UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO DIVERSIDAD DE BEGOMOVIRUS PRESENTES EN EL CULTIVO DE TOMATE EN COSTA RICA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Biología para optar al grado y título de Maestría Académica en Biología con Énfasis en Genética y Biología Molecular KAREN ANDREA VALVERDE MÉNDEZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2021 ii DEDICATORIA A mi papá, que me enseñaste el amor al estudio. Nos separamos por un tiempo, pero siempre estarás en mi corazón. A mi mamá, por apoyarme incondicionalmente y alentarme a ser mejor cada día. A Dios, por guiar mi camino. iii AGRADECIMIENTOS Al Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), por permitirme trabajar en sus instalaciones para realizar esta investigación. A mi tutora, Dra. Natalia Barboza Vargas, por apoyarme en el transcurso de mi investigación, compartir su conocimiento y guiarme en mi formación tanto teórica como práctica. Al Lic. Eduardo Hernández Jiménez, por aclarar mis dudas y ayudarme cada vez que estaba a su alcance. A mis compañeras del laboratorio de Biología Molecular de Plantas y Virus (lab 6) del CIBCM, por crear tan buen ambiente de trabajo, darme apoyo moral y compartir conocimientos. Al Dr. Mauricio Montero Astúa y al Dr. Andrés Gatica Arias, por aceptar ser mis lectores e invertir de su tiempo en la revisión y recomendaciones dadas para este trabajo. iv “Esta Tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Biología de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Biología con Énfasis en Genética y Biología Molecular” ____________________________________ Dr. James Karkashian Córdoba Representante del Decano Sistema de Estudios de Posgrado ______________________________________ Dra. Natalia Barboza Vargas Profesora Guía ____________________________________ Dr. Mauricio Montero Astúa Lector ____________________________________ Dr. Andrés Gatica Arias Lector ____________________________________ Dr. Eduardo Chacón Madrigal Representante del Director Programa de Posgrado en Biología ____________________________________ Karen Valverde Méndez Sustentante v TABLA DE CONTENIDOS DEDICATORIA .......................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................. iii HOJA DE APROBACIÓN…………………………………………………………………….……………… iv TABLA DE CONTENIDOS ....................................................................................................... v RESUMEN ................................................................................................................................. vi ABSTRACT ............................................................................................................................... vii LISTA DE CUADROS ............................................................................................................ viii LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ ix LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................. xi DIVERSIDAD DE BEGOMOVIRUS PRESENTES EN EL CULTIVO DE TOMATE EN COSTA RICA..............................................................................................................................1 Introducción ............................................................................................................................1 Metodología .............................................................................................................................3 Obtención de las muestras y extracción de ADN ..................................................................3 Hibridación de ácidos nucleicos con una sonda general ........................................................3 Hibridación de ácidos nucleicos con una sonda específica ....................................................4 Detección por PCR del TYLCV ............................................................................................5 Clonaje y secuenciación de productos de PCR ......................................................................6 Amplificación por círculo rodante, clonaje y secuenciación .................................................7 Resultados ................................................................................................................................8 Detección de begomovirus por hibridación ...........................................................................8 Detección por PCR del TYLCV y análisis de secuencias ....................................................10 Discusión ................................................................................................................................12 Agradecimientos ....................................................................................................................20 Referencias.............................................................................................................................21 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...............................................................................................41 Referencias.............................................................................................................................47 vi RESUMEN Los Begomovirus (familia Geminiviridae) son fitovirus que causan importantes pérdidas agrícolas, son trasmitidos por la mosca blanca Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae), e infectan cultivos de importancia económica como el tomate (Solanum lycopersicum). Se caracterizan por su alta tasa de recombinación y tener un amplio rango de plantas hospederas, esto dificulta en ocasiones su manejo. En Costa Rica se han reportado diversas especies de begomovirus bipartitas, entre las que se encuentran el Tomato yellow mottle virus (ToYMoV), Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV), Pepper golden mosaic virus (PepGMV) y recientemente uno de los begomovirus monopartitas que se considera de los más importantes por el daño que se le atribuye a nivel mundial, el Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Desde el primer reporte de TYLCV en el país, no hay conocimiento de cuanto se ha dispersado este begomovirus en el territorio nacional, así como la distribución reciente de las otras especies bipartitas. Este trabajo tuvo como objetivo determinar la diversidad genética y la distribución geográfica de begomovirus que se encuentran presentes en plantaciones de tomate en las principales zonas productoras del cultivo en Costa Rica. En total, se trabajó con 212 muestras de tomate recolectadas durante los años 2015-2016. Cada muestra se georreferenció y fue analizada con diversas técnicas como hibridación, PCR y secuenciación para los begomovirus previamente reportados en el país. Se encontró que, dependiendo de la provincia, la presencia/ausencia de las distintas especies puede variar. El TYLCV se encontró presente en las seis provincias analizadas en este trabajo, con una proporción que varía del 50-100%. Alajuela y Cartago son las provincias más afectadas por begomovirus. Se detectaron 13 haplotipos diferentes de TYLCV, pero todos se identifican como TYLCV-IL. La distribución de TYLCV parece estar relacionada con la presencia de la mosca blanca B. tabaci en algunas zonas, pero no sigue un patrón asociado a la topología o clima del país. Es necesario continuar con muestreos de prospección anuales para no perder control de que está sucediendo con el cultivo, así como la posible llegada de otra especie de virus o sus variantes al país, sobre todo del TYLCV. Esta información permite a los servicios de vigilancia fitosanitaria desarrollar estrategias de manejo integrado de la enfermedad y/o bien aportar esta información a los programas de mejoramiento genético del cultivo. vii ABSTRACT Begomoviruses (Geminiviridae family) are phytoviruses that cause significant agricultural losses due to their vector the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) and infect economically important crops such as tomato (Solanum