura específica por un tiempo definido, con el objetivo de la destrucción de los microorganismos patógenos presentes, reduciendo el número a un nivel aceptable. Este principio comenzó a utilizarse en leche, sometida a una temperatura de 63 °C durante 30 minutos, sin embargo, investigaciones posteriores han determinado que se pueden utilizar diferentes combinaciones de tiempo y temperatura (González, 2007). Las condiciones de la pasteurización están diseñadas para destruir efectivamente los microorganismos Mycobacterium tuberculosis y Coxiella burnetti. Este proceso puede realizarse como una operación discontinua, donde la leche es pasteurizada por lotes o por “pasteurización lenta a baja temperatura (LTLT)”, en la que el producto se calienta y se retiene en una cisterna cerrada, o bien como una operación continua “pasteurización rápida a alta temperatura (HTST), en la que el producto se calienta en un intercambiador de calor, donde cumple las condiciones específicas de tiempo y temperatura en un tubo de retención (Barrera, 2012). En la pasteurización LTLT, las condiciones de tiempo y temperatura se conservan según el método tradicional implementado por Pasteur, 63 °C por 30 minutos, mientras que en la pasteurización HTST, se utilizan temperaturas que rondan los 72-75 °C por 15-20 segundos (Zavala, 2015). 3.2.1.2 Ultra pasteurización y Esterilización UHT La ultra pasteurización propiamente dicha, es un proceso térmico que provoca la destrucción total de todo tipo de microorganismo aerobio y anaerobio presente en la leche, sin alterar de forma considerable su composición, olor, sabor y contenido nutricional. La fase de tratamiento térmico por ultra alta temperatura y ultra corta duración ocurre cuando el producto es sometido a 135-150 °C durante 3-5 segundos, dentro de un ultra pasteurizador de flujo indirecto o directo y posteriormente sometido a una fase de enfriamiento gradual (Rebolledo et al. 2001). 13 Es un proceso de flujo continuo, donde las condiciones de tiempo y temperatura de calentamiento son optimizadas de manera que radica en menores cambios fisicoquímicos en el producto, en comparación con otros métodos de pasteurización. El proceso debe ser diseñado de manera tal que la combinación de tiempo y temperatura garantice la esterilidad comercial del producto, por lo que factores como el tipo de producto, el perfil microbiológico que presenta, el equipo y empaque a utilizar deben ser considerados. Además, se busca lograr obtener un producto con características sensoriales aceptables durante la vida en anaquel (Scott, 2008). La diferencia entre la ultra pasteurización y la esterilización UHT radica en las temperaturas utilizadas, así como en el tipo de envase y vida útil que presenta el producto. La temperatura utilizada generalmente en la ultra pasteurización es de 138 ºC por 2 segundos, la cual es menor a la temperatura usada en el proceso UHT, la cual es de 145 ºC por 3-5 segundos. La leche ultra pasteurizada posee una vida útil de hasta 90 días a temperaturas de refrigeración, mientras que la esterilización por UHT viene acompañada de un envasado aséptico, lo cual garantiza la esterilidad comercial del producto, con una vida útil alrededor de 6 meses a temperatura ambiente (Barrera, 2012). En el tratamiento térmico por UHT, se puede utilizar vapor, agua caliente o electricidad como medios de calentamiento, donde el vapor y el agua caliente son los más utilizados. Estos sistemas pueden clasificarse en tratamientos térmicos directos e indirectos, donde en el sistema indirecto, el producto y el medio de calentamiento no tienen contacto, mientras que, en los sistemas de calentamiento directo, vapor culinario presurizado se mezcla directamente con el producto. Los medios de calentamiento directo incluyen inyección de vapor, infusión de vapor y superficie raspada, mientras que los de calentamiento indirecto incluyen tubos en espiral, tubos indirectos, placas indirectas, superficie raspada y electricidad (Scott, 2008). 14 3.2.2 Cambios fisicoquímicos y sensoriales inducidos por el tratamiento térmico El procesamiento térmico de la leche es aplicado con la finalidad de asegurar la inocuidad, así como ampliar su vida útil desde el punto de vista microbiano y enzimático, sin embargo, puede ocasionar cambios indeseables en la leche a nivel estructural y sensorial. Walstra (1999) señala que el calor produce cambios fisicoquímicos en la leche que dependerán de la intensidad del tratamiento térmico aplicado, como: pardeamiento, desarrollo de sabores indeseables y ajenos a la leche (“off-flavours”), pérdida de calidad nutricional, inactivación de inhibidores bacterianos, entre otros. 3.2.2.1 Cambios nutricionales De los constituyentes de la leche, las proteínas y las vitaminas son los que experimentan los mayores cambios fisicoquímicos durante y después del procesamiento térmico. Las proteínas pueden sufrir modificaciones en su estructura primaria, o bien en su estructura terciaria y cuaternaria, proceso denominado desnaturalización proteica. Al ocurrir una modificación en la estructura terciara o cuaternaria, puede mejorar el valor biológico de las proteínas, ya que sus enlaces se encuentran más susceptibles a la acción enzimática. Por otro lado, la alteración en su estructura primaria puede reducir la digestibilidad y dar origen a residuos proteicos no biodisponibles (Zavala, 2015). La desnaturalización proteica, inducida por la aplicación de calor, da origen a interacciones proteína-proteína, formando aglomerados, los cuales causan problemas de insolubilización y separación por formación de un gel que no se suspende en la fase acuosa. Estas interacciones ocurren principalmente en las proteínas del suero, las cuales son termolábiles. El proceso de desnaturalización de las seroproteínas inicia con la β-lactoglobulina, la cual expone sus grupos sulfhidrilo que posteriormente van a formar interacciones con otras proteínas séricas, así como con la κ-caseína, formando agregados proteicos (Raikos, 2010). Por otro lado, las caseínas de la leche, son las proteínas que presentan mayor estabilidad térmica, sin embargo, en los tratamientos térmicos severos pueden sufrir 15 cambios sustanciales, por ejemplo, desfosforilación y agregación por interacciones moleculares (Raikos, 2010). Dichos cambios estructurales a nivel proteico se han asociado a la presencia de grumos en la leche o bien a un aumento de viscosidad de ésta durante su almacenamiento (Vuholm, 2016) La mayoría de las vitaminas presentes en la leche son termolábiles. Estudios muestran que el contenido de folato, vitamina B12, vitamina B6 y vitamina C disminuye igual o menor al 10% después de la pasteurización. De las anteriores, la vitamina C es el compuesto más afectado, cuyas pérdidas llegan a un 20% del contenido original en el producto (Roginski, 2005). Por otra parte, la vitamina B2 y las vitaminas liposolubles A, D, E y K son muy