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Diferentes especies de Acanthamoeba (ahora agrupadas en 18 genotipos(7)) y la única especie reportada del género Balamuthia (B. mandrillaris) son causantes de la encefalitis granulomatosa amebiana (GAE, por sus siglas en inglés), infectando ésta última tanto inidividuos inmunosupresos como inmunocompetes(6). A la fecha, más de 200 casos de encefalitis por Balamuthia han sido reportados a nivel mundial, la mayoría de éstos en América Latina y Estados Unidos(5,8): 55 casos se han reportado en Perú, 4 casos en Argentina, 4 casos en México, 1 caso en Brasil y 1 caso en Venezuela, sin reporte alguno de casos en América Central. Además de la afección a sistema nervioso central, B. mandrillaris puede afectar piel, pulmones y riñones de seres humanos y animales(5,9). Los aislamientos a partir de lesiones en piel son cada vez más frecuentes, considerándose ésta como una de las principales puertas de entrada al organismo. Después de un periodo variable de tiempo (que va desde algunos meses hasta años), la infección podría progresar, generando un cuadro de encefalitis que en la mayoría de los casos es mortal(5). A nivel de laboratorio, el diagnóstico de esta especie es difícil de realizar. La biopsia de tejido cerebral o de piel son las muestras requeridas para realizar el diagnóstico clínico. La observación de las amebas en cortes teñidos con hematoxilina eosina constituye el procedimiento más empleado en el laboratorio clínico. A diferencia de otras especies de AVL, B. mandrillaris es difícil de cultivar y requiere de medios de cultivo especiales y un tiempo de incubación mucho más prolongado debido al largo tiempo de generación que caracteriza a la ameba. Algunos laboratorios recomiendan el empleo de cultivos celulares, técnica que, sin embargo, se utiliza poco debido al crecimiento de hongos, bacterias y otros protistas contaminantes. Recientemente fue diseñada una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de género(8), que puede ser empleada tanto con muestras ambientales (como suelos y polvo)(3,4,5,6) como clínicas (tejido cerebral y algunas veces líquido cefalorraquídeo, aunque es raro el hallazgo de formas a partir de esta última muestra)(9,10,11,12,13). En la literatura existen reportes previos sobre el recolectadas de diferentes puntos de las unidades combinadas de emergencia(14,15,16). De acuerdo a estos estudios, la presencia de AVL potencialmente patógenas en estos dispositivos, podría provocar infecciones severas cuando son utilizadas por un individuo que presente trauma o lesión a nivel de ojo o piel. Las unidades combinadas de emergencia son sitios donde es común el aislamiento de estas amebas, debido a que acumulan mucho polvo, humedad y generalmente, los sitios donde son instaladas a menudo no cuentan con un protocolo de limpieza continuo para las mismas. En este trabajo se informa sobre el primer aislamiento de B. mandrillaris en el polvo de una unidad combinada de emergencia en Costa Rica. La publicación de este aislamiento es importante debido a que, además de ser la primera vez que se informa sobre la presencia de esta especie en el país, éste corresponde al quinto aislamiento de B. mandrillaris nivel mundial a partir de una muestra ambiental. Se recolectaron 24 muestras de polvo y 12 muestras de agua de cabezales de ducha, cabezales de lava ojos y reservorios de 12 unidades combinadas de emergencia (Figura 1)(17), localizadas en la Universidad de Costa Rica. Las muestras fueron colectadas con torundas y pipetas pasteur estériles, respectivamente. Las torundas estériles se sumergieron y lavaron en 3 mL de solución Page estéril. Posteriormente, cada muestra se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y aproximadamente 200 µL del sedimento se inocularon en placas de agar no nutritivo al 1,5% suplementadas con Escherichia coli. Las placas se incubaron a 30 °C durante 7 días y posteriormente a temperatura ambiente durante más de 3 semanas. La presencia de AVL se observó con un microscopio basó en la observación de las formas y apariencia de los trofozoítos y tipo de pseudópodos emitidos(18). Para la extracción de ADN se empleó el método descrito por Reyes-Batlle et al(19) . La concentración de ADN extraído se determinó utilizando un espectrofotómetro del gen 16S ADNr de B. mandrillaris según método descrito por Niyyati et al(6). Los primers empleados fueron F-Balspec16S y R-Balspec 16S. Como controles positivos se utilizaron la cepa ID-19 de Balamuthia strain ID-19 y la cepa ATCC Balamuthia mandrillaris CDC:V451 (ATCC PRA-291), como control negativo se utilizó agua destilada. Alemania), y se secuenciaron en ambas direcciones. La secuenciación se realizó en el secuenciador automático MegaBACE 1000 (Healthcare Biosciences, España) Las secuencias se editaron y alinearon usando el software Mega 5.0(20). Trofozoítos de aproximadamente 25 a 30 µm, y de movimiento muy lento, se observaron dentro de la capa de agar, aislados