lycopersicum). These viruses are characterized by their high recombination rate and a wide range of hosts, making their control difficult. In Costa Rica, various species of bipartite begomovirus have been reported, among which are Tomato yellow mottle virus (ToYMoV), Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV), Pepper golden mosaic virus (PepGMV) and recently a monopartite begomovirus that is considered one of the most important due to the damage that is ascribed to it worldwide, Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Since the first TYLCV report in the country, there is no knowledge of how much this begomovirus has spread in the national territory, as well as the recent distribution of the other bipartite species. Therefore, this work generates updated information and aims to determine the genetic diversity and geographical distribution of begomoviruses that are present in tomato plantations in the main producing areas in Costa Rica. In total, 212 tomato samples collected during the years 2015-2016 were used. Each sample was georeferenced and analyzed with various techniques such as nucleic acid hybridization, PCR, and sequencing for the begomoviruses previously reported in the country. It was found that, depending on the province, the presence / absence of the different species can vary. TYLCV is present in the six provinces analyzed in this work, with a proportion from 50 to 100%. Alajuela and Cartago are the provinces most affected by tomato-infecting begomoviruses. Thirteen different haplotypes of TYLCV were detected, but all were identified as TYLCV-IL. The distribution of TYLCV seems to be related to the presence of the whitefly B. tabaci in some areas but does not follow a pattern associated with the topology or climate of the country. It is necessary to continue with annual prospecting samplings to maintain control of what is happening with the crop, as well as the possible arrival of another viral species to the country, especially a variant of TYLCV. This information allows the phytosanitary surveillance services to develop strategies for the integrated management of the disease and to contribute the data to the genetic improvement programs of the crop. viii LISTA DE CUADROS Cuadro Descripción Página Cuadro 1. Porcentaje de muestras infectadas por especie de begomovirus según la provincia de Costa Rica por Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Pepper golden mosaic virus (PepGMV), Tomato yellow mottle virus (ToYMoV) y Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV) durante el periodo 2015-2016. 34 Cuadro S1. Porcentaje de muestras infectadas por begomovirus según la provincia, año de muestreo y sonda específica para Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Pepper golden mosaic virus (PepGMV), Tomato yellow mottle virus (ToYMoV) y Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV). 39 ix LISTA DE FIGURAS Figura Descripción Página Figura 1. Plantas de tomate infectadas con begomovirus. (A, B) Plantas con infección de tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). (C) Planta con infección mixta de TYLCV y pepper golden mosaic virus (PepGMV). (D, E) Planta con infección mixta de TYLCV y tomato yellow mottle virus (ToYMoV). 35 Figura 2. Distribución de muestras positivas para begomovirus en los años 2015-2016 en Costa Rica. Las infecciones mixtas incluyen begomovirus como Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Pepper golden mosaic virus (PepGMV), Tomato yellow mottle virus (ToYMoV) y Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV). Se muestra el área de Costa Rica con detalle de elevación. 36 Figura 3. Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en secuencias nucleotídicas de Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) de Costa Rica y otras partes del mundo que abarcan parte de la región intergénica larga (LIR), todo el gen V2 y parte del gen V1/CP). Las muestras obtenidas en este estudio se marcan con un punto negro. Las secuencias fueron alineadas usando Mafft y el árbol fue construido con 3000 replicaciones bootstrap ̧ las distancias evolutivas se calcularon con el método Tamura-Nei (TrN). Solo se ven los valores de bootstrap mayores a 50%. Se utilizó como raíz del árbol una secuencia de Tomato yellow leaf curl virus variante Mld (TYLCV-Mld). 37 Figura 4 Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en componentes ADN-A completos de secuencias nucleotídicas de Tomato yellow leaf curl virus 38 x (TYLCV) de Costa Rica y secuencias de TYLCV de otras partes del mundo. Las muestras obtenidas en este estudio se marcan con un punto negro. Las secuencias fueron alineadas usando Mafft y el árbol fue construido con 3000 replicaciones bootstrap, las distancias evolutivas se calcularon con el método General Time Reversible plus Gamma plus Invariable sites (GTR+G+I). Solo se ven los valores de bootstrap mayores a 50%. Se utilizó como raíz del árbol una secuencia de Pepper golden mosaic virus (PepGMV). Figura S2 Porcentaje de muestras consideradas en la investigación por cada provincia de Costa Rica en los años 2015 y 2016. De las 212 muestras consideradas en total, 86 (41%) pertenecen a Alajuela, 54 (25%) pertenecen a Cartago, 2 (1%) pertenecen a Guanacaste, 65 (31%) pertenecen a Heredia, 3 (1%) pertenecen a Puntarenas y 2 (1%) pertenecen a San José. 40 xi LISTA DE ABREVIATURAS BGYMV Bean golden yellow mosaic virus CP proteína de cubierta ICTV Comité Internacional de Taxonomía de Virus IL variante Israelí IR región intergénica LIR región intergénica larga MEAM1 Middle East-Asia Minor 1 MED Mediterránea Mld variante Mild NW New World ORF marco abierto de lectura PCR reacción en cadena de la polimerasa PepGMV Pepper golden mosaic virus PYMPV Potato yellow mosaic Panama virus RCA ampliflicación de círculo rodante ToLCSiV Tomato leaf curl Sinaloa virus ToYMoV Tomato yellow mottle virus TrN Tamura-Nei TYLCSV Tomato yellow leaf curl Sinaloa virus TYLCV Tomato yellow leaf curl virus xii 1 DIVERSIDAD DE BEGOMOVIRUS PRESENTES EN EL CULTIVO DE TOMATE EN COSTA RICA Introducción Los Begomovirus (familia Geminiviridae) son fitovirus que infectan plantas dicotiledóneas (Zerbini et al., 2017). Se han reportado en regiones tropicales, subtropicales y templadas alrededor del mundo (Brown et al., 2015), causan importantes pérdidas agrícolas, son trasmitidos por la mosca blanca Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae), infectan cultivos como el frijol (Phaseolus vulgaris), tomate (Solanum lycopersicum), chile (Capsicum annuum), calabaza (Cucurbita spp.), entre otros (Basak, 2016; Chang-Sidorchuk et al., 2018; Kil et al., 2017; Parrella et al., 2016; Vargas Salinas, 2017). Se caracterizan porque algunos de sus miembros tienen genomas bipartitos (con dos componentes, ADN-A y ADN-B) (Goodman, 1981; Haber et al., 1981; Hamilton et al., 1983) o monopartitas (con un componente) (Goodman, 1977a, 1977b; Harrison et al., 1977). Son uno de los géneros de virus más amplio que existe, en la actualidad se han aceptado más de 424 especies distintas (http://ictvonline.org/). Sus miembros se caracterizan por tener una alta tasa de recombinación y un relativo amplio rango de hospederos, esto dificulta en ocasiones su manejo y los convierte en un problema constante para la producción de cultivos susceptibles (Hosseinzadeh et al., 2013; Melgarejo et al., 2013; Rocha et al., 2013). En cultivos como el tomate, hay reportes de al menos 136 especies de begomovirus que pueden infectarlo (Basak, 2016; Macedo et al., 2017; Moriones & García-Andrés, 2007; Romay et al., 2019; Vaghi Medina et al., 2019; Xu et al. 2017). En América Latina 2 se dio un incremento en la producción de este cultivo en la década de los 70s y 80s, en paralelo, aumentó el número de nuevas especies de begomovirus presentes en el mismo (Morales & Anderson, 2001). En América Central, los begomovirus que infectan tomate, han ocasionado pérdidas que sobrepasaban el 60% de su producción, por esta razón países como Guatemala y Nicaragua