estables al calor y por tanto no son afectadas considerablemente por el tratamiento térmico (Cep, 2016). Respecto a la grasa, la membrana de glóbulos de grasa láctea se altera durante el procesamiento térmico, especialmente cuando conlleva agitación o flujos turbulentos. La agitación puede causar cambios en el tamaño del glóbulo debido a la alteración o coalescencia de la membrana, principalmente en el tratamiento por UHT. Esta ruptura, en conjunto con la desnaturalización de las proteínas y la exposición de la cisteína, provoca reacciones que dan lugar a la formación de una capa de proteínas de suero desnaturalizadas en las membranas de los glóbulos de grasa. Esta capa puede participar además en reacciones de Maillard, junto con la lactosa, dando lugar a coloraciones pardeadas y sabores indeseables (Fox et al. 2015). Las reacciones de Maillard que ocurren en la leche durante su procesamiento térmico, así como durante el almacenamiento, comienzan con la unión del grupo aldehído de lactosa con el grupo amino de los residuos lisil (residuos del aminoácido lisina) de diferentes proteínas lácteas. Estas reacciones se favorecen en condiciones alcalinas y durante la exposición de la leche a altas temperaturas. Consiste en una serie de cambios cuya consecuencia es la formación de pigmentos de color marrón, como melanoidinas principalmente, polímeros como lactulosa- lisina o fructosa-lisina, así como ácidos de bajo peso molecular (Popov et al. 2008). La lactosa, además de participar en la reacción de Maillard, sufre otros dos cambios estructurales, inducidos por el tratamiento térmico y el almacenamiento: la 16 formación de lactulosa y la formación de ácidos orgánicos. Al calentar a bajas temperaturas la leche bajo su condición ligeramente alcalina, la glucosa de la lactosa se epimeriza a fructosa, dando origen a la formación de lactulosa, compuesto que no ocurre en la naturaleza. En procesos de HTST, la cantidad de lactulosa formada no es considerable, sin embargo, ésta incrementa durante la esterilización UHT. Por lo tanto, la concentración de lactulosa en la leche es un indicador útil de la severidad del tratamiento térmico al que se ha sometido (Fox et al. 2015). Por otro lado, la formación de ácidos ocurre por la degradación térmica de la lactosa. El ácido fórmico es el principal ácido formado, seguido por el ácido láctico el cual representa el 5% de los ácidos formados. Este proceso se potencia a condiciones superiores a los 130 °C, donde el pH puede disminuir hasta 5,8. Alrededor de la mitad del descenso de pH se debe a la formación de ácidos orgánicos a partir de la lactosa, mientras que el resto se debe a la precipitación del fosfato de calcio y a la desfosforilación de la caseína (Fox et al. 2015). 3.2.2.2 Cambios enzimáticos Según Roginski (2005), varias enzimas endógenas de la leche son destruidas por la pasteurización. La desnaturalización de las lipasas y algunas proteasas limitan la formación de mal sabor en la leche pasteurizada, lo que contribuye a extender su vida útil. En contraste, muchas lipasas y proteasas de origen bacteriano son muy resistentes al calor y no pueden ser inactivadas por pasteurización (Barrera, 2012). Las cantidades de estas enzimas que sobreviven procesos de UHT pueden ser suficientes para causar sabores desagradables, tales como amargor, sabores rancios, y en algunos casos gelificación (Fox et al. 2015). 3.2.2.3 Cambios sensoriales Los mayores cambios sensoriales en la leche se ven reflejados en el color de la misma, ya que durante su procesamiento y almacenamiento se potencian reacciones de Maillard y caramelización, dando lugar a coloraciones pardeadas. La 17 intensidad del color pardeado de la leche UHT es afectado por su composición, temperatura de homogenización, tratamiento térmico aplicado y condiciones de almacenamiento. Generalmente, los productos con mayor contenido de azúcares reductores y mayores temperaturas de procesamiento y almacenamiento, presentan mayor pardeamiento, afectando su percepción sensorial (Scott, 2008). Por otra parte, los defectos en sabor asociados a la grasa de la leche, hacen referencia a sabores rancios y oxidados. Estos sabores resultan de la acción del oxígeno en ciertos componentes de la grasa, produciendo “off flavours” que se han descrito diversamente como oxidado, aceitoso y a pescado. Así mismo, la desnaturalización de las proteínas a causa del tratamiento térmico puede desarrollar sabores amargos en la leche (Gursoy & Kinik, 2002). Sin embargo, dichos cambios de sabor y color se ven potenciados principalmente durante el almacenamiento de la leche. 3.2.3 Otras técnicas de procesamiento: filtración por membranas Otra opción para el procesamiento de leche fluida es la tecnología de filtración por membranas. Dicha tecnología se ha aplicado en la industria láctea desde principios de los años 60´s y sirve como alternativa viable para el procesamiento de los productos lácteos más tradicionales (Kumar et al. 2013). Las técnicas de separación o filtración por membrana consisten en el uso de una membrana semipermeable como filtro, a una presión determinada, para concentrar o fraccionar un líquido. En dicho proceso, la corriente líquida circula tangencial o frontal a la superficie de la barrera permeable (membrana con poros de diferente tamaño), obteniéndose el fluido filtrado (permeado) del lado opuesto al de la barrera y quedando los sólidos en la porción de la corriente líquida que no atraviesa la membrana (retenido) (Gutiérrez, 2013). Este proceso se utiliza principalmente para concentrar, purificar o fraccionar un líquido a través de un proceso de separación que se fundamenta en la permeabilidad a través de la membrana (Suarez et al.1992). Además, son sistemas de bajo consumo energético, en comparación con las técnicas para concentrar que requieren de un cambio de fase, como es el caso de la evaporación, y es una 18 tecnología más amigable con el ambiente que permite minimizar los efectos negativos del uso de altas temperaturas, como cambios de fase, desnaturalización de proteínas y cambios en las propiedades sensoriales del producto (Kumar et al. 2013). Las membranas utilizadas son de gran diversidad, tanto en forma como en materiales. En términos del material de fabricación, las membranas pueden estar constituidas por acetato de celulosa, de polímeros orgánicos (polisulfonas, propilenos, poliamidas, polisulfuros) o compuestas de sales inorgánicas (Al2O3, TiO2). De las anteriores, las membranas celulósicas tienden a ser más sensibles a la temperatura y al deterioro químico; por otro lado, las poliméricas resisten mejor a los factores anteriores, sin embargo, no soportan muy bien la compactación y los agentes clorados, a diferencia de las inorgánicas que se muestran como las más resistentes. En cuanto a la forma, pueden ser aplanadas o en forma de cartucho tubular de material permeable (Chacón, 2006) La permeabilidad de la membrana está determinada por el tamaño de poro, la afinidad química con el material y el movimiento difusivo de los componentes. De las características anteriores, el tamaño de poro de la membrana, así como la presión aplicada, determinan el tipo de proceso. La filtración tangencial por membranas se clasifica entonces en microfiltración (MF), ultrafiltración (UF), nanofiltración (NF) y ósmosis inversa (OI) (Murillo, 2013), siendo el mayor tamaño de poro y la menor presión en microfiltración y las mayores presiones y menor tamaño de poro en osmosis inversa (Smith, 2013). 