UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO ESTUDIO DE BIOCOMPATIBILIDAD DE LAS NANOPARTÍCULAS DE HIDROXIAPATITA Y SU POSIBLE APLICACIÓN COMO VEHÍCULO PARA SUSTANCIAS BIOACTIVAS Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Química para optar al grado y título de la Maestría Académica en Química JERSON GONZÁLEZ HERNÁNDEZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2014 ii Dedicatoria A mi papá Gabriel González Alfaro, su afán por la vida me arañó como un arado que surca la tierra. "Aunque los pasos se vuelvan lentos y la energía se convierta en fatiga, quedará siempre por dentro el instinto primitivo, la fuerza de voluntad." Anónimo, visto en el Parque Nacional Chirripó, Costa Rica. iii Agradecimientos Expreso mi agradecimiento al director de este proyecto, Dr. Rer. Nat. Alfonso García Piñeres, por la oportunidad otorgada para recorrer este excepcional camino a la sombra de su conocimiento y su experiencia. Agradezco, profundamente, a mis asesores, Ph.D. Mavis Montero Villalobos y Ph.D. José Bonilla Vargas, por aunar a este trabajo sus valiosos aportes. A la Escuela de Química, a la Escuela de Medicina, al Centro de Electroquímica y Energía Química (CELEQ) y, especialmente, al Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), por facilitarme sus laboratorios para realizar la parte experimental de la tesis. A la empresa Florida Ice & Farm, por el otorgamiento del premio Aportes a la Creatividad y a la Excelencia 2009, el cual contribuyó al financiamiento de este proyecto de investigación. A la Vicerrectoría de Investigación y a la Federación de Estudiantes de la Universidad de Costa Rica, además al Ministerio de Ciencia, Tecnología y Telecomunicaciones, por financiar la presentación de una parte del trabajo de investigación en el V Congreso Internacional de Biomateriales que se llevó a cabo en la Habana, Cuba, en marzo de 2010. Al CELEQ y al Sistema de Estudios de Posgrado de la Universidad de Costa Rica, por asumir el costo de la participación en el III Taller de Órganos Artificiales, Biomateriales e Ingeniería de Tejidos, realizado en Viña del Mar, Chile, en setiembre de 2013. Al personal administrativo del CELEQ de la Universidad de Costa Rica, por extenderme la oportunidad de equilibrar mi tiempo laboral con el tiempo académico requerido para la maestría. Al M.Sc. Walter Hernández Ascencio del CIBCM, por brindarme su ayuda y su conocimiento en las diferentes tareas relacionadas con los procedimientos de biología molecular. Al M.Sc. Leonardo Rojas Álvarez de la Escuela de Química, por su colaboración en la caracterización de los materiales a través de la medición de los espectros de infrarrojo y del difractograma de rayos X. iv Al Ph.D. Sergio Madrigal Carballo y al Lic. Jorge Araya Matey del Laboratorio de Ciencia y Tecnología de Polímeros de la Universidad Nacional, por su contribución en las mediciones del potencial ζ y del tamaño de las partículas en suspensión. A mis compañeros del Laboratorio de Cultivo Celular, Elisa Cordero Chacón y Francis Rodríguez Fonseca, por compartir esta experiencia académica conmigo. A la Ing. Migde Reyes Pérez del CIBCM, por su grata compañía en las largas horas de trabajo. A Daniele Rocchi, por la traducción del resumen de este documento a los idiomas italiano e inglés. A mis amigos Carlos Calderón Castro y Paola Fuentes Schweizer, porque son excepcionales y me recuerdan con ahínco muchas de las cosas que son importantes en la vida. A mi mamá Virginia Hernández Lara, por su inagotable amor incondicional que me trajo hasta aquí. A mi papá Gabriel González Alfaro, porque el recuerdo de sus relatos aún me entretiene tanto como los de Edward Bloom en Big Fish. Gracias por todo papi, fue un viaje extraordinario. A mi hermana Jeannette González Hernández, por la dicha de compartir más que esta vida juntos. A las montañas de Costa Rica, porque sus senderos y sus parajes me llenan de felicidad. Sobre todo lo demás, gracias a Jairo García Céspedes —ab imo pectore—. v vi Índice general Dedicatoria ............................................................................................................................. ii Agradecimientos .................................................................................................................... iii Índice general ........................................................................................................................ vi Resumen .............................................................................................................................. viii Abstract ................................................................................................................................. ix Riassunto ................................................................................................................................ x Lista de cuadros ..................................................................................................................... xi Lista de figuras ...................................................................................................................... xii Lista de abreviaturas ............................................................................................................ xvi Difusión de los resultados en publicaciones y congresos .................................................... xvii 1. Marco teórico ................................................................................................................. 