dejaron de cultivarlo por temporadas (Nakhla et al., 2005). En Costa Rica se han reportado diversas especies de begomovirus bipartitas, entre las que se encuentran el Tomato yellow mottle virus (ToYMoV), Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV) y Pepper golden mosaic virus (PepGMV) (Barboza et al., 2018; Hilje et al., 1993, Nakhla et al., 2005). Mientras que la especie monopartita del Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) fue identificada en pocas muestras de tomate recolectadas en el Valle Central del país (Barboza et al., 2014, Barboza et al., 2018). Desde el primer reporte de TYLCV en Costa Rica, se realizó un estudio de seguimiento de begomovirus en muestras de tomate y chile recolectadas en el periodo de 2011-2012 (Barboza et al., 2018), sin embargo, en la actualidad no hay conocimiento de cuanto se ha dispersado este begomovirus a otras regiones del país, así como la distribución reciente de las otras especies bipartitas previamente reportadas. Es por esto que este trabajo genera datos más actualizados y tiene como objetivo determinar la diversidad genética y la distribución geográfica de begomovirus que se encuentran presentes en plantaciones de tomate en las principales zonas productoras del cultivo en Costa Rica. 3 Metodología Obtención de las muestras y extracción de ADN La recolecta del material vegetal se realizó de forma no probabilística, intencional (aleatoria en plantas con síntomas de la enfermedad) y se recolectó tejido foliar próximo al meristemo apical en fincas de las principales zonas productoras de tomate en Costa Rica, durante los años 2015 y 2016. Cada muestra fue georeferenciada y posterior a su análisis se les asignó sus respectivos virus presentes o bien la ausencia de estos. Se realizó un mapa ubicando cada punto en el programa QGIS 3.10.5. Las muestras de tejido vegetal fueron liofilizadas y almacenadas a -70°C (10- 15mg). Se seleccionaron un total de 212 muestras, 123 del 2015 y 89 del 2016. Las 212 muestras se eligieron tomando como referencia los resultados del análisis de hibridación de ácidos nucleicos con una sonda general. Todas las muestras seleccionadas dieron una señal positiva para la hibridación con sonda general y las muestras con señal negativa no se consideraron en el estudio. Las extracciones de ADN se realizaron por el método Dellaporta et al. (1983) modificado por Hernández et al. (2012). Hibridación de ácidos nucleicos con una sonda general Para confirmar la presencia de begomovirus se utilizó la técnica de hibridación “dot blot”. El ADN se desnaturalizó a 65 °C, 5 µl de cada muestra se colocaron en una membrana de nilón (Pall Corporation, Glen Cove, NY; USA) junto con los respectivos controles positivos y negativos, después se fijó la muestra con luz ultravioleta calibrada a 50MJ y se detectó la señal con autoradiografías. Se realizó la hibridación de ácidos nucleicos con una sonda general de 400 nt que hibrida con el gen de la proteína de cubierta 4 (CP) (altamente conservado), para lo anterior se utilizaron los iniciadores PBGGTv647/PBGGTc1048 (Potter et al., 2003) que amplifican para el componente A del Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), en este caso se amplificó la región CP del clon BGYMV-Gt (amablemente suministrado por la Dra. Pilar Ramírez, UCR). Se utilizó el ADN de la sonda sin marcar como control positivo de sensibilidad y se trabajó con tres concentraciones (10ng/µl, 1ng/µl y 0.1ng/µl), como control negativo se usó agua desionizada. El marcaje de la sonda se realizó con fosfatasa alcalina (Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA) y las condiciones de hibridación se realizaron a baja astringencia (55°C) siguiendo las especificaciones de Gene Image Alkphos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA), siendo este método de marcaje el más recomendado para hibridación no radioactiva (Potter et al., 2003). Hibridación de ácidos nucleicos con una sonda específica La técnica de hibridación “dot blot” se utilizó para identificar de forma específica ToYMoV, PepGMV, ToLCSiV y TYLCV, para esta identificación se utilizaron sondas dirigidas a la región intergénica (IR), diseñadas y descritas por Barboza et al. (2018). El marcaje de las sondas se realizó con fosfatasa alcalina (Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA) y las condiciones de hibridación se realizaron a alta astringencia (75°C) siguiendo las especificaciones de Gene Image Alkphos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA). Se utilizó el ADN de las sondas sin marcar como controles positivos de sensibilidad y se trabajó con tres 5 concentraciones (10ng/µl, 1ng/µl y 0.1ng/µl), como control negativo se usó agua desionizada. Detección por PCR del TYLCV Para la identificación a nivel de especie o variante de TYLCV se utilizaron los siguientes imprimadores: MA117 (5'-TAAGGAGCACTTAGGATATG-'3) y MA118 (5'- CAGAACGTTATACACCCTAG-'3) para TYLCV-Mld, MA115 (5'- GAAAGTACCCCATTCAAGAAC-'3) y MA116 (5'-CTATTTCATCACCCGGGATG- '3) para TYLCSV (Moriones & García-Andrés, 2007) y PTYIRv21 (5'- GTTGAAATGAATCGGTGTCCC-'3) y PTYc287 (5'- TTGCAAAGACAAAAAACTTGGGACC-'3) para TYLCV-IL (Nakhla et al., 1993). Los controles positivos para TYLCV-Mld y TYLCSV fueron suministrados gentilmente por Dr. Enrique Moriones (Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea "La Mayora" y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas IHSM-UMA-CSIC Estación Experimental "La Mayora"). Mientras que para el control positivo del TYLCV- IL se utilizaron muestras de tomate procedentes de Costa Rica previamente secuenciadas para asegurar la presencia de esta variante. Con la finalidad de confirmar los resultados del PCR se seleccionaron 31 muestras de las distintas regiones y años, que fueron secuenciadas utilizando los iniciadores IRTyKrF (5'- TTTCCTGAATCTGTTCACGGATT-'3) y IRTyKrR (5'- AACTAATGCCTGTTCCTTCATTC-'3) de acuerdo a lo recomendado por Park et al. (2014). 6 Para las reacciones de PCR se utilizó 1µl de ADN genómico, 0.2µmol de cada imprimador, 1x de buffer Taq, 2.5mM de MgCl2, 0.25mM de dNTPs, 0.04U/µl de Taq polimerasa (Thermo Fisher Scientific, USA) y agua destilada ultrapura (Invitrogen, USA) hasta completar la reacción de 25µl. Los ciclos para la amplificación de fragmentos para los imprimadores IRTyKrF y IRTyKrR fueron de 94°C por 3 min, desnaturalización a 94°C por 30 s, alineamiento a 55°C por 30 s, polimerización a 72°C por 30 s y ajuste final a 72°C por 5 min, durante 30 ciclos. Para todos los PCR se usó un termociclador Biometra T-Gradient (Biometra, Goettingen, Alemania). Clonaje y secuenciación de productos de PCR Se seleccionaron 31 muestras de tomate, un total de 23 muestras del año 2015 y ocho del año 2016. Se consideró para su selección su ubicación geográfica y la presencia o ausencia de infecciones mixtas. Los productos de PCR fueron clonados y secuenciados, se utilizó el kit Thermo Scientific InsTAclone PCR cloning (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, USA). Para la ligación se utilizó el vector pBluescript SK (+) (Stratagene, California, USA), y para la transformación se emplearon células de Escherichia coli Top 10. Los productos de PCR fueron secuenciados en ambas direcciones por la empresa Macrogen Inc. (Seúl, Corea). Las secuencias obtenidas fueron ensambladas con el programa Staden (Bonfield et al., 1995). La similitud de las secuencias se analizó con BLASTn (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) para compararlas con las bases de datos de secuencias públicas (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Las secuencias de Costa Rica fueron 7 analizadas con el software DnaSP 6 (DNA Sequence Polymorphism) que permitió seleccionar e identificar las muestras que fueron idénticas y denotarlas como haplotipos. Se generó un árbol filogenético con un ejemplar de cada haplotipo de las secuencias generadas con los imprimadores IRTyKrR y IRTyKrF (parte de la región intergénica larga (LIR), todo el gen V2 y parte del gen V1/CP) y 16 