3.2.3.1 Microfiltración La microfiltración es la técnica que utiliza las menores presiones y presenta un tamaño de poro capaz de permear partículas en un rango de 0,1 a 10 µm. Este tamaño de poro permite retener la mayoría de esporas, bacterias, hongos y levaduras, por lo que puede utilizarse como una técnica de pasteurización que no implica tratamiento térmico (Chacón, 2006). En la industria láctea, la microfiltración es comúnmente utilizada para la reducción de la carga bacteriana y para la estandarización de la proteína, principalmente la caseína (GEA, 2012). 19 3.2.3.2 Ultrafiltración Los procesos de ultrafiltración consisten en la separación de partículas con peso molecular desde 1000 hasta 50000 Da. En estos casos, no solo el tamaño de los poros de la membrana afecta la separación, sino también la configuración espacial de las moléculas a separar y las interacciones entre su carga eléctrica y la carga del material de la membrana (Murillo, 2013). Las presiones son mayores que en la MF, oscilando entre 1,4 y 14 bar y el tamaño de poro oscila entre 1 y 100 nm (Kumar et al. 2013). En la industria láctea, la ultrafiltración presenta un rango amplio de aplicaciones, entre ellas: estandarizar la proteína de la leche destinada a la elaboración de quesos y yogures, concentrar la proteína en leche fluida, decalcificar permeados, así como reducir el contenido de lactosa en leche (GEA, 2012). El permeado del proceso de ultrafiltración de leche se compone de lactosa y sales minerales principalmente. El mismo se puede utilizar para estandarizar la leche, ya que es un producto que proviene de la misma. Por otra parte, este permeado se puede hacer pasar por el proceso de ósmosis inversa para la obtención de un concentrado en lactosa que puede ser utilizado para la producción de lactosa en polvo (con aplicaciones en la industria farmacéutica, la alimenticia o la alimentación animal). Así mismo, el permeado derivado del proceso de ósmosis puede ser utilizado como agua de reuso para la limpieza de los equipos (Gutiérrez, 2013). Por otra parte, el retenido del proceso de UF, se caracteriza por la presencia de micelas de caseína, proteínas del suero, glóbulos de grasa, bacterias y células somáticas (Kumar et al. 2013). Debido a su composición, anteriormente se le ha buscado diferentes aplicaciones en la industria láctea, entre ellas se ha utilizado principalmente en la elaboración de quesos y yogures para la obtención de mayores rendimientos de producción. Además, se ha utilizado en la elaboración de leches enriquecidas, en la clarificación, estandarización y concentración de la leche y para la obtención de concentrados de proteína de leche en presentaciones líquidas y en polvo (Murillo, 2013). 20 3.2.3.3 Nanofiltración La nanofiltración puede considerarse como un proceso dual, donde generalmente se aplica en conjunto con la ósmosis inversa. Suele involucrar una separación en base al tamaño molecular y otra basada en la carga eléctrica, lo que en teoría permite apartar los iones monovalentes de los polivalentes. Presenta punto de corte de moléculas que rondan los 200 a 1000 Da, con tamaños de poro inferiores a 2 nm (Chacón, 2006). Con la nanofiltración es posible separar sales, azúcares simples, colorantes y aminoácidos. También permite la separación de iones monovalentes como sodio y cloruros, logrando una desmineralización parcial del suero, así como para generar leches deslactosadas (Bylund, 2003). 3.2.3.4 Ósmosis Inversa En las membranas de ósmosis inversa, la presión aplicada es suficiente para sobrepasar la presión osmótica y, por difusión, pasar de una solución menos concentrada a una más concentrada. El proceso permite un punto de corte molecular de 100 Da y utiliza presiones muy elevadas, entre 13 y 80 bar (Smith, 2013). Consiste en un proceso en el cual se da la separación únicamente del agua presente en la leche (Chacón, 2006). En la Figura 1 se muestra una comparación de las diferentes tecnologías de filtración por membranas aplicadas a la leche, según el tamaño de poro y los compuestos que retiene. 21 Figura 1. Selectividad de los diferentes procesos de membranas aplicados a la leche (adaptado de Chacón, 2006). 3.3 Vida útil de los alimentos La vida útil de un alimento se define como “el período de tiempo durante el cual el alimento se conserva apto para el consumo desde el punto de vista sanitario, manteniendo las características sensoriales, funcionales y nutricionales por encima de los límites de calidad previamente establecidos como aceptables” (Hough & Fiszman, 2005). La misma debe ser establecida por el fabricante para cada alimento o producto en particular (Carrillo & Mondragón, 2011). Una vida útil establecida inadecuadamente tanto a nivel sensorial como fisicoquímico y sanitario, puede llevar a la obtención de consumidores insatisfechos, que presenten quejas sobre el producto, lo que eventualmente puede afectar la aceptabilidad y las ventas, tanto del producto en cuestión como de productos relacionados con la marca que representa (Robertson, 2010). La vida útil de un alimento varía según factores como: la materia prima utilizada, la formulación del producto, el proceso aplicado, las condiciones sanitarias durante el proceso, el envasado, almacenamiento y distribución del producto y las prácticas de los consumidores (Carrillo & Mondragón, 2011). Así mismo, Valencia y colaboradores (2008) señalan que es importante identificar los factores específicos 22 que afectan la vida útil del producto y evaluar sus efectos individualmente y en combinación. Éstos se pueden dividir en factores intrínsecos: materia prima (composición, estructura, naturaleza), actividad de agua, pH y acidez, así como factores extrínsecos: procesamiento, higiene y manipulación, materiales y sistemas de empaque, almacenamiento, distribución y lugares de venta. Por otra parte, a nivel sensorial, la vida útil de los alimentos en estantería depende de la aceptación, al interactuar el consumidor con el alimento. Además de los factores mencionados, la velocidad de las reacciones de deterioro de los alimentos, así como la temperatura a la que el producto es expuesto, juegan papeles determinantes en su vida útil. La mayoría de las reacciones de deterioro que ocurren en los alimentos pueden clasificarse como de orden cero o de primer orden a nivel cinético y pueden emplearse para predecir el grado de deterioro de los alimentos en función de la temperatura y/o el tiempo (Robertson, 1999; Azofeifa, 2016). Las reacciones de orden cero pueden explicarse mediante la Ecuación 1 y las de primer orden mediante la Ecuación 2. Ambas ecuaciones son una función de la calidad (Q(A)) del alimento a un tiempo determinado (t) (Valentas, 1997). 