1 1.1 Introducción ............................................................................................................ 1 1.2 Transporte dirigido de los medicamentos y terapia génica ...................................... 3 1.3 Generalidades de la hidroxiapatita .......................................................................... 9 1.4 Aplicaciones biomédicas de las nanopartículas de hidroxiapatita .......................... 15 2. Hipótesis ....................................................................................................................... 19 3. Objetivos ...................................................................................................................... 19 3.1 Objetivo general.................................................................................................... 19 3.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 19 4. Sección experimental.................................................................................................... 21 4.1 Síntesis de hidroxiapatita ...................................................................................... 23 4.1.1 Síntesis por el método electroquímico 23 4.1.2 Síntesis por el método de coprecipitación 23 4.1.3 Suspensión de las nanopartículas de hidroxiapatita en PBS 24 4.2 Caracterización de las nanopartículas de hidroxiapatita ........................................ 24 4.2.1 Espectroscopia infrarroja y difracción de rayos X 24 4.2.2 Medición del potencial ζ de las nanopartículas en suspensión 25 4.2.3 Medición del tamaño de las nanopartículas en suspensión 25 vii 4.3 Biocompatibilidad de las nanopartículas de hidroxiapatita .................................... 26 4.3.1 Mantenimiento del cultivo celular 26 4.3.2 Ensayos de citotoxicidad 26 4.3.3 Análisis estadístico 27 4.4 Preparación de los plásmidos pTZ57R y pCMV-AC-GFP .......................................... 27 4.4.1 Transformación de bacterias Escherichia coli competentes de la cepa DH5α 28 4.4.2 Amplificación del plásmido a gran escala 29 4.4.3 Extracción del plásmido por lisis alcalina 29 4.4.4 Purificación del plásmido por precipitación con polietilenglicol 30 4.4.5 Corroboración del plásmido por electroforesis y PCR 31 4.5 Caracterización fisicoquímica de los complejos hidroxiapatita y plásmido.............. 33 4.5.1 Cinética de adsorción y desorción 33 4.5.2 Ensayos de adsorción del plásmido sobre la hidroxiapatita 33 4.5.3 Medición de la capacidad máxima adsorbente de la hidroxiapatita 34 4.5.4 Análisis estadístico 34 4.6 Transfección de las células RAW 264.7 con vectores de HA y Ca3(PO4)2 .................. 35 4.6.1 Ensayos de microscopia fluorescente 35 4.6.2 Ensayos de citometría de flujo 36 4.6.3 Análisis estadístico 38 5. Resultados y discusión .................................................................................................. 39 5.1 Caracterización de los tipos de hidroxiapatita ....................................................... 39 5.2 Potencial ζ y tamaño de las nanopartículas ........................................................... 43 5.3 Ensayos de biocompatibilidad ............................................................................... 47 5.4 Caracterización fisicoquímica de los complejos hidroxiapatita y plásmido.............. 51 5.5 Transfección de las células RAW 264.7 .................................................................. 63 6. Conclusiones ................................................................................................................. 71 Referencias ........................................................................................................................... 73 Anexos .................................................................................................................................. 