secuencias de otros begomovirus relacionados al TYLCV disponibles en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Se realizó un alineamiento múltiple usando el algoritmo Mafft (Katoh et al., 2002) en el servidor en línea GUIDANCE2 (Sela et al., 2015). La evaluación del modelo de sustitución de nucleótidos se llevó a cabo con el software FindModel (Posada & Crandall, 1998) y las distancias evolutivas para todas las muestras se estimaron mediante el método Tamura-Nei (TrN). Se construyó un árbol filogenético de máxima verosimilitud con 3000 réplicas utilizando el programa MEGA 10.1.8 (Tamura et al., 2013) y se utilizó como grupo externo un ejemplar de TYLCV-Mld de España (número de acceso AF071228). Amplificación por círculo rodante, clonaje y secuenciación Dos muestras fueron seleccionadas para la amplificación y clonaje de componentes completos, para esto se utilizó la técnica del círculo rodante (RCA) (Fire & Xu, 1995; Inoue-Nagata et al., 2004) utilizando el kit Illustra TempliPhi DNA Sequencing Template Amplification (GE Healthcare, LC, UK). Se probaron las enzimas de restricción BamHI, XbaI, PaeI, SacI, HindIII, SalI, KpnI y PstI (Thermo Fisher Scientific, USA) con la finalidad de obtener sitios de corte únicos. PaeI fue seleccionada para linearizar el fragmento de TYLCV. El plásmido pBluescript SK (+) (Stratagene, California, USA) fue 8 digerido con la misma enzima y ligado al producto de RCA previamente digerido. La transformación se realizó utilizando el kit Thermo Scientific InsTAclone PCR cloning (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, USA) y células de E. coli Top 10. Los insertos del tamaño esperado fueron seleccionados y secuenciados utilizando el método de primer walking. La secuenciación se realizó en la empresa Macrogen Inc. (Seúl, Corea). Los productos de la secuenciación fueron ensamblados utilizando el programa Staden (Bonfield et al., 1995) y los ORFs se analizaron con ORF Finder program (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/). La similitud de las secuencias se analizó con BLASTn (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) para compararlas con las bases de datos de secuencias públicas (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Se construyó un árbol filogenético considerando 63 secuencias de begomovirus disponibles en GenBank. El alineamiento de las secuencias se realizó con el algoritmo Mafft (Katoh et al., 2002) en el servidor en línea GUIDANCE2 (Sela et al., 2015). La evaluación del modelo de sustitución de nucleótidos se llevó a cabo con el software jModelTest 2.1.7.10 (Darriba et al., 2012) y las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método General Time Reversible plus Gamma plus Invariable sites (GTR+G+I). La máxima verosimilitud se calculó utilizando 3000 réplicas. Se utilizó como grupo externo al begomovirus PepGMV. Resultados Detección de begomovirus por hibridación En total se seleccionaron 212 muestras de plantas de tomate durante los años 2015 y 2016, de las principales zonas productoras del país. Las plantas seleccionadas mostraban 9 síntomas de la enfermedad como deformación foliar, mosaicos amarillos, clorosis en las hojas, rizado hacia arriba o hacia abajo de las hojas, clorosis en las venas y retardo en el crecimiento (enanismo) (Figura 1). Se muestreó en seis de las siete provincias de Costa Rica (no se consideró Limón). En el año 2015 se contempló Alajuela, Cartago, Guanacaste, Heredia, Puntarenas y San José y en el año 2016 se muestreó en Alajuela, Cartago, Heredia y San José (Figura 2 y Cuadro S1). Las muestras utilizadas dieron como resultado una señal positiva cuando fueron analizadas mediante la prueba de hibridación con sonda general, no obstante, para determinar la identidad de estos begomovirus se realizó la prueba de hibridación con sondas específicas, que fueron seleccionadas con base en estudios anteriores realizados en el país sobre incidencia de begomovirus en cultivo de tomate (Barboza et al., 2018). Se utilizaron sondas específicas para los begomovirus PepGMV, ToLCSiV, ToYMoV y TYLCV. Se observó que, dependiendo de la provincia, la presencia/ausencia de las distintas especies puede variar. El TYLCV está presente en las seis provincias analizadas en este trabajo y en todas ellas (con excepción de Guanacaste) es el virus que se encontró en una mayor proporción (50-100%). La presencia del TYLCV en Alajuela y Cartago fue de un 95.3% y 74.1%, respectivamente. Mientras que el virus en menor proporción fue el ToLCSiV (2.3%) en el caso de Alajuela y el PepGMV (5.6%) en Cartago. Estas dos provincias fueron también las más afectadas por begomovirus en general, sin embargo, existe un posible sesgo por la densidad desigual de muestreo en comparación a las otras provincias. En la provincia de Guanacaste se detectó infección por dos begomovirus, ToLCSiV en mayor proporción con 100% de las muestras infectadas (2/2) y solo el 50% (1/2) resultó infectada con el TYLCV. En Heredia y Puntarenas se detectaron tres begomovirus, siendo el TYLCV el virus de mayor proporción, 95.4% (62/65) y 100% 10 (3/3), respectivamente. En las muestras analizadas de San José solo se encontraron los virus TYLCV y ToYMoV, con una proporción de 100% (2/2) y 50% (1/2), respectivamente (Cuadro 1, Cuadro S1 y Figura S2). En las muestras analizadas del 2015, se registró la presencia de cinco infecciones mixtas, una muestra tuvo la presencia de TYLCV y PepGMV, otra presentó TYLCV, PepGMV y ToLCSiV, mientras que tres de ellas tuvieron TYLCV y ToLCSiV. Durante el 2016 se obtuvieron 20 infecciones mixtas, una con TYLCV, ToYMoV y ToLSiV, once con TYLCV y ToYMoV, cinco con TYLCV y PepGMV y tres con TYLCV y ToLCSiV (Figura 2). Detección por PCR del TYLCV y análisis de secuencias Se realizó una comprobación de los resultados obtenidos con la hibridación específica utilizando sondas del TYLCV. Para lo anterior, la totalidad de las muestras fue analizada con imprimadores específicos para diferenciar entre especies y variantes del TYLCV (Park et al., 2014). Al comparar ambas técnicas solo hay discrepancia en 10,8% (23/212) de las muestras analizadas. Esto significa que existen muestras que se agrupan como positivas, pues emiten una señal en la prueba de hibridación con una sonda del TYLCV, sin embargo, no fue posible obtener una amplificación por PCR o viceversa (amplifican por PCR, pero no emite señal positiva por hibridación). Estos resultados se encontraron en un 7,3% (9/123) de las muestras analizadas del 2015 y 15,7% (14/89) del material vegetal del 2016. No se obtuvo ninguna amplificación para las variantes TYLCV-Mld y TYLCV- Sardinia. Para corroborar los resultados, un total de 31 muestras fueron seleccionadas y clonadas, se consideró una secuencia de 675 nt, por cada una de las muestras. Estas se 11 seleccionaron siguiendo criterios de ubicación geográfica y presencia o ausencia de infecciones mixtas. En el análisis de la filogenia se muestran según la provincia de procedencia aquellos haplotipos (13) que fueron diferentes (Figura 3). Se encontró una asociación entre el amplicón y su ubicación geográfica, sin embargo, se requeriría hacer una búsqueda más exhaustiva, preferiblemente usando componentes completos con más muestras por región para relacionar aislados específicos a zonas concretas, ya que incluso en una misma muestra se encontró más de un haplotipo distinto (Figura 3). El alineamiento múltiple de los amplicones muestra alta identidad nucleotídica (98.67-99.85%) entre los 13 haplotipos, identificándolos como TYLCV-IL. Además, las secuencias analizadas presentaron una identidad nucleotídica de 99.11-100% con secuencias provenientes del TYLCV-IL de China (números de acceso JX128099, FN252890, AM698118 y AM698117) y Japón (números de acceso AB192965 y AB192966). Las secuencias obtenidas de esta investigación se agrupan en un cluster monofilético donde se asocian todos los haplotipos obtenidos en el estudio con secuencias provenientes de China, Japón, Australia, México, Corea y otras