𝑄(𝐴)𝑡 = 𝐴0 − 𝑘𝐴𝑡 (Ecuación 1) 𝑄(𝐴)𝑡 = ln ( 𝐴0 𝑘𝐴𝑡 ) (Ecuación 2) Donde, k = constante de la velocidad de la reacción de deterioro, A0 = calidad del alimento en el tiempo inicial y At = calidad del alimento a un tiempo determinado t. Valentas (1997) señala la calidad general de productos congelados y el pardeamiento no enzimático como reacciones de orden cero, mientras que dentro de las reacciones de primer orden señala la pérdida vitamínica, el crecimiento microbiano y la pérdida de textura durante el tratamiento térmico. Además de estas reacciones, Hough y Fiszman (2005) ubican la degradación enzimática de frutas frescas y vegetales y la oxidación de lípidos en alimentos congelados como reacciones de orden cero, y la rancidez en aceites o en alimentos deshidratados como reacciones de primer orden. 23 Por otra parte, varios autores han desarrollado ecuaciones que permiten relacionar la vida útil de los alimentos y la temperatura. El modelo de Arrhenius es uno de los modelos que mejor representa la relación entre la velocidad de reacción de deterioro de los alimentos y la temperatura; su modelo lineal se expresa en la Ecuación 3 (Hough & Fiszman, 2005). ln 𝑘 = ln 𝑘0 − 𝐸𝑎 𝑅𝑇 (Ecuación 3) Donde, k = constante de la velocidad de la reacción de deterioro, ko = constante de Arrhenius, Ea = energía de activación (Jmol-1), R = constante de gases ideales (8,314J K-1mol-1) y T = temperatura (K). Otra alternativa a la ecuación de Arrhenius es la representación de la variación de la vida útil de un alimento a dos temperaturas diferentes. Si la diferencia entre ambas temperaturas es 10°C, se cumple lo que expresa la Ecuación 4 y en la Ecuación 5, cuando la diferencia de temperaturas es diferente de 10 °C (Robertson, 1999; Azofeifa, 2016). Ambas ecuaciones utilizan el valor de Q10, el cual expresa la razón obtenida por el aumento de la velocidad de las reacciones de deterioro cuando la temperatura del sistema aumenta en 10 °C. Por ejemplo, para reacciones enzimáticas, un Q10= 2 es frecuentemente encontrado. Esto indica que la velocidad enzimática se duplica por cada 10 °C de aumento en la temperatura, hasta que ocurra la desnaturalización o inactividad de la enzima por la energía calorífica (Valentas, 1997). Q10 = θs(T) θs(T+10°C) (Ecuación 4) Q10 ∆ 10 = θs (T1) θs (T2) (Ecuación 5) Donde ϴs (T1) = vida útil a una temperatura T1, ϴs (T2) = vida útil a una temperatura T2 y Δ es la diferencia entre las temperaturas T1 y T2, donde T2 > T1. 24 3.3.1 Mecanismos de deterioro de los alimentos El deterioro de los alimentos ocurre generalmente por efecto de la combinación de los factores intrínsecos y extrínsecos mencionados anteriormente. Existen tres mecanismos básicos de deterioro de los alimentos; deterioro químico, físico y microbiológico (Kopper, 1994). 3.3.1.1 Deterioro químico El deterioro químico de los alimentos se debe a modificaciones en sus componentes principales como resultado de una serie de reacciones enzimáticas y no enzimáticas. Dentro de las reacciones catalizadas por enzimas se tiene: la aparición de sabores rancios en el alimento por la hidrólisis de las grasas, la modificación de sabor y valor nutricional a raíz de la proteólisis, cambios de color debido al pardeamiento enzimático, así como disminución del valor nutritivo por degradación de pigmentos (Carrillo & Reyes, 2013). Por otra parte, las grasas sufren reacciones químicas de origen no enzimático, conocidas como rancidez oxidativa, donde se da la formación y liberación de peróxidos por exposición de las grasas al oxígeno, la luz y los metales (Carrillo & Reyes, 2013). Estas reacciones potencian sabores rancios en los alimentos, característicos del deterioro, así como pérdidas vitamínicas y de color (Robertson, 2010). Así mismo, las reacciones de pardeamiento no enzimático (reacción de Maillard y caramelización de los carbohidratos) generan pigmentos pardos y modifican el olor y sabor del alimento (Kopper, 1994). 3.3.1.2 Deterioro físico Los cambios físicos en el alimento generalmente ocurren durante el almacenamiento y distribución. Algunos de los cambios físicos de deterioro en los alimentos son:  Modificación en textura: ocurre por golpes o vibraciones durante el almacenamiento y distribución, así como por técnicas de conservación como lo es la congelación o la aplicación de altas temperaturas. La congelación 25 provoca daños irreversibles en la estructura celular que dan lugar a texturas suaves y blandas. Así mismo, la aplicación de altas temperaturas, como en el caso de la deshidratación, puede causar encogimiento del tejido, suavizamiento y pérdida de crujencia (Valentas, 1997).  Ganancia o pérdida de humedad: debido a las condiciones de almacenamiento, un alimento puede ganar o perder humedad, lo cual en ambos casos puede ser adverso para la pérdida de la calidad. Por ejemplo, en polvos para elaborar bebidas, leches en polvo o recubrimiento de dulces, una ganancia de humedad genera problemas de solubilización y aglutamiento (Carrillo & Reyes, 2013).  Marchitamiento: es provocado por la pérdida de humedad que se da en el proceso de transpiración de los vegetales (hojas, frutas y verduras), lo que se refleja en una pérdida de turgencia y brillo (Kopper, 1994). 3.3.1.3 Deterioro microbiológico Diversos factores contribuyen a la presencia de microorganismos en los alimentos siendo la presencia endógena y las contaminaciones cruzadas las fuentes más comunes. Algunos microorganismos son los responsables del deterioro de gran parte de los alimentos, mientras que otros, los patógenos, tienen un papel muy importante en las enfermedades de origen alimentario al ser los principales causantes de las mismas. Por las razones anteriores, el control del deterioro microbiológico es estricto y siempre debe ser considerado al determinar la vida útil de un alimento (Valentas, 1997). Entre los grupos de microorganismos que pueden desarrollarse en un alimento se encuentran: bacterias y hongos, los cuales son capaces de multiplicarse en los alimentos y deteriorar el producto; parásitos y virus, qué, aunque no se desarrollan en los alimentos, utilizan éstos como vehículo. Estos microorganismos generalmente ocasionan cambios en el sabor, textura, apariencia visual y olor de los alimentos (Carrillo & Reyes, 2013). El valor Aw puede limitar el crecimiento de los microorganismos, y por lo general cuando éste se reduce, la velocidad de crecimiento de los microorganismos 26 se ve disminuida igualmente. Otros factores que afectan el crecimiento de los microorganismos son: el potencial nutritivo del alimento, el pH y la presencia de compuestos antimicrobianos (Robertson, 2010; Azofeifa, 2016). 