83 viii Resumen Las nanopartículas sintéticas se utilizan en aplicaciones médicas para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de las enfermedades. Algunos de los usos más destacados de estos biomateriales, a través de la nanotecnología, incluyen: el marcaje biológico por fluorescencia, el transporte de genes y de medicamentos, la biodetección de patógenos y la ingeniería de tejidos, entre otros. La hidroxiapatita es un mineral que se describe con la fórmula empírica Ca10(PO4)6(OH)2 la cual se ha convertido en un material con mucho éxito en la investigación biomédica, pues el grado de compatibilidad con las células de los diferentes tejidos estudiados es muy alto y la toxicidad es muy baja. Estas nanopartículas se han utilizado en tratamientos tales como: las prótesis y los rellenos óseos, el recubrimiento de superficies metálicas para los implantes, el refuerzo de materiales compuestos y, recientemente, como vehículo liberador de sustancias bioactivas, entre ellas los fármacos, los péptidos y los ácidos nucleicos. El objetivo de este proyecto de investigación es evaluar la biocompatibilidad de las nanopartículas de la hidroxiapatita sintética con los macrófagos murinos RAW 264.7 por medio de ensayos in vitro, y caracterizar la interacción de este nanomaterial con el ADN para valorar la factibilidad de su empleo como un vehículo molecular. Para su consecución se sintetizaron nanopartículas de hidroxiapatita por un método electroquímico y un método de coprecipitación, se caracterizaron los materiales por medio del análisis de difracción de rayos X y espectroscopia infrarroja, se midió el potencial Z y el tamaño de las partículas en suspensión, se realizaron pruebas de viabilidad celular con el reactivo MTT, se determinó la capacidad máxima adsorbente de la hidroxiapatita con respecto a los plásmidos de ADN a través de isotermas de adsorción y se llevaron a cabo ensayos de transfección celular evaluados por microscopia óptica de fluorescencia y citometría de flujo. Con base en los resultados se demostró que la hidroxiapatita es un material biocompatible con las células RAW 264.7 y que presenta una afinidad por las moléculas de ADN, cuya capacidad máxima adsorbente se determinó en 679 µg/mg. Asimismo, se obtuvo evidencia de que las nanopartículas de hidroxiapatita funcionan como un vector de transfección, lo cual permite emplear este nanomaterial inorgánico como un vehículo para transportar los ácidos nucleicos al interior de las células. ix Abstract Synthetic nanoparticles are used in the field of medicine for the diagnosis, prevention and treatment of disease. Some of the most relevant applications of these biomaterials in nanotechnology include fluorescent tracing, targeted gene transport and drug delivery, the biodetection of pathogens, as well as tissue engineering, among others. Hydroxyapatite is a mineral with empirical formula Ca10(PO4)6(OH)2 that has been widely used in the field of biomedical research, given that the level of compatibility with the cells of various tissues has been very high while toxicity is very low. These nanoparticles have found application in several treatments such as: prosthetics and bone grafts, coating of metal surfaces used in manufacturing implants, reinforcement of compound materials and, more recently, as delivery systems for the release of bioactive substances, including drugs, peptides and nucleic acids. The main goal of this project is to evaluate the biocompatibility of synthetic hydroxyapatite nanoparticles with murine macrophages RAW 264.7 through in vitro assays, and to describe the interaction of this nanomaterial with DNA, as well as to assess its applicability for use as a molecular delivery system. For this purpose, hydroxyapatite nanoparticles were synthesized using electrochemical and coprecipitation methods, materials were characterized by means of X-ray diffraction analysis, infrared spectroscopy, Z potential and size of the particles in suspension. Cell viability tests were also conducted using the MTT reagent. The maximum DNA adsorption capacity of hydroxyapatite was determined by measuring adsorption isotherms and cell transfection trials were performed and compared using fluorescence microscopy and flow cytometry. The results show that hydroxyapatite is biocompatible with RAW 264.7 cells and has an affinity to DNA molecules, with a maximum adsorption capacity of 679 µg/mg. Likewise, was shown that hydroxyapatite nanoparticles could work as a transfection vector, which allows using this inorganic nanomaterial to deliver nucleic acids within cells. x Riassunto Le nanoparticelle sintetiche si utilizzano per applicazioni mediche per la diagnostica, la prevenzione ed il trattamento delle patologie. Tra gli usi più importanti di questi biomateriali, per mezzo della nanotecnologia, si trovano: il tracciamento biologico con fluorescenza, il trasporto genetico e dei farmaci, la biodetezione di patogeni e l’ingegneria dei tessuti, tra altri. La idrossiapatite è un minerale avente composizione chimica Ca10(PO4)6(OH)2, ed è un materiale che ha riscosso molto successo nell’ambito della ricerca biomedica, dato che il grado di compatibilità con le cellule nei diversi tessuti studiati è molto alto, mentre è molto bassa la tossicità. Sono state utilizzate queste nanoparticelle in trattamenti tali come: le protesi e gli innesti ossei, per ricoprire superfici metalliche per gli impianti, per rafforzare materiali composti