muestras de Costa Rica obtenidas previamente (número de acceso KF533855, KF533856, KF533857, KY064016). El taxón con 95% de soporte contiene muestras de Australia, México, China, Corea y Japón y comparten una identidad nucleotídica de 98.52-99.26% con los amplicones considerados en esta investigación (Figura 3). Con la finalidad de corroborar los datos obtenidos, dos componentes completos de TYLCV-IL fueron seleccionados y clonados. Ambos clones comparten 99.39% de identidad nucleotídica entre ellos y un 99.35-99.64% con las otras secuencias de Costa Rica (números de acceso KF533855, KF533856 y KY064016). Además, tienen una similitud del 99.28-99.32% con muestras de China (número de acceso JX128099). El 12 árbol filogenético muestra que las secuencias obtenidas en este estudio se agrupan en un clado monofilético (99% de soporte), dentro de este grupo se ubican muestras de Costa Rica, China, Australia, Japón, México y Corea. Las muestras de esta investigación tienen una relación más cercana con otras muestras de Costa Rica, luego con muestras de China. Es importante señalar, que secuencias del TYLCV procedentes de distintos países de América y el Caribe, tal es el caso de República Dominicana, Guatemala, Cuba, Granada y diversas zonas de USA son cercanas a secuencias de Jordania, Japón, Corea y Egipto. Se encontraron 10 grupos más, donde se ubican las otras secuencias consideradas en este análisis (Figura 4). Las bases de datos utilizadas para la construcción de ambas filogenias son muy similares, es por lo cual, aunque en un árbol se consideró una parte del genoma viral y en el otro árbol agrupa los componentes completos, ambos comparten la misma topología. Discusión Este trabajo permitió realizar un seguimiento de la dispersión relativa de las distintas especies de begomovirus presentes en Costa Rica. Se consideró para este análisis material vegetal procedente de muestras de tomate, que fueron recolectadas en las principales zonas productoras de este cultivo. Sin embargo, con la finalidad de conocer un poco más sobre el movimiento del TYLCV desde su arribo al país, fueron consideradas también algunas provincias donde la producción de este cultivo no es tan intensiva. Los resultados obtenidos con el muestreo exploratorio permiten generar datos actualizados de la distribución geográfica y diversidad genética de begomovirus en el país. 13 La técnica de hibridación general permitió trabajar con un gran número de muestras y descartar de forma rápida y eficiente las muestras que no presentaron una infección con begomovirus. De igual forma, la aplicación de la hibridación específica permitió una rápida clasificación de las especies de begomovirus que se encontraban presentes en los cultivos de tomate, además, de obtener su distribución en las zonas donde fue recolectado el material vegetal. La técnica PCR es conocida por ser más sensible (Pico et al., 1999; Nakhla et al., 2005), por lo tanto, la poca diferencia entre los datos obtenidos indica que ambos son buenos procedimientos para aplicar en identificación de virus, aunque sigue siendo más fidedigno emplear las dos técnicas para confirmar resultados. Esta diferencia se ha visto reflejada en otros estudios. Potter et al. (2003) emplearon ambas metodologías para la identificación de begomovirus en América y el Caribe, se señala también que un adecuado almacenamiento y extracción del ADN de las muestras permite tener concordancia de resultados entre hibridación y PCR. Estos investigadores indican que la inconsistencia de resultados entre ambas técnicas se debe al emplear tejidos secos o tejidos de plantas con alto contenido de fenoles y polisacáridos. Además, de acuerdo a un estudio realizado por Pico et al. (1999) en donde se hace un análisis comparativo de técnicas de diagnóstico de TYLCV para programas de mejora de tomate, tanto la técnica por hibridación como la de PCR mostraron ser buenas para escenarios diferentes. La técnica de PCR es más sensible, por lo tanto, es más útil cuando se trabaja con genotipos resistentes y tejidos jóvenes. Sin embargo, para plantas con síntomas severos es más efectiva la técnica de hibridación, probablemente por ser menos sensible a altos niveles de contaminantes. La discrepancia de los resultados obtenidos entre ambas técnicas también se puede deber a otras variantes de TYLCV que no se hayan considerado en este estudio. La sonda específica de TYLCV usada para el ensayo de hibridación sí detectaría 14 otras variantes de TYLCV, pero como la técnica por PCR se diseñó con imprimadores específicos, esta no detectaría otras variantes de TYLCV. Trabajos previos realizados con muestreos de tomate durante el periodo de 1994- 1996 (Nakhla et al., 2005) y 2012-2013 (Barboza et al., 2018) en el país, sugieren una distribución geográfica de begomovirus diferente a los mostrados en este estudio, sin embargo, es importante señalar que en este caso se realizó un esfuerzo importante de muestreo para cubrir la totalidad de las regiones productoras de este cultivo en el país. Durante el 2005 (Nakhla et al., 2005), se analizaron dos muestras de tomate de la provincia de Alajuela y fue posible encontrar los virus ToYMoV y ToLCSiV. En muestreos realizados durante el periodo 2012-2013 (Barboza et al., 2018) se analizaron 216 muestras de tomate de Alajuela (cantones de Grecia y Zarcero) en donde se encontró ToYMoV en mayor porcentaje (11.6 %), seguido de ToLCSiV (2.8%) y TYLCV (1.9%), en algunos sitios no se encontraron begomovirus. Estos datos contrastan con los resultados obtenidos en esta investigación, donde se encontró que el TYLCV es el virus en mayor proporción e incluso estuvo presente en todas las provincias del estudio, por lo que es posible afirmar que su distribución es casi en la totalidad del país. La rapidez de adaptabilidad de los begomovirus observada en la investigación no es ninguna novedad y en parte se adjudica esta plasticidad a su vector B. tabaci con un espectro de infección a más de 600 especies de plantas (Polston et al., 2014). Por ejemplo, el PepGMV se encontró infectando plantas de chile y no de tomate en 2012-2013 (Barboza et al., 2018), sin embargo, para el 2015-2016 ya se encontraba infectando tomate. Estos resultados podrían ser esperables, ya que existen reportes previos de este virus presente en tomate en Nicaragua (Ala‐Poikela et al., 2005). 15 El complejo de especies B. tabaci muestra una capacidad diferencial para transmitir diversos begomovirus (Bedford et al., 1994; Sánchez-Campos et al., 1999; Shi et al., 2014; Ning et al., 2015). Esto es importante señalar para el TYLCV, ya que existe evidencia de una relación mutualista más eficiente entre B. tabaci Mediterranean (MED) y TYLCV en comparación a la relación entre B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1) y TYLCV, esto se da por una ventaja indirecta del virus sobre la mosca blanca producto de una disminución en el sistema de defensa de la planta huésped (Fang et al., 2013; Shi et al., 2014). De acuerdo con Can-Vargas et al. (2020), muestras de mosca blanca recolectadas en Costa Rica durante los años 2015-2016 revelan que la especie más abundante en el país es Trialeurodes vaporiorum (68.5%), seguido de B. tabaci MED (26.9%), B. tabaci New World (NW) (4.3%) y B. tabaci MEAM1 (0.3%). La amplia distribución del TYLCV y al mismo tiempo la tendencia al aumento de la incidencia de B. tabaci MED en el país deben tomarse con cautela. Esta situación plantea un riesgo epidemiológico por la posible relación mutualista entre el virus y la mosca blanca que podrían ofrecer ventajas adaptativas e incrementar la propagación tanto de la plaga como de la enfermedad. El porcentaje de infección más alto de ToLCSiV (100%) en comparación al porcentaje de infección de TYLCV (50%) en la provincia de Guanacaste podría atribuirse a la baja presencia de mosca blanca en la región, donde solamente se identificó B. tabaci NW con una incidencia del 6% (Can-Vargas et al., 2020) y a la baja producción de tomate en la zona. El virus ToLCSiV está