3.3.2 Determinación de vida útil de los alimentos Los métodos utilizados para determinar la vida útil de un alimento generalmente se basan en una combinación de análisis subjetivos y objetivos. Las medidas subjetivas determinan el momento en que un consumidor en particular detecta algún cambio en el alimento, mientras que las mediciones objetivas identifican el tiempo en el cual la medición de un parámetro alcanza un valor determinado. Frecuentemente, las mediciones subjetivas y objetivas se correlacionan para evaluar la vida útil de cada alimento en específico (Reid et al. 2003; Ledezma, 2013). En algunas ocasiones se tiende a confundir los estudios de vida útil y los estudios de estabilidad. En un estudio de vida útil, el principal interés es definir la vida útil del producto, mientras que, en los estudios de estabilidad, lo principal es la evolución de una o varias características del producto a lo largo del tiempo (Robertson, 2010; Azofeifa, 2016). En ambos casos, se debe tener conocimiento previo y total del producto a evaluar, incluyendo aspectos de componentes, procesamiento y almacenamiento, así como conocer y determinar parámetros relacionados al estudio, incluyendo tiempos de muestreo, temperaturas de almacenamiento, características a evaluar, cantidad de muestra y técnica del estudio (Giraldo, 1999). De las características anteriores, es importante la determinación del número de muestras, ya que el estudio se realiza hasta lograr un deterioro apreciable en las muestras, por lo que las mismas deben ser suficientes. Así mismo, el diseño y preparación de dichas muestras es un factor crítico. Existen dos tipos de diseño aplicables a los estudios, ya sea de vida útil o de estabilidad (Araya, 2012):  Diseño básico: consiste en almacenar un único lote de muestras en las condiciones seleccionadas e ir haciendo muestreos en los tiempos prefijados. 27 Este método presenta la ventaja de preparar todas las muestras una única vez, sin embargo, puede ser un factor limitante ya que cada tiempo de muestreo requiere de análisis individuales.  Diseño escalonado: consiste en almacenar diferentes lotes de producción en las condiciones seleccionadas a diferentes tiempos, de forma que se logre obtener en un mismo día todas las muestras con los diferentes grados de deterioro y en ese día analizarlas. Este método repercute en una ventaja al reunir todas las muestras el mismo día, sin embargo, puede presentar la limitación de que se requieren varias producciones. Tanto los estudios de vida útil como los estudios de estabilidad corresponden a estudios de almacenamiento, donde el tipo de alimento a evaluar determina la técnica empleada. Para alimentos frescos, o cuya vida útil es menor a los 6 meses, generalmente se realizan estudios bajo condiciones normales de almacenamiento, mientras que, para productos estables como los térmicamente procesados, se realizan estudios de almacenamiento acelerados (Mercado et al. 2016). 3.3.2.1 Estudios de almacenamiento acelerados Los estudios de almacenamiento acelerados permiten obtener información en tiempos relativamente cortos; y consisten en incubar el alimento bajo condiciones controladas y a diferentes temperaturas. Estas temperaturas, en general, deben ser mayores a las de almacenamiento y comercialización para permitir que las reacciones de deterioro se aceleren y se obtenga una respuesta en períodos más cortos (Rodríguez, 2004). En estos casos, la temperatura, además de ser uno de los factores más críticos que afecta las reacciones cinéticas en los alimentos, es el factor que presenta más bases teóricas disponibles para el desarrollo matemático sobre su efecto en la tasa de pérdida de calidad de los alimentos. Por esta razón, los estudios acelerados se basan en el modelo de Arrhenius descrito anteriormente en la Ecuación 3 (Ledezma, 2013) 28 El diseño de un estudio de almacenamiento acelerado, requiere de conocimientos de todas las disciplinas relacionadas con los alimentos. De manera general, pueden seguirse los siguientes pasos (Valentas, 1997): 1. Evaluar los factores de seguridad microbiológica del producto en estudio, de manera que el mismo no presente un riesgo para la salud en caso de utilizar técnicas sensoriales de evaluación. 2. Realizar pruebas preliminares y revisión bibliográfica que fundamente las condiciones de almacenamiento a utilizar y su durabilidad, así como las variables que serán cuantificadas u observadas y su límite de aceptabilidad. 3. Seleccionar el empaque del producto. Productos procesados térmicamente, congelados y acidificados pueden ser almacenados en el empaque actual del producto, mientas que productos secos deben ser almacenados en envases sellados bajo condiciones específicas de humedad y Aw. 4. Definir las temperaturas de almacenamiento, donde se deben tomar en consideración las condiciones del Cuadro III. Cuadro III. Temperaturas de almacenamiento recomendadas para estudios de vida útil acelerados, según el producto (adaptado de Kopper, 1994; Valentas, 1997; Robertson, 2010). Productos Temperatura de almacenamiento (°C) Temperatura control (°C) Deshidratados 25, 30, 35, 40, 45 -18 Enlatados o procesados térmicamente 25, 30, 35, 40 5 Refrigerados -2, 0, 4, 8, 10, 15 -20 Congelados -5, -10, -15 -40 5. Para cada temperatura de almacenamiento, calcular la durabilidad del estudio según valores de Q10 reportados y/o pruebas preliminares. Para 29 productos donde los valores de Q10 se desconocen, se recomiendan mínimo tres temperaturas de almacenamiento. 6. Definir la frecuencia de muestreo para cada temperatura, la cual va a depender de la temperatura de almacenamiento y viene dada por la Ecuación 6. 𝑓2 = 𝑓1 ∗ 𝑄10 ∆𝑇 10 (Ecuación 6) Donde, f1 = frecuencia a la temperatura alta T1, f2 = frecuencia a la temperatura baja T2 y ΔT = T1-T2. Al calcular la frecuencia, se debe tomar en cuenta que se requieren mínimo 6 puntos de muestreo para disminuir errores estadísticos; en cuyo caso de tener menos de 6 puntos, el nivel de confianza estadística se ve reducido significativamente. 7. Realizar el análisis de los datos, mediante la construcción del gráfico del Pseudo ploteo de Arrhenius. Éste consiste en graficar el logaritmo de la vida útil determinada a cada temperatura de almacenamiento con respecto a la temperatura y el valor Q10 se obtiene de la pendiente, como se observa en la Figura 2. Así mismo, se pueden realizar regresiones lineales para cada variable en estudio en función del tiempo, de manera que se evalúe su estabilidad. A partir de estas regresiones, suele determinarse la variable crítica del deterioro, siendo ésta la que presente cambios significativos en el tiempo y por ende arroje el menor tiempo de vida útil. 30 Figura 2. Pseudo ploteo del modelo de Arrhenius. 