UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO EFECTOS DE LA OXITETRACICLINA EN UN SISTEMA DE BIOPURIFICACIÓN: ELIMINACIÓN DE TRIAZINAS Y ORGANOFOSFORADOS Y VARIACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE GENES DE DEGRADACIÓN Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología, Química Clínica e Inmunología, para optar por el grado y título de Maestría Académica en Microbiología MARTA EUGENIA PÉREZ VILLANUEVA Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2020 Dedico esta tesis a mi familia que ha sido una motivación enorme para proponer y cosechar mis metas. Nada es imposible si se lucha y persevera día a día. ii Agradecimientos: Gracias a todas esas personas que de una forma u otra me apoyaron, ayudaron y acompañaron durante el largo proceso de esta tesis, al CICA, al LAIMEC, al CENIBiot, al CIBCM, al CIET y a todas las personas involucradas en cada centro que me dieron una mano, me recibieron, permitieron que usara sus instalaciones y sus equipos, además de atender mis consultas para poder llevar a cabo esta tesis. A todas las personas que de una forma u otra han sido parte de esta tesis, colaborando conmigo de distintas maneras; con ayuda en el laboratorio, compartiéndome reactivos, discutiendo los resultados que iba obteniendo, dándo consejos y guía, o simplemente compartiendo este proceso conmigo en un camino de altibajos, pero de mucho aprendizaje, a Diego, a Teresita, a María Laura, a Fabián, a César J., a Carlos Chacón y a Camilo por toda su ayuda. A Silvia y a Jeffrey por siempre escucharme y compartir de cerca los momentos de frustación, de éxito y de alegría y a todos los que no mencioné pero que han seguido de cerca este proceso conmigo. A todos muchas gracias, sin ustedes esta tesis no estaría concluida el día de hoy. iii iv Tabla de Contenidos Resumen .................................................................................................................... viii Lista de cuadros ........................................................................................................... ix Lista de figuras ...............................................................................................................x 1. Introducción ............................................................................................................1 1.1. Actividad agrícola en Costa Rica ..................................................................... 1 1.2.1. Organofosforados ..................................................................................... 3 1.2.2. Triazinas .................................................................................................. 5 1.3. Sistemas de Biopurificación de Plaguicidas ..................................................... 7 1.4. Degradación bacteriana de organofosforados y triazinas .................................. 9 1.4.1. Degradación de organofosforados (OP) .................................................... 9 1.4.2. Degradación de triazinas .......................................................................100 1.5. Antibióticos de uso agrícola .......................................................................... 11 2. Justificación .......................................................................................................... 13 3. Hipótesis ............................................................................................................... 14 4. Objetivo General ................................................................................................... 15 4.1. Objetivos Específicos .................................................................................... 15 5. Estrategia metodológica ......................................................................................... 16 6. Materiales y métodos ............................................................................................. 17 6.1. Reactivos, materiales y equipo ...................................................................... 17 6.1.1. Reactivos químicos ................................................................................ 17 6.1.2. Biomezcla .............................................................................................. 17 6.1.3. Medio mínimo........................................................................................ 18 6.2. Procedimientos experimentales ..................................................................... 18 6.2.1. Ensayo de eliminación de plaguicidas organofosforados y triazinas en la biomezcla a diferentes concentraciones de oxitetraciclina, ensayos toxicológicos y ensayos de cuantificación génica .......................................................................... 18 6.2.2. Ensayo de NMP para la cuantificación de degradadores de atrazina (NMP- TTC)…….………………………………………………………………………….19 6.2.3. Ensayo de NMP por mineralización de 14C-CLP para la cuantificación de degradadores de clorpirifós (NMP-14C) ................................................................ 20 6.3. Procedimientos analíticos .............................................................................. 20 v 6.3.1. Extracción y cuantificación de plaguicidas ............................................. 20 6.3.2. Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna ..................................... 22 6.3.3. Ensayo de fitotoxicidad con Lactuca sativa ............................................ 23 6.3.4. Determinación 14CO2 del ensayo de 14C-NMP ........................................ 23 6.4. Análisis de expresión de genes de degradación de organofosforados y triazinas ………………………………………………………………………………...24 6.4.1. Extracción de ADN total ........................................................................ 24 6.4.2. PCR punto final...................................................................................... 24 6.4.3. Obtención de controles positivos para el qRT-PCR ................................ 24 6.4.4. PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) .......................................... 25 7. Resultados ............................................................................................................. 28 7.1. Eliminación de plaguicidas organofosforados y triazinas en presencia de oxitetraciclina .......................................................................................................... 28 7.2. Toxicidad residual de la biomezcla durante el tratamiento de organofosforados y triazinas en co-aplicación con oxitetraciclina......................................................... 33 7.3. Cuantificación de genes involucrados en la degradación de organofosforados y triazinas durante su eliminación en la biomezcla ...................................................... 34 7.3.1. Selección de los imprimadores y genes a evaluar en el qPCR ................. 34 7.3.2. Obtención de controles positivos para qPCR .......................................... 35 7.3.3. PCR punto final para los genes 16S Wang, 16S Monard, atzA, atzD, opd y opdA y su presencia en el tiempo .......................................................................... 36 7.3.4. qPCR para los genes atzA y opd en el tiempo ......................................... 37 7.4. Cuantificación de los microorganismos viables en la biomezcla con capacidad de degradar atrazina o clorpirifós ............................................................................. 38 7.4.1. NMP de degradadores de clorpirifós por mineralización de 14C-CLP ...... 39 7.4.2. NMP de degradadores de atrazina (NMP-ATZ) ...................................... 40 8. Discusión .............................................................................................................. 42 8.1. Eliminación de plaguicidas organofosforados y triazinas en presencia de oxitetraciclina .......................................................................................................... 42 8.2. Toxicidad residual de la biomezcla durante el tratamiento de organofosforados y triazinas en co-aplicación con oxitetraciclina......................................................... 50 8.3. Cuantificación de genes involucrados en la degradación de organofosforados y triazinas durante su eliminación en la biomezcla ...................................................... 53 8.4. Cuantificación de los microorganismos viables en la biomezcla con capacidad de degradar atrazina o clorpirifós ............................................................................. 56 vi 9. Conclusiones ......................................................................................................... 61 10. Referencias ............................................................................................................ 62 Anexos ......................................................................................................................... 81 Anexo 1. Resultados de pruebas preliminares para la ejecución del qPCR ................ 81 vii Resumen La contaminación que provoca el mal uso de agroquímicos y el manejo inadecuado de sus desechos, puede afectar cuerpos de agua superficiales o subterráneos y grandes volúmenes de suelo. Los plaguicidas organofosforados y triazinas son dos familias químicas ampliamente utilizadas y podrían contribuir de manera relevante a esta problemática. Por su parte los sistemas de biopurificación de plaguicidas (SBP) son una opción amigable con el ambiente para el tratamiento de aguas contaminadas de forma puntual por el uso y aplicación de plaguicidas, sin embargo, al co-aplicar antibióticos de uso agrícola como la oxitetraciclina (OTC) los procesos degradativos en la biomezcla podrían verse afectados negativamente. En este trabajo, se analizó el efecto de la OTC a dos concentraciones diferentes, en la eliminación de los organofosforados clorpirifós (CLP), metamidofós (MTM), monocrotofós (MNC) y cadusafós (CDF) y las triazinas atrazina (ATZ), ametrina (AMT), terbutilazina (TBZ) y terbutrina (TBT) en una biomezcla de SBP, por medio de pruebas de eliminación, toxicidad residual de la biomezcla, cuantificación por NMP de poblaciones de degradadores y estudio de genes involucrados en la degradación de organofosforados y triazinas. A los 11 días la mayoría de los plaguicidas había sido eliminado en su totalidad sin presentar diferencias significativas entre los tratamientos con y sin OTC, a excepción de AMT, TBT, TBZ y CLP, que presentaron diferencias entre al menos uno de los tratamientos, por su parte la OTC al cabo de los 60 días se eliminó entre un 60-70 %. La toxicidad residual de la biomezcla se redujo en más de un 90 % para D. magna y entre un 22.4 % y 36.7 % para L. sativa. Los genes atzA y opd están aparentemente presentes en las biomezclas con y sin OTC y se obtuvieron resultados preliminares de su cuentificación respaldando su presencia. La cuantificación por NMP de las poblaciones degradadoras de ATZ y CLP mostró una afectación de las poblaciones por la presencia de OTC, con de reducciones de 1 a 5 logaritmos. Por lo tanto, la biomezcla de SBP utilizada es de las más eficientes probadas hasta el momento para la eliminación de organofosforados y triazinas y también es capaz de degradar la OTC. Adicionalmente, la presencia de OTC, aunque tiene un efecto negativo en la microbiota de la biomezcla el cual debe ser estudiado a mayor profundidad, no afecta el resultado final en la eliminación de los plaguicidas, por lo que la biomezcla se recomienda para el tratamiento simultáneo de plaguicidas y OTC bajo las condiciones probadas en esta investigación. viii Lista de cuadros Cuadro 1. Características de algunos plaguicidas de uso en Costa Rica ...........................4 Cuadro 2. Transiciones seleccionadas y otros parámetros en la detección de organofosforados y triazinas en la biomezcla, utilizando el método de monitoreo dinámico de reacción múltiple (dMRM) ....................................................................... 21 Cuadro 3. Secuencias de los imprimadores utilizados para los ensayos de expresión..... 27 Cuadro 4. Resumen de vidas medias y porcentajes de eliminación a los 60 días para cada uno de los agroquímicos estudiados .............................................................................. 31 Cuadro 5. Cambios netos de disminución de toxicidad en la biomezcla durante la eliminación de triazinas, organofosforados y oxitetraciclina ......................................... 34 Cuadro 6. Resultados del PCR punto final de los tratamientos B+M, B+M+OTC10 y B+M+OTC50 en el tiempo ........................................................................................... 36 Cuadro 7. Índices de cuantificación de los genes atzA y opd en la biomezcla sometida a diferentes tratamientos y su variación en el tiempo ....................................................... 37 Cuadro 8. Comparación de las DT50 reportados previamente en SBP para los plaguicidas estudiados y OTC ...................................................................................... 43 Cuadro A1. Calidad del ADN purificado de las bandas para usar como controles positivos en el qPCR .................................................................................................... 83 Cuadro A2. Cuantificación en fluorímetro del ADN de las muestras para qPCR ........... 83 Cuadro A3. Pendiente y eficiencia de las curvas de calibración realizadas con los genes housekeeping ................................................................................................................ 83 ix Lista de figuras Figura 1. Estructura general de los plaguicidas organofosforados ...................................3 Figura 2. Estructura química de algunos plaguicidas organofosforados ...........................4 Figura 3. Estructura química general de los plaguicidas triazinas ....................................6 Figura 4. Estructura química de algunos plaguicidas de la familia de las triazinas ...........6 Figura 5. Representación esquemática del diseño original de un SBP .............................8 Figura 7. Eliminación de triazinas en la biomezcla a diferentes concentraciones de oxitetraciclina ............................................................................................................... 30 Figura 8. Perfil de concentración de oxitetraciclina durante la eliminación de triazinas y organofosforados en una biomezcla .............................................................................. 31 Figura 9. Cambios en la toxicidad residual en la biomezcla durante la eliminación de una mezcla de triazinas y organofosforados ........................................................................ 33 Figura 10. Gel de agarosa con los productos de amplificación de las diluciones de ADN con los imprimadores 16S Monard (A) y 16S Wang (B) para ver inhibidores ............... 35 Figura 11. Gel de electroforesis con las bandas seleccionadas para purificar y usar el ADN como control positivo .......................................................................................... 35 Figura 12. Cambios en el NMP de los degradadores de CLP en la biomezcla durante la eliminación de una mezcla de plaguicidas triazinas y organosfosforados ...................... 40 Figura 13. Cambios en el NMP de los degradadores de ATZ en la biomezcla durante la eliminación de una mezcla de plaguicidas triazinas y organosfosforados ...................... 41 Figura A1. Productos de PCR punto final obtenidos en diferentes condiciones de trabajo. ......................................................................................................................... 81 Figura A2. Productos de PCR punto final de los tratamientos B+M, B+M+OTC10 y B+M+OTC50 en el tiempo ........................................................................................... 82 x xi 1 1. Introducción A nivel mundial la actividad agrícola ha cumplido un papel importante en el desarrollo de las sociedades, y continúa siendo uno de los pilares de la economía. Sin embargo, diferentes actividades están asociadas a la agricultura, entre ellas el uso de plaguicidas, que a pesar de los grandes aportes que ha generado, como el control de vectores de enfermedades tanto para cultivos como para humanos, mejoras en el rendimiento de la producción, entre otros, se ha definido también como un factor contribuyente a la problemática ambiental (Waite et al., 2002). Estas sustancias en muchas ocasiones se utilizan y desechan indebidamente, y aunado a los procesos naturales de migración de los plaguicidas, estos químicos pueden llegar a diversos compartimentos ambientales contaminándolos (Valls-Cantenys et al., 2016). También se ha reportado entre algunos efectos de los plaguicidas, la muerte de peces, fallo reproductivo en pájaros y muerte en humanos (Ewence et al., 2015). 