registrado en Costa Rica desde 1998 (Idris et al., 1999) y el virus ToYMoV aproximadamente desde 1996 (Castillo, 1997; Polston & Anderson, 1997). B. tabaci NW fue una de las primeras moscas identificadas en colonizar el país, justo después de la identificación del biotipo C y casi simultánea a la identificación de B. 16 tabaci MEAM1 (Castillo, 1997; Brown, 1993; Morales et al., 2005) y la primera región en mostrar síntomas de infección por begomovirus fue Guanacaste por la presencia de hospederos y su clima poco lluvioso (Gámez, 1970). Considerando que tanto el ToLCSiV como B. tabaci NW fueron de los primeros en afectar al país, es esperable que estén más adaptados a la zona y por lo tanto se presenten en mayor proporción. Se debe de señalar también, la virulencia del TYLCV, cuando se compara con las otras tres especies de begomovirus bipartitos que se encontraron anteriormente en el país (ToYMoV, ToLCSiV y PepGMV). Como se explicó previamente los trabajos de Barboza et al. (2018) y Nakhla et al. (2005) muestran un contraste con los datos de esta investigación, al encontrar predominancia del TYLCV sobre los otros virus bipartitos. Un fenómeno similar se ha observado en otros países, primero se encuentran los begomovirus en infecciones mixtas con el TYLCV y luego se da un desplazamiento importante por parte de TYLCV de los otros begomovirus que infectaban el cultivo inicialmente (Sánchez-Campos et al., 1999; Davino, Napoli, Davino, & Accotto, 2006). Es posible suponer que este fenómeno pueda llegar a suceder en el país, ya que los resultados de la investigación permitieron identificar al TYLCV como el virus dominante. Además, se han encontrado desplazamientos más fuertes cuando se dan infecciones mixtas de diferentes variantes de TYLCV, en donde incluso puede llegar a surgir producto de la recombinación, nuevas variantes más virulentas que sus parentales (García-Andrés et al., 2007; Péréfarres et al., 2011; Belabess et al., 2016). La distribución de las especies virales según los muestreos exploratorios realizados durante los dos años muestra que no hay una asociación con la topología o clima del país, sin embargo, cuando se analizan los haplotipos de TYLCV si se observa un patrón por región. También es importante resaltar que en la región fronteriza con Panamá, se 17 encontraron muestras infectadas con TYLCV, PepGMV y ToLCSiV. En este país se han reportado los begomovirus bipartitos Potato yellow mosaic Panama virus (PYMPV), ToLCSiV y ToYMoV (Herrera-Vásquez et al., 2018), considerando que en Panamá también se ha reportado B. tabaci MEAM1 (Brown & Bird, 1992; Chang, 2000; Kriticos et al., 2020), la cual se ha asociado con la transmisión de TYLCV, se debería prestar especial atención a esta zona fronteriza para evitar o eventualmente controlar la transmisión de TYLCV. Las secuencias encontradas presentaron una alta similitud con aislamientos de China y Japón, estos resultados son similares a los encontrados previamente (Barboza et al. 2018). Esto igual hace pensar que la introducción del TYLCV a Costa Rica no fue por medio del Caribe, que se propone fue uno de los principales ingresos del TYLCV en el hemisferio oeste, sino que fue producto de introducciones independientes provenientes de Asia del Este (Mabvakure et al., 2016). Dado que las introducciones a China y Australia también proceden de Asia del Este (Japón) en diferentes rangos temporales, no es tan extraño que las muestras de Costa Rica sean similares a estos aislados (Mabvakure et al., 2016), lo mismo podría explicarse con el aislamiento de Sinaloa- México (número de acceso FJ012358). Según lo mencionado por Bañuelos-Hernández et al. (2012), en México hay diferentes introducciones del virus, la primera fue en la península de Yucatán (Ascencio-Ibáñez et al., 1999) y luego se detectó en el estado de Sinaloa (Brown & Idris, 2006; Gámez-Jiménez et al., 2009). El aislamiento de Sinaloa se asocia a las infecciones de California en Estados Unidos, el cual también proviene de una migración de TYLCV- IL de Australia (Duffy & Holmes, 2007; Lefeuvre et al., 2010). Por lo tanto, las muestras consideradas en la confección del filograma provenientes de China, de Australia y de México provienen directa o indirectamente de Asia del Este. 18 La filogenia que se realizó con los componentes completos confirma la relación cercana entre las muestras de este estudio y los aislamientos previamente reportados para Costa Rica. La similitud en la topología entre ambos filogramas indica que el amplicón que corresponde a las secuencias parciales, es un buen representante del genoma completo para los ejemplares de Costa Rica, en donde la identidad nucleotídica entre las muestras es muy alta y algunas de las variaciones entre ambas filogenias pueden explicarse por el largo de estas. En ambos árboles se utilizan secuencias previamente descritas, por lo que su interpretación detallada ya ha sido analizada y resumida (Lefeuvre et al., 2010; Hosseinzadeh et al., 2013; Mabvakure et al., 2016). Un ejemplo de esto sería la antes mencionada entrada del TYLCV a América por medio del Caribe, la cual se cuestiona si fue un cargamento de plántulas infectadas hacia República Dominicana o Cuba proveniente de Israel (Polston et al., 1999; Mabvakure et al., 2016). Dado lo anterior es que secuencias de distintos países de América y el Caribe agrupan en un mismo clado con 73% de soporte (Figura 4). Otro ejemplo es citado por Mabvakure et al. (2016) donde se menciona como hubo una migración de TYLCV-IL desde el Mediterráneo occidental hacia Nueva Caledonia e Islas Reunión, y luego se dio una migración hacia Isla Mauricio. Además, Lobin et al. (2010) y Botermans et al. (2009) mencionan como este mismo clado guarda estrecha relación con muestras de TYLCV de Almeria-España. Estos tres trabajos obtuvieron la misma relación filogenética con diferentes muestras y llegan a la misma conclusión. Resultados similares fueron encontrados cuando se analizó la filogenia en esta investigación y se encuentra que estas secuencias agrupan con un 99% de similitud en el árbol filogenético (Figura 4). Es importante destacar que las migraciones mencionadas en los estudios citados se basan en patrones de movimiento utilizando modelos de predicción, por lo que puede ser diferente a la realidad (Posada 2001; Drummond & Rambaut, 2007; 19 Baele et al., 2012; 2013). Además, los árboles se crean bajo inferencias probabilísticas con valores variables de soporte en las ramas y basados en modelos de evolución molecular, por lo que también están sujetos a márgenes de error (Rutschmann 2006; Peña, 2011). Esta investigación muestra como la infección por TYLCV en Costa Rica en plantas de tomate se ha propagado por casi todo el país y esto ha enmascarado las infecciones con otros begomovirus (PepGMV, ToYMoV y ToLCSiV). Se refleja un leve aumento en la cantidad de infecciones mixtas entre el año 2015 al 2016, sin embargo, es necesario continuar con muestreos de prospección anuales para no perder control de lo que está sucediendo con el cultivo, así como posibles eventos de mutación y/o recombinación, la llegada de otra variante de TYLCV al país o bien la introducción de otras especies de begomovirus. A pesar de no existir un registro detallado de las pérdidas ocasionadas en Costa Rica por begomovirus, se sabe que los daños ocasionados por la infección del TYLCV ocasionaron un aumento significativo en el precio del tomate en el mercado nacional (Hilje & Stansly, 2017). Dado lo anterior, la información obtenida en esta investigación permite a los servicios de vigilancia fitosanitaria desarrollar estrategias de manejo integrado de la enfermedad y bien aportar esta información a los programas de mejoramiento genético del cultivo. En el caso de Costa Rica, la importancia del monitoreo de los begomovirus reside en la alta virulencia del TYLCV y la posible amenaza de recombinación, ya que por sí solas las otras especies bipartitas no habían sido un problema grave para el agricultor en el país. Nuevas investigaciones podrían mostrar cómo ha sido el efecto de la introducción de variedades de tomate con genes de resistencia a estos begomovirus. 