8. Extrapolar los tiempos de vida útil a la temperatura de interés para el producto, haciendo uso del gráfico del Pseudo ploteo de Arrhenius. Durante el estudio, la medición o cuantificación de variables de interés puede realizarse mediante métodos instrumentales o sensoriales. Comúnmente se realiza mediante evaluación sensorial, ya que las características sensoriales del producto son las variables que determinan la aceptabilidad por parte del consumidor y permiten observar la preferencia, aceptación y el grado de satisfacción de los consumidores. Estos resultados se vuelven aún más útiles cuando se acompañan de mediciones instrumentales y cuando se logra encontrar una correlación de los datos (Sánchez & Pérez, 2016). Las técnicas de evaluación sensorial, para la determinación de la vida útil de un producto, incluyen panelistas entrenados o con experiencia, análisis descriptivos, además de pruebas de aceptación con consumidores regulares del producto en evaluación empleando escalas hedónicas. Para estas últimas se recomienda reclutar al menos 100 consumidores (Hough & Fiszman, 2005; Azofeifa, 2016). En dichas técnicas suele utilizarse el método de análisis estadístico de supervivencia. El uso de este método para estudiar la vida útil consiste en enfocar la estimación de la vida útil en el rechazo del producto por los consumidores. Se utiliza la función de rechazo F(t), definida como la probabilidad de que un 31 consumidor rechace un producto almacenado antes del tiempo t. El riesgo no se enfoca sobre el deterioro del producto, sino sobre el rechazo del consumidor hacia el producto. Se debe tener en cuenta que el momento en que un consumidor rechaza el producto depende de los tiempos de almacenamiento en que éste prueba el producto, sin embargo, el tiempo t hasta que se produce el rechazo no se observa con exactitud, dando lugar a los llamados tiempos censurados (Sánchez & Pérez, 2016). En la Figura 3, se observa un ejemplo del método de análisis de supervivencia (Hough & Fiszman, 2005; Azofeifa, 2016). Figura 3. Porcentaje de rechazo en función del tiempo de almacenamiento utilizando análisis estadístico de supervivencia. Así mismo, puede utilizarse la metodología de punto de corte, la cual consiste en la correlación de dos variables que van a limitar la vida útil de un producto. Para ello, generalmente se utilizan jueces entrenados, los cuales se encargan de evaluar de forma analítica las variables de deterioro de interés, mientras que, un panel de consumidores evalúa la aceptabilidad del producto y permite entonces conocer cuál es el valor de dichas características que limita la vida útil (Hough & Fiszman, 2005). Además, se debe fijar un límite de aceptabilidad, el cual de acuerdo con Hough (2010), es elegido por el investigador de forma arbitraria de acuerdo con la escala empleada, o bien corresponde a calificaciones por debajo del punto medio de la escala (Valentas, 1997). Dicho límite de aceptabilidad se utiliza entonces para interceptar la recta de correlación y con ello determinar el punto de corte de las 32 variables de interés. En la Figura 4, se observa un ejemplo de la metodología descrita (Hough, 2010; Azofeifa, 2016). Figura 4. Gráfico para la determinación del punto de corte. 3.3.3 Vida útil de la leche La vida útil de la leche pasteurizada se encuentra estrechamente relacionada con la calidad de la leche cruda utilizada, así como es dependiente de las condiciones de procesamiento, las cuales deben ser óptimas desde el punto de vista higiénico y técnico. La leche pasteurizada por métodos tradicionales presenta una vida útil de 5 a 7 días bajo condiciones de refrigeración o bien de 7-28 días cuando se aplica pasteurización HTST. Por otra parte, la vida útil de la leche UHT se extiende, al ser un producto con esterilidad comercial (Barrera, 2012). En el Cuadro IV, se presenta la vida útil de diferentes leches UHT a temperatura ambiente. 33 Cuadro IV. Vida útil (meses) de diferentes leches comerciales UHT a temperatura ambiente. Leche UHT comercial Vida útil (meses)1 Entera 3,5 % grasa (1 L) 8 Entera 3,5 % grasa (450 y 750 mL) 3 Descremada 0 % grasa (250 mL y 1 L) 8 Semidescremada 1 % grasa (1 L) 8 Semidescremada 2 % grasa (1 L) 8 Deslactosada 3% grasa (1 L) 6 1SOP, 2018. 3.3.3.1 Factores que afectan la vida útil de la leche UHT  Calidad de la leche cruda inicial La calidad de la leche cruda inicial se considera uno de los factores más determinantes de la vida útil de la misma. Esta se expresa como la cantidad de bacterias por mililitro de leche y va a determinar las condiciones necesarias de procesamiento. Los tratamientos térmicos se encuentran diseñados para reducir la carga microbiana a un nivel aceptable en términos de inocuidad. Sin embargo, si la calidad de la materia prima es mala, repercute en la eficiencia del tratamiento térmico y por ende en la vida útil de la leche (Barrera, 2012). Además, el recuento de células somáticas también es tomado en cuenta por las industrias lecheras como un indicador de calidad higiénica ya refleja el estado de salud de la ubre del animal. La influencia del recuento de células somáticas en la leche cruda sobre la calidad de la leche fluida pasteurizada es causada por el aumento de niveles de proteasas y lipasas termoestables originarias de la vaca con altos recuentos de células somáticas (Barrera, 2012).  Actividad enzimática residual y termorresistencia La actividad enzimática residual se debe a la presencia de proteasas y lipasas de origen tanto endógeno como exógeno. Algunos autores han descrito la 34 termorresistencia de las proteasas nativas de la leche; por ejemplo, la termorresistencia de la plasmina y especialmente su precursor que es el plasminógeno. Por otra parte, el componente exógeno lo conforman enzimas tales como proteasas y lipasas, secretadas por bacterias psicotrópicas. Estas bacterias se ven favorecidas en su desarrollo por las condiciones de almacenamiento refrigerado previo a los tratamientos térmicos de alta temperatura en la industria. Las proteasas y lipasas de origen bacteriano presentan una marcada termorresistencia frente a tratamientos térmicos a temperaturas elevadas y pueden deteriorar finalmente el producto, manifestándose en olores y sabores desagradables, producto de la hidrólisis de la materia grasa, y pérdida de textura (apariencia mucilaginosa) producto de la acción proteolítica (Simpson et al. 2000).  pH Los valores normales de pH de la leche son 6,5 – 6,7; dentro de dicho rango la leche es bastante estable en los procesos de elaboración. Sin embargo, la disminución del pH a raíz del deterioro microbiológico o debido a la formación de ácidos orgánicos por degradación de la lactosa, así como por desfosforilación de la caseína, facilitan la agrupación de los glóbulos de grasa y de las micelas de caseína, perjudicando su vida útil, al ocasionar cambios sensoriales que pueden ser detectados por los consumidores (Huamani, 2012).  