1.1. Actividad agrícola en Costa Rica A pesar que la actividad agrícola en el país ha sufrido un descenso en las últimas décadas, aún sigue siendo una de las principales actividades económicas en Costa Rica, superada solo por las actividades financieras, actividades de información y comunicaciones, servicios profesionales y actividades de transporte y almacenamiento (Jiménez-Fontana, 2019). Para el año 2018 tuvo una tasa de crecimiento del producto interno bruto (PIB) junto con la silvicultura y pesca de aproximadamente el 2.0 %, valor menor al correspondiente para el año 2017, pero cercano a lo reportado para el promedio quinquenial (Jiménez-Fontana, 2019). Los productos agrícolas, además de ser distribuidos para consumo nacional también se exportan, lo que para el año 2014 representó el 23.3 % de todos los productos exportados por el país (Alonso y Jiménez-Fontana, 2015). Además, en el 2015 la oferta exportable de estos productos fue de más del 70 %, siendo apenas un 8.3 % para el consumo nacional (SEPSA, 2015). Según el vigésimo primer informe del estado de la nación correspondiente al año 2015, para ese año la mayoría de los sectores económicos no alcanzó su nivel promedio de largo 2 plazo, sin embargo, la agricultura fue uno de los pocos que superaron, por poco, el crecimiento promedio de los últimos veintidós años (Alonso y Jiménez-Fontana, 2015). 1.2.Uso de plaguicidas Directamente relacionado a la actividad agrícola, como se ya se mencionó, está el uso de plaguicidas, sin embargo, es necesario aclarar que no solamente esta industria aprovecha los beneficios de estas sustancias. Otros usos comunes aunque en menor cantidad son, en la ganadería, para el mantenimiento de la salud pública con el control de vectores e incluso el uso doméstico (Ramírez y Lacasaña, 2001). Según el Censo Agropecuario del 2015 en el país el 82.1 % de los productores utiliza fertilizantes, mientras que el 90.1 % hace uso de plaguicidas en sus cultivos para controlar diversas plagas. Además, el Servicio Fitosanitario del Estado reporta que entre los años 2013 y 2014 las importaciones de plaguicidas aumentaron de 7.4 a 7.8 millones de kilogramos de ingrediente activo, y las exportaciones a su vez disminuyeron de 3.4 a 2.7 millones de kilogramos de ingrediente activo. Según estas mismas estadísticas la cantidad remanente de plaguicida que permanece en el país y es utilizado en las actividades agrícolas correspondió a 7.0 y 8.1 millones de kilogramos de ingrediente activo para el 2013 y el 2014 respectivamente (Corrales y Chacón, 2015). Para el año 2016, último del que se cuenta con reporte, se mantuvo una tendencia similar a pesar que las importaciones de plaguicida bajaron a 6.7 millones de kilogramos de ingrediente activo (Merino y Chacón, 2018). Según la plaga a controlar, estos plaguicidas se clasifican en insecticidas, herbicidas, nematicidas o fungicidas. Otra manera de clasificarlos es según su familia química, dentro de la cual comparten propiedades y por lo general un modo de acción similar (Ramírez y Lacasaña, 2001). Los plaguicidas organoclorados por ejemplo, hace algunas décadas fueron ampliamente utilizados como insecticidas, pero debido a su alta toxicidad y efectos negativos en el ambiente y la salud, se ha reducido su uso ligado a su prohibición en una gran mayoría de los países del mundo (Vega, 2008; Rojas-Cabezas, 2016). Sin embargo, ese no es el caso de todas las familias de plaguicidas y algunos de los que más se utilizan en la actualidad son los que pertenecen a las familias de los organofosforados o las triazinas (Ramírez y Lacasaña, 2001). 3 1.2.1. Organofosforados Los plaguicidas de esta familia se caracterizan por ser ésteres, amidas o tioles derivados de ácido fosfórico; su estructura básica se observa en la figura 1. Los grupos de cadena lateral (-R) usualmente corresponden a grupos alquilo o arilo que pueden estar unidos directamente al fósforo o a través de un átomo de oxígeno o de azufre, en este segundo caso se llaman fosfonatos o tiofosfonatos respectivamente. Las fosforoamidas se forman cuando un carbono se encuentra unido al fósforo a través de un grupo –NH. Por su parte X podría ser ocupado por un amplio rango de grupos químicos por ejemplo, grupos alifáticos, aromáticos o heterocíclicos, unidos al átomo de fósforo a través de un grupo lábil o saliente que usualmente es un átomo de oxígeno o azufre (Ballantyne y Marrs, 1992; Sogorb y Vilanova, 2002). Figura 1. Estructura general de los plaguicidas organofosforados. A. Fosfato. B. Fosforotioato. A nivel mundial esta familia de plaguicidas se utiliza como insecticidas y nematicidas, y representan una de las familias de plaguicidas más utilizados actualmente, representando en el 2010 más de un 36 % del mercado global (Ghosh et al., 2010). En Costa Rica, al igual que a nivel mundial, los insecticidas en general son los segundos agroquímicos más utilizados, superados únicamente por los herbicidas (Grube et al., 2011; Ramírez et al., 2009; Ramírez, 2010), y algunos de ellos, por ejemplo el clorpirifós que es uno de los más ampliamente utilizados, se han encontrado en valores cuantificables en muestras de agua y sedimento en Costa Rica (Alfaro, 2011; Carazo-Rojas et al., 2018). Algunos representantes de esta familia de plaguicidas son el clorpirifós recientemente mencionado, el metamidofós, el cadusafós, el monocrotofós, entre otros. Todos ellos son distribuidos y utilizados en Costa Rica y se ha reportado que sus vidas medias en el campo van desde los 1.4 días hasta los 39 días (Lewis et al., 2016) como se muestra en el cuadro 1. En la figura 2 se observa la estructura química de estos plaguicidas. 4 Figura 2. Estructura química de algunos plaguicidas organofosforados. A. Clorpirifós. B. Metamidofós. C. Cadusafós. D. Monocrotofós (Elaborados con MarvinSketch® y Chemicalize®). Cuadro 1. Características de algunos plaguicidas de uso en Costa Rica. (Tomado de University of Hertfordshire y Servicio Fitosanitario del Estado) (Lewis et al., 2016; SFE, 2017). Plaguicida Nombre IUPAC Tipo de Solubilidad Degradación Uso permitido plaguicida (mg L-1 a en campo en Costa Rica 20°C) (DT50 dado según SFE en días) (SFE, 2017) Clorpirifós Dietoxi-sulfanilideno-(3,5,6- Insecticida/ 1.05 21 Caña de azúcar, tricloropiridin-2-il)oxi-lambda5-fosfano organofosforado piña, papa, maíz, algodón, arroz, café, chile dulce, sorgo, tomate, banano, plátanos. Metamidofós [Amino(metilsulfanil)fosforil]oximetano Insecticida, 200 000 4 Algodón, acaricida/ melón, papa, organofosforado pepino, tabaco, tomate, sandía, repollo, ornamentales. Cadusafós 2-[butano-2- Insecticida, 245 39 Banano, ilsulfanil(etoxi)fosforil]sulfanilbutano nematicida/ plátanos, piña. organofosforado 5 Monocrotofós Dimetil [(E)-4-metilamino-4-oxobut-2- Insecticida, 818 000 30 Algodón, caña en-2-il] fosfato acaricida/ de azúcar, papa, organofosforado café, cítricos, maíz, tabaco. Atrazina 6-cloro-4-N-etil-2-N-propan-2-il-1,3,5- Herbicida/ 35 29 Caña de azúcar, triazina-2,4-diamina triazina maíz, sorgo, piña, Ametrina 4-N-etil-6-metilsufanil-2-N-propan-2-il- Herbicida/ 200 37 Caña de azúcar, 1,3,5-triazina-2,4-diamina triazina piña, banano, plátanos, maíz, cítricos, Terbutilazina 2-N- tert-butil-6-cloro-4-N-etil-1,3,5- Herbicida/ 6.6 22.4 Maíz, sorgo, triazina-2,4-diamina triazina ornamentales, café Terbutrina 2-N-tert-butil-4-N-etil-6-metilsufanil- Herbicida/ 25 52 Caña de azúcar, 1,3,5-triazina-2,4-diamina triazina ornamentales El modo en que actúan los organofosforados es mediante la inhibición de la degradación de acetilcolina, un importante neurotransmisor involucrado en la transmisión de impulsos nerviosos en el cerebro y músculo esquelético principalmente. Una vez que ha cumplido su función, la acetilcolina debe ser hidrolizada por la enzima acetilcolinesterasa para evitar una sobreestimulación en el sistema nervioso; este es el paso que se ve inhibido en presencia del compuesto organofosforado (Pope et al., 2005; Singh y Walker, 2006). De esta forma causan toxicidad en insectos y mamíferos provocando parálisis, convulsiones y finalmente la muerte de su objetivo blanco. Sin embargo, otros vertebrados e invertebrados también pueden sufrir efectos tóxicos al entrar en contacto con estas sustancias (Galloway y Handy, 2003). 1.2.2. Triazinas La familia de plaguicidas triazinas son utilizados como herbicidas alrededor del mundo, y como se mencionó anteriormente, los plaguicidas utilizados para combatir malezas son los que poseen mayores índices de importación en el país y son los de mayor demanda a nivel global (Grube et al., 2011; Ramírez et al., 2009; Ramírez, 2010). 6 Químicamente se caracterizan porque en su estructura central poseen un anillo heterocíclico en el que tres carbonos fueron sustituidos por átomos de nitrógeno como se observa en la figura 3. Según la distribución de sus cadenas laterales además se clasifican en tres grupos, triazinas simétricas, las cuales se subdividen en metoxitriazinas, clorotriazinas o metiltiotriazinas según sus grupos sustituyentes; triazinas no simétricas o triazinonas, y hexazinonas también llamadas triazindionas (Sabik et al., 2000). La atrazina, una triazinona, es uno de los representantes de esta familia más ampliamente utilizado en muchos países, incluido Estados Unidos, mientras que en otros ya ha sido prohibido su uso debido en gran parte a su susceptibilidad de lixiviación (EPA, 2013). La estructura de algunos representantes de esta familia se puede ver en la figura 4, y el detalle de algunas de sus principales características se muestra en el cuadro 1. Figura 3. Estructura química general de los plaguicidas triazinas. A. Triazina. B. Triazinona. C. Hexazinona Figura 4. Estructura química de algunos plaguicidas de la familia de las triazinas. A. Atrazina. B. Ametrina. C. Terbutilazina. D. Terbutrina. (Elaborados con MarvinSketch® y Chemicalize®). 7 La forma en que actúan estos plaguicidas y en general la mayoría de los herbicidas es mediante la inhibición de la fotosíntesis. En el caso de las triazinas el bloqueo se da al inhibir el transporte de electrones en el fotosistema II (Mets y Thiel, 1989). 1.3. Sistemas de Biopurificación de Plaguicidas Con el fin de mitigar el ya conocido efecto negativo de los plaguicidas en el ambiente, se han desarrollado estrategias que contribuyan a disminuir este problema. Tal es el caso de los sistemas de biopurificación de plaguicidas (SBP). Estos ofrecen una opción sencilla y de bajo costo que permite utilizar materiales de desecho y de fácil acceso para los productores agrícolas, a la vez que favorecen la degradación microbiológica de sustancias complejas como los plaguicidas (Rodríguez-Rodríguez et al., 2013). El SBP o biobed, como también es conocido, con su diseño original nace en Europa durante los años 90 y consta de tres componentes, una capa de arcilla, una capa de biomezcla y una capa de pasto, contenidos en una construcción simple tipo excavación similar a la que se muestra en la figura 5, que tiene como objetivo contener las sustancias a degradar y evitar que lleguen al ambiente (Castillo et al., 2008). Se ha demostrado que utilizando estos sistemas con algunas modificaciones en su diseño, pueden llegar a reducir las concentraciones de plaguicida hasta en un 98% en las aguas contaminadas (Cooper et al., 2016; Karas et al., 2016). La biomezcla es una matriz biológicamente activa, y es quien contribuye mayoritariamente a la degradación. Está compuesta por suelo, un componente de alto contenido húmico y un material lignocelulósico en las proporciones volumétricas originales de 25:25:50 respectivamente (Chin-Pampillo et al., 2015a; Karanasios et al., 2012a). Sin embargo, Chin-Pampillo y colaboradores en el 2015 demostraron que estos componentes en una proporción volumétrica de 42:13:45 respectivamente, favorecen la degradación de plaguicidas como el carbofurán y la reducción de la toxicidad residual de la matriz (Chin-Pampillo et al., 2015b). 8 Figura 5. Representación esquemática del diseño original de un SBP (Tomado de Rodríguez-Rodríguez et al., 2013). Cada componente en la biomezcla cumple un papel diferente. El suelo, que debe ser preferiblemente proveniente de la misma finca donde va a ser utilizado el SBP, con el fin de que haya sido preexpuesto a los plaguicidas de uso frecuente en esta, aporta microorganismos con capacidad degradativa y adicionalmente colabora con la capacidad de adsorción del sistema (Sniegowski et al., 2011). El componente de alto contenido húmico puede ser turba o compost y también contribuye a la capacidad de adsorción, la cual a su vez varía para cada plaguicida según sus características químicas; este componente de la biomezcla, además puede aportar microorganismos que participan en la degradación de plaguicidas y ayuda al control de la humedad (Castillo et al., 2008; Fogg et al., 2003a), y finalmente el material lignocelulósico favorece la colonización de hongos ligninolíticos y potencia su actividad enzimática, ideal para la degradación de contaminantes orgánicos (Rivero et al., 2016); otro aporte de este sustrato es liberar moléculas más simples a partir de la ruptura de la lignina, y que sirven como nutrientes para los demás microorganismos presentes en la biomezcla (Rodríguez-Rodríguez et al., 2013). Algunos materiales con estas características ya han sido probados en los biobeds tal es el caso del bagazo de caña, la fibra de coco, la granza de arroz, entre otros (Coppola et al., 2007; Vischetti et al., 2008; Chin-Pampillo et al., 2015a). Aún restan por evaluar a fondo otros factores que podrían afectar la efectividad de la depuración realizada por los SBP, como la presencia y co-aplicación de antimicrobianos de uso agrícola. Recientemente Huete-Soto y colaboradores en el 2017, reportaron que la presencia de oxitetraciclina (OTC) en la biomezcla de un SBP estimuló su respiración y aceleró levemente las tazas de mineralización de clorpirifós, sin embargo, de tres 9 herbicidas probados, la degradación de uno de ellos fue significativamente inhibida (Huete-Soto et al., 2017a) por lo que son necesarios más estudios que clarifiquen este tema y que se complementen con estudios genéticos para alcanzar una mejor comprensión de los procesos que se llevan a cabo en los SBP. 1.4.Degradación bacteriana de organofosforados y triazinas Las bacterias son capaces de llevar a cabo diversos procesos metabólicos y establecerse en un elevado número de sustratos. Esto entre otras causas ha llevado al uso de técnicas de cuantificación en medios selectivos para estudiar las capacidades de crecimiento específicas, entre ellas la técnica del Número Más Probable (NMP), con la cual es posible obtener una estimación de la cantidad de microorganismos en una muestra con capacidad de metabolizar contaminantes, como los plaguicidas (Woomer, 1994). Además, gracias a características como sus cortos tiempos de generación, sus altas tasas de mutación y la elevada plasticidad genómica que caracteriza a las bacterias, es que estas se adaptan fácilmente a diferentes ambientes y condiciones, desarrollando diversos mecanismos para sobrevivir, multiplicarse y utilizar o degradar casi cualquier compuesto orgánico (Johnson y Spain, 2003; Verhagen et al., 2015). La manera en que las bacterias del suelo adquieren sus fenotipos degradadores involucra procesos para el reclutamiento de los genes necesarios y su distribución por transferencia horizontal de genes (Monard et al., 2013). Posteriormente, la selección natural se encarga de elegir y mantener las poblaciones bacterianas con mejores recursos para vivir en estos ambientes y ya se han descrito genes estrechamente relacionados con la capacidad bacteriana de degradar plaguicidas de una familia específica (Rousidou et al., 2016). 1.4.1. Degradación de organofosforados (OP) La degradación bacteriana de los organofosforados es un evento que le brinda ventajas al microorganismo en cuestión, ya que posterior a su mineralización o degradación el plaguicida le sirve como fuente de fósforo y/o carbono (Meleiro-Porto et al., 2011). Esta degradación está mediada principalmente por enzimas que liberan el grupo saliente del átomo de fósforo y catalizan reacciones de hidrólisis, oxidación, alquilación y desalquilación (Sogorb y Vilanova, 2002; Singh et al., 1999). 10 Las enzimas con actividad fosfotriesterasa son importantes porque se encargan de realizar la primera fase en el proceso de detoxificación, todas actúan a través de la hidrólisis del enlace fosfoéster del grupo saliente dejando libre un fosfodiéster y un alcohol (Singh y Walker, 2006). Se clasifican en hidrolasas de organofosforados (OPH), anhidrolasas ácidas de organofosforados (OPAA) y metilparatión hidrolasas (MPH) (Singh et al., 1999). Por ser enzimas fundamentales en los procesos de degradación de OP, el estudio de los genes que las codifican brinda un primer acercamiento en el conocimiento del potencial degradador de una comunidad o cepa específica. Algunos de los genes que se han identificado que tienen relación con la actividad bacteriana degradadora de OP son el gen opd (organophosphate-degrading) que codifica por la enzima OPH, el gen opdA que codifica por la enzima OPDA y es una variante de la enzima OPH, el gen mpd que codifica por la enzima MPH, y el gen opaA el cual codifica por la enzima OPAA. (Cheng et al., 1996; Singh, 2008). El origen de estas enzimas no está del todo claro, pero se cree que la OPH se origina por la promiscuidad en la actividad de la lactonasa (Singh, 2008). De estas enzimas la OPH se ha encontrado en diferentes géneros de bacterias, entre ellas Brevundimonas diminuta y Flavobacterium spp., además se ha encontrado que tiene una amplia especificidad de sustratos y capacidad para romper enlaces P-O, P-CN, P-F y P-S, este último enlace es importante porque no hay otra enzima que se conozca con capacidad de romperlo (Cheng y DeFrank, 2000). El gen opd se codifica en plásmidos diferentes según la especie (pPDL2 y pCMS1) con una región altamente conservada de aproximadamente 5.1 kb, y ha sido encontrado en diferentes regiones del mundo (Siddavattam et al., 2003). Por otro lado, la enzima por la que codifica el gen opdA, a diferencia del opd, no está codificado en un plásmido sino en el cromosoma pero las proteínas correspondientes cuentan con un 90% de homología de aminoácidos y comparten la estructura secundaria (Horne et al., 2002). 