20 Agradecimientos Este proyecto fue realizado gracias al soporte económico de Vicerrectoría de Investigación (Proyecto B7-145) y el Servicio Fitosanitario del Estado. Además, se agradece el acceso brindado por los agricultores a sus terrenos para la toma de muestras. 21 Referencias Ala‐Poikela, M., Svensson, E., Rojas, A., Horko, T., Paulin, L., Valkonen, J. P. T., & Kvarnheden, A. (2005). Genetic diversity and mixed infections of begomoviruses infecting tomato, pepper and cucurbit crops in Nicaragua. Plant pathology, 54(4), 448-459. 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Provincia TYLCV PepGMV ToYMoV ToLCSiV Alajuela 95,3 (82/86) * 3,5 (3/86) 8,1 (7/86) 2,3 (2/86) Cartago 74,1 (40/54) 5,6 (3/54) 7,4 (4/54) 14,8 (8/54) Guanacaste 50,0 (1/2) 0,0 (0/2) 0,0 (0/2) 100,0 (2/2) Heredia 95,4 (62/65) 9,2 (6/65) 1,5 (1/65) 0,0 (0/65) Puntarenas 100,0 (3/3) 33,3 (1/3) 0,0 (0/3) 66,7 (2/3) San José 100,0 (2/2) 0,0 (0/2) 50,0 (1/2) 0,0 (0/2) *Proporción de muestras infectadas con begomovirus (número de muestras positivas por provincia/ número de muestras totales por provincia analizadas por hibridación utilizando sondas específicas de begomovirus) 35 Figura 1. Plantas de tomate infectadas con begomovirus. (A, B) Plantas con infección de tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). (C) Planta con infección mixta de TYLCV y pepper golden mosaic virus (PepGMV). (D, E) Planta con infección mixta de TYLCV y tomato yellow mottle virus (ToYMoV). 36 Figura 2. Distribución de muestras positivas para begomovirus en los años 2015-2016 en Costa Rica. Las infecciones mixtas incluyen especies de begomovirus como Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Pepper golden mosaic virus (PepGMV), Tomato yellow mottle virus (ToYMoV) y Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV). Se muestra el área de Costa Rica con detalle de elevación. 37 Figura 3. Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en secuencias nucleotídicas de TYLCV de Costa Rica y otras partes del mundo que abarcan parte de la región intergénica larga (LIR), todo el gen V2 y parte del gen V1/CP). Las muestras obtenidas en este estudio se marcan con un punto negro. Las secuencias fueron alineadas usando Mafft y el árbol fue construido con 3000 replicaciones bootstrap¸ las distancias evolutivas se calcularon con el método Tamura-Nei (TrN). Solo se ven los valores de bootstrap mayores a 50%. Se utilizó como raíz del árbol una secuencia de Tomato yellow leaf curl virus variante Mld (TYLCV-Mld). 38 Figura 4. Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en componentes completos de secuencias nucleotídicas de TYLCV de Costa Rica y secuencias de TYLCV de otras partes del mundo. Las muestras obtenidas en este estudio se marcan con un punto negro. Las secuencias fueron alineadas usando Mafft y el árbol fue construido con 3000 replicaciones bootstrap, las distancias evolutivas se calcularon con el método General Time Reversible plus Gamma plus Invariable sites (GTR+G+I). Solo se ven los valores de bootstrap mayores a 50%. Se utilizó como raíz del árbol una secuencia de la especie de begomovirus Pepper golden mosaic virus (PepGMV). El recuadro de la derecha muestra una ampliación del recuadro de la izquierda. 39 Anexos Cuadro S1. Porcentaje de muestras infectadas por begomovirus según la provincia, año de muestreo y sonda específica para Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Pepper golden mosaic virus (PepGMV), Tomato yellow mottle virus (ToYMoV) y Tomato leaf curl Sinaloa virus (ToLCSiV). Provincia TYLCV PepGMV ToYMoV ToLCSiV 2015 Alajuela 38,2 (47/123) * 0,0 (0/123) 0,0 (0/123) 0,8 (1/123) Cartago 8,9 (11/123) 0,8 (1/123) 0,0 (0/123) 0,0 (0/123) Guanacaste 0,8 (1/123) 0,0 (0/123) 0,0 (0/123) 1,6 (2/123) Heredia 45,5 (56/123) 0,0 (0/123) 0,0 (0/123) 0,0 (0/123) Puntarenas 2,4 (3/123) 0,8 (1/123) 0,0 (0/123) 1,6 (2/123) San José 0,8 (1/123) 0,0 (0/123) 0,0 (0/123) 0,0 (0/123) 2016 Alajuela 39,3 (35/89) * 3,4 (3/89) 7,9 (7/89) 1,1 (1/89) Cartago 32,6 (29/89) 2,2 (2/89) 4,5 (4/89) 9,0 (8/89) Guanacaste 0,0 (0/89) 0,0 (0/89) 0,0 (0/89) 0,0 (0/89) Heredia 6,7 (6/89) 6,7 (6/89) 1,1 (1/89) 0,0 (0/89) Puntarenas 0,0 (0/89) 0,0 (0/89) 0,0 (1/89) 0,0 (0/89) San José 1,1 (1/89) 0,0 (0/89) 1,1 (1/89) 0,0 (0/89) *Proporción de muestras infectadas con begomovirus (número de muestras positivas/ número de muestras totales por año y por provincia analizadas por hibridación utilizando sondas específicas de begomovirus) 40 Figura S2. Porcentaje de muestras consideradas en la investigación por cada provincia de Costa Rica en los años 2015 y 2016. De las 212 muestras consideradas en total, 86 (41%) pertenecen a Alajuela, 54 (25%) pertenecen a Cartago, 2 (1%) pertenecen a Guanacaste, 65 (31%) pertenecen a Heredia, 3 (1%) pertenecen a Puntarenas y 2 (1%) pertenecen a San José. 41% 25% 1% 31% 1% 1% Alajuela Cartago Guanacaste Heredia Puntarenas San José 41 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Los Begomovirus son uno de los nueve géneros de la familia Geminiviridae y se destaca por ser el más grande de la familia (Zerbini et al. 2017), su especie tipo es Bean golden yellow mosaic virus (antes Bean golden mosaic virus – Puerto Rico) (BGYMV). Esta exitosa familia le debe su gran variedad de especies a varios factores, dentro de los cuales se puede mencionar, una expansión explosiva de su vector Bemisia tabaci (género Hemíptera, familia Aleyrodidae) en distintas zonas geográficas, una evolución rápida producto de mutaciones, pseudo-recombinación, recombinación y adquisición de satélites. Otros factores que contribuyen a su diversidad son cambios climáticos, siembra masiva de cultivos susceptibles a la enfermedad (algodón, tomate, cucurbitáceas, etc), otros begomovirus silvestres distribuidos en plantas no cultivadas como malezas, introducción de nuevas plantas a regiones infectadas con el virus, comercio con plantas infectadas, entre otras (Melgarejo et al., 2013; Seal et al., 2006). Nuevos virus se describen continuamente y los begomovirus al ser tan versátiles no son la excepción, es por esto por lo que es necesario establecer criterios para para separar variantes y especies de virus (http://ictvonline.org/). El Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV; International Committee on Taxonomy of Viruses) es el encargado de crear normas para su clasificación, en el caso de los begomovirus se proponen cinco normas: (1) el número de componentes genómicos; (2) la organización del genoma donde se cita la presencia o ausencia del marco abierto de lectura (ORF) AV2 que codifica para la proteína de movimiento; (3) la identidad de secuencia nucleotídica considerando la secuencia completa del componente A, si son miembros de especies distintas deberán tener una identidad <91% de la secuencia, para miembros de variantes distintas el porcentaje de identidad es de 94% de la secuencia; (4) si la proteína de 42 Replicación (Rep) de un virus es incapaz de replicar en trans el genoma de otro virus se considera como indicador para separar las posibles especies estudiadas, sin embargo, esta característica debe ir acompañada con otras de mayor fidelidad porque un cambio pequeño en el sitio de unión de Rep pueden afectar de forma positiva o negativa este sitio de unión y (5) el rango natural del huésped y los distintos fenotipos por diferentes síntomas pueden estar asociados con una especie en particular, pero su uso más común será distinguir variantes (http://ictvonline.org/). Los begomovirus son un grupo importante de fitovirus que afectan ecosistemas agrícolas tropicales, subtropicales y templados (Fiallo-Olivé et al., 2020). Son virus pequeños de ADN de cadena simple circular, de aproximadamente 2.6-2.8 kb cada componente genómico. Dentro del insecto vector se mueven de manera circulativa y se trasmiten de forma persistente por el complejo críptico de