NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 Aplicación de la topología molecular en la predicción de la actividad antiprotozoaria de derivados del benzimidazol Fecha de recepción y aceptación: 23 de enero de 2013, 15 de febrero de 2013 Ángela Debenedetti López, Irene Iglesias Gómez, Lissette Retana Moreira, Jorge Gálvez Álvarez y Ramón García Domenech* Facultad de Farmacia, Universitat de València * Correspondencia autor: Avda. V. A. Estellès, s/n. 46100 Burjassot, Valencia. España. E-mail: ramon.garcia@uv.es Nereis. Revista Iberoamericana Interdisciplinar de Métodos, Modelización y Simulación 5 9-17 Universidad Católica de Valencia “San Vicente Mártir” Valencia (España) ISSN 1888-8550 RESUMEN Se ha aplicado la topología molecular a la búsqueda de nuevos derivados del benzimidazol con actividad antiprotozoaria frente a Trichomonas vaginalis y Giardia intestinalis. A partir de los resultados del análisis lineal discriminante, dos modelos basados en cuatro descriptores (en el caso de T. vaginalis) y cinco descriptores (en el caso de G. intestinalis) demostraron ser capaces de predecir correctamente la actividad de cada compuesto analizado. Después de un cribado virtual aplicando ambos modelos, se proponen nuevas estructuras químicas potencialmente activas frente a T. vaginalis y G. intestinalis. PALABRAS CLAVE: Topología molecular, actividad antiprotozoaria, Trichomonas vaginalis, Giardia intestinalis, análisis QSAR. ABSTRACT Molecular topology has been applied to search for new benzimidazole derivatives with antiprotozoal activity against Trichomonas vaginalis and Giardia intestinalis. From linear discriminant analysis results, two models based on 4 descriptors (in the case of T. vaginalis) and 5 descriptors (in the case of G. intestinalis), demonstrated to be capable to predict correctly the activity of each compound tested. After a virtual screening using both models, new chemical structures potentially active against T. vaginalis and G. intestinalis are proposed. KEYWORDS: Molecular topology, antiprotozoal activity, Trichomonas vaginalis, Giardia intestinalis, QSAR analysis. INTRODUCCIÓN Las enfermedades parasitarias están ampliamente distribuidas a nivel mundial, representando un gran problema sanitario, principalmente en países en vías de desarrollo. Dentro de este gran grupo de enfermedades, dos causadas por protozoos que afectan a diferentes tipos de mucosas tienen una prevalencia importante; estas enfermedades son la trichomoniasis y la giardiasis, causadas por los flagelados Trichomonas vaginalis y Giardia intestinalis, respectivamente. En la trichomoniasis, el parásito afecta al tracto genitourinario. Se estima que más de ciento sesenta millones de personas al año son infectadas con este protozoo, considerándose, por tanto, la enfermedad de transmisión sexual más común provocada por un protozoo flagelado (Harp y Chowdhury, 2011). En el caso de la giardiasis, se estima que afecta aproximadamente a doscientos cincuenta millones de personas al año, siendo sus manifestaciones clínicas más frecuentes en niños que en adultos (Alarcón et al., 1993; W.H.O., 1996) y donde el parásito afecta al tracto gastrointestinal, siendo la diarrea su principal síntoma (Jerlstrom- Hultqvist et al., 2010). Debido a los efectos secundarios, contraindicaciones y resistencia a los fármacos utilizados frente a T. vaginalis y G. intestinalis, como son los nitroimidazoles (Gardner y Hill, 2001; Cudmore et al., 2004), se sigue trabajando en el desarrollo de nuevos NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 Ángela Debenedetti López et al.10 compuestos con actividad giardicida y trichomonicida, probándose algunos derivados sintéticos del benzimidazol para estos fines (Pérez-Villanueva et al., 2010). En la actualidad, se utilizan diferentes métodos para el diseño y selección de nuevos compuestos activos, destacando la topología molecular y particularmente la conectividad molecular (Kier y Hall, 1976) como herramientas sumamente útiles, esta última destinada a la búsqueda de relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR, siglas en inglés) (García-Domenech et al., 2008b). La ventaja del empleo de la topología molecular radica en el cálculo rápido y directo de descriptores topológicos. Para ello la molécula se representa por un grafo en donde los átomos son los vértices (exceptuando los átomos de hidrógeno los cuales se suprimen) y los enlaces, las aristas. Además, se incluye la conectividad entre los átomos dentro de matrices topológicas (de distancia o adyacencia), las cuales se manipulan matemáticamente para obtener los índices topológicos (IT). Estos IT van a permitir una caracterización sencilla de la estructura molecular y se utilizarán en la búsqueda de los modelos QSAR (De Gregorio et al., 1998; Duart et al., 2002; García-Domenech et al., 2008b). El empleo de la topología molecular para el diseño y la selección de nuevos fármacos va en aumento, tanto es así que en el área de la parasitología actualmente se reporta su uso en el diseño de antimaláricos (Gálvez et al., 1995; García-Domenech et al., 2008c; Mahmoudi et al., 2008), antitripanosomátidos (García-Domenech et al., 2008a), drogas con actividad anti-Toxoplasma (Gonzalbes et al., 2000) y repelentes de mosquitos (García-Domenech et al., 2010). Sin embargo, su aplicación se extiende más allá de esta área, reportándose también en el diseño de antivirales (De Julián-Ortíz et al., 1999), antibacterianos (García-García et al., 2004; Sivakumar et al., 2008), hipoglucémicos (Calabuig et al., 2004), analgésicos (Gálvez et al., 1994a y b), antihistamínicos (Duart et al., 2002) e, incluso, anticancerígenos (Vyas et al., 2011; Jasinski et al., 2011). En el presente trabajo se analiza la actividad trichomonicida y giardicida de un grupo de compuestos derivados del benzimidazol, con el fin de obtener modelos de predicción QSAR utilizando la topología molecular y el análisis lineal discriminante. Los modelos topológicos seleccionados se aplicarán a una librería molecular virtual con el objetivo de seleccionar y proponer nuevos derivados del benzimidazol potencialmente activos frente a T. vaginalis y G. intestinalis. MATERIAL Y MÉTODOS En este trabajo se ha seleccionado un grupo de 32 derivados del benzimidazol. Las estructuras químicas, así como su actividad biológica in vitro frente a los protozoos T. vaginalis y G. intestinalis descrita por Pérez-Villanueva et al. (2010 y 2012), se encuentran recopiladas en las tablas 1 y 2 (columnas 2 y 6). La actividad antiparasitaria aparece como pCI 50 para cada compuesto, lo que corresponde a la transformación -logCI 50 (siendo CI 50 la concentración inhibitoria del 50% expresada en unidades de mol/L). A partir de la formulación química teórica se realizó una representación bidimensional de cada compuesto, con el fin de simular la estructura molecular y la posición de las especies químicas que diferencian cada derivado benzimidazol (tabla 1). Para realizar el diseño en 2D se utilizó la aplicación ChemDraw del software informático ChemOffice® versión 10.0. Dicha herramienta informática permite guardar cada compuesto en un formato digital apto para diferentes programas informáticos de análisis químico y cálculo de descriptores topológicos. NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 11Aplicación de la topología molecular en la predicción de la actividad antiprotozoaria... Tabla 1. Estructura química del grupo de compuestos derivados del benzimidazol estudiado CF3 N H N 1 F3C CF3 N N 2 CF3 N N F3C 3 CF3 N N HS 4 CF3 N N HS 5 CF3 N N HS 6 CF3 N N HS 7 CF2CF3 N H NCl Cl 8 CF3 N H NBr Br Br Br 9 CF2CF3 N H NCl Cl 10 CF3 N H NO2N O2N 11 CF2CF3 N H NBr Br Br Br 12 CONH2 N N Cl 13 CONHCH3 N N Cl 14 CON(CH3)2 N N Cl 15 COOCH2CH3 N N Cl 16 CONH2 N NCl 17 CONHCH3 N NCl 18 CON(CH3)2 N NCl 19 COOCH2CH3 N NCl 20 CONH2 N NCl Cl 21 CONHCH3 N NCl Cl 22 CON(CH3)2 N N Cl Cl 23 COOCH2CH3 N NCl Cl 24 CONH2 N N 25 CONHCH3 N N 26 CON(CH3)2 N N 27 COOCH2CH3 N N 28 COCH3 N N 29 COCH3 N NCl 30 COCH3 N N Cl 31 COCH3 N N Cl Cl 32 NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 Ángela Debenedetti López et al.12 Tabla 2. Actividad antiparasitaria experimental y resultados de clasificación obtenidos para cada compuesto a partir de las funciones discriminantes seleccionadas T. vaginalis G. intestinalis Comp. pCI 50exp Clas exp FD Tv Clas calc pCI 50exp Clas exp FD Gi Clas calc 1 5,5 I –7,41 I 6,97 A 11 A 2 5,39 I –13,92 I 5,94 I –8 I 3 5,27 I –9,16 I 5,05 I –7,6 I 4 6,7 A 0,17 A 4,98 I –7,4 I 5 5,59 I –5,41 I 5,85 I –10 I 6 4,53 I –7,13 I 5,96 I –6,7 I 7 4,97 I –12,16 I 5,89 I –8,7 I 8 6,66 A 5,36 A 6,92 A 5,6 A 9 8,7 A 15,00 A 7,25 A 10 A 10 6,52 I –10,76 I 6,25 I –12 I 11 6,24 I –1,73 I 6,62 A 7,6 A 12 5 I –12,13 I 7,64 A 9,5 A 13 6,96 A 10,18 A 7,12 A 9,5 A 14 6,98 A 7,86 A 7,15 A 0,4 A 15 6,63 A 9,98 A 7,4 A 7,3 A 16 7,72 A 10,18 A 7,32 A 5,7 A 17 6,73 A 10,78 A 6,63 A 6,5 A 18 6,45 I 1,14 A 6,45 I 0 I 19 6,68 A 3,23 A 6,61 A 5,9 A 20 7,57 A 9,31 A 7,4 A 6,6 A 21 6,87 A 13,09 A 6,34 I 3,2 A 22 6,65 A 4,48 A 6,82 A 8,7 A 23 7,12 A 6,32 A 7,13 A 8,4 A 24 7,53 A 16,24 A 7,56 A 11 A 25 6,78 A 12,32 A 7,03 A 13 A 26 6,98 A 9,31 A 7,22 A 7,2 A 27 6,37 A 11,19 A 6,29 I –3,7 I 28 7,07 A 7,24 A 7,16 A 2,2 A 29 6,68 A 12,33 A 7,06 A 13 A 30 6,88 A 10,12 A 7,3 A 6,5 A 31 6,64 A 9,97 A 7,17 A 9,5 A 32 7,2 A 13,13 A 7,46 A 3,2 A Metronidazol 6,62 5,92 NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 13Aplicación de la topología molecular en la predicción de la actividad antiprotozoaria... TRATAMIENTO INFORMÁTICO Descriptores moleculares En el presente trabajo se escogió un gran número de descriptores topológicos, en su mayoría índices de uso habitual en el campo de la topología molecular (García-Domenech et al., 2008b). De cada compuesto se caracterizaron hasta un total de 425 descriptores moleculares, entre ellos: índices de conectividad, descriptores constitucionales, índices de información teórica, índices de proximidad, autovalores, índices de carga, etc. Para el cálculo de los descriptores topológicos se utilizó el software informático Dragon® versión 5.0, el cual permite la obtención de un gran número de variables topológicas de forma automática e inmediata. Análisis lineal discriminante El análisis lineal discriminante (ALD) es un algoritmo heurístico capaz de distinguir entre dos o más categorías u objetos. Así pues, el ALD permite discriminar entre compuestos activos e inactivos a partir de los valores de los descriptores moleculares de cada uno. Como criterio de discriminación se utilizó su actividad antiprotozoaria (anti-T. vaginalis y anti-G. intestinalis, en cada caso) en función del valor del pCI 50 , estableciéndose dos grupos: – Compuestos activos con capacidad antiprotozoaria probada (pIC 50 > 6,6). – Compuestos inactivos y sin capacidad antiprotozoaria (pIC 50 < 6,6). El valor de corte empleado para discriminar la actividad, pCI 50 = 6,6, corresponde a una concentración 0.25mM, equivalente a la del fármaco de referencia utilizado (metronidazol). La capacidad discriminante se testó en función del porcentaje de clasificación correcta obtenida dentro de cada grupo. El ALD se realizó con ayuda del software informático Statistica® versión 8.0. La selección de los descriptores se basó en el parámetro de F-Snedecor y el criterio de clasificación fue la distancia más corta de Mahalanobis, entendiendo como tal la distancia de cada caso a la media de todos los casos utilizados para la ecuación de regresión. El programa informático elige las variables más adecuadas computando las funciones de clasificación linear una por una. En cada paso, la variable que presente mayor separación del grupo o bien será introducida en la función discriminante, o bien la que tenga menos distancia será excluida de este. Seguidamente, la calidad de la función se evaluó por el parámetro lambda de Wilk (λ), un estadístico de análisis de varianza que mide la igualdad de medias de los grupos para la variable o variables que han sido introducidas en la función discriminante. Una vez obtenida la función discriminante, es posible dibujar un diagrama de distribución de la actividad antiprotozoaria (DDAA). Los DDAA son histogramas en los que en ordenadas aparece la expectancia (E) y en abcisas el valor de la función discriminante (FD). Para un intervalo arbitrario de (FD), se puede definir la expectancia de actividad (Ea) como: Ea = a/(i+1), en donde a e i representan el número de compuestos activos (o inactivos) en dicho intervalo dividido por el número total de compuestos activos (o inactivos). De forma similar se puede definir la expectancia de inactividad (Ei) como: Ei = i/(a+1) (Gálvez et al., 1996). Estos diagramas permiten visualizar los intervalos de la función discriminante, para los cuales la probabilidad de actividad es máxima o mínima. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La búsqueda de modelos topológicos capaces de discriminar la actividad antiprotozoaria frente a T. vaginalis y G. intestinalis se realizó con la ayuda del análisis lineal discriminante. El punto de corte utilizado para agrupar los compuestos en activos o inactivos fue de pCI 50 >6,6. Ello significa que un compuesto con un valor de CI 50 <0,25mM se encontrará en el grupo de los activos. Si CI 50 >0,25mM (pCI 50 <6,6), el compuesto se considera inactivo. La tabla 2 (columnas 3 y 7) muestra la agrupación asignada a cada compuesto según su actividad experimental. Utilizando el valor numérico de agrupación como variable dependiente y los descriptores topológicos como variables independientes, se seleccionaron las siguientes funciones de discriminación para ambos parásitos: FD Tv = 9,82 – 30,14EEig09r + 251,14ESpm04d – 210,82ESpm05d + 146,15GGI8 N = 32 λ (Wilk) = 0,201 F(4,27) = 26,8 FD Gi = 179,6 + 26,6EPS1 + 38,6EEig10x + 50,3EEig13x – 38,0EEig14x + 1,01BAC N = 32 λ (Wilk) = 0,241 F(4,27) = 16,4 NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 Ángela Debenedetti López et al.14 A partir de estas funciones, un compuesto será clasificado como activo si FD>0, y en caso contrario, se clasifica como inactivo. La tabla 2 recoge el valor de FD para cada compuesto y la clasificación resultante. Las ecuaciones seleccionadas muestran valores bajos de lambda de Wilks (λ) (0,201 y 0,241 para T. vaginalis y G. intestinalis, respectivamente), lo que sugiere un elevado grado de discriminación. Como se puede observar, la matriz de clasificación muestra un elevado grado de significación, con un porcentaje de correcta clasificación del 100% para el grupo de compuestos activos y ambos parásitos, pues las 22 moléculas activas fueron clasificadas adecuadamente. En cuanto a la clasificación del grupo inactivo, 9 de las 10 moléculas que fueron evaluadas se clasificaron correctamente, por lo que el porcentaje de acierto fue del 90%. En términos globales, aplicando estas FD se obtiene un 96,87% de probabilidad de clasificar correctamente el grupo de compuestos analizados. Los descriptores topológicos que se seleccionaron para construir las funciones discriminantes fueron, por un lado, índices derivados de la matriz de adyacencia de aristas, EEig, ESpm y EPS y, por otro, un índice de carga topológico, GGI8, y el índice céntrico de Balaban, BAC (Todeschini et al., 2009). Las figuras 1 y 2 muestran los diagramas de actividad obtenidos con ambas funciones discriminantes. Como se puede observar, existen pequeños solapamientos de actividad entre los grupos activo e inactivo con valores de FD próximos a cero. La máxima probabilidad de encontrar compuestos activos estaría en el intervalo 5-10 para G. intestinalis, FD Gi , y 3-12 para T. vaginalis y FD Tv . Figura 1. Diagrama de distribución de la actividad antiprotozoaria, T. vaginalis, obtenido con la función discriminante FD Tv Figura 2. Diagrama de distribución de la actividad antiprotozoaria, G. intestinalis, obtenido con la función discriminante FD Gi NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 15Aplicación de la topología molecular en la predicción de la actividad antiprotozoaria... Una vez seleccionados los modelos matemáticos de discriminación de la actividad antiprotozoaria frente a T. vaginalis y G. intestinalis, las funciones FD Tv y FD Gi , se pasó a realizar un cribado molecular virtual formado por derivados del benzimidazol no utilizados en el análisis discriminante y que se utilizaría con el fin