La temperatura de almacenamiento y distribución La temperatura de almacenamiento y distribución de la leche juegan un papel determinante en su vida útil. Ha sido demostrado que un aumento de 5 °C podría disminuir hasta la mitad la vida útil de un producto. La relación de la temperatura y la vida útil fue detallada en la sección 3, mediante el valor de Q10 y el modelo matemático propuesto por Arrhenius. A pesar de que los alimentos obtenidos por sistemas asépticos, como es el caso de la leche UHT, son estables a temperatura ambiente, su almacenamiento en ambientes frescos o refrigerados, fuera de la exposición solar, se consideran una buena opción para alargar la vida útil de estos 35 productos. Autores sugieren, por tanto, que 18 °C sea considerado como la temperatura máxima de almacenamiento de la leche UHT, sin embargo, en países tropicales, el producto comercializado llega a temperaturas superiores al valor mencionado (Huamani, 2012).  Barrera del envase al oxígeno y la luz El tamaño y formato del envase del producto interfieren en su vida útil y estabilidad. A medida que el tamaño del envase aumenta, la relación área/volumen disminuye y por ende más protector se torna el envase. Así mismo, envases con barreras fuertes frente a la luz y a la permeabilidad del oxígeno, protegen al producto frente a cambios oxidativos (Huamani, 2012). 3.3.3.2 Modificaciones fisicoquímicas y sensoriales de la leche UHT durante el almacenamiento Problemas tales como separación de la grasa, la desnaturalización de proteínas junto a la gelificación, pérdida de nutrientes, pardeamiento y aparición de sabores desagradables son los principales defectos de la leche UHT causados por almacenamiento por un tiempo prolongado. La mayoría de estos efectos surgen a raíz del tratamiento térmico y se potencian durante la vida en anaquel de la leche (Becerra, 2014). De los defectos mencionados, los relacionados a la aceptación sensorial se consideran como los factores limitantes de la vida útil de la leche. Dentro de éstos se encuentra la aparición de sabores ajenos, donde el sabor a cocido es el más característico de leches tratadas térmicamente. En los primeros meses de vida en anaquel este sabor se percibe, sin embargo, durante el almacenamiento prolongado la intensidad de este sabor se ve reducida y otros sabores se tornan evidentes. Después del almacenamiento prolongado, el sabor “rancio” producto de reacciones de oxidación de la grasa aparece y limita la aceptación del producto, así mismo se percibe el sabor “amargo” relacionado con la desnaturalización de las 36 proteínas. Ambos sabores se encuentran también asociados a la presencia de proteasas y lipasas termorresistentes (Huamani, 2012). En leches descremadas, el sabor rancio no es un factor limitante, ya que, al disminuir el contenido de materia grasa, las reacciones oxidativas se ven opacadas. Por otra parte, en leches deslactosadas se han descrito sabores dulces/ caramelizados que se potencian durante el almacenamiento. En estas leches, a raíz de la hidrólisis de la lactosa y de su participación en la reacción de Maillard, se han descrito tonalidades oscuras, producto del pardeamiento, que limitan la vida en anaquel (Becerra, 2014). Varios autores han estudiado las características sensoriales de la leche UHT durante su vida útil. Chapman y colaboradores (2001) desarrollaron términos descriptivos sensoriales para leche UHT durante almacenamiento y se describieron principalmente como “aroma a cocido” y “sabor a cocido”. Así mismo, Clare y colaboradores (2005) utilizaron “sabor a cocido / caramelizado”, “dulce aromático”, “graso / rancio”, “sabor dulce”, “sabor amargo” e “intensidad de color” para diferenciar leches UHT por tratamiento indirecto y microondas. Por otra parte, la desnaturalización de las proteínas se ha asociado al desarrollo de “off-flavours”, gelatinización, aumento de viscosidad, formación de sedimento, pérdida de valor nutricional y oscurecimiento durante el almacenamiento de leches UHT. Dichos cambios asociados a la proteólisis pueden ser monitoreadas en las etapas de almacenamiento por la liberación de glicomacropéptido (GMP), como indicador de índice proteolítico, así como por la evaluación de la viscosidad y la sedimentación de la leche. Las características de viscosidad y consistencia son críticas, al determinar la aceptación o no por parte del consumidor, mientras que la sedimentación o agregación de las proteínas se va a ver favorecida por la disminución leve del pH, aumentando considerablemente cuando el pH disminuye de 6,6 (Huamani, 2012). Estos cambios generan modificaciones en la apariencia de la leche, en su sabor y de textura. La textura es caracterizada por cambios de viscosidad en la leche, conduciendo en algunos casos a la formación de gel y/o a la precipitación o agregación. Además, las proteínas participan en la reacción de Maillard durante el 37 almacenamiento, ocasionando el subsecuente oscurecimiento de la leche, afectando la aceptación general del producto (Huamani, 2012). 3.4 Oferta en el mercado: bebidas altas en proteína En la actualidad, la salud es una de las principales razones que determinan la elección de los alimentos por parte de los consumidores conscientes de los efectos potenciales de la dieta sobre la prevención de enfermedades y bienestar (Bogue & Ritson, 2000). Según Zegler (2018), las tendencias de consumo de alimentos y bebidas en el 2018, reforzarán la necesidad de contar con una variedad de alimentos que aporten a los consumidores soluciones positivas y flexibles de salud y bienestar. Esto crea oportunidades de mercado para una variedad de formulaciones, formatos y tamaños de alimentos y bebidas que brinden a los consumidores beneficios emocionales, físicos y nutricionales. Además, existe un interés creciente por parte de los consumidores por los alimentos ricos en proteínas, por lo que el desarrollo de productos con proteína de alto valor biológico toma mayor importancia en el mercado (Zegler, 2018). El IFT (Institute of Food Technology) resalta que especialmente los consumidores entre los 18 y 35 años y por encima de los 65 años, son los consumidores más conscientes en la búsqueda de alimentos con altas fuentes de proteína (Martínez, 2016). Adicionalmente, las tendencias de alimentación y bebidas del 2017 (Mintel, 2017), establecen que los consumidores actuales buscan alimentos que ofrezcan salud y bienestar, de manera que se emplean en la búsqueda de alimentos con alto contenido de proteína y bajo contenido calórico. Lo anterior se ve reflejado en los datos consultados de Innova Market Insights, donde se establece que el 3% de los nuevos lanzamientos de alimentos y bebidas a nivel mundial (el 6% en Estados Unidos) en el 2017, se comercializaron bajo el claim "alto contenido de proteínas" o posicionándose como "fuente de proteínas” (Martínez, 2016). La leche de vaca proporciona una