e, più recentemente, come agente per liberare sostanze bioattive, come farmaci, peptidi e acidi nucleici. La scopo di questo progetto di ricerca è quello di valutare la biocompatibilità delle nanoparticelle della idrossiapatite sintetica con i macrofagi murini RAW 264.7 per mezzo di test in vitro, e definire l’interazione di questo nanomateriale con il DNA per valutare l’applicabilità del suo utilizzo come un veicolo molecolare. Per questo scopo, sono state sintetizzate nanoparticelle di idrossiapatite usando un metodo elettrochimico ed un metodo di coprecipitazione, ed i materiali sono stati definiti attraverso l’analisi radiografica e spettroscopia infrarossa. È stato misurato il potenziale Z e le dimensioni delle particelle in sospensione, e sono stati realizzati dei test di applicabilità cellulare con il reagente MTT; è stata determinata la capacità massima di adsorbimento dell’idrossiapatite riguardo ai plasmidi del DNA per mezzo di isoterme di adsorbimento, e sono stati realizzati dei test di transfezione cellulare valutati con microscopia ottica di fluorescenza e citometria a flusso. In base ai risultati è stato dimostrato che l’idrossiapatite è un materiale biocompatibile con le cellule RAW 264.7 e che presenta affinità con le molecole del DNA, la cui capacita massima di adsorbimento è stata determinata in 679 µg/mg. Allo stesso tempo, si sono ottenute prove del fatto che le nanoparticelle di idrossiapatite funzionano come vettore di transfezione, e per tanto questo nanomateriale inorganico può essere utilizzato come veicolo per trasportare acidi nucleici all’interno delle cellule. xi Lista de cuadros Cuadro 1 Potencial ζ y diámetro de las nanopartículas de hidroxiapatita en suspensión acuosa y del complejo formado entre las nanopartículas y el plásmido a 25,0 °C y a un pH de 7,0. ....... 43 Cuadro 2 Absorbancia promedio y normalizada obtenida de los ensayos de citotoxicidad de la hidroxiapatita con los macrófagos murinos RAW 264.7. ......................................................... 47 Cuadro 3 Análisis de la varianza de un factor para los resultados del ensayo de citotoxicidad de la HA sobre las células RAW 264.7 a un nivel de significancia menor que 0,05........................ 49 Cuadro 4 Ecuación de la recta de mejor ajuste con base en el modelo de la isoterma de Langmuir de las cuatro figuras anteriores para cada tipo de hidroxiapatita según la temperatura del ensayo. .................................................................................................................................. 58 Cuadro 5 Capacidades adsorbentes de los diferentes tipos de hidroxiapatita según la temperatura del ensayo. Los valores fueron calculados a partir de las ecuaciones de las rectas de mejor ajuste...................................................................................................................... 59 Cuadro 6 Fluorescencia promedio relativa de las muestras de células RAW 264.7 transfectadas con el plásmido pCMV6-AC-GFP............................................................................................. 67 xii Lista de figuras Figura 1 Ejemplos de los tipos de vehículos más empleados en la investigación médica y farmacológica para el transporte de los medicamentos. .......................................................... 4 Figura 2 Principales vectores virales (retrovirus, adenovirus y virus asociados a los adenovirus) y no virales (liposomas y ADN desnudo) utilizados en la terapia génica. La selección de estos vectores se basa en el porcentaje obtenido de eficiencia de la transfección. ............................ 5 Figura 3 Mapa genético del vector plasmídico pCMV6-AC-GFP y los puntos de referencia de la secuencia de los nucleótidos que se describen a partir de la flecha roja en el sentido de las manecillas del reloj: el gen para la síntesis de la GFP, una secuencia de poliadenilato, un origen de replicación del Virus del Simio 40, el gen para la resistencia contra la neomicina, el gen para la síntesis de la colicina E1, el gen para la resistencia contra la ampicilina, un origen de replicación de un bacteriófago F1, el promotor del citomegalovirus, la secuencia Kozak y el sitio de clonación múltiple. ............................................................................................................. 5 Figura 4 Esquema tridimensional de la conformación hexagonal de la estructural de la hidroxiapatita cristalina. .......................................................................................................... 9 Figura 5 Representación de la estructura cristalina de la hidroxiapatita en la que se muestra a la izquierda el eje c perpendicular a los tres ejes a los cuales tienen ángulos de 120 ° entre sí. A la derecha se observa una proyección de la estructura química sobre el plano 001. ............... 