de proponer nuevos compuestos potencialmente activos frente a ambos parásitos. Para ello, se preparó una librería formada por 120 moléculas derivadas del benzimidazol (ver estructura química representada en la tabla 3), utilizando otros fragmentos estructurales diferentes a los analizados en el trabajo en las posiciones R 3 y R 4 . Se calcularon los índices topológicos de cada molécula de la librería y se les aplicaron los modelos de discriminación seleccionados. La tabla 3 recoge las moléculas seleccionadas basadas en los intervalos de máxima probabilidad de actividad establecidos por las funciones FD Tv (3-12) para T. vaginalis y FD Gi (5 y 10) para G. intestinalis. Estos compuestos se consideran potencialmente activos frente a T. vaginalis y G. intestinalis. El siguiente paso de la investigación sería la síntesis de algunos de estos nuevos compuestos y su posterior ensayo en el laboratorio para corroborar los resultados obtenidos a través del estudio topológico. Tabla 3. Resultados de clasificación obtenidos para las moléculas utilizadas en el cribado molecular y que han superado los modelos topológicos, FD Tv y FD Gi R3 N N R2 R4 R1 Comp. R 1 R 2 R 3 R 4 FDTv FDGi a H Cl COOCH 3 CH 3 7,00 8,92 b Cl H COOCH 2 CH 2 CH 3 CH 3 5,99 3,44 c H Cl COCH 2 CH 3 CH 3 5,75 8,92 d H H COOCH 3 CH 3 7,42 3,74 e Cl Cl COOCH 3 CH 3 3,42 8,29 f Cl Cl COOCH 2 CH 2 CH 3 CH 3 5,63 11,41 g H H CONHCH 2 CH 3 CH 3 8,95 3,00 h H H COCH 2 CH 3 CH 3 5,49 3,74 i H H COCH 2 CH 2 CH 3 CH 3 4,25 3,00 j H Cl CONH 2 H 9,60 5,96 k Cl H CONH 2 H 9,60 7,29 l H Cl CON(CH 3 ) 2 H 11,28 6,42 m Cl H CON(CH 3 ) 2 H 11,28 6,44 n H Cl CO 2 CH 2 CH 3 H 8,92 3,30 o H Cl COCH 3 H 9,64 5,96 p Cl H COCH 3 H 9,64 7,29 q H Cl CONHCH 2 CH 3 H 10,12 3,30 r H Cl COCH 2 CH 2 CH 3 H 7,28 3,30 s Cl Cl CONHCH 3 H 3,55 6,16 NEREIS 5 [Marzo 2013], 9-17, ISSN: 1888-8550 Ángela Debenedetti López et al.16 CONCLUSIONES La topología molecular ha demostrado ser una herramienta muy eficaz en la búsqueda de modelos QSAR de predicción de la actividad antiparasitaria de un grupo de compuestos derivados del benzimidazol, frente a los protozoos T. vaginalis y G. intestinalis. En el presente estudio se evaluaron diferentes descriptores moleculares de estos compuestos, todos ellos grafoteóricos y calculados mediante la aplicación de herramientas informáticas de uso habitual en el campo de la topología molecular. Las variables seleccionadas para la construcción de los modelos matemáticos son, en su mayoría, descriptores topológicos derivados de la matriz de adyacencia de aristas. La actividad antiprotozoaria se ha cuantificado a través de la concentración inhibitoria 50, en su transformación logarítmica pCI 50 . El poder discriminante de los modelos topológicos seleccionados ha sido superior al 90% para ambos parásitos. Estos modelos pueden ser utilizados en la búsqueda de nuevos derivados del benzimidazol potencialmente activos frente a T. vaginalis y G. intestinalis. Se presentan algunos de los compuestos seleccionados para su valoración y posterior desarrollo. Agradecimientos: esta investigación ha sido financiada por el Máster en Enfermedades Parasitarias Tropicales (Universitat de València, Curso 2011-2012). REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALARCÓN J., CASTRO C. & MURILLO J. 1993. Prevalencia de giardiasis en encuestas parasitológicas publicadas en la literatura peruana, 1943-1990, Revista Peruana de Epidemiología, 6, 5-17. CALABUIG, C., ANTÓN-FOS, G. M., GÁLVEZ, J. & GARCÍA-DOMENECH, R. 2004. New hypoglycaemic agents selected by molecular topology. International Journal of Pharmaceutics, 278, 111-118. CUDMORE, S. L., DELGATY, K. L., HAYWARD-MCCLELLAND, S. F., PETRIN, D. P. & GARBER, G. P. 2004. Treatment of infections caused by metronidazole-resistant Trichomonas vaginalis. Clinical Microbiology Reviews, 17, 783-793. DE GREGORIO, C., KIER, L. B. & HALL, L. H. 1998. QSAR modeling with the electrotopological state indices: corticosteroids. Journal of Computer-Aided Molecular Design, 12, 557-561. DE JULIÁN-ORTÍZ, J. 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