gran cantidad de proteínas fácilmente digeribles y de alto valor biológico, ya que aportan los aminoácidos, incluidos los 38 esenciales, para cubrir los requerimientos humanos. Por la razón anterior, los concentrados de proteína de leche (Milk Protein Concentrate; MPC por sus siglas en inglés) y los concentrados de proteína de suero de leche (Whey Protein Concentrate; WPC por sus siglas en inglés) han sido ampliamente utilizados para el desarrollo de productos altos en proteína (Fernández et al. 2015). En el Cuadro V se detallan algunas bebidas altas en proteína que se ofrecen en el mercado latinoamericano. Cuadro V. Descripción de bebidas altas en proteína del mercado. Producto Imagen del producto Descripción Ensure High Protein Bebida láctea con sabores fresa, vainilla y chocolate a base de concentrado de proteína de leche y otros ingredientes. Se declara como producto alto en proteína al contener 16 gramos de proteína por porción de 235 mL. Leche LALA 100 Aporta 70% más de proteínas naturales de la leche, así como 30% más de calcio. Tres versiones del producto, incluyendo versiones descremadas y sin lactosa. Muscle Milk Bebida alta en proteína, aportando 40 gramos por porción de 414 mL. Sabores vainilla, cookies and cream, chocolate y banano. Contiene proteínas de suero lácteo y otros ingredientes. 39 GNC Lean Shake Bebida a base de concentrado de proteínas de leche y de suero de leche. Aporta 25 gramos de proteínas por porción de 414 mL, además de 8 gramos de fibra. Presentación en diferentes sabores. Nesquik Protein Plus Bebida láctea a base de leche, concentrado de proteínas de leche y otros ingredientes. Aporta 23 gramos de proteína por porción de 414 mL, con sabores a vainilla y chocolate. Arla Milk Drink Bebida láctea a base de leche y concentrado de proteínas de suero de leche. Aporta 5,5 gramos de proteína por porción de 100 mL. Presentación en diferentes sabores. UFit Producto elaborado a base de concentrado de proteína de leche y otros ingredientes. Aporta 22 gramos de proteína por porción de 310 mL. Fa!rlife Milk Leche ultrafiltrada alta en proteína, aportando 13 gramos de proteína por porción de 250 mL. Diferentes sabores y presentación, incluyendo descremada y libre de lactosa. 40 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Localización del proyecto El proyecto se llevó a cabo en las instalaciones del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA) y la Escuela de Tecnología de Alimentos (ETA), Campus Rodrigo Facio de la Universidad de Costa Rica, ubicadas en San Pedro de Montes de Oca. Los análisis fisicoquímicos y sensoriales se realizaron en los Laboratorios de Química y Análisis Sensorial de la ETA y del CITA. Además, se hizo uso de las instalaciones de la empresa solicitante en donde se realizó la caracterización fisicoquímica, las pruebas a nivel piloto y la producción industrial. Los análisis fisicoquímicos (humedad, proteína, grasa, lactosa, calcio y acidez) se realizaron en el Laboratorio de Química de la empresa. 4.2 Materia prima La materia prima para la realización del proyecto fue financiada y suministrada por la empresa que financió el proyecto. La materia prima suministrada consistió en el retenido de la operación de ultrafiltración de leche descremada y pasteurizada, ajustado a un 50% más de proteína respecto al contenido promedio de proteína en leche. A la materia prima se le realizó, como análisis microbiológico de rutina, un recuento total por medio de la técnica de campo visual y un conteo de células somáticas. 4.3 Definición del prototipo de producto a elaborar La definición del prototipo a elaborar dependió de la caracterización fisicoquímica del retenido, los requisitos de la empresa y la revisión bibliográfica en relación a productos del mercado y normativa vigente. 4.3.1 Caracterización fisicoquímica Para la definición del prototipo a elaborar, se realizó una caracterización fisicoquímica del retenido de la operación de ultrafiltración de leche, descremada y pasteurizada, ajustado a 50 % más de proteína en comparación con el valor 41 promedio de proteína en leche. Se trabajaron tres lotes de materia prima, a los cuales se les realizó un análisis proximal en el cual se determinaron los siguientes parámetros: - Contenido de humedad (%) - Contenido de proteína (%) - Contenido de grasa (%) - Contenido de lactosa (%) - Contenido de minerales (calcio; mg) Además del análisis proximal, se determinaron las siguientes propiedades fisicoquímicas: - Acidez - Color (parámetros L*, a* y b*) - pH La metodología utilizada para cada análisis se muestra en el apartado 4.6 Métodos de Análisis. Para cada parámetro en estudio, se tomaron tres muestras por lote y se procedió a realizar la determinación. Posteriormente, se calculó la media de la determinación con su respectivo intervalo de confianza. A continuación, se presenta un esquema de la metodología descrita. Figura 5. Esquema de la metodología descrita para la caracterización fisicoquímica de la materia prima. 42 4.3.2 Requisitos de la empresa Los requisitos definidos por parte de la empresa para la definición del prototipo a desarrollar fueron los siguientes: - Tipo de producto: Bebida láctea - Características del producto: Estable a temperatura ambiente (UHT) - Valor nutricional del producto: o 50% más de proteína con respecto al contenido promedio de proteína en leche o Descremado o Deslactosado Con los resultados anteriores, se procedió a definir la formulación del prototipo de producto a elaborar. Además, a partir de la revisión bibliográfica sobre productos similares en el mercado y la consulta a la normativa vigente respecto a productos lácteos, se procedió a especificar el prototipo elaborado: la composición teórica nutricional, características físicas y sensoriales esperadas, clasificación o definición según la normativa y a la verificación y aprobación por parte de la empresa. Por limitaciones de insumos por parte de la empresa que financió el proyecto, el prototipo elaborado para las pruebas piloto no fue deslactosado, sin embargo, este requisito sí se cumplió para el prototipo elaborado en la producción industrial. 4.4 Evaluación del efecto del tratamiento térmico UHT sobre las características fisicoquímicas y sensoriales del prototipo elaborado 4.4.1 Descripción del proceso Una vez definido el prototipo, se procedió a elaborar el mismo y realizar la evaluación del efecto del tratamiento térmico UHT sobre sus características fisicoquímicas y sensoriales. Para ello, se realizaron pruebas a nivel piloto, para tres lotes de prototipo (retenido descremado y pasteurizado, ajustado a 4,8 % proteína), de manera que se obtuvieron muestras control (sin tratamiento UHT; únicamente fueron sometidas a pasteurización tradicional por lote a 63 °C por 30 minutos) y 43 muestras procesadas (muestras UHT), a las cuales se les realizó la determinación de color, acidez, pH y variables sensoriales