10 Figura 6 Imágenes de Microscopia de Transmisión Electrónica (TEM) de dos productos distintos de hidroxiapatita. a) HA obtenida por el método de coprecipitación a pH = 9,0. b) HA obtenida por el método de la electrólisis con una densidad de corriente de 55 mA/cm2 y a pH = 7,0. ... 11 Figura 7 Modelo que sugiere un posible mecanismo de interacción entre los ácidos nucleicos y la superficie de la hidroxiapatita para formar una capa unimolecular de recubrimiento con ADN. .............................................................................................................................................. 12 Figura 8 Representación de la doble capa de una partícula con carga negativa en suspensión. La primera capa con una densidad de carga positiva muy alta se le conoce como la capa Stern. La siguiente región denominada capa difusa es una esfera iónica con cargas mayoritariamente positivas pero con una baja densidad. El potencial ζ corresponde al potencial eléctrico en la región de traslape entre ambas capas. ................................................................................... 14 xiii Figura 9 Resumen esquematizado del proceso que se llevó a cabo en la parte experimental de este proyecto de investigación............................................................................................... 21 Figura 10 Espectro de infrarrojo obtenido con transformada de Fourier y por reflexión total atenuada de la hidroxiapatita sintetizada por el método electroquímico a un pH de 7,03 (HA-7). .............................................................................................................................................. 39 Figura 11 Espectro de infrarrojo obtenido con transformada de Fourier y por reflexión total atenuada de la hidroxiapatita sintetizada por el método electroquímico a un pH de 5,88 (HA-6). .............................................................................................................................................. 40 Figura 12 Espectro de infrarrojo obtenido con transformada de Fourier y por reflexión total atenuada de la hidroxiapatita sintetizada por el método de coprecipitación (HA-P). .............. 41 Figura 13 Patrón de difracción por rayos X de la muestra en polvo de la hidroxiapatita sintetizada por el método electroquímico y por el método de coprecipitación. El color de las líneas indica el tipo de la hidroxiapatita. .................................................................................................... 42 Figura 14 Efecto de la concentración de la hidroxiapatita sobre el crecimiento de las células RAW 264.7 en un período de 24 h de incubación. El color de las barras indica la concentración de HA. ................................................................................................................................... 48 Figura 15 Variación en el tiempo de la concentración del plásmido pTZ57R libre luego de una incubación con HA-7. La absorbancia de las muestras fue medida en el líquido sobrenadante a 260 nm. El control positivo se prepara a la misma concentración de las muestras pero sin hidroxiapatita. ....................................................................................................................... 51 Figura 16 Isotermas de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-6 a dos temperaturas distintas. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de tres ensayos. ... 53 Figura 17 Isotermas de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-7 a dos temperaturas distintas. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de tres ensayos. ... 53 xiv Figura 18 Isotermas de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-8 a dos temperaturas distintas. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de tres ensayos. ... 54 Figura 19 Isotermas de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-P a dos temperaturas distintas. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de tres ensayos. ... 54 Figura 20 Ajuste a una isoterma de Langmuir de los datos de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-6 que se presentan en la figura 16. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. ..................................................................... 56 Figura 21 Ajuste a una isoterma de Langmuir de los datos de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-7 que se presentan en la figura 17. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. ..................................................................... 56 Figura 22 Ajuste a una isoterma de Langmuir de los datos de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-8 que se presentan en la figura 18. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. ..................................................................... 57 Figura 23 Ajuste a una isoterma de Langmuir de los datos de adsorción del plásmido pTZ57R sobre la HA-P que se presentan en la figura 19. El color y la forma de las marcas son indicativos de la temperatura a la que se realizó el ensayo. ..................................................................... 