especies B. tabaci también conocida como mosca blanca del tabaco, que transfiere el virus a la planta de forma indirecta mientras se alimenta de su floema (Jones et al., 2003; Hilje & Stansly, 2017). Después de la ingestión del virus por la mosca se requiere mínimo un lapso de 8 h para poder infectar otra planta, esto porque debe pasar a lo largo del canal alimentario, la hemolinfa y las glándulas salivales primarias (Czosnek et al., 2017; Ghanim et al., 2001). Recientes y distintas publicaciones indican una posible transmisión de diversos begomovirus por semilla, por ejemplo sweet potato leaf curl virus (SPLCV) en camote (Ipomoea batatas), tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) en tomate (Solanum lycopersicum), soya (Glycine max) y chile dulce (Capsicum annuum), mung bean yellow mosaic virus (MYMV) en frijol negro (Vigna mungo), dolichos yellow mosaic virus (DoYMV) en Lablab purpureus L. conocida como frijol de Egipto, bitter gourd yellow mosaic virus (BgYMV) en Momordica charantia L. conocida como melón amargo y 43 tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) en zucchini (Cucurbita pepo) (Kil et al., 2016; Kil et al., 2017; Kil et al., 2018; Kil et al., 2020; Kim et al., 2015; Kothandaraman et al., 2016; Manivannan et al. 2019; Suruthi et al., 2018), pero es un tema que sigue en discusión pues no todos los experimentos se han podido reproducir (Rajabu et al., 2018; Rosas-Díaz et al., 2017). Pérez-Padilla et al. (2020) indican que esta trasmisión es resultado de contaminación externa de la semilla. En su ensayo, se realizan pruebas antes y después de una limpieza externa con etanol y cloro, las mismas antes de la limpieza son positivas para el TYLCV, sin embargo, luego de esta disminuye significativamente la presencia del virus. Los autores concluyen que lo que parece ser una transmisión por semilla es en realidad una transmisión por contaminación de la testa. Esta investigación pone en duda a los demás begomovirus que en apariencia se pueden transmitir por semilla y se propone repetir los estudios con tratamientos de limpieza externa. La sintomatología de las enfermedades causadas por los begomovirus varía en dependencia de la planta huésped, la variante/especie de virus que infecta, condiciones ambientales y climáticas, etapa de crecimiento de la planta, entre otras (Malathi et al., 2017). A pesar de estas variables, se puede generalizar algunos síntomas en las hojas como moteados y mosaicos amarillos, clorosis intervenal y marginal, deformación y enrrollamiento hacia arriba o hacia abajo (Moriones & García-Andrés, 2007; Nava et al., 2013; Rezk et al., 2019). Además, si la infección se da en una etapa temprana del desarrollo de la planta puede causar pérdida de la fruta y semillas infértiles, por lo tanto, un detrimento en el rendimiento (Malathi et al., 2017; Moriones & García-Andrés, 2007). Su genoma comprende uno (monopartita, ADN-A) o dos componentes (bipartita ADN-A y ADN-B), cada uno es encapsidado de forma individual en una partícula de icosaedros incompletos gemelos (T=1), con 110 subunidades de proteína de cápside (CP), 44 organizadas en 22 capsómeros pentaméricos (Zhang et al., 2001). Estos virus no codifican para la enzima ADN polimerasa y por eso son dependientes de la maquinaria del hospedero en sus primeras etapas de replicación. Sus ORF tienen orientación bidireccional en ambos componentes y están separados por una región intergénica (LIR, por sus siglas en inglés), donde se encuentra el origen de replicación (Ori). El componente A (ADN-A) tiene seis ORF, dos en sentido viral y cuatro en sentido complementario (sintetizada durante la replicación de ADN). Los ORF antisentido codifican para la proteína asociada a la replicación (Rep, AC1/C1) (Elmer et al., 1988; Sunter et al., 1989), un activador transcripcional (TrAP, AC2/C2) que cumple un papel en el control de replicación, expresión genética y supresión de sistemas de defensa de las plantas (Elmer et al., 1988; Sunter & Bisaro, 1992), una proteína potenciadora de replicación (Ren, AC3/C3) (Elmer et al., 1988; Morris et al., 1991; Nagar et al., 1995) y una proteína relacionada con la supresión de silenciamiento (AC4/C4). En sentido viral los ORF codifican para la proteína de cubierta (CP, AV1/V1) (Gardiner et al., 1988; Stanley & Townsend, 1986) y la proteína de movimiento (AV2/V2) (los begomovirus bipartitas del nuevo mundo no lo tienen) (Zerbini et al., 2017). El componente B (ADN-B) tiene dos ORF, uno en sentido complementario que codifica para una proteína de movimiento (MP, BC1) y en sentido viral para una proteína de movimiento hacia afuera del núcleo (NSP, BV1) (Brough et al., 1988; Stanley, 1995). Los begomovirus monopartitas tienen solo un componente que se asemeja al componente A del bipartita (Dry et al., 1993; Hanley-Bowdoin, 1999; Mullineaux et al., 1993; Zerbini et al., 2017). En algunos casos, los begomovirus están acompañados de un ADN cadena simple circular de ~1.4kb, puede ser alfasatélite, betasatélite o deltasatélite (Briddon & Stanley, 2006; Fiallo-Olivé et al., 2012; Li et al, 2019; Lozano et al. 2016; Nawaz-ul-Rehman & 45 Fauquet, 2009). Estos satélites presentan distintas características, unos se replican a sí mismos (alfasatélites), otros dependen por completo de la molécula viral primaria para su replicación, movimiento, encapsidación y transmisión (beta/deltasatélites). Algunos no tienen una función asociada como los alfasatélites y deltasatélites, pero otros como los betasatélites se les atribuye un papel en la interferencia de la resistencia de la planta, aumento en la virulencia y contribución al desplazamiento sistémico del virus primario (Idris et al., 2005; Lozano et al. 2016; Nawaz-ul-Rehman & Fauquet, 2009). De acuerdo con su organización genómica, la diversidad genética y la distribución geográfica, los begomovirus se han dividido en dos grupos: los del viejo mundo (OW; Old World = Europa, África, Asia y Australia) y los del nuevo mundo (NW; New World = América) (Nawaz-ul-Rehman & Fauquet, 2009). Sin embargo, esta línea divisoria se hace cada vez más difusa ya que en un principio los virus del OW se caracterizaban por ser monopartitas y los virus del NW se conocían como bipartitas (Macedo et al., 2018). Posteriormente, en OW se empezaron a describir virus bipartitas y se cambió la primicia a que en OW sí había virus bipartitas, pero en menor cantidad, como por ejemplo el tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) el cual es un virus bipartita que afecta la zona de la India (Zaidi et al., 2017). En los últimos años, se ha descubierto que en el NW también hay virus monopartitas y no solo producto de migración, si no endémicos de la zona, por ejemplo las especies: Tomato leaf curl purple vein virus (ToLCPVV) y Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV) en Brasil (Macedo et al., 2018; Vu et al., 2015), Tomato leaf deformation virus (ToLDeV) en Ecuador y Perú (Melgarejo et al., 2013) o Tomato twisted leaf virus en Venezuela (Romay et al., 2019). Como son varios los factores que contribuyen al éxito de los begomovirus, es difícil estimar la pérdida ocasionada por estas enfermedades. En parte depende de las 46 prácticas de manejo de cultivo que tenga la zona afectada. Se estima entre un 10-30% de pérdida de rendimiento general ocasionado por begomovirus, no son muchos los que logran sobrepasar este porcentaje, sin embargo, existen episodios de enfermedades catastróficas que han alcanzado importancia internacional debido a su propagación, periodicidad y virulencia, dentro de las que se puede mencionar cassava mosaic disease (CMD), tomato yellow leaf curl disease (TYLCVD) y cotton leaf curl disease (CLCuD) (Briddon, 2003; Czosnek, 2007; Legg & Fauquet, 2004; Mahatma et al., 2016; Scholthof et al., 2011). 47 Referencias Briddon, R. W. (2003). Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex. Molecular Plant Pathology, 4(6), 427-434. Briddon, R. W., & Stanley, J. (2006). 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