a partir de una muestra de polvo. Las características morfológicas observadas fueron similares a las descritas para el género Balamuthia(18). B. mandrillaris (Figura 2). El análisis de la secuencia obtenida y la comparación con las secuencias disponibles de otros aislamientos de B. mandrillaris en el GenBank reveló un 97% de homología entre las secuencias. B. mandrillaris en Costa Rica, es la segunda vez a nivel mundial donde se realiza el aislamiento a partir de una muestra de polvo y constituye el quinto aislamiento a partir de muestras ambientales. Cabe anotar que, a pesar de que el aislamiento de esta especie se ha realizado en diferentes países(4,5,6), solamente en un caso se logró asociar la presencia la ameba con la muerte de un niño por un cuadro a nivel de SNC(3). El hallazgo de esta ameba a partir de una muestra de polvo indica que posiblemente el riesgo de una infección por este agente no se limita al contacto con el suelo(6), aspecto que debe ser considerado cuando se estudia la epidemiología de este agente infeccioso. A pesar de que el aislamiento de esta especie en Costa Rica no se ha ligado a ningún caso clínico, su hallazgo advierte la necesidad de contar con un protocolo de limpieza y mantenimiento adecuado de unidades como las analizadas en este estudio. Además del potencial riesgo que podría representar la presencia de B. mandrillaris en este tipo de equipos de bioseguridad, hay que anotar la posibilidad del aislamiento de otras amebas de vida libre reportadas con mayor frecuencia en la naturaleza, como es el caso de los genotipos del género Acanthamoeba. Algunas investigaciones reportan la presencia de los miembros de este género hasta en el 48% de las muestras recolectadas(15). En el caso del aislamiento de estos organismos, es importante realizar pruebas adicionales que evalúen el potencial patogénico de los mismos, ya que algunos genotipos son considerados no patógenos para el ser humano y animales. mantenimiento adecuado y la realización de pruebas agentes, no solo en sitios que cuenten con unidades combinadas de emergencia, sino en lugares con piscinas, unidades dentales, unidades de aire acondicionado, unidades de diálisis y otros dispositivos médicos y de laboratorio. En estos sitios ya ha sido reportada la presencia de AVL(21,22), por lo que podrían ser fuentes de infección para el ser humano, no solo porque las amebas pueden ser patógenas por sí mismas, sino porque además podrían funcionar como transportadores de bacterias como Pseudomonas sp., Legionella pneumophila, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Chlamydia pneumoniae y Mycobacterium avium, entre otras(15,23). A pesar de que se reporta un número relativamente bajo de infecciones por B. mandrillaris, se considera que la frecuencia del reporte de los casos está Figura 2. Producto de la PCR para B. mandrillaris, aislada a partir de una muestra de polvo. M: marcador de peso molecular, Mu: muestra, CN: control negativo, 1-2: controles positivos (Balamuthia strain ID-19 y Balamuthia mandrillaris CDC:V451) Diagrama de una unidad combinada de emergencia(17) M Mu CN 1 2 Revista del Colegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de Costa Rica ISSN: 2215-3713Revista del Colegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de Costa Rica ISSN: 2215-3713 Applied and Environmental Microbiology. 1991; 57: 163- 167. 16. Trabelsi H., Dendana F., Sellami A., Cheikhrouhou F., Neji S., Makni F., and Ayadi A. Pathogenic free-living amoebae: Epidemiology and Clinical review. Pathologie Biologie. 2012; 60: 399-405. internet: http://www.paritarios.cl/especial_duchas_de_ emergencia.htm. 18. Visvesvara G.S., Moura H., Schuster F.L. Pathogenic and opportunistic free-living amoebae: Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris ,Naegleria fowleri , and Sappinia diploidea. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2007; 50: 1-26. 19. 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Un agradecimiento especial al Servicio de Secuenciación SEGAI de la Universidad de La Laguna, Tenerife, España, por el servicio de secuenciación brindado al estudio. 1. Amaral Zettler L.A., Nerad T.A., O’Kelly C.J., Peglar M.T., Gillevet P.M., Silberman J.D., Sogin M.L. A molecular reassessment of the leptomyxid amoebae. Protist. 2000; 151: 275-282. 2. Adl S.M., Simpson A.G.B., Farmer M.A., Andersen R.A., Barta J.R., Bowser S.S., Brugerolle G.,Fensome R.A.,Fredericq S.,James T.Y.,Karpov S.,Kugrens P., Krug J., Lane C.E., Lewis L.A., Lodge J.,Lynn D.H., Mann D.G., McCourt R.M., Mendoza L., Moestrup O., Mozley-Standridge S.E., Nerad T.A., Shearer C.A., Smirnov A.V., Spiegel F.W., Taylor M.F. The new higher taxonomy of protists. Journal of Eukaryotic Microbiology. 2005; 5: 399-451. 3. Schuster F.L., Dunnebacke T.H., Booton G.C., Yagi S, Kohlmeier C.K., Glaser C., Vugia D., Bakardjiev A., Azimi P., Maddux-Gonzalez M., Martinez A.J., Visvesvara G.S. 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