1.4.2. Degradación de triazinas En el caso de las triazinas se ha reportado que su degradación biológica incluye una serie de pasos multienzimáticos, en su mayoría hidrolíticos, que inician con la formación de 11 hidroxiatrazina mediada por una deshalogenación (Krutz et al., 2010). La vía biodegradativa que mejor se conoce es Atz, descrita inicialmente en una cepa de Pseudomonas sp. y luego en otras bacterias ambientales (Martinez et al., 2001; Devers et al., 2004). Esta vía involucra seis proteínas AtzA (atrazina clorohidrolasa), AtzB (hidroxiatrazina etilaminohidrolasa), AtzC (N-isopropilamelida isopropilaminohidrolasa), AtzD (ácido cianúrico hidrolasa), AtzE (biuret aminohidrolasa), AtzF (alofanato hidrolasa) (Cheng et al., 2005; Sagarkar et al., 2016; Douglass et al., 2016), sin embargo, no es la única y otros genes han sido implicados en vías degradativas de triazinas, e incluso en algunos casos codifican por productos similares a las enzimas de la vía Atz, estos genes son trzN (triazina hidrolasa) y trzD (ácido cianúrico hidrolasa) (Sajjaphan et al., 2004; Karns y Eaton, 1997) descritos en diferentes géneros de bacterias ambientales como Pseudomonas sp., Arthrobacter sp., Nocardioides sp., entre otros (Mulbry et al., 2002; Eaton y Karns, 1991). En los aislamientos ambientales se ha encontrado que lo que predomina son combinaciones de genes atz y trz trabajando en conjunto para lograr la mineralización de las triazinas tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas (Douglass et al., 2016; El Sebaï et al., 2011). Estos genes por lo general se han descrito ubicados en plásmidos, sin embargo, en el 2003 un grupo de investigadores reportó una cepa de Arthrobacter sp. que podría tener el gen atzA dentro del cromosoma, lo cual favorece su transmisión a las siguientes generaciones bacterianas (Cai et al., 2003). 1.5.Antibióticos de uso agrícola Así como en las actividades agrícolas se utilizan los plaguicidas para controlar plagas de insectos, hongos y malezas, no es difícil pensar que también existen productos que combatan las enfermedades de los cultivos causadas por bacterias. Este es el caso de los antibióticos de uso agrícola. Al igual que sucede con los plaguicidas, el uso inadecuado de estas sustancias es un tema que merece atención desde el punto de vista de contaminación. El uso excesivo o la disposición inadecuada de sus residuos son capaces de acarrear o empeorar problemáticas 12 de resistencia a los antimicrobianos tanto en humanos como en los ecosistemas, además del problema de contaminación (Thiele-Bruhn y Beck, 2005). En Costa Rica es reducido el número de antibióticos utilizados en las actividades agrícolas, entre ellos se pueden mencionar la estreptomicina, la oxitetraciclina y la kasugamicina, sin embargo, son al menos 18 cultivos diferentes, muchos de ellos productos de la canasta básica, los que utilizan antibióticos (Gobierno de la República, 2018). La oxitetraciclina es uno de los antibióticos más utilizado en el sector agrícola, pertenece a la familia de las tetraciclinas, es producido por Streptomyces rimosus y su efecto bacteriostático lo efectúa bloqueando la síntesis de proteínas en los ribosomas bacterianos (Stockwell y Duffy, 2012; O’Neil, 2006). En Costa Rica su uso está autorizado para los cultivos de aguacate, cacao, café, cebolla, frijol, tabaco, banano, plátanos, ajonjolí, soya, papa, arroz, manzana, pera y ornamentales, en dosis cercanas a 1 g del ingrediente activo por litro de mezcla de aplicación (SFE, 2017). Desafortunadamente la regulación y monitoreo de su uso a nivel agrícola no se hace en el país, y se estima que las cantidades de esta sustancia para este fin específico no son para nada despreciables (Rodríguez-Sánchez, 2008). En el contexto de los SBP, se ha mencionado que el mayor potencial biodegradador es aportado por los microorganismos del suelo, principalmente bacterias. Además, ya que el uso que reciben ambas sustancias (plaguicidas y antibióticos) es similar, es posible que coexistan en el SBP, por lo cual el estudio de este escenario cobra importancia. Hasta el momento los resultados obtenidos de la interacción antibiótico-plaguicida en los SBP sugieren que ambas sustancias podrían descartarse en conjunto en estos sistemas, sin embargo, para concluir adecuadamente son necesarios más estudios (Castillo-González et al., 2017; Huete-Soto et al., 2017a). Conociendo el panorama general del uso de plaguicidas, especialmente triazinas y organofosforados, y las ventajas que los SBP representan en el manejo de sus residuos, nace el cuestionamiento de si realmente existe un efecto negativo en la degradación de estas familias de plaguicidas en un SBP, donde, además, se tratan diferentes concentraciones de oxitetraciclina, y si este efecto correlaciona con la expresión de genes bacterianos en el SBP. 13 2. Justificación Las actividades asociadas a la producción agrícola, a pesar de traer numerosos beneficios en cuanto a rendimiento y control de la producción, en muchos casos contribuyen a la contaminación ambiental. Los plaguicidas representan uno de los principales contaminantes derivados de esta actividad económica (Castillo et al., 2008). Dentro de este contexto los SBP son una solución sencilla y económica para dar un manejo adecuado a los residuos de plaguicidas provenientes de las actividades de carga, preparación, dispersión y descarte de estos agentes químicos, evitando o disminuyendo su llegada a otros compartimentos ambientales (Karanasios et al., 2012b). Sin embargo, es necesario considerar que el comportamiento de los SBP debe ser ampliamente evaluado ya que existen diversas variables según cada región, los plaguicidas que se utilizan y las cantidades de estos que podría recibir el SBP, las poblaciones microbianas presentes en la biomezcla encargadas de la degradación, la expresión de genes específicos involucrados en los procesos degradativos, y la coexistencia de otras sustancias de uso agrícola en el SBP que podrían alterar las comunidades bacterianas y consecuentemente la degradación y eficiencia del SBP (Rivero et al., 2016). Hasta la fecha existe poca información acerca del efecto que los antibióticos de uso agrícola provocan en la población bacteriana y el potencial degradador de las biomezclas en un SBP, en los que simultáneamente se está dando la degradación de mezclas complejas de plaguicidas. Técnicas moleculares que permitan evaluar y monitorear en el tiempo el comportamiento de genes bacterianos involucrados con los procesos de degradación de plaguicidas, sumado a análisis que de manera simultánea monitoreen la degradación de cada plaguicida, pueden contribuir a disminuir el vacío de conocimiento en este campo y facilitar la comprensión de los procesos microbiológicos que participan en los SBP, con el fin de modificar adecuadamente los sistemas, de modo que el rendimiento de biodepuración mejore o bien, no se vea disminuido. 14 3. Hipótesis La degradación de plaguicidas organofosforados y triazinas en un sistema de biopurificación de plaguicidas (SBP) se reduce en presencia de oxitetraciclina y está relacionada a una menor cuantificación de genes bacterianos involucrados en la degradación de plaguicidas. 15 4. Objetivo General Analizar el efecto de la oxitetraciclina en la degradación de plaguicidas organofosforados y triazinas a nivel de laboratorio en una biomezcla para la degradación de plaguicidas. 4.1.Objetivos Específicos 4.1.1. Determinar la cinética de eliminación de plaguicidas seleccionados de las familias organofosforados y triazinas, en una biomezcla de SBP en ausencia y en presencia de oxitetraciclina para determinar su efecto sobre la tasa de eliminación de los plaguicidas. 4.1.2. Monitorizar los cambios en la toxicidad residual de la biomezcla durante el tratamiento de organofosforados y triazinas en co-aplicación con oxitetraciclina, para relacionar la tasa de eliminación con los efectos ecotoxicológicos de la biomezcla tratada y estimar su aplicabilidad en el ambiente. 4.1.3. Determinar la variación en la cuantificación de genes involucrados en la degradación de organofosforados y triazinas durante su eliminación en la biomezcla, para correlacionar este parámetro con las tasas de eliminación de los plaguicidas en presencia de oxitetraciclina. 4.1.4. Cuantificar los microorganismos viables en la biomezcla con capacidad de degradar un representante de las triazinas y uno de los organofosforados, para estimar la población microbiana involucrada en los procesos degradativos de triazinas y organofosforados en la matriz. 16 5. Estrategia metodológica Por medio de ensayos de degradación se evaluó la capacidad de una biomezcla para eliminar 4 triazinas: atrazina (ATZ), ametrina (AMT), terbutilazina (TBZ) y terbutrina (TBT) y 4 organofosforados: clorpirifós (CLP), cadusafós (CDF), metamidofós (MTM), y monocrotofós (MNC). La cinética de eliminación se determinó tanto en ausencia como en presencia de OTC. Los ensayos consistieron en triplicados de tres condiciones o tratamientos en una biomezcla, además de un sistema sin tratamiento que funcionó como control. Los tratamientos consistieron en: a) una mezcla de plaguicidas organofosforados y triazinas a altas concentraciones, b) la misma mezcla de plaguicidas más el antibiótico OTC en una concentración alta (10 mg kg-1) respecto a las dosis de aplicación recomendadas y c) nuevamente esta mezcla de plaguicidas más el antibiótico a una concentración aún más alta (50 mg kg-1); ambas concentraciones de OTC corresponden a posibles escenarios encontrados en una biomezcla, de acuerdo con el uso del antibiótico. La concentración de los plaguicidas y la OTC se cuantificó en cada sistema a lo largo de un período de 60 días utilizando LC-MS/MS; la determinación de las vidas medias en cada caso, permitió la comparación de los diferentes tratamientos. Adicionalmente, se realizaron ensayos de toxicidad aguda (inmovilización de Daphnia magna) y fitotoxicidad (germinación de Lactuca sativa) durante el tratamiento, con el fin de no solo evaluar la degradación, sino también el efecto tóxico residual en la biomezcla, ya que los productos intermedios de la degradación también podrían ser tóxicos. La evaluación de la fitotoxicidad resulta relevante ya que gran parte de los plaguicidas agregados son herbicidas. Además, para tener un panorama más amplio del proceso de degradación, se emplearon las técnicas de PCR y qPCR para efectuar estudios de cuantificación de los genes opd y atzA involucrados en los procesos degradativos de organofosforados y triazinas. Por último, se realizaron ensayos de NMP para obtener una estimación de la cantidad de microorganismos en la biomezcla con capacidad para degradar atrazina (ensayo de variación de potencial redox) y clorpirifós (ensayo de mineralización de 14C- clorpirifós) en representación de cada familia de plaguicidas: triazinas y organofosforados. 17 6. Materiales y métodos 6.1.Reactivos, materiales y equipo 6.1.1. Reactivos químicos Estándares analíticos de clorpirifós ((dietoxi-sulfanilideno-(3,5,6-tricloropiridin-2-il)oxi- lambda5-fosfano), 99.5 %), metamidofós ([amino(metilsulfanil)fosforil]oximetano, 99.5 %), cadusafós (2-[butano-2-ilsulfanil(etoxi)fosforil]sulfanilbutano, 97.2 %), monocrotofós (dimetil [(E)-4-metilamino-4-oxobut-2-en-2-il] fosfato, 99.5 %), atrazina (6-cloro-4-N-etil-2-N-propan-2-il-1,3,5-triazina-2,4-diamina, 99.0 %), ametrina (4-N- etil-6-metilsufanil-2-N-propan-2-il-1,3,5-triazina-2,4-diamina, 98.0 %), terbutilazina (2- N- tert-butil-6-cloro-4-N-etil-1,3,5-triazina-2,4-diamina, 98 %), terbutrina (2-N-tert-butil- 4-N-etil-6-metilsufanil-1,3,5-triazina-2,4-diamina, 100 %) y oxitetraciclina ((4S,4aR,5S,5aR,6S,12aR)-4-dimetilamino-1,5,6,10,11,12a-hexahidroxi-6-metil-3,12- dioxo-4,4a,5,5a-tetrahidrotetraceno-2-carboxamida, 99 %) se obtuvieron de Chem Service (West Chester, Pennsylvania, USA). Los plaguicidas formulados de clorpirifós (Solver ® 48SC, 48 g/100 mL), atrazina (Atranex® 90WG, 90 g/100 g), ametrina (Agromart® Ametrina 50SC, 50 g/100 mL), terbutilazina (Terbusol® 50SC, 50 g/100 mL), terbutrina (Terbutrex® 50SC, 50 g/100 mL) y oxitetraciclina (Terramicina Agrícola® 5WP, 5 g/100 g) se consiguieron de negocios locales. El clorpirifós radiomarcado (14C- CLP; [anillo-2,6-14C2]-clorpirifós; 4.38 × 10 9 Bq g−1; pureza radioquímica 98.99 %; pureza química 98.34 %) se obtuvo de Izotop (Institute of Isotopes Co., Budapest, Hungría). El hidróxido de potasio (grado analítico) se obtuvo de Merck (Darmstadt, Germany). El coctel para los análisis de centelleo líquido Ultima Gold se obtuvo de Perkin Elmer (Waltham, Massachusetts, USA). Los solventes y reactivos para extracción de los plaguicidas se detallan en Ruiz-Hidalgo et al. (2014). 6.1.2. Biomezcla Una biomezcla que contiene fibra de coco, compost y suelo de una finca productora en Tierra Blanca de Cartago, en las proporciones volumétricas 45:13:42, respectivamente, almacenada a temperatura ambiente con humedad controlada, se utilizó para los ensayos 18 de degradación de plaguicidas, toxicidad aguda, fitotoxicidad, cuantificación por NMP y cuantificación génica. 6.1.3. Medio mínimo La composición del medio mínimo utilizado en el ensayo de NMP por variación del potencial redox contiene (por litro) 0.5 g KH2PO4, 0.2 g MgSO4· 7H2O, y 10 mL de una solución de elementos traza que contiene (por litro de solución): 1 g MnSO4 · H2O, 0.9 g CaSO4, 0.8 g FeSO4 · 7H2O, 0.2 g CoSO4 · 7H2O, 0.2 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.03 g CuSO4 · 7H2O, 0.02 g Na2WO4, 0.02 g Na2SeO3 y 0.02 g NiCl2 · 6 H2O. Citrato en una concentración final de 15 mmol L-1 y succinato a una concentración final de 28 mmol L-1 fueron utilizados como fuentes de carbono. La atrazina (99.0 %) a una concentración final de 2 mmol L-1 se utilizó como única fuente de nitrógeno (Cook y Hütter, 1981). 6.2. Procedimientos experimentales 6.2.1. Ensayo de eliminación de plaguicidas organofosforados y triazinas en la biomezcla a diferentes concentraciones de oxitetraciclina, ensayos toxicológicos y ensayos de cuantificación génica Los ensayos de eliminación se llevaron a cabo en recipientes plásticos (17x11x9.5 cm) que contenían ~700 mL de biomezcla. Se prepararon tres tratamientos diferentes y un control, todos por triplicado. A todos los recipientes con biomezcla excepto a los controles se les agregó una mezcla de 8 plaguicidas: CLP, MTM, CDF, MNC, ATZ, AMT, TBZ y TBT, para que la concentración final en la biomezcla fuese de 50 mg kg-1 en el caso de ATZ, AMT, TBZ, TBT y CLP, de 6.8 mg kg-1 para el MTM y de 10 mg kg-1 para CDF. El primer tratamiento consistió únicamente en la biomezcla más la mezcla de plaguicidas, al segundo tratamiento se le agregó, además, una concentración de OTC de 10 mg kg-1 y 50 mg kg-1 para el tercer tratamiento. El contenido de todos los recipientes se homogenizó manualmente y se incubó en condiciones estáticas a 25°C hasta el final del ensayo; periódicamente se verificó de forma gravimétrica la pérdida de volumen y se les agregó agua para mantener un contenido de agua constante en la matriz. Se tomaron muestras de 5 g periódicamente (0, 4, 7, 11, 14, 28, 42, 60 días) durante un periodo de 60 días, considerado suficiente tomando en cuenta la vida media de degradación en campo de los 19 plaguicidas estudiados, para determinar la concentración remanente de cada plaguicida y de OTC (OTC no se determinó en las muestras del tratamiento que no contiene OTC) por LC-MS/MS. También se tomaron muestras de 2 g (0, 4, 7, 11, 14 y 28 días) para los ensayos de cuantificación génica y adicionalmente se tomó una muestra compuesta (100 g; 33.3 g por réplica) de cada tratamiento a los (7, 14, 28, 42 y 60 días) para realizar los ensayos ecotoxicológicos. 6.2.2. Ensayo de NMP para la cuantificación de degradadores de atrazina (NMP- TTC) Un gramo de biomezcla preexpuesta a atrazina fue diluido en 9 mL de solución amortiguadora de fosfato de sodio (1.2 mmol L-1, pH 7.0) y homogenizados, posteriormente se realizaron diluciones decimales seriadas y se trabajó con las diluciones 1.0x10-2 a 1.0x10-10 para ser utilizados como inóculo en el ensayo de NMP-TTC. El ensayo se llevó a cabo según el método validado por Dinamarca y colaboradores (Dinamarca et al., 2007) en microplacas de 96 pozos. A cada pozo se le agregó 200 μL de una disolución de atrazina (2 mmol L-1) en metanol, se dejó secar en condiciones de esterilidad por 5 días. Se añadió a cada pozo 45 µL de medio mínimo y 45 µL de cada respectiva dilución de biomezcla por quintuplicado. La microplaca se incubó por una semana a 25ºC en cámara húmeda para evitar pérdidas por evaporación. Al final del periodo de incubación se añadió TTC (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium), de manera que se alcanzara una concentración final en cada pozo de 0.01 mL L-1, se incubó por 4 horas más a 25ºC y antes de leer se agregó 100 µL de etanol para disolver precipitados que puedan interferir con la lectura. Se midió la absorbancia a 490 nm en un espectrofotómetro MultiSkan Sky® (Thermo Scientific), se consideraron positivos los pozos que superaron la absorbancia del blanco más 3 desviaciones estándar. La estimación de los microorganismos viables capaces de degradar atrazina se realizó según los cálculos establecidos por la FDA en el Manual de análisis bacteriológico (BAM) para la cuantificación de bacterias por NMP (Blodgett, 2010) y según lo descrito por Jarvis et al. (2010). 20 6.2.3. Ensayo de NMP por mineralización de 14C-CLP para la cuantificación de degradadores de clorpirifós (NMP-14C) Se realizaron diluciones decimales de la biomezcla con los diferentes tratamientos en solución amortiguadora de fosfato de sodio (1.2 mmol L-1, pH 7.0), para esto se pesó 1 g de biomezcla y se añadieron 9 mL de la solución amortiguadora (dilución 1.0x10-1), a partir de esta dilución se continuó con las demás diluciones decimales hasta la dilución 1.0x10-10, todas con volumen final de 10 mL. Para determinar el NMP de degradadores de CLP se midió la mineralización del 14C-CLP a través de la producción de 14CO2 en sistemas biométricos para cada dilución de la biomezcla. Se implementó el procedimiento descrito por Lehmicke y colaboradores (Lehmicke et al., 1979) modificado. Brevemente, los sistemas biométricos se construyeron utilizando viales de vidrio de 15 mL y 1.5 mL, los más pequeños se utilizaron como trampa para capturar el 14C-CO2. Se tomaron 600 µL de cada una de las diluciones y se colocaron por quintuplicado en los viales de 15 mL. Posteriormente, a cada sistema se le añadió CLP hasta alcanzar una concentración final de 50 mg kg-1 en un volumen de 6 mL, 60 µL de CLP radiomarcado con 14C (1.0x107 dpm) y se completó el volumen hasta 6 mL con solución amortiguadora de fosfatos. Finalmente, al sistema se le añadió el vial con 1.5 mL con 1.0 mL de KOH (0.25 mol L-1) donde se capturó el 14C-CO2 producto de la mineralización del 14C-CLP. Los sistemas se montaron a los días 0, 11 y 28 después de aplicar los diferentes tratamientos a la biomezcla. Todos los sistemas fueron incubados en la oscuridad a (25±1) °C durante 30 días, cuando el KOH se retiró para medir su actividad. Quintuplicados de una muestra de solución amortiguadora sin 14C-CLP, fueron utilizados como control negativo. 6.3. Procedimientos analíticos 6.3.1. Extracción y cuantificación de plaguicidas La extracción de los plaguicidas organofosforados y triazinas se llevó a cabo utilizando una mezcla de agua y acetonitrilo acidificado (ácido fórmico 1 mL L-1) tal como se describe en Ruiz-Hidalgo et al, 2014. La extracción de OTC se realizó según el método descrito en Jiménez-Gamboa et al., 2018. El análisis de los plaguicidas se hizo por LC- 21 MS/MS utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC-1290 Infinity LC, Agilent Technologies, CA) acoplada a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Agilent Technologies, modelo 6460). La separación cromatográfica se llevó a cabo a 40 °C inyectando 6 μL del extracto de la muestra en una columna Poroshell 120 EC-C18 (100 mm x 2.1 m i.d., tamaño de partícula 2.7 μm), y utilizando agua acidificada (ácido fórmico 0.1 mL L-1, A) y metanol acidificado (ácido fórmico 0.1 mL L-1, B) como fases móviles. Como estándar interno y estándar de recuperación se utilizó el linurón-d6 y el carbofurán-d3 respectivamente. Las transiciones seleccionadas, los límites de detección (LOD) y los límites de cuantificación (LOQ) para los analitos se muestran en el cuadro 2. Las condiciones del detector del espectrómetro de masas que fue utilizado se describen en Chin-Pampillo et al. (2015b). Cuadro 2. Transiciones seleccionadas y otros parámetros en la detección de organofosforados y triazinas en la biomezcla, utilizando el método de monitoreo dinámico de reacción múltiple (dMRM) Compuesto Transición Ion Ion Fragmentador Energía de Tiempo de Tipo de LOD LOQ (µg precursor producto (V) colisión retención transición (µg kg-1 kg-1 (V) (min) biomezcl biomezcla) a) Ametrina 228 186 106 17 8.05 Q 45.5 88.8 96 25 q Atrazina 216 174 106 17 9.45 Q 39.8 79.8 96 25 q Terbutilazina 230 174 104 13 11.3 Q 34.9 68.6 96 29 q Terbutrina 242 186 96 17 9.8 Q 41.9 81.9 91 29 q Clorpirifós 350 97 90 30 15.74 Q 64.3 124.2 198 15 q Metamidofós 142 94 90 10 0.98 Q 41.9 82.1 125 10 q Cadusafós 271 159 70 5 14.3 Q 66.5 128.8 131 20 q Monocrotofós 224 127 62 13 1.85 Q 48.7 94.8 193 5 q 22 Linurón-d6 255 160 92 17 11.14 Q - - (e.i.) 185 13 q Carbofurán-d3 225 165 86 9 7.67 Q - - (e.s.) 123 21 q Q: transición de cuantificación, q: transición de confirmación. e.i.: estándar interno; e.s.: estándar de recuperación. LOD: límite de detección; LOQ: límite de cuantificación Los datos por triplicado de las concentraciones de cada plaguicida y OTC se emplearon para determinar sus vidas medias de eliminación (DT50). Primero se graficaron los datos y se buscó el modelo de mejor ajuste para la curva con el programa SigmaPlot 12.0 (San José, CA, USA). Las curvas se ajustaron a modelos de decaimiento exponencial o modelos sigmoidales de Gompertz; en cada caso se tomarón los parámetros de la curva y se utilizarón para calcular las respectivas DT50 según una cinética de primer orden (ecuación 1), en la que la DT50 no depende de la concentración inicial. 𝑙𝑛2 𝐷𝑇50 = (1) 𝑘 Donde: k = es la constante de decaimiento en las ecuaciones del modelo de decaimiento exponencial En el caso de las curvas ajustadas al modelo de Gompertz, para calcular la DT50 se igualó la mitad del valor de la asíntota superior a la ecuación de Gompertz y se despejó x que corresponde al número de días. Las vidas medias para cada plaguicida fueron comparadas en cada tratamiento calculando sus intervalos de confianza, para esto se utilizó el software SPSS Statistics 19 (IBM, Armonk, NY). En aquellos casos en que los intervalos de confianza no se traslaparon, se consideró que existe diferencia significativa entre los tratamientos. 6.3.2. Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna El ensayo de toxicidad aguda se llevó a cabo con el dáfnido Daphnia magna. Se utilizaron elutriados preparados con las muestras de los ensayos de degradación como matriz analítica: Para preparar los elutriados se seguió el protocolo EPA-823-B-01-002 (EPA, 23 2001). Los ensayos ecotoxicológicos se realizaron por triplicado usando viales de vidrio de 25 mL de capacidad y agua moderadamente dura reconstituida sin vitamina B12 para las diluciones. Diez dáfnidos neonatos (menos de 24 h) se colocaron en cada vial y se expusieron a 20 mL de las diluciones respectivas de los elutriados; posteriormente se incubaron en oscuridad a (23±1) °C. A las 24 h y 48 h de exposición se contó el número de individuos muertos o inmovilizados. La CE50 (concentración a la cual se produce el 50 % de muerte en los individuos) se determinó utilizando el software TOXCALC – Toxicity Data Analysis Software (Tidepool Scientific Software, CA, USA), y los resultados de toxicidad se expresaron como unidades de toxicidad (TU), calculadas de acuerdo a la expresión: TU= (CE )-150 x 100. 6.3.3. Ensayo de fitotoxicidad con Lactuca sativa La fitotoxicidad de cada matriz se evaluó por medio de ensayos de germinación con lechuga (Lactuca sativa var. Georgia). La germinación relativa de las semillas (GS) y la elongación relativa de la raíz (ER) se determinaron utilizando diez semillas expuestas a los elutriados durante seis días de incubación a 22 °C, usando las ecuaciones (2) y (3). Estos parámetros se determinaron por comparación con controles de germinación obtenidos de la exposición a agua destilada bajo las mismas condiciones. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y el índice de germinación (IG) se calculó de acuerdo a la ecuación (4). semillas germinadas GS = x100 (2) semillas germinadas en el control longitud promedio de la raíz ER = x100 (3) longitud promedio de la raíz en el control (GS)x(ER) IG = (4) 100 6.3.4. Determinación 14CO2 del ensayo de 14C-NMP A 8 mL de coctel de centelleo líquido se le agregó un alícuota de 1 mL proveniente de las muestras de KOH recolectadas de los sistemas biométricos, se homogenizó y la actividad del 14C se midió por centelleo líquido utilizando el equipo Beckman LSC6000SC. Se calculó el promedio de la medición de los controles negativos + 2 desviaciones estándar y se utilizó como criterio para definir los viales positivos. La estimación de los 24 microorganismos viables capaces de degradar clorpirifós se realizó según los cálculos establecidos por la FDA (U.S. Food and Drug Administration) en el Manual de análisis bacteriológico (BAM) para la cuantificación de bacterias por NMP (Blodgett, 2010) y según lo descrito por Jarvis et al. (2010). 6.4. Análisis de expresión de genes de degradación de organofosforados y triazinas 6.4.1. Extracción de ADN total El ADN total fue extraído a partir de las muestras de biomezcla almacenada a 25 °C utilizando el kit NucleoSpin™ Soil (Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones del fabricante, incluso para seleccionar el buffer de lisis más adecuado para realizar la extracción. La cuantificación del ADN obtenido se hizo midiendo la absorbancia a 260 nm en el equipo Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) y en el fluorómetro Quantifluor dsDNA System (Promega) para estándarizar la cantidad de ADN que se utilizó en el qPCR. La integridad del ADN, además, fue evaluada mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 % utilizando el marcador de peso molecular GeneRuler 50 pb (Thermo Fisher). Los productos de ADN fueron almacenados a -80 ºC hasta su uso. 6.4.2. PCR punto final Se utilizó el master mix DreamTaq PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific) a una concentración final de 1X y los imprimadores del cuadro 3 a una concentración final del 0.4 μM, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó agua libre de nucleasas como control de PCR y ADN de una cepa de E. coli ATCC 25922 como control positivo para la amplificación del gen del ARNr 16S, presente en todas las bacterias, por lo que es utilizado como control de amplificación. Se prepararon 25 μL de mezcla de reacción, la cual fue incubada en un termociclador T100 Thermal Cycler (Bio-Rad) a 95 ºC por 3 minutos, seguidos de 35 ciclos de 95 ºC por 30 seg, 50 ºC por 30 seg y 72 ºC por 1 min, y por último 5 minutos a 72 ºC para la terminación de la reacción de síntesis. Los productos de PCR se congelaron a -20 ºC hasta que se corrieron en un gel de agarosa a concentración de 2 g/100 mL utilizando el marcador de peso molecular GeneRuler 100 bp DNA ladder (Thermo Scientific). 6.4.3. Obtención de controles positivos para el qRT-PCR 25 Debido a que los genes en estudio corresponden a genes muy específicos de degradación de plaguicidas, no se contaba con cepas aisladas positivas para los genes de interés. Por lo tanto, para obtener los controles positivos se siguió el procedimiento de Smith et al. (2006) modificado. Brevemente, se utilizaron los imprimadores para obtener productos de PCR con los genes de interés proveniente de la biomezcla, para utilizarlos como controles positivos. A falta de cepas tipo, estos controles permitieron confirmar que los amplicones en las muestras tuvieron el mismo tamaño que los generados con el control, obteniendo así resultados preliminares que podrían ser confirmados más adelante con secuenciación. Una vez obtenido el ADN, se corrió un gel de agarosa a concentración de 2 g/100 mL, se cortaron las bandas de cada gen y se purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). El producto purificado, se cuantificó con el fluorómetro Quantifluor dsDNA System (Promega) y se almacenó a -70 ºC hasta su uso. 6.4.4. PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) Se prepararón disoluciones de ADN de 10 ng μL-1 para los ADN obtenidos, los que se utilizarían como controles y los correspondientes a las muestras. El qRT-PCR se llevó a cabo utilizando un equipo QuantStudio 3 Real Time PCR (ThermoFisher Scientific). Las reacciones se llevaron a cabo en placas de reacción de 96 pozos MicroAmp (Applied Biosystems) y utilizando el Master mix PowerUp SYBR Green (Applied Biosystems) con un volumen total de reacción en cada pozo de 10 μL que contenga 5 μL del master mix, 1 μL del ADN, el cuál fue previamente normalizado a una concentración de 10 ng μL-1, 0.5 μL (10 μmol L-1) del forward primer, 0.5 μL (10 μmol L-1) del reverse primer, y 3 μL de agua libre de nucleasas. Para realizar las amplificaciones se utilizaron las siguientes temperaturas, una incubación inicial a 50 °C por 2 min y 2 min a 95 °C, seguido de 45 ciclos de 95 °C por 15 s, 58 °C por 15 s y 72 ºC por 1 min; en este punto es donde se colectaron los datos. Finalizados los ciclos, se hizo una incubación a 95 ºC por 15 s, 60 ºC por 1 min y finalmente 95 ºC por 1 s. La lista de los imprimadores utilizados se muestra en el cuadro 3. Se verificó con las curvas de melting que el punto más alto en la curva obtenida de las muestras coincidiera con el punto más alto de la curva de melting de los controles. La interpretación de los resultados obtenidos se realizó utilizando el método comparativo de Ct (∆∆CT), según lo descrito por el fabricante (Applied Biosystems, 2008) 26 con el cual se determina la cantidad relativa de la secuencia objetivo en las muestras con respecto a la abundancia total de bacterias, medida a través de la expresión del ADN que codifica para un gen de referencia housekeeping, por ejemplo, el ARN ribosomal (región 16S). Brevemente, se calculó el ∆CT con la siguiente ecuación ∆𝐶𝑇 = ?̅?𝐶𝑇 𝑑𝑒𝑙 𝐺𝐻𝐾 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎 − 𝐶𝑇𝐺𝐼 (5) Donde: GHK = gen housekeeping GI = gen de interés Posteriormente se determinó el ∆∆CT con la ecuación (6) y el cambio en el incremento o fold change con la ecuación (7) ∆∆𝐶𝑇 = ∆𝐶𝑇𝑖 − ∆𝐶𝑇𝑓 (6) Donde: i = tratamiento inicial a comparar f = tratamiento final a comparar 𝐶𝐼: 2−𝛥𝛥𝐶𝑇 (7) Donde: CI = cambio en el incremento de la muestra con tratamiento final respecto a la muestra con tratamiento inicial Para una mayor fiabilidad en los resultados, se utilizaron diferentes genes de referencia housekeeping: dos pares de imprimadores para el 16S y uno del 23S para calcular la abundancia relativa de bacterias. Los datos de pendiente y eficiencia para cada uno de los genes housekeeping se puede consultar en la sección de anexos. 27 Cuadro 3. Secuencias de los imprimadores utilizados para los ensayos de expresión. Gen Imprimador Secuencia Referencia 16S Wang 16S F CAATGGACGAAAGTCTGACG Wang et al., 2016 16S R ACGTAGTTAGCCGTGGCTTT Wang et al., 2016 16S Monard 16S (341) F CCTACGGGAGGCAGCAG Monard et al., 2013 16S (515) R TTACCGCGGCTGCTGGCAC Monard et al., 2013 23S 23S (2069) F GACGYAAAGACCCCRTG Hunt et al., 2006 23S (2241) R ACCGCCCCAGTHAAACT Hunt et al., 2006 atzA atzA 1F GTGGCGGTGAGGTTGTATTG NA atzA 1R ACCTCACCATAGACCGCCAT NA atzD atzD 1F CTCGCTACAGAAGAGGTGCC NA atzD 1R GTTGTGCTCCAGTTCGATGC NA opd opd 2F AAGGCTGTGAGAGGATTGCG NA opd 2R CGCGAAACCTCGGCCAATAA NA opdA opdA 1F TACTCGGTCGTGGCAAACAA NA opdA 1R AAAACCCGAACAGCCAGTCA NA 28 7. Resultados 7.1. Eliminación de plaguicidas organofosforados y triazinas en presencia de oxitetraciclina Se evaluó la eliminación de las triazinas ATZ, AMT, TBT y TBZ y los organofosforados CLP, MNC, MTM y CDF en la biomezcla, a la que, además, se añadió OTC a diferentes concentraciones. Los resultados se muestran en las figuras 6 y 7 y en el cuadro 4. Los organofosforados alcanzaron disminuciones en su concentración de aproximadamente un 90 % al día 11, manteniéndose casi invariable hasta el final del experimento (Figura 6), únicamente con excepción del CDF (eliminación de menos del 45 % al día 60). En el caso del CLP y el CDF, se observó un retraso en su eliminación hasta el día 7 del ensayo, no así en el MTM y en el MNC. El CDF fue el que presentó una mayor persistencia en la biomezcla durante el tiempo del ensayo; a pesar de esto logró eliminarse de la biomezcla en el mismo periodo que los demás plaguicidas, hasta en un 40.8% en ausencia de OTC, un 35.3% (B+M+OTC10) y un 43.3% (B+M+OTC50). Las DT50 de los organofosforados en la biomezcla están por debajo de los dos días, a excepción del cadusafós, cuyas DT50 fueron de 61.3 d (B+M), 59.2 d (B+M+OTC10) y 56.8 d (B+M+OTC50) (Cuadro 4). 29 50 20 40 Clorpirifós 15 Monocrotofós 30 10 20 B+M B+M+OTC10 B+M+OTC50 5 10 0 0 0 10 20 60 0 10 20 60 14 1,2 1,0 12 Metamidofós Cadusafós 0,8 10 0,6 8 0,4 6 B+M B+M+OTC10 0,2 B+M+OTC50 4 0,0 0 0 10 20 60 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (d) Tiempo (d) Figura 6. Eliminación de organofosforados en la biomezcla a diferentes concentraciones de oxitetraciclina. B+M: Biomezcla + mezcla de plaguicidas (●). B+M+OTC10: Biomezcla + mezcla de plaguicidas + OTC a 10 mg kg-1 (○). B+M+OTC50: Biomezcla + mezcla de plaguicidas + OTC a 50 mg kg-1 (▼). Por su parte, de forma similar a los organofosforados, las cuatro triazinas mostraron una disminución en su concentración hasta valores cercanos o inferiores a los 5 mg kg-1 (>95 % eliminación) al día 11, sin embargo, todas ellas durante los primeros siete días del ensayo presentaron un retraso o aparente “fase lag” en la cinética de eliminación (Figura 6), este efecto fue mucho más evidente para las triazinas que para los organofosforados CLP y CDF. Adicionalmente, se calcularon las vidas medias de eliminación (DT50) según el modelo de mejor ajuste para cada una de las curvas (Cuadro 4); la TBZ y la TBT presentaron las DT50 más prolongadas con valores promedio de 10.9 d y 10.3 d -1 Concentración (mg kg ) Concentración (mg kg-1) 30 respectivamente; mientras que la AMT tuvo en promedio una DT50 de 7.7 d, la más corta de la triazinas. 25 25 20 Atrazina 20 Terbutilazina 15 15 10 10 5 5 0 0 0 10 20 60 0 10 20 60 25 25 20 20 Ametrina Terbutrina 15 15 10 10 B+M 5 B+M+OTC10 5 B+M+OTC50 0 0 0 10 20 60 0 10 20 60 Tiempo (d) Tiempo (d) Figura 7. Eliminación de triazinas en la biomezcla a diferentes concentraciones de oxitetraciclina. B+M: Biomezcla + mezcla de plaguicidas (●). B+M+OTC10: Biomezcla + mezcla de plaguicidas + OTC a 10 mg kg-1(○). B+M+OTC50: Biomezcla + mezcla de plaguicidas + OTC a 50 mg kg-1(▼). La presencia de OTC en la biomezcla no afectó el resultado final de eliminación de los plaguicidas evaluados, sin embargo, si aportó diferencias en los DT50 obtenidos (figuras 6 y 7, cuadro 4). De forma simultánea a la eliminación de plaguicidas, se evaluó la eliminación de oxitetraciclina en la biomezcla (figura 8) y se encontró que al día 60 la concentración de OTC se eliminó de la biomezcla hasta en un 70.5% con una DT50 de 8.0 d (concentración inicial 10 mg kg-1) y un 61.0% con una DT50 de 12.3 d (concentración inicial 50 mg kg-1). -1 Concentración (mg kg ) Concentración (mg kg-1) 31 60 B+M+OTC10 50 B+M+OTC50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (d) Figura 8. Perfil de concentración de oxitetraciclina durante la eliminación de triazinas y organofosforados en una biomezcla. Biomezcla con concentración inicial de oxitetraciclina de 10 mg kg-1(○) y 50 mg kg-1(▼). Cuadro 4. Resumen de vidas medias y porcentajes de eliminación a los 60 días para cada uno de los agroquímicos estudiados Agroquímico Tratamiento1 Concentración Concentración Porcentaje DT 250 Intervalo de Modelo de Valor inicial (µg kg- final (µg kg-1) de (d) confianza al 50% mejor de r 1) eliminación Superior Inferior ajuste a los 60 d (d) (d) (%) Atrazina B+M 17 608.5 78.0 99.6 8.9 6.91 8.76 Gompertz3 0.98 B+M+ 16 879.7 39.0 99.8 7.1 7.10 7.97 Gompertz3 0.99 OTC10 B+M+ 19 914.4 39.0 99.8 9.5 9.55 10.92* Gompertz3 0.99 OTC50 Ametrina B+M 18 566.0 254.0 98.6 6.9 6.96 6.97 Gompertz3 0.98 B+M+ 17 939.4 265.5 98.5 6.9 6.98 6.99 Gompertz3 0.99 OTC10 B+M+ 21 598.3 312.4 98.6 9.4 6.99 8.27* Gompertz3 0.99 OTC50 Terbutilazina B+M 16 815.2 132.8 99.2 10.9 10.61 10.96 Gompertz3 0.98 B+M+ 16 385.5 112.5 99.3 10.8 10.93 10.95 Gompertz3 0.98 OTC10 B+M+ 19 082.6 115.7 99.4 11.0 10.98 10.99* Gompertz3 0.99 OTC50 Terbutrina B+M 17 693.2 396.9 97.8 9.4 9.15 10.44 Gompertz3 0.98 -1 Concentración oxitetraciclina (mg kg ) 32 B+M+ 17 123.5 383.0 97.8 10.5 10.63 10.91 Gompertz3 0.99 OTC10 B+M+ 20 122.7 450.5 97.8 10.9 10.53 10.95 Gompertz3 0.99 OTC50 Clorpirifós B+M 33 011.7 560.4 98.3 9.0 9.31 10.42 Gompertz3 0.98 B+M+ 31 066.3 678.1 97.8 9.2 8.98 9.82 Gompertz3 0.98 OTC10 B+M+ 37 136.6 731.4 98.0 9.6 8.04 8.75* Gompertz3 0.99 OTC50 Metamidofós B+M 447.6 41.0 90.8 2.0 1.83 2.47 Decaimiento 0.97 exponencial4 B+M+ 874.0 41.0 95.3 1.1 1.00 1.47 Decaimiento 0.99 OTC10 exponencial4 B+M+ 705.7 41.0 94.2 1.2 1.13 1.16 Decaimiento 0.98 OTC50 exponencial4 Monocrotofós B+M 15 618.6 48.0 99.7 1.7 1.52 2.00 Decaimiento 0.99 exponencial4 B+M+ 15 044.0 48.0 99.7 1.7 1.47 1.83 Decaimiento 0.99 OTC10 exponencial4 B+M+ 17 865.1 48.0 99.7 1.7 1.24 1.79 Decaimiento 0.99 OTC50 exponencial4 Cadusafós B+M 8632.5 5114.4 40.8 61.3 57.50 68.75 Decaimiento 0.81 exponencial4 B+M+ 7926.2 5131.7 35.3 59.2 58.49 68.75 Decaimiento 0.76 OTC10 exponencial4 B+M+ 9485.1 5375.0 43.3 56.8 51.93 65.91 Decaimiento 0.82 OTC50 exponencial4 Oxitetraciclina 10 mg kg-1 13.1 3.9 70.5 8.0 7.10 8.84 Decaimiento 0.97 exponencial5 50 mg kg-1 53.5 20.9 61.0 12.3 9.89 11.42* Decaimiento 0.95 exponencial5 1 B=Biomezcla, M=mezcla de plaguicidas, OTC10=oxitetraciclina 10 mg kg-1, OTC50=oxitetraciclina 50 mg kg-1 2DT50: Vida media de eliminación 3 Ajuste sigmoidal de Gompertz con 3 parámetros 4 Decaimiento exponencial con dos parámetros 5 Decaimiento exponencial con tres parámetros Se resaltan en negrita los intervalos de confianza significativamente diferentes respecto al tratamiento sin OTC 33 * Intervalos de confianza significativamente diferentes entre los tratamientos B+M+OTC10 y B+M+OTC50 7.2.Toxicidad residual de la biomezcla durante el tratamiento de organofosforados y triazinas en co-aplicación con oxitetraciclina La toxicidad residual de la biomezcla se evaluó con dos diferentes organismos indicadores; los resultados obtenidos se muestran en la figura 9. La toxicidad para D. magna disminuyó drásticamente al día 11, alcanzando detoxificaciones superiores al 94% (cuadro 5), de forma concordante con la eliminación de los plaguicidas. El caso de L. sativa fue diferente, en todos los tratamientos excepto B+M+OTC50, hubo un pico en el índice de germinación (IG) al día 11, lo que indica una detoxificación inicial. Sin embargo, rápidamente volvió a valores similares a los observados al inicio del ensayo. Posterior a esta caída en el índice de germinación, la toxicidad para L. sativa fue disminuyendo hasta alcanzar valores de IG alrededor de 60 al final del ensayo. Los cambios netos en el índice de germinación (cuadro 5) fueron de +26.0% (B+M), +22.4% (B+M+OTC10) y +36.7% (B+M+OTC50). El tratamiento con mayor concentración de OTC, tuvo un comportamiento de detoxificación con tendencia lineal durante todo el experimento para L. sativa. Al final del ensayo los valores del índice de germinación fueron similares para los tres tratamientos, rondando el valor de IG=60. 2500 80 2000 Daphnia magna 60 1500 1000 40 B+M B+M+OTC10 500 B+M+OTC50 Lactuca sativa 20 0 0 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 Tiempo (d) Tiempo (d) Figura 9. Cambios en la toxicidad residual en la biomezcla durante la eliminación de una mezcla de triazinas y organofosforados Toxicidad (TU) Índice de germinación 34 Cuadro 5. Cambios netos de disminución de toxicidad en la biomezcla durante la eliminación de triazinas, organofosforados y oxitetraciclina. Ensayo D. magna L. sativa Toxicidad Toxicidad Cambio Toxicidad Toxicidad Cambio inicial final (TU) neto inicial final (IG) neto (TU) (%) (IG) (%) B+M 2130 56 -97.4 36.4 62.5 +26.0 B+M+OTC10 1590 81 -94.9 36.3 58.7 +22.4 B+M+OTC50 2380 94 -96.1 27.4 64.1 +36.7 7.3. Cuantificación de genes involucrados en la degradación de organofosforados y triazinas durante su eliminación en la biomezcla 7.3.1. Selección de los imprimadores y genes a evaluar en el qPCR Inicialmente se contaba con 8 pares de imprimadores, correspondientes a dos pares de imprimadores diferentes para cada uno de 2 de los genes involucrados en las vías de degradación de las familias de plaguicidas estudiadas: triazinas y organofosforados, sin embargo, posterior a pruebas con todos los imprimadores, el total a utilizar en este estudio se redujo a los imprimadores que se muestran en el cuadro 3. En un inicio la mayoría de los imprimadores no generaban buenas amplificaciones, a pesar que se probaron diferentes estrategias para optimizar la reacción de PCR, como el PCR touchdown, PCR en gradiente y PCR probando 3 temperaturas de annealing diferentes, por lo que se realizaron diluciones del ADN, obteniendo amplificaciones en la reacción de PCR con una dilución 1.0x10-1, mientras que en la muestra sin diluir no hubo amplificación. Esto indica que en las muestras de ADN hay presencia de inhibidores como se observa en la figura 10. Se procedió a seleccionar una pareja de imprimadores por familia de plaguicidas, para ser evaluados en el qPCR. Para esto se probaron las parejas de imprimadores disponibles en un PCR punto final utilizando ADN obtenido de la biomezcla adicionada con los plaguicidas estudiados. Los imprimadores que demostraron amplificar y ser viables para el estudio fueron atzA EAV1 y opd EAV2, además de 35 imprimadores 16S Wang, 16S Monard y 23S, que se seleccionaron como genes housekeeping para las corridas de qPCR. Figura 10. Gel de agarosa con los productos de amplificación de las diluciones de ADN con los imprimadores 16S Monard (A) y 16S Wang (B) para ver inhibidores. 1: MPM 50 pb; 2: Dilución 1/1; 3: 1/10; 4: 1/100; 5: 1/1000; 6: control negativo. 7.3.2. Obtención de controles positivos para qPCR Una vez seleccionados los imprimadores y la dilución a la cual trabajar, se procedió a obtener el ADN que sería utilizado como control positivo para la corrida del qPCR. En la figura 11 se muestran las bandas que se cortaron y purificaron para usarse como controles positivos, para los carriles 3 y 6 se utilizaron las bandas con mayor intensidad las cuales corresponden a los tamaños esperados para el amplicón. Figura 11. Gel de electroforesis con las bandas seleccionadas para purificar y usar el ADN como control positivo. 1: MPM 100 pb, 2: 23S, 3: 16S Monard, 4: 16S Wang, 5: atzA, 6: opd, 7: control negativo. 36 7.3.3. PCR punto final para los genes 16S Wang, 16S Monard, atzA, atzD, opd y opdA y su presencia en el tiempo Se corrió una reacción de PCR punto final con muestras de ADN obtenido de los tratamientos B+M, B+M+OTC10 y B+M+OTC50 en diferentes puntos en el tiempo. Los resultados se muestran en la figura 11 y cuadro 6. Cuadro 6. Resultados del PCR punto final de los tratamientos B+M, B+M+OTC10 y B+M+OTC50 en el tiempo Amplificación de genes Día Tratamiento 16S Wang 16S Monard atzA atzD opd opdA 0 B+M No No No No No No B+M+OTC10 Sí Sí Sí No Sí No B+M+OTC50 Sí Sí Sí No Sí No 11 B+M+OTC10 Sí No No No No No B+M+OTC50 Sí Sí Sí No Sí No 28 B+M+OTC10 Sí Sí Sí No Sí No B+M+OTC50 Sí No Sí No No No Los resultados, a pesar que requieren ser afinados para obtener datos más concluyentes, pueden ser considerados como resultados preliminares que indicaron la no amplificación en estas condiciones de los genes atzD y opdA en ninguna de las muestras, pero por otro lado respecto a los otros genes, al día 0 en el tratamiento B+M+OTC10 hay una fuerte presencia de los genes 16S Wang, 16S Monard, atzA y opd, mientras que en el tratamiento B+M+OTC50 se observan las bandas de 16S Wang, 16S Monard, atzA y opd, pero mucho más débiles que en el tratamiento con la concentración de OTC más baja. Al día 11 en el tratamiento B+M+OTC10 no hubo amplificación de ningún gen además del 16S Wang, pero en B+M+OTC50 se mantuvieron los genes observados al día 0. Por el contrario, al día 28 el tratamiento B+M+OTC10 presentó los dos genes de 16S, el atzA y el opd, mientras que en B+M+OTC50 solo se observaron las bandas correspondientes a 16S Wang y atzA. Por lo tanto, se evidencia la presencia de los genes 16S, atzA y opd en la 37 biomezcla, los cuales probablemente están involucrados en la degradación de los plaguicidas, sin embargo, su distribución y expresión no son claros. 7.3.4. qPCR para los genes atzA y opd en el tiempo La calidad y cantidad del ADN obtenido puede observarse en los cuadros A1 y A2, donde se observa que la calidad no fue la óptima. Los índices de expresión se calcularon tanto con 16S Wang como con 16S Monard como genes housekeeping; con el 23S no fue posible calcularlo debido a que no hubo amplificación en la curva de este gen. Además, no se presentan resultados del gen opd ya que ninguna de las muestras amplificó. Respecto al gen atzA, como se puede ver en el cuadro 9, la cuantificación siempre fue ligeramente mayor en el tratamiento B+M+OTC50; adicionalmente, el comportamiento en el tiempo mostró que la concentración del gen atzA disminuyó al día 28, mientras que en el día 0 y 11 fue muy similar. Cuadro 7. Índices de cuantificación de los genes atzA y opd en la biomezcla sometida a diferentes tratamientos y su variación en el tiempo 16S Wang Tratamiento Día Promedio CT Promedio CT ΔCT 16S atzA B+M 0 ND1 ND ND 11 33.694 ND ND 28 ND ND ND Determinación de cambio en el incremento ΔΔCT Índice de -ΔΔCT de cuantificación cuantificación (2 ) ND ND B+M+OTC10 0 24.331 35.000 11.026 11 ND ND ND 28 23.196 36.181 11.500 Determinación de cambio en el incremento ΔΔCT Índice de -ΔΔCT de cuantificación cuantificación (2 ) 0.474 0.720 B+M+OTC50 0 23.617 ND ND 38 11 27.540 38.032 38.032 28 26.166 37.803 37.803 Determinación de cambio en el incremento ΔΔCT Índice de -ΔΔCT de cuantificación cuantificación (2 ) -0.229 1.172 16S Monard Tratamiento Día Promedio CT Promedio CT ΔCT 16S atzA B+M 0 ND ND ND 11 ND ND ND 28 ND ND ND Determinación de cambio en el incremento ΔΔCT Índice de -ΔΔCT de cuantificación cuantificación (2 ) ND ND B+M+OTC10 0 18.166 35.000 16.927 11 ND ND ND 28 20.189 36.181 15.024 Determinación de cambio en el incremento ΔΔCT Índice de -ΔΔCT de cuantificación cuantificación (2 ) -1.904 3.741 B+M+OTC50 0 17.980 ND ND 11 25.506 38.032 12.526 28 22.126 37.803 16.646 Determinación de cambio en el incremento ΔΔCT Índice de -ΔΔCT de cuantificación cuantificación (2 ) 4.120 0.058 1ND: sin datos 7.4.Cuantificación de los microorganismos viables en la biomezcla con capacidad de degradar atrazina o clorpirifós Los valores de NMP g-1 que se presentan, en algunos de los casos, deben considerarse como un primer reporte para SBP, pero, sin embargo, deben ser verificados con ensayos 39 aún más extensivos, ya que no siempre fue posible seleccionar una triada de datos adecuada para el cálculo del NMP, esto a pesar que el ensayo se repitió en más de una ocasión. En los casos descritos, se seleccionó la triada que incluyera las diluciones mayores positivas. 7.4.1. NMP de degradadores de clorpirifós por mineralización de 14C-CLP El comportamiento de la población de degradadores de CLP en la biomezcla (Figura 12), fue diferente al de los degradadores de ATZ, en este caso, las mayores cuantificaciones de degradadores, se obtuvieron en el día 0 y se mantuvieron hasta el día 11 en los tratamientos B+M y B+M+OTC10, para caer a su valor más bajo en el día 28. En el caso del tratamiento B+M+OTC50 el NMP de degradadores fue disminuyendo con el paso de los días. Al día 28 la población cuantificada fue similar en todos los tratamientos, entre 1.0x105 y 1.0x106 NMP g-1. Además, la población neta cuantificable fue menor en aproximadamente un logaritmo, a la población neta cuantificable de los degradadores de ATZ; a pesar de esto, la población estudiada estuvo en valores superiores a 1x107 NMP g-1 de suelo, incluso cuando las concentraciones del antibiótico OTC fueron las más altas. En este caso, también pareciera haber un efecto negativo en la población cuantificable de degradadores por la presencia de OTC, ya que a mayor concentración de OTC, mayor disminución desde el día 0 fue observada en la población de microorganismos estudiada, con diferencias mayores a un logaritmo en el NMP g-1 entre los tratamientos. De forma similar a lo sucedido con el ensayo de NMP para degradadores de ATZ, en el procedimiento del NMP de degradadores de CLP también debe incubarse la muestra (en este caso por 28 días) antes de poder hacer la lectura de los resultados, lo que podría permitir que haya crecimiento microbiano a pesar que el medio no lo favorece. 40 1011 10 B+M10 B+M+OTC10 B+M+OTC50 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 0 12 28 Tiempo (d) Figura 12. Cambios en el NMP de los degradadores de CLP en la biomezcla durante la eliminación de una mezcla de plaguicidas triazinas y organosfosforados 7.4.2. NMP de degradadores de atrazina (NMP-ATZ) En la figura 13 se muestran los valores de NMP g-1 de la población de microorganismos degradadores de atrazina en la biomezcla utilizada para la eliminación de triazinas y organosfosforados. Se puede observar una tendencia concordante con los datos de eliminación de la ATZ y las triazinas en general, ya que al día 11 es cuando se cuantificó una mayor población de microorganismos degradadores de atrazina. La presencia de OTC en general, sugiere ejercer un efecto negativo sobre las poblaciones microbianas degradadoras de atrazina, ya que tanto al inicio como al final del ensayo la muestra sin OTC presentó valores mayores de la población degradadora. La diferencia es más evidente al día 0, cuando hay una distancia de aproximadamente 5 logaritmos entre la muestra sin OTC y las otras dos con concentraciones de OTC de 10 y 50 mg kg-1. Cabe recordar que el ensayo debe incubarse por un plazo de una semana antes de obtener los resultados y en este periodo podría haber crecimiento microbiano, a pesar que el medio que se utiliza no es un medio de crecimiento. Sin embargo, entre las biomezclas con concentraciones de 10 -1 Degradadores de CLP (NMP g ) 41 mg kg-1 y 50 mg kg-1 de OTC, no se encontró mayor diferencia en el tamaño de la población degradadora de ATZ. 1013 B+M 1012 B+M+OTC10 B+M+OTC50 1011 1010 109 108 107 106 105 104 103 102 0 12 28 Tiempo (d) Figura 13. Cambios en el NMP de los degradadores de ATZ en la biomezcla durante la eliminación de una mezcla de plaguicidas triazinas y organosfosforados -1 Degradadores de ATZ (NMP g ) 42 8. Discusión 8.1.Eliminación de plaguicidas organofosforados y triazinas en presencia de oxitetraciclina El comportamiento de los plaguicidas organofosforados y triazinas en la biomezcla demostró que esta es efectiva para tratar estos compuestos, ya que, en todos los casos, con excepción del CDF, los valores de DT50 obtenidos fueron de la mitad o menos del valor que se reporta en la literatura (ver cuadros 1 y 4). Respecto a lo que se ha reportado previamente para SBP (cuadro 10), la biomezcla utilizada en esta investigación, también resultó ser más efectiva para eliminar los plaguicidas estudiados, logrando las DT50 más bajas en comparación con las reportadas hasta el momento. Este comportamiento podría explicarse por factores, como la presencia de varios plaguicidas de las mismas familias y, por lo tanto, con similitud en sus estructuras químicas. Aunque en SBPs la degradación de mezclas de plaguicidas de una misma familia ya se ha estudiado antes (Masís-Mora et al., 2019), en este caso, la fuerza de selección sobre las poblaciones microbianas capaces de degradar estos compuestos pareciera ser de gran relevancia y puede estar ejerciciendo un efecto negativo sobre los microorganismos que no cuentan con esta capacidad (Cycoń et al., 2013; Soulas y Lagacherie, 2001). Esto además, podría explicar la fase lag observada en la eliminación de varios de los plaguicidas al inicio del ensayo, ya que si esta fuerza de selección es tan importante, es posible que se evidencie en la curva de eliminación. La eliminación efectiva de estos plaguicidas, ya sea por procesos bióticos o abióticos, ambos presentes en los SBP, es de gran importancia, ya que como se ha mencionado antes, las familias de triazinas y organofosforados han sido detectados en suelos, fuentes de agua superficiales y sedimentos en diferentes países de Latinoamérica y el mundo, incluyendo Costa Rica (Carazo-Rojas et al., 2018; Barchanska et al., 2017; Vammen et al., 2019; Pirsaheb et al., 2017). A pesar de esto, se ha visto que en los SBP, el responsable mayoritario de la degradación son los procesos bióticos mediados por las comunidades microbianas (Delgado-Moreno et al., 2019). De tal modo, estrategias como los SBP representan una solución para reducir el riesgo que su presencia representa para los ecosistemas y consecuentemente para la salud humana (Carazo-Rojas et al., 2018; 43 Fernandez y Gardinali, 2016; Ccanccapa et al., 2016), tal como ha quedado demostrado en esta investigación; además, el favorecimiento de la degradación biótica es un aspecto deseable en la mineralización de los contaminantes, la cuál ha sido demostrada previamente en más de un 20 % en un plazo de 70 días en un SBP para el tratamiento de CLP (Castillo-González et al., 2017; Huete-Soto et al., 2017a). Cuadro 8. Comparación de las DT50 reportados previamente en SBP para los plaguicidas estudiados y OTC Agroquímico DT50 DT50 reportada Referencias obtenida en previamente este estudio (d) (d)1 Atrazina 7.1 7.8 Masís-Mora et al., 2019 9.9 Castro-Gutiérrez et al., 2018 <10.0 Tortella et al., 2013a, 2013c Ametrina 6.9 231.0 / 40.3 Masís-Mora et al., 2019; 43.9 Huete-Soto et al., 2017a Terbutilazina 10.8 11.0 Masís-Mora et al., 2019; 8.1 Gikas et al., 2018; 60 Spliid et al., 2006 Terbutrina 9.4 315.0 / 187.3 Masís-Mora et al., 2019; 34.0-51.0 Cambronero-Heinrichs et al., 2018 Clorpirifós 9.0 56.0 Masís-Mora et al., 2019 49.1 Fogg et al., 2003b 58.9 Urrutia et al., 2013 Metamidofós 1.1 34.0 Masís-Mora et al., 2019 Monocrotofós 1.7 110.0 Masís-Mora et al., 2019 Cadusafós 56.8 178.0 Masís-Mora et al., 2019 Oxitetraciclina 8.0 38.0 Cambronero-Heinrichs et al., 2018 34.0 Jiménez-Gamboa et al., 2018 1Se presenta el menor valor de DT50 obtenido 44 En el caso de los organofosforados es importante resaltar que, acerca de la eliminación en SBP del MCF, el MTM y el CDF, existe muy poca información. Recientemente Masís- Mora et al. (2019) reportaron su eliminación en biomezclas a pequeña escala utilizadas para el tratamiento de mezclas complejas de plaguicidas, sin embargo, los DT50 reportados fueron de 110.0 d, 34.0 d y 178.0 d respectivamente. Mientras tanto en el actual estudio el MTM y el MCF tuvieron DT50 de menos de 2.0 d, mientras que incluso el plaguicida con los resultados menos prometedores de este estudio, el CDF, tuvo una DT50 menor (56.8 d). Esto refleja los cambios que puede haber en la eliminación de los contaminantes de un SBP a otro dependiendo incluso de los contaminantes que van a ser tratados, ya sea por interacciones químicas entre los compuestos presentes o por afectaciones a las comunidades microbianas. Para los organofosforados CLP, MTM y MCF se alcanzaron valores promedio de DT50 alrededor de 9.2 d, 1.4 d y 1.7 d respectivamente, mucho menores a los que se reportan para estos plaguicidas en suelo (21 d, 4 d y 30 d respectivamente) (Lewis et al., 2016), y menores a los reportados previamente en biomezclas o SBP (cuadro 10). El cambio más significativo en la DT50 obtenida, respecto a lo reportado previamente se observó para el MCF, que se elimina en la biomezcla un 94.0 % más rápido que en condiciones normales en campo y un 98.5 % más rápido que en una biomezcla probada a pequeña escala para la eliminación de mezclas complejas de plaguicidas (Masís-Mora et al., 2019). Este es un plaguicida autorizado en Costa Rica para el control de insectos y ácaros en cultivos de alto consumo en el país y que forman parte de la canasta básica, como lo son la caña de azúcar, la papa, el café y el maíz, entre otros (SFE, 2017). El CLP es un insecticida de amplio uso en el país, está autorizado para más de 10 cultivos, muchos de ellos, al igual que en caso del MCF, son productos de la canasta básica (SFE, 2017). Además, al tratarse de un plaguicida que se ha detectado en altas concentraciones en el ambiente (Carazo-Rojas et al., 2018; Echeverría-Saenz et al., 2012; Etchegoyen et al., 2017; Ccanccapa et al., 2016), los sistemas de biopurificación han demostrado ser eficientes para su tratamiento y reducción del riesgo que ejerce para el ambiente (Castillo- González et al., 2017; Rivero et al., 2016; Coppola et al., 2007). Lizano-Fallas et al. (2017) reportaron en un SBP hasta el 93% de eliminación de CLP después de 20 días, mientras 45 que Masís-Mora et al. (2019) reportaron una DT50 de 56.0 d en una biomezcla a pequeña escala. Se debe rescatar, además, que la curva de eliminación del CLP en la biomezcla tuvo un comportamiento sigmoidal (Figura 7), con una fase lag los primeros 4 días del ensayo, menor a la observada en las triazinas. Anteriormente se ha descrito la presencia de una fase lag inicial en la eliminación de algunos plaguicidas organofosforados en suelo (Cycoń et al., 2013), sin embargo, es más común ver curvas que se ajusten a un decaimiento exponencial (Castillo-González et al., 2017; Fogg et al., 2003b), como fue el caso de los otros plaguicidas organofosforados estudiados en esta investigación (cuadro 4). A pesar de las diferencias en la curva de mejor ajuste, la vida media de todos los contaminantes estudiados se pudo calcular como cinéticas de primer orden, lo cual indica que son independientes de la concentración inicial del plaguicida y son las más comunes en los procesos de degradación de plaguicidas, sin embargo, no siempre se ajustan adecuadamente (Cycoń et al., 2013; Fogg et al., 2003b). El cadusafós mostró un comportamiento diferente a los demás plaguicidas organofosforados y triazinas. Fue el único plaguicida que no alcanzó porcentajes de eliminación mayores al 90 %, de hecho, no superó el 43 % (cuadro 4) y las DT50 calculadas para describir su comportamiento en la biomezcla (61.3 d para B+M; 59.2 d para B+M+OTC10 y 56.8 d para B+M+OTC50), arrojaron valores superiores al reportado para este plaguicida en suelo (49 d) (Lewis et al., 2016), sin embargo, estos valores fueron menores a los reportados previamente en biosistemas de pequeña escala utilizados para el tratamiento de mezclas complejas de plaguicidas (178.0 d) (Masís-Mora et al., 2019). Esto puede deberse a que las vías de degradación del cadusafós contengan enzimas diferentes involucradas a las que participan en las rutas de degradación de los otros organofosforados presentes, y que no estén presentes en proporciones equivalentes, sin embargo, se requiere de más experimentos para probar esta hipótesis. Este planteamiento concuerda con los hallazgos de Ahn et al. (2018), quienes trabajaron con dos cepas de Sphingobium sp. capaces de degradar eficientemente cadusafós, etoprofós, fentoato y forato, sin embargo, no fueron capaces de degradar clorpirifós y diazinon. Es importante resaltar que el cadusafós fue el plaguicida con el modelo de ajuste para el cálculo de la DT50, que presentó los valores más bajos de correlación (r), 0.81; 0.76 y 0.83 respectivamente para cada uno de los tratamientos. 46 Las triazinas, son de los herbicidas más ampliamente utilizados para el control de malezas por su alta efectividad en el control de las mismas, incluso en algunos países se utilizan con fines no agrícolas, por ejemplo, en el mantenimiento de carreteras y en la esterilización de suelos (Papadopoulos et al., 2012; Malá y Gebauer, 2017). En el caso de las triazinas estudiadas, para todas se observó una reducción importante en la DT50 respecto a los valores reportados previamente en suelo e incluso respecto a los que se han reportado para biomezclas de SBP. En esta investigación las DT50 alcanzaron valores promedio de 8.5 d; 7.7 d; 10.9 d y 10.3 d para ATZ, AMT, TBZ y TBT respectivamente, mientras que los valores de DT50 en suelo para estos herbicidas corresponden a 29 d, 37 d, 22 d y 52 d; y en SBP se han reportado valores de 7.8 d, 40.3 d, 8.1 d y 34.0 d respectivamente (ver cuadro 10). Esto representa reducciones en la DT50 de hasta un 80 % en el caso de TBT. La TBT se utiliza en Costa Rica principalmente en el cultivo de caña de azúcar, e incluso ha sido detectada en fuentes de agua superficial y sedimento aledañas a este cultivo en la zona de Guanacaste, representando un riesgo mucho más elevado a los aceptados para los ecosistemas de la zona (Carazo-Rojas et al., 2018). Por lo tanto, la implementación de un sistema sencillo, como los SBP planteados en este trabajo, reducirían significativamente el riesgo asociado al uso de este plaguicida sin necesidad de prohibiciones que afecten la productividad. Otro aspecto a resaltar de la eliminación de las triazinas en la biomezcla, es que las cuatro que se probaron presentaron una fase lag o retraso en su eliminación, similar a la observada para CLP, solo que en el caso de las triazinas, la fase lag se mantuvo hasta cerca de una semana, antes de ver una caída importante en la concentración de los plaguicidas (figura 9), como se mencionó antes este comportamiento se ha descrito para algunos plaguicidas en suelo (Cycoń et al., 2013), sin embargo, en las biomezclas de los SBP no se había descrito hasta el momento; Knight et al. (2016) han descrito una fase lag en la producción de CO2 en el biobed después de la aplicación del herbicida 2,4-D, y autores como Sniegowski et al. (2012), han reportado la fase lag en la mineralización de herbicidas, sin embargo, la eliminación no se reportó en estos casos y como se sabe, la mineralización requiere más pasos a nivel de reacciones que la eliminación, por lo que las fases lag son comunes. 47 La ATZ por su parte es el plaguicida mejor estudiado y más utilizado de la familia de las triazinas (Malá y Gebauer, 2017), y se sabe que además, las principales vías de degradación de esta familia han sido descritas con la ATZ, además se ha encontrado que los organismos capaces de degradar ATZ con frecuencia logran degradar otras triazinas por reacciones cruzadas (Moran et al., 2006). En la biomezcla se alcanzaron DT50 para ATZ de hasta 7.1 d, de las menores que han sido obtenidas en biomezclas, por ejemplo, Huete-Soto et al. (2017a) reportaron DT50 de 23.7 d y Chu y Eivazi (2018) de 14.3 d, mientras que Masís-Mora et al. (2019) obtuvieron en una biomezcla utilizada a pequeña escala DT50 de 7.8 d y de <10 d en un SBP para tratar altas cantidades de desechos de plaguicidas, muy similares a la obtenida en el presente estudio. Por su parte, Tortella et al. (2013a) también trabajaron con una biomezcla eficiente para la eliminación de ATZ (96 % de eliminación en 30 días), pero además, encontraron que aplicaciones sucesivas de ATZ no afectaron la tasa de eliminación. La eficiencia encontrada en la degradación de este herbicida, representa un hallazgo importante que sugiere que la biomezcla es una matriz efectiva para el tratamiento de otros herbicidas de la familia de las triazinas. La TBZ como se mencionó anteriormente, ha sido estudiada en biobeds, reportando DT50 desde 60.0 d hasta 8.1 d (Spliid et al., 2006; Gikas et al., 2018), mientras que el valor reportado en esta investigación fue de 10.8 d, sin embargo, es importante resaltar que los datos de la eliminación de terbutilazina presentados por Gikas et al. (2018), corresponden a un estudio paralelo que se hizo con la misma biomezcla de la presente investigación y en condiciones similares, por lo tanto tiene sentido que las DT50 sean muy similares y las más bajas reportadas hasta el momento para TBZ. Por otro lado, es importante resaltar que todas las triazinas presentaron diferencias significativas en el intervalo de confianza al 50% para la DT50 del tratamiento B+M+OTC50 respecto a los tratamientos sin OTC y con OTC a 10 mg kg-1 (a excepción de TBT que solo presentó diferencia significativa con el tratamiento sin OTC), no obstante, al comparar el efecto de la OTC a 10 mg kg-1, solo se encontraron diferencias significativas en el caso de la AMT y la TBT. Esto evidencia que, a pesar que en presencia de OTC la biomezcla continúa siendo efectiva, la concentración del antibiótico si tiene un efecto en el proceso de degradación de las triazinas. Cabe resaltar, además, que la AMT 48 fue la triazina que más se vio afectada por la presencia de OTC en la concentración más elevada, dado que la DT50 aumentó en un 27 % en el tratamiento B+M+OTC50, respecto al tratamiento sin OTC, y el intervalo de confianza al 50 % para la vida media fue significativamente diferente a los obtenidos en los otros dos tratamientos; no obstante, los intervalos de confianza de estos dos tratamientos son muy estrechos y con diferencias de menos de 1 día (cuadro 4). Este dato es novedoso y a la vez concordante con investigaciones previas, pues aporta conocimiento respecto a las concentraciones de OTC que afectan la eliminación de la AMT en los SBP. Anteriormente, en una biomezcla similar a la de este estudio, se siguió la eliminación de mezclas de plaguicidas, entre estos la AMT, sin embargo, se encontró que a concentraciones de 17 mg kg-1 de OTC la DT50 de AMT aumentó en casi un 40 %, al compararse con la DT50 de la biomezcla sin OTC (Huete-Soto et al., 2017a); lo que evidencia que el efecto se presenta solamente a concentraciones mayores a los 10 mg kg-1. Además, en la misma investigación se reportaron valores de DT50 para la ametrina mayores a los 40 días en ausencia de OTC, mucho mayores a los obtenidos en este experimento (menores a 10 d; ver cuadro 4), lo que demuestra que pequeñas diferencias en las biomezclas y/o las mezclas de plaguicidas por tratar, pueden resultar en diferencias en los perfiles de eliminación. A pesar de esto, el porcentaje de eliminación al final del experimento fue similar en los tres tratamientos, lo que evidencia el efecto de la presencia de la fase lag inicial en la degradación de las triazinas. Este comportamiento no había sido descrito antes en la eliminación de plaguicidas con biomezclas de Costa Rica, sin embargo, sí se ha descrito que la mineralización de contaminantes, como los plaguicidas, se ajustan a modelos sigmoidales como el de Gompertz (Johnsen et al., 2013), incluso Monard et al. (2013) reportaron que la curva de mineralización de ATZ se ajustó a un modelo de Gompertz de 3 parámetros, mismo modelo que se usó para las triazinas y el CLP en este estudio. También, Topp (2001) describió que bacterias del género Nocardiodes eran capaces de acelerar la eliminación de atrazina cuando están en densidades de 105 cél g-1 de suelo, pero solo después de una fase lag de varios días, a diferencia de las bacterias del género Pseudoaminobacter, que en las mismas condiciones lograron acelerar la eliminación de atrazina pero sin la fase lag previa. Esto sugiere que el retraso observado en la eliminación 49 de las triazinas puede responder a los microorganismos presentes en la biomezcla encargados de la degradación de estos compuestos. La OTC por su parte, es una tetraciclina utilizada como agroquímico para el control de plagas bacterianas en los cultivos, por lo tanto, sigue la misma dinámica de almacenaje, aplicación y descarte que otros agroquímicos como los plaguicidas (Vidaver, 2002). Respecto a su efecto cuando es aplicado a diferentes concentraciones (10 mg kg-1 y 50 mg kg-1) y las diferencias entre cada uno de los tratamientos, tanto en el caso de los organofosforados como en el ya discutido caso de las triazinas, pareciera que en general entre mayor es la concentración de OTC, mayor es la DT50 observada para los plaguicidas, sin embargo, las diferencias entre tratamientos observadas con los organofosforados solo fueron significativas en el caso del CLP y el MTM (cuadro 4), para el MNC y el CDF no hubo diferencias significativas al 50% de confianza, por lo que se concluye que OTC no afecta la eliminación de estos dos plaguicidas a estas dosis en el SBP. Previamente en estudios de eliminación de plaguicidas en SBP con presencia de antibióticos, se han encontrado resultados concordantes con los de este estudio. Cambronero-Heinrichs et al. (2018) demostraron que la OTC no afectó negativamente la eliminación de triazinas en un SBP, mientras que Castillo-González et al. (2017) demostraron lo mismo en un SBP para el tratamiento de fungicidas. Adicionalmente, se ha visto que la presencia de OTC a muy altas dosis (>100 mg kg -1), estimuló la respiración de una biomezcla de un SBP y a dosis bajas (≤10 mg kg-1) incrementó la mineralización de CLP recordando un efecto hormético, descrito también para la mineralización del carbofurán (Huete-Soto et al., 2017a; Jiménez-Gamboa et al., 2018). Sin embargo, con la mezcla de plaguicidas utilizada en este estudio y las condiciones del experimento no se presentó el mismo efecto, lo que podría indicar que no es una característica que se observe siempre que estén CLP y OTC juntos, sino que depende de condiciones adicionales. Los resultados obtenidos por Castillo-González et al. (2017), parecieran confirmarlo, ya que en presencia de una mezcla de OTC y gentamicina la respiración de la biomezcla y la mineralización inicial del CLP se vieron disminuidas. Para poder sacar mejores conclusiones respecto al efecto hormético, sería importante analizar la mineralización del CLP con las condiciones estudiadas en el presente trabajo. 50 Por último, la biomezcla utilizada demostró ser efectiva para la eliminación no solo de los plaguicidas, sino también de la OTC, no obstante, la eliminación del antibiótico es significativamente más rápida a la concentración de 10 mg kg-1. Por lo tanto, los SBP son una alternativa para el tratamiento incluso de antibióticos de uso agrícola en mezclas complejas de agroquímicos, esto se había reportado antes en biomezclas para el tratamiento de carbofurán (Jiménez-Gamboa et al., 2018) y de triazinas (Cambronero- Henrichs et al., 2018). Sin embargo, la DT50 para la OTC obtenida en esos estudios fue de 34 d y 38 d respectivamente, en el actual estudio, se logró alcanzar DT50 mucho menores (8,02 d y 12,3 d). En el caso del ensayo con triazinas, los investigadores realizaron un pretratamiento de la OTC en un reactor de tanque agitado, sin embargo, se concluyó que este tipo de pretratamiento no es obligatorio por la efectividad que demostró la biomezcla por si sola (Cambronero-Henrichs et al., 2018). Por su parte, el presente estudio lo confirma, incluso demuestra que la biomezcla se mantiene efectiva para el tratamiento de los plaguicidas y de la OTC cuando se utilizan mezclas más complejas de plaguicidas. 8.2.Toxicidad residual de la biomezcla durante el tratamiento de organofosforados y triazinas en co-aplicación con oxitetraciclina La ecotoxicidad es un parámetro que siempre debería ser evaluado en estudios de eliminación o degradación de contaminantes, ya que el objetivo final es reducir los efectos de los contaminantes en el ambiente. La detoxificación de biomezclas utilizadas en SBP para el tratamiento de plaguicidas, sobre la también conocida como pulga de agua D. magna, uno de los organismos globalmente más utilizados para estudios de ecotoxicidad, y L. sativa, ha sido evaluada previamente, encontrando resultados variables (Huete-Soto et al., 2017b). Además, como puede observarse en la figura 9 y en el cuadro 5, la toxicidad sobre D. magna fue similar en todos los tratamientos y se lograron detoxificaciones de casi el 100% al final del ensayo (60 d); estos resultados demuestran que la presencia de OTC no es determinante en la toxicidad sobre D. magna. Los resultados de este ensayo (detoxificaciones de más del 90% en 11 días) también son concordantes con ensayos ecotoxicológicos realizados durante estudios de eliminación del CLP, ATZ, AMT y TBT en una biomezcla similar a la utilizada en esta ocasión, donde se observaron rápidas 51 detoxificaciones de más del 90% en 10 días para D. magna (Lizano-Fallas et al., 2017). Además, la disminución en la toxicidad coincide con las curvas de eliminación, ya que al día 11 del ensayo, cuando se observó el mayor pico en la eliminación de los plaguicidas, también se alcanzó la mayor detoxificación para D. magna de la biomezcla con los diferentes tratamientos, y se mantuvo en niveles similares hasta el final del ensayo. El comportamiento de la toxicidad para L. sativa fue muy diferente. En los tratamientos B+M y B+M+OTC10, se observó una detoxificación inicial al día 11, representada con un aumento en el índice de germinación hasta 76.6 y 66.9 respectivamente (figura 9), sin embargo, al día 28 los valores del índice de germinación cayeron hasta 42.0 y 45.2, cercanos al nivel más tóxico, el del día 0. Esto indica que a pesar que en la curva de eliminación se evidencia que las moléculas agregadas al inicio del experimento se habían eliminado casi por completo para este punto (figuras 8 y 9), es probable que se hayan generado otros productos de transformación con un efecto tóxico igual o mayor al de las moléculas iniciales, producto de la degradación de las moléculas originales, por lo que también requieren ser detoxificados. Esto ha sido reportado para otras sustancias, tal como el carbofurán, un plaguicida de la familia de los carbamatos, y sus metabolitos 3- ketocarbofurán y 3-hidroxicarbofurán, los cuales posen una alta toxicidad (Otieno et al., 2010). Al día 60, la toxicidad continuaba reduciéndose para L. sativa, donde los valores del índice de germinación fueron de 62.5 para B+M y 58.7 para B+M+OTC10; sin embargo, no alcanzaron los valores obtenidos en la detoxificación inicial, lo que indica que los procesos de detoxificación de estas nuevas sustancias, incluidos los procesos microbianos, son más lentos que los de las moléculas iniciales. A diferencia de lo observado para D. magna, con los resultados obtenidos no es posible saber si la biomezcla es capaz de alcanzar la detoxificación completa para L. sativa. Para tener certeza de esto es necesario realizar ensayos similares por un periodo de tiempo mayor y que permitan conocer a qué compuestos se atribuye el efecto tóxico, considerando que estudios previos han demostrado que la OTC posee un efecto tóxico sobre L. sativa, incluso más importante que el producido por algunos herbicidas (Huete-Soto et al., 2017b). Además, es necesario recordar que los procesos de degradación microbiana, a los que atribuimos la mayor parte de la eliminación de contaminantes orgánicos como los 52 plaguicidas, frecuentemente involucran la participación de diferentes especies microbianas, ya que es poco común que una misma especie lleve a cabo todos los pasos necesarios para la degradación (Singh y Singh, 2016). También es frecuente que la degradación se lleve a cabo por medio de reacciones de cometabolismo (Ye et al., 2018), que son aquellas que permiten que una sustancia entre en las vías metabólicas de un organismo cualquiera, porque cuenta con una estructura similar al sitio blanco de alguna molécula que forma parte del metabolismo central de este organismo, o por inespecificidad de alguna enzima involucrada en la ruta de degradación (Horvath, 1972). Cabe destacar que cuando una molécula es degradada por cometabolismo, esto no implica que el microorganismo involucrado sea capaz de continuar con la degradación en los pasos posteriores a la reacción cometabólica. Por su parte la biomezcla con el tratamiento B+M+OTC50, a diferencia de los otros dos tratamientos, no presentó un pico de detoxificación inicial tan marcado, sino que tuvo un comportamiento lineal a lo largo del tiempo, para alcanzar valores de IG similares a los alcanzados en los otros dos tratamientos. Sin embargo, como el IG fue el menor de los 3 tratamientos al inicio del ensayo, el cambio neto en la toxicidad sobre L. sativa fue el mayor con un valor de 36.7% (cuadro 5). La ausencia del pico de detoxificación inicial puede deberse al efecto tóxico de la OTC sobre L. sativa, el cual ha sido demostrado previamente por Huete-Soto et al. (2017b) en un SBP para la eliminación de herbicidas y fungicidas en co-aplicación de OTC a una concentración de 17 mg kg-1. A pesar que en este estudio el tratamiento B+M+OTC10 presentó un comportamiento similar al tratamiento sin OTC, en términos de toxicidad para L. sativa, esto en lugar de contradecir el efecto tóxico de la OTC lo confirma y aporta información importante, ya que pareciera que el efecto tóxico en lechuga es mucho más importante a concentraciones elevadas de OTC (mayores a los 10 mg kg-1), mientras que a concentraciones más bajas la toxicidad es dada mayoritariamente por otros agroquímicos desechados en la biomezcla. Otras plantas usadas frecuentemente como indicadores de toxicidad también han mostrado ser sensibles a OTC, tal es el caso de la alfalfa (Medicago sativa) y la lenteja de agua (Lemna minor) (Kong et al., 2007; Pro et al., 2003). Tampoco se descarta la posibilidad de que haya reacciones de sinergia entre la mezcla de plaguicidas y la OTC a concentraciones superiores a los 10 mg kg-1, que podrían aumentar la toxicidad de los elutriados obtenidos 53 de la biomezcla hacia L. sativa cuando las concentraciones de OTC son mayores (Gomez- Eyles at al., 2009; Hernández et al., 2013). Finalmente, con los hallazgos relacionados a la eliminación de los contaminantes y la toxicidad residual en la biomezcla obtenidos en esta investigación, se considera que un SBP como el planteado en este estudio es una buena alternativa para tratar de forma efectiva, triazinas, organofosforados e incluso la OTC, tomando en consideración únicamente la concentración del antibiótico (que sea ≤10 mg kg-1) para obtener detoxificaciones más rápidas y reducir los efectos tóxicos en plantas. Además, se evidencia la importancia de evaluar la toxicidad en más de un indicador biológico, ya que los efectos pueden ser diversos y no todos los organismos indicadores poseen la misma sensibilidad a los diferentes contaminantes. 8.3.Cuantificación de genes involucrados en la degradación de organofosforados y triazinas durante su eliminación en la biomezcla La cuantificación de genes involucrados en la degradación de plaguicidas en los SBP, ha sido un área poco explorada, a pesar de que ha habido interés por conocer los cambios en la diversidad microbiana y funcional de la biomezcla (Castro-Gutierréz et al., 2019, Castro-Gutiérrez et al., 2018; Karas et al., 2016; Tortella et al., 2013a; Tortella et al., 2013b), además de los estudios genéticos que se han desarrollado sobre algunos microorganismos específicos aislados de SBP o utilizados para bioaumentar las biomezclas (Karas et al., 2016; de Souza et al., 1996; Zhang et al., 2013). Esto en parte se debe a la complejidad de la biomezcla y de los microorganismos presentes en ella, además de la variabilidad genética que puede existir de una biomezcla a otra (Bergsveinson et al., 2018); sin embargo, es de gran interés conocer las diferencias en la dinámica microbiana y la expresión génica de los responsables de la degradación de contaminantes, en respuesta a los estímulos químicos. El presente trabajo, establece los primeros resultados de la cuantificación de genes involucrados en las vías de degradación de plaguicidas en un SBP, a la vez que se comparan con una curva de eliminación. El proceso de selección de los imprimadores y genes, descrito en la sección de resultados, permitió seleccionar los genes más adecuados para el estudio. En el cuadro 6 y la figura 10 se puede observar que los imprimadores de atzD y opdA producían con frecuencia 54 amplificaciones inespecíficas, además que no amplificaron con las muestras de biomezcla; por esta razón estos imprimadores se excluyeron de la cuantificación con qPCR. Además, los resultados de la calidad y cantidad del ADN extraído que se muestran en el cuadro A1 muestran que la eficiencia de las extracciones fue baja, así como la de la purificación de las bandas amplificadas para controles positivos. Otros autores, han reportado bajas eficiencias al extraer ADN de muestras complejas como el suelo (Sagova-Mareckova et al., 2008; İnceoǧlu, et al., 2010), donde se ha observado que pH bajos y el contenido de agua pueden afectar la eficiencia de la extracción incluso utilizando kits especializados como el kit NucleoSpin™ Soil (Macherey-Nagel), utilizado en este estudio (Sagova- Mareckova et al., 2008). Además, se ha descrito que el contenido de arcillas, materia orgánica y ácidos húmicos también interfiere en la eficiencia de extracción, debido a que el ADN se adsorbe fácilmente a estas partículas y los ácidos húmicos inhiben la reacción de PCR (Sagova-Mareckova et al., 2008; Roose-Amsaleg et al., 2001; Robe et al., 2003). Cabe destacar que, por estos motivos, en este estudio se procuró hacer la extracción con ayuda de un kit que mejore la pureza del ADN extraído, sin embargo, al parecer no fue suficiente, ya que como se muestra en la figura 10, al realizar la reacción de PCR con diluciones del ADN, se evidenció la presencia de inhibidores. Es probable que el efecto inhibidor esté dado por las altas cantidades de materia orgánica y de ácidos húmicos en la biomezcla, pues se ha reportado que son potentes inhibidores de la polimerasa (Kermekchiev et al., 2009), y la presencia de compost en la biomezcla incrementa la cantidad de estas sustancias respecto al suelo. A pesar de esto, en estudios con biomezclas no se ha reportado hasta ahora la presencia de inhibidores de la PCR. La metodología utilizada para la obtención de los controles positivos se ha recomendado anteriormente para muestras de suelo, ya que aporta una imagen más real de la matriz compleja que se está trabajando (Smith et al., 2006; de Sosa et al., 2018), sin embargo, en el presente estudio no mostró resultados favorables. Las curvas dieron bajos porcentajes de amplificación, por lo que pareciera que usar amplicones purificados de una reacción de PCR no es una buena estrategia puesto que no se amplifican adecuadamente en una segunda reacción de PCR, en este caso de qPCR. Esto se puede deber a exceso de dNTPs, o a la ausencia de las secuencias ubicadas antes de la secuencia blanco o incluso pérdida de pares de bases al inicio de la secuencia, lo que podría afectar la unión a los 55 imprimadores en la segunda reacción de PCR y con ello la especificidad de esta segunda amplificación. Una posibilidad para mejorar los controles positivos, sería clonar el gen de interés en un plásmido y posteriormente hacer la extracción a partir del plásmido para tener mejores rendimientos en la reacción del qPCR (Ursi et al., 1992). Del PCR punto final efectuado a los diferentes tratamientos en el tiempo, se puede observar que para los genes atzA y opd se obtuvieron amplificaciones del mismo tamaó que las amplificaciones de los controles utilizados, por lo que se pareciera que están presentes en la biomezcla y podrían estar posiblemente involucrados en la eliminación de las triazinas y organofosforados, respectivamente, en el SBP. A pesar de esto, su presencia no fue constante en el tiempo. Esto podría deberse a diferentes factores, el más importante de ellos, considerando que anteriormente se demostró la presencia de inhibidores de la reacción de PCR, es que, a diferentes puntos en el tiempo, e incluso según cada muestra, la concentración de inhibidores cambie y que la dilución utilizada no haya sido suficiente para eliminar su efecto inhibitorio. Otros autores han reportado que provocando alteraciones mutacionales de la polimerasa el efecto de los inhibidores desaparece (Kermekchiev et al., 2009); esta es una alternativa que permitiría obtener resultados más confiables a partir de las muestras de la biomezcla. Otro factor podría ser las alteraciones en las poblaciones de microorganismos en el tiempo y en respuesta al estímulo de contaminantes; de este modo si la frecuencia del gen es muy baja en la población, la dilución del ADN y una baja eficiencia en la extracción podrían hacer que en la reacción de PCR no se detecten los genes de interés. Por último, los resultados obtenidos del qPCR reflejan cambios mínimos en el índice de cuantificación del gen atzA a los días 0, 11 y 28, ya que las concentraciones, además del cambio en el incremento de la cuantificación, se mantuvieron muy bajas y en algunas muestras no fue posible su cuantificación, mientras que no fue posible cuantificar el gen opd. Al comparar estos valores con otros estudios que han cuantificado genes específicos en suelo, como el gen amoA involucrado en la oxidación del amonio, obteniendo valores de la abundancia del gen alrededor de 103-106 copias g-1 de suelo (Feld et al., 2015), los valores obtenidos en este estudio se consideran bajos y rechazan la hipotésis de que estos genes estarían presentes en gran cantidad en la biomezcla. La principal razón de esto es 56 posible que sea nuevamente la presencia de inhibidores en las muestras de ADN utilizadas, ya que pueden interferir en la cuantificación de los genes y dar falsos negativos (Wang et al., 2017). Por su parte, con los datos obtenidos pareciera ser que no existe un efecto de la OTC en la cuantificación del gen atzA en la biomezcla, ya que todos los índices relativos de expresión presentaron valores similares. Esto concuerda con los otros resultados obtenidos en este estudio, que demuestran que la OTC no genera grandes efectos en la eliminación de los plaguicidas organofosforados y triazinas, y abre una nueva pregunta relacionada a los genes de resistencia a los antibióticos presentes en la biomezcla. Por otro lado, sí pareciera haber un efecto según el tiempo trascurrido desde la aplicación de los agroquímicos, ya que al día 28 es cuando se logró cuantificar los genes con mayor frecuencia, a pesar que en ese punto en el tiempo ya se habían eliminado casi por completo las moléculas de plaguicidas añadidas al inicio del ensayo, mientras que a los días 0 y 11 no se logró cuantificar los genes en la mayoría de las muestras (ver cuadro 9), a pesar de que al día 11 se observó la mayor caída en la concentración de ATZ y las triazinas en general. Esto podría deberse a que como se ha mencionado antes, la eliminación de las moléculas padre no implica la mineralización (Abdelraheem et al., 2015), por lo que puede haber productos de transformación siendo aún degradados y favoreciendo a las poblaciones capaces de degradar triazinas. Inicialmente, se esperaba que este fenómeno fuera mínimo debido a que la enzima atrazina clorohidrolasa codificada por el gen atzA se ha descrito que es la primera enzima que participa en el proceso de mineralización de la ATZ en bacterias gram negativas (Wang et al., 2005), sin embargo, no se puede descartar que las bacterias capaces de degradar metabolitos de la ATZ, posean también el gen atzA. El estudio del ARN para evaluar la expresión del gen en el tiempo, ayudaría a dilucidar mejor el papel de la enzima atzA en el tiempo. 8.4.Cuantificación de los microorganismos viables en la biomezcla con capacidad de degradar atrazina o clorpirifós Es importante resaltar, que la metodología utilizada tiene sus limitaciones y que el resultado obtenido no se puede considerar como el número absoluto de los degradadores de ATZ en la biomezcla, debido a que las condiciones del experimento, como la atmósfera de incubación, la temperatura, entre otras, conducen a subestimaciones de la población 57 real (Ellingsøe y Johnsen, 2002). De igual forma para el caso de CLP es importante tener en consideración que, como lo que se cuantifica es el plaguicida mineralizado, es probable que la población de degradadores sea mayor, ya que como se sabe, la mineralización es la degradación completa, hasta los productos más sencillos (CO2 y H2O en este caso), por lo que las recciones de degradación parcial mediadas por microorganismos y reacciones cometaboólicas, no estarían siendo consideradas (Xu, et al., 2007). Sin embargo, los datos recolectados con este tipo de ensayos son datos valiosos a pesar de sus limitaciones porque permiten hacer comparaciones entre tratamientos y obtener un valor base del número de microorganismos meta. Adicionalmente, se debe mencionar que a pesar que los resultados obtenidos evidencian tendencias claras, estos resultados deben ser verificados y la prueba refinada, ya que las triadas utilizadas para el cálculo del NMP fueron seleccionadas por ser las que demostraban positividad en las diluciones más altas, pero en algunos casos hubo presencia de dos posibles triadas a seleccionar o de resultados irregulares en la positividad de las diluciones realizadas. Entre las posibles explicaciones a este fenómeno, se sospecha la presencia de algún tipo de inhibidor en la biomezcla que provoque resultados falsamente negativos o bajos en las muestras menos diluidas. Casos de inhibidores han sido reportados previamente en el desarrollo de cuantificaciones por el NMP. Tal es el caso de Papen y Von Berg (1998), al tratar de estimar el número de bacterias nitrificadoras en suelo, donde parecía no haber crecimiento en las muestras menos diluidas; en este caso el efecto inhibidor se le atribuyó a la atmósfera producto de la intensiva respiración de las bacterias de crecimiento rápido. La enumeración de bacterias degradadoras en matrices ambientales, como el suelo, por la técnica de NMP puede ser complicada ya que la población de estudio es muy heterogénea, puede incluir un importante número de microorganismos no cultivables y parte de ella puede verse limitada fácilmente por las condiciones de la prueba. Anteriormente otros autores ya han reportado resultados no satisfactorios al tratar de enumerar las poblaciones de degradadores de atrazina en suelo por la técnica de NMP (Ostrofsky et al., 2002). La eliminación de atrazina y clorpirifós en la biomezcla, se supone está mediada principalmente por bacterias capaces de metabolizar este contaminante. Sin embargo, las 58 poblaciones capaces de degradar el contaminante, en este caso la ATZ o el CLP, pueden reducirse o aumentarse en respuesta al estímulo de la OTC en la biomezcla, así como por efecto de otras sustancias que pueden llegar a limitar su crecimiento. Thiele-Bruhn y Beck (2005) probaron que la OTC puede reducir significativamente el número de bacterias en suelos dependiendo de factores como la adsorción al suelo, la biodisponibilidad, el tiempo de exposición y la dosis del antibiótico. Esto se confirma con los ensayos de NMP realizados con las biomezclas, al comparar la población cuantificada a los cero días del ensayo en cada uno de los tratamientos. Se encontró que la OTC tanto en concentraciones de 10 mg kg-1 como de 50 mg kg-1 tuvo un efecto negativo en dichas poblaciones, puesto que estas se redujeron entre 7 y 2 logaritmos (ATZ y CLP respectivamente) respecto al tratamiento que no contenía OTC. Como se mencionó anteriormente, esto no es un comportamiento inesperado, anteriormente se ha visto que el tratamiento de suelos con OTC a concentraciones de 9.9 mg g-1 ha logrado disminuir el número de bacterias cultivables, aunque en ese caso no afectó la biomasa bacteriana total (Piotrowska-Seget et al., 2008); también se han encontrado efectos negativos sobre poblaciones específicas, como las bacterias fijadoras de nitrógeno, a concentraciones de 10, 60 y 200 mg kg-1 (Sun et al., 2016) similares a las estudiadas en esta investigación, A pesar de esto, no se han estudiado los efectos de la OTC en SBP para el tratamiento de plaguicidas y antibióticos de uso agrícola, en la cuantificación de las poblaciones de degradadores de ATZ o CLP. Los estudios se han enfocado principalmente en cambios en la estructura de la comunidad microbiana (Castro-Gutiérrez et al., 2018; Tortella et al., 2013a), por lo que datos como los presentados en este estudio podrían ser de gran ayuda en la comprensión de las dinámicas microbianas en los SBP. Al evaluar el efecto de la OTC sobre la población inicial de degradadores de ATZ, se observa que la cuantificación del NMP se reduce de 6 a 7 logaritmos, por lo que se puede decir que, contrario a lo que se creía analizando solo los resultados de eliminación, que la OTC efectivamente sí afecta a las poblaciones microbianas presentes en la biomezcla encargadas de eliminar los agroquímicos. A pesar de esto y considerando los resultados de la eliminación, pareciera ser que estas poblaciones son capaces de recuperarse y adaptarse a la presencia de los contaminantes rápidamente, un comportamiento similar se ha visto antes con microrganismos ambientales, Parada et al. (2019) por ejemplo, 59 demostraron la recuperación de comunidades microbianas del suelo después de la exposición a ATZ junto con nanoparticulas de cobre, puesto que a los 12 días la población de degradadores de atrazina se encuentra en su punto máximo cuantificado en el experimento y cae levemente a los 28 días cuando el estímulo de ATZ prácticamente ha desaparecido. Recolectando más frecuentemente datos de la cuantificación de estos microorganismos, sería posible obtener una mejor idea de cuánto tiempo requieren estas poblaciones para adaptarse al estímulo de OTC en la biomezcla. Adicionalmente, al analizar los resultados por cada tratamiento aplicado, es posible concluir que en ausencia de OTC las bacterias cuantificables capaces de degradar ATZ se vieron ligeramente afectadas por sustancias presentes en la biomezcla al día 12, ya que la población se redujo un logaritmo respecto al día 0, probablemente producto del metabolismo de los contaminantes y la liberación de intermediarios tóxicos. Sin embargo, una vez que los agroquímicos iniciales fueron en su mayoría eliminados, la población aumentó, demostrando su adaptabilidad a las condiciones de su entorno. Otros autores han cuantificado las poblaciones de degradadores de ATZ en suelo por la técnica de NMP, obteniendo poblaciones alrededor de 3.2x104, 3.5x103, 4.6x103 y 1.5x106 NMP g-1 (Jayachandran et al., 1998; Dinamarca et al., 2007; Arthur et al., 1997; Goux et al., 2003), menores en varios logaritmos a las obtenidas en este estudio. Este resultado confirma lo que se ha dicho en múltiples ocasiones respecto a los SBP, que brindan las condiciones adecuadas para que los microorganismos encargados de eliminar contaminantes utilizadas en la agroindustria (Castillo et al., 2008; Castillo y Torstensson, 2007; Dunon et al., 2013). En cuanto a la cuantificación de los microorganismos degradadores de CLP, al igual que como se mencionó anteriormente con la ATZ, hubo una disminución en el NMP g-1 de estos microorganismos en las biomezclas que contenían OTC versus el tratamiento que no contenía el antibiótico, sin embargo, en este caso corresponde a 2 y 3 logaritmos en los tratamientos de 10 mg kg-1 y 50 mg kg-1 respectivamente. A pesar que la disminución en la población cuantificable por este método fue menor, los microorganismos no se recuperaron en número al día 12 de ensayo, como sí ocurrió con la ATZ, pero continuaron eliminando los contaminantes, como se observa en la figura 13, esto podría deberse a reacciones de cometabolismo de otros microorganismos presentes en la biomezcla 60 Ahora bien, al analizar los resultados obtenidos en el tiempo para cada tratamiento particular, se observa que tanto en el tratamiento de OTC 10 mg kg-1 como en el de 50 mg kg-1 la población fue decayendo en el tiempo, con la disminución más radical al día 28. Este comportamiento podría explicarse debido a que después del día 12 los plaguicidas organofosforados ya habían sido eliminados casi por completo, con excepción del cadusafós, lo que podría conducir a nuevas adaptaciones de la comunidad microbiana, al estar ausente el estresor que favorecía a la población de degradadores de CLP (Xe et al., 2018b); incluso es probable que la disminución observada al día 12 también responda a este fenómeno, puesto que las vidas medias de degradación de la mayoría de los organofosforados estuvieron muy por debajo de los 10 días. Por otro lado, no se hizo el análisis de los metabolitos del CLP o de los otros plaguicidas, un factor que podría tener injerencia sobre los cambios en la población de degradadores, ya que como se ha mencionado antes, los productos intermediarios de la degradación pueden tener una toxicidad asociada (Tang et al., 2017), tal como se ha demostrado con el TCP, el principal metabolito de la degradación del CLP, el cuál es más tóxico incluso que el CLP y se ha asociado a efectos negativos en las poblaciones microbianas (Vischetti et al., 2007 ). Estudios previos han demostrados que bacterias de los géneros Pseudomonas sp., Bacillus pumilus, Stenotrophomonas maltophilia, Flavobacterium sp., Proteus sp. y Acinetobacter sp. están involucradas en las reacciones metabólicas para la degradación del CLP (Bhagobaty y Malik, 2008; Ahmad et al., 2012; Dubey y Fulekar, 2012; Pino y Peñuela, 2011), cuyo metabolismo se desarrolla en presencia de oxígeno y a temperaturas ambientales, condiciones a las que se desarrolló el presente ensayo. Las poblaciones microbianas, tal como se ha demostrado en múltiples ocasiones, son muy complejas y diferentes unas de otras. Lo que se observó en este ensayo es la adaptación de los microorganismos a los estresores ambientales y la selección de las poblaciones con mejores posibilidades de sobrevivir (Xe et al., 2018b), sin embargo, aplicando otras técnicas como la secuenciación y la metagenómica, es posible obtener mucha más información que complemente los primeros hallazgos presentados en este estudio respecto a la dinámica de las poblaciones en los SBP y el efecto de los antibióticos sobre estas. 61 9. Conclusiones El sistema de biopurificación de plaguicidas probado demostró ser eficiente para la eliminación de organofosforados y triazinas, obteniendo valores de DT50 de los más bajos reportados hasta el momento para la mayoría de los plaguicidas. Adicionalmente, la coaplicación de OTC en la biomezcla, aumentó significativamente la DT50 de los plaguicidas con mayor eliminación en la biomezcla, especialmente a concentraciones altas de OTC. A pesar de esto, las DT50 incluso en presencia de OTC, se mantuvieron entre las más bajas reportadas en la literatura. Por su parte los resultados de ecotoxicidad fueron muy favorables para D. magna y L. sativa, sin embargo, las diferencias encontradas entre ambos organismos, recalca la importancia de evaluar la toxicidad en diferentes organismos de la cadena trófica. Por lo tanto, la biomezcla se recomienda para la eliminación de residuos de plaguicidas triazinas y organofosforados provenientes de las aguas de lavado de los equipos de aplicación. En la biomezcla se demostró que hay presencia de poblaciones microbianas degradadoras de ATZ y de CLP, además de la presencia apaerente del gen atzA la cuál podría confirmarse con una futura secuenciación de la muestra. Las pruebas para cuantificación por NMP y cuantificación de los genes de degradación deben afinarse y ajustarse mejor a las condiciones complejas de la biomezcla para obtener más resultados que permitan llegar a dilucidar más detalles de las poblaciones microbianas que participan en la degradación de organofosforados y triazinas en el SBP. 62 10. Referencias 1. Abdelraheem WH, He X, Duan X, Dionysiou DD. 2015. Degradation and mineralization of organic UV absorber compound 2-phenylbenzimidazole-5- sulfonic acid (PBSA) using UV-254 nm/H2O2. J. Hazard. Mater. 282: 233-240. doi:10.1016/j.jhazmat.2014.07.041 2. Ahmad F, Iqbal S, Anwar S, Afzal M, Islam E, Mustafa T, Khan QM. 2012. Enhanced remediation of chlorpyrifos from soil using ryegrass (Lollium multiflorum) and chlorpyrifos-degrading bacterium Bacillus pumilus C2A1. J. Hazard. Mater. 237: 110-115. doi: 10.1016/j.jhazmat.2012.08.006 3. Ahn JH, Lee SA, Kim SJ, You J, Han BH, Weon HY, Lee SW. 2018. 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En la figura A1 se muestra un gel realizado a los productos de PCR punto final usado para definir las condiciones de extracción de ADN a utilizar para las muestras de la biomezcla, ya que el kit utilizado incluye diferentes opciones según el tipo de suelo. Figura A1. Productos de PCR punto final obtenidos en diferentes condiciones de trabajo. A. ADNs obtenidos con los diferentes métodos de extracción recomendados por el fabricante, A1 y A7: marcador de peso molecular (MPM); A2: ADN obtenido con el método 1 de extracción; A3: ADN obtenido con el método 2 de extracción; A4: ADN obtenido con el método 3 de extracción; A5: ADN obtenido con el método 4 de extracción; A6: control negativo; B. ADN amplificado con el 16S Wang; C. ADN amplificado con el 16S Monard. Para B y C las muestras corresponden a 1 y 7: MPM; 2: ADN método 1; 3: ADN método 2; 4: ADN método 3; 5: ADN método 4; 6: control negativo. De la figura anterior se obtuvo que el buffer SL1 de los dos posibles aportados en el kit, fue el que presentó mejores resultados de extracción, los cuales mejoraron al ser aplicados 82 junto con el potenciador aportado por el kit, esta combinación (SL1+potenciador) es la que se representa en el método 2, por lo que esta fue la metodología seleccionada para la extracción de las muestras para el qPCR. Figura A2. Productos de PCR punto final de los tratamientos B+M, B+M+OTC10 y B+M+OTC50 en el tiempo. A: Día 0, B+M; B: Día 0, B+M+OTC10; C: Día 0, B+M+OTC50; D: Día 11, B+M+OTC10; E: Día 11, B+M+OTC50; F: Día 28, B+M+OTC10; G: Día 28, B+M+OTC50; H: Controles positivos; 1: MPM 100 pb; 2: 16S Monard; 3: 16S Wang; 4: atzA; 5: atzD; 6: opd; 7: opdA. 83 Cuadro A1. Calidad del ADN purificado de las bandas para usar como controles positivos en el qPCR Muestra Cuantificación Relación 260/280 Cuantificación Nanodrop (ng µL-1) fluorímetro (ng µL-1) Control 16S Wang 11.7 2.25 6.700 Control 16S Monard 18.4 1.97 5.500 Control 23S 11 1.97 3.740 Control atzA 8 2 2.520 Control opd 4.4 1.71 0.725 Control de E. coli 19.4 1.54 NA ATCC 25922 Cuadro A2. Cuantificación en fluorímetro del ADN de las muestras para qPCR Muestra Cuantificación fluorímetro (ng µL-1) Día 0, B+M 38.0 Día 0, B+M+OTC10 120.0 Día 0, B+M+OTC50 124.0 Día 11, B+M 8.3 Día 11, B+M+OTC10 14.0 Día 11, B+M+OTC50 12.0 Día 28, B+M+OTC10 14.0 Día 28, B+M+OTC50 18.0 Cuadro A3. Pendiente y eficiencia de las curvas de calibración realizadas con los genes housekeeping Gen housekeeping Pendiente Eficiencia 16S Wang -4.406 68.631 16S Monard -4.354 69.705 23S -6.606 41.701