57 Figura 24 Capacidades máximas adsorbentes (qm) de los cuatro tipos de hidroxiapatita a dos temperaturas distintas. El color de las barras indica la temperatura del ensayo. La barra de error de cada grupo de datos es equivalente a su desviación estándar. .......................................... 60 Figura 25 Imágenes de microscopia fluorescente de la transfección de las células RAW 264.7 con el plásmido pCMV6-AC-GFP que codifica para la síntesis de la GFP. a) Control negativo de un ensayo de transfección. b) Transfección con el kit comercial de precipitación con fosfato de calcio. c) Transfección con HA-6. d) Transfección con HA-7. e) Transfección con HA-P. f) Transfección con HA-8. .......................................................................................................... 64 Figura 26 Diagrama en la escala logarítmica de base diez de la dispersión de la luz de las células RAW 264.7 transfectadas con el plásmido pCMV6-AC-GFP por medio del vector de HA-7. En el xv eje x se muestra la altura de la dispersión frontal y en el eje y se muestra la altura de la dispersión lateral. Las unidades indican la intensidad de la luz dispersada. ............................ 65 Figura 27 Histograma en la escala logarítmica de base diez de la intensidad de fluorescencia para la región encerrada en el círculo rojo de la figura 26. En el eje x se grafica la intensidad de la señal fluorescente y en el eje y se representa la cantidad de eventos por número de canal. .............................................................................................................................................. 66 Figura 28 Superposición del histograma representado en la figura 27 con su respectivo blanco de transfección. En el eje x se grafica la intensidad de la señal fluorescente y en el eje y se representa la cantidad de eventos por número de canal. El histograma de la muestra transfectada con el vector de HA-7 se presenta en color azul y su respectivo blanco en color rojo........................................................................................................................................ 66 Figura 29 Efecto del vector en la fluorescencia relativa de las células RAW 264.7 transfectadas con el plásmido pCMV6-AC-GFP. El color de las barras indica el tipo de vector. El porcentaje de error de cada barra corresponde a la desviación estándar de dos experimentos. ................... 68 xvi Lista de abreviaturas Abreviatura Significado ADN Ácido desoxirribonucleico. ANOVA Análisis de la varianza. ATR-FT-IR Infrarrojo de reflexión total atenuada con transformada de Fourier. DRX Difracción de rayos X. EDTA Ácido etilendiaminotetraacético. GFP Proteína verde fluorescente. HA Hidroxiapatita. HA-6 Hidroxiapatita sintetizada por el método electroquímico a un pH de 5,88. HA-7 Hidroxiapatita sintetizada por el método electroquímico a un pH de 7,03. HA-8 Hidroxiapatita sintetizada por el método electroquímico a un pH de 8,52. HA-P Hidroxiapatita sintetizada por el método de coprecipitación. HEPES Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)1-piperazinil]-etanosulfónico. ICDD Centro Internacional para Datos de Difracción. IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido. LB Medio de cultivo Luria-Bertani. NADPH+ Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en su forma reducida. PBS Disolución amortiguadora salina de fosfatos. PCR Reacción en cadena de la polimerasa. qm Capacidad máxima adsorbente. RPMI-1640 Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute. TE Tris-EDTA. TEM Microscopia de Transmisión Electrónica. Tris Tri(hidroximetil)aminometano. X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido. xvii Difusión de los resultados en publicaciones y congresos Publicaciones en artículos "Nano-hydroxyapatite colloid suspension coated on chemically modified porous silicon by cathodic bias: a suitable surface for cell culture". • Publicación en línea el 23 de noviembre de 2010 en la revista Physica Status Solidi. • Colaboración con el grupo de investigación NanoFem de la Universidad de Costa Rica, en las pruebas de viabilidad celular sobre los materiales inorgánicos modificados. Congresos I Congreso Centroamericano de Innovación e Investigación de la red CADAN:R. • 23-25 de octubre de 2013, San José, Costa Rica. • Póster: "Aplicación de las nanopartículas de hidroxiapatita como vehículo para el transporte de sustancias bioactivas en células del sistema inmune". III Taller de Órganos Artificiales, Biomateriales e Ingeniería de Tejidos. • 26-28 de setiembre de 2013, Viña del Mar, Valparaíso, Chile. • Póster y charla: "Aplicación de las nanopartículas de hidroxiapatita como vehículo para el transporte de sustancias bioactivas en células del sistema inmune". Symposium on Pharmaceutical Biology. • 25 de Mayo de 2012, Universidad Albert-Ludwigs, Friburgo, Alemania. • Charla: "Chemically modified hydroxyapatite nanoparticles: Novel activators of the immune system." xviii I Simposio de Ciencia e Ingeniería de Materiales. • 07-09 de diciembre de 2010, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. • Charla: "Biocompatibilidad de hidroxiapatita y su posible aplicación como vehículo para sustancias bioactivas: Aplicación en transfección celular. V Congreso Internacional BIOMAT 2010. • 17-19 de marzo de 2010, La Habana, Cuba. • Póster: "Silicio recubierto con nano-hap por polarización catódica como un nuevo material para el cultivo celular in vitro". 1 1. Marco teórico 1.1 Introducción La nanomedicina se define como el uso de la nanotecnología en la medicina a través de los avances de la investigación interdisciplinaria que involucran la química, la biología, la ingeniería y la medicina, con el objetivo de mejorar la salud de los seres humanos, a partir del uso de nanomateriales en el diagnóstico, en la prevención y en el tratamiento de las enfermedades.1– 3 Algunos de los usos más destacados de la nanotecnología incluyen el marcaje biológico por fluorescencia, el transporte de genes y medicamentos, la detección de patógenos y proteínas, la ingeniería de tejidos y los estudios fagocinéticos para determinar la capacidad fagocítica de los macrófagos, entre otros.4,5 De esta forma, las aplicaciones de la nanomedicina abren una gama de posibilidades en el cuidado de la salud por medios innovadores. La tendencia actual consiste en crear nanosistemas y nanodispositivos biocompatibles y con características específicas, que puedan atravesar las barreras naturales, como el transporte limitado a través de los epitelios, para alcanzar una determinada actividad biológica con fines terapéuticos. Por ejemplo, se prevé que los mecanismos de administración de los medicamentos desarrollados con estas técnicas, aporten mejoras significativas en el diagnóstico y en el tratamiento de las enfermedades, tales como las infecciones virales, los trastornos genéticos y el cáncer.6,7 Aunque muchas nanopartículas están compuestas de materiales cuya biocompatibilidad es conocida, la condición de inocuidad de éstas puede variar cuando se transforma físicamente en un producto con dimensiones nanométricas debido a la capacidad de interacción con sitios en los órganos y en los tejidos que antes no eran accesibles.8 El comportamiento de los nanomateriales en el organismo depende de variables tales como el tamaño, la forma, la composición química, la solubilidad y la reactividad con el tejido circundante.9 Por tanto, en la mayoría de los casos se desconoce la reacción del organismo al ser expuesto a estas sustancias sintéticas.10 Los seres humanos han estado siempre en contacto con diminutas partículas de origen natural como la ceniza volcánica, el humo, la arena del desierto, la sal del agua que se evapora en los mares o el polvo,11 sin embargo cada vez hay más productos manufacturados que contienen nanopartículas que son empleadas por la industria como ingredientes en los fármacos, los textiles, los cosméticos, los envases para alimentos, las pinturas y los dispositivos médicos, 2 entre otros.12 Existe poca información sobre la seguridad y la nanotoxicidad de estos productos los cuales pueden repercutir negativamente en el medio ambiente y en la salud humana. Esta aplicación de la innovación tecnológica es lo que suele llamarse como una invasión silenciosa de nanopartículas relacionada principalmente con la enfermedad pulmonar y las alteraciones genéticas. Un ejemplo de lo anterior son las nanopartículas de plata, las cuales son ampliamente utilizadas por la industria moderna como un agente bactericida y fungicida en los productos como jabones, champús, pasta de dientes, desodorantes, desinfectantes, almohadas, zapatos, toallas húmedas, filtros de aire, aspiradoras y teléfonos celulares entre otros. Sin embargo, hay un peligro potencial de este uso porque las partículas de plata ingresan a la sangre y al sistema linfático para acumularse en sitios más sensibles como el bazo, el hígado, el corazón y el cerebro;13 la toxicidad de estos materiales no es tan clara como la de las nanopartículas del humo del tabaco pero los reportes de efectos adversos para la salud cada vez son más numersos.14 Para el diseño de materiales con la capacidad de dirigirse a un órgano o tejido específico y llevar a cabo su función diagnóstica o terapéutica de forma óptima, es fundamental conocer el mecanismo de biodegradación del producto final; esta información es además imprescindible para evaluar su posible toxicidad.15 En ciertos casos, el sistema fagocítico mononuclear es el principal encargado de reconocer y eliminar las partículas del torrente sanguíneo y de los diferentes tejidos en los que se han depositado, pero la ruta metabólica de degradación de algunas nanopartículas no está aún bien definida y varía de un material a otro con base en sus propiedades físicas y químicas.16 El riesgo tóxico de estos materiales es mayor cuando el organismo no posee una ruta de metabolización o cuando ésta se lleva a cabo de manera parcial, porque algunas de estas nanopartículas o los subproductos de la biodegradación, pueden acumularse en los órganos y en los tejidos.17,18 Así, podrían participar en procesos biológicos y desencadenar respuestas perjudiciales para el individuo, desde el punto de vista fisiológico. Con base en lo anterior, es evidente la necesidad de evaluar cada nanomaterial que se pretende introducir en el cuerpo humano, para determinar el riesgo nanotóxico a través de la caracterización del comportamiento general de las sustancias y su interacción con el organismo. 3 1.2 Transporte dirigido de los medicamentos y terapia génica El transporte dirigido de los medicamentos es un objetivo importante en la investigación para el desarrollo de productos farmacéuticos. Con él se busca mejorar la eficiencia farmacológica mediante el estricto direccionamiento de la actividad al tejido o al órgano de acción.19 En principio, esto se puede lograr por sistemas físicos, biológicos o químicos, que tradicionalmente pueden ocasionar concentraciones elevadas del agente activo en el área fisiológica relevante o en todo el organismo.20,21 Los mayores beneficios del transporte dirigido son la disminución de la dosis requerida y un aumento en la eficiencia del tratamiento.22 En este contexto, un componente biológicamente activo y dirigido al sitio de acción, es de mayor interés que la manipulación molecular destinada a perfeccionar las interacciones receptor-sustrato.23 Algunos ejemplos de sustancias utilizadas para este fin son las nanopartículas inorgánicas como las de sílice, las de alúmina o las metálicas que pueden ser diseñadas para evadir el sistema fagocítico mononuclear; las nanopartículas poliméricas como el ácido poli(láctio-co-glicólico) aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para su uso en el encapsulamiento de fármacos de bajo peso molecular; los liposomas, cuya función es adherirse a las membranas celulares y realizar por este medio o por endocitosis, la entrega de las sustancias activas; y las nanopartículas sólidas lipídicas como una alternativa más estable para el uso de los liposomas.24 En los años más recientes se han empezado a utilizar otras nanopartículas como los nanocristales empleados en la fabricación de los puntos cuánticos, los nanotubos y los dendrímeros, las cuales tienen una menor aplicación en el campo farmacológico ya que se emplean principalmente en la elaboración de materiales (figura 1).25 Los agentes terapéuticos que se han desarrollado para el tratamiento de distintas patologías, tales como las enfermedades inflamatorias, las enfermedades autoinmunes o el cáncer, no son específicos ni dirigidos al sitio de interés, lo que ocasiona efectos secundarios no deseados para su aplicación clínica, principalmente, porque afectan otros sistemas que son alcanzados por los componentes activos sin ser requeridos; esto conlleva a una modificación del buen funcionamiento y al posible daño colateral del organismo.26 Por tanto, es importante encontrar sustancias que puedan actuar como un transportador de los fármacos hasta sitios específicos, para lograr un tratamiento que minimice los efectos secundarios.27 4 Figura 1 Ejemplos de los tipos de vehículos más empleados en la investigación médica y farmacológica para el transporte de los medicamentos.a La terapia génica consiste en una técnica que emplea la expresión de genes exógenos en el organismo para tratar o prevenir algunas enfermedades. En este caso, la prioridad es hallar un vector no inmunogénico con la capacidad de transferir un material genético a las células blanco de forma segura, eficiente y selectiva.28,29 Este proceso se complica cuando se lleva a cabo in vivo, pues los órganos, los tejidos y los focos tumorales ocultos, no siempre están accesibles.30 La selección de un método de introducción del gen terapéutico, depende del tejido diana y del objetivo de la terapia; sin embargo, cualquiera que sea el proceso elegido, siempre se deben afrontar determinados problemas intrínsecos como la respuesta inmune del organismo, la mutagénesis y el riesgo de afectación de las células germinales, para los cuales aún no se cuenta con soluciones contundentes.31 Los principales sistemas de transfección génica se clasifican en dos grupos, los métodos fisicoquímicos y los métodos virales (figura 2).32 En el primer grupo, la técnica consiste en integrar el ADN foráneo o exógeno en un plásmido, que es una molécula que puede ser mantenida de forma estable e independiente del genoma de la célula huésped. La figura 3 muestra el mapa genético de un plásmido utilizado para la expresión de proteínas en células eucariotas. Algunos de estos métodos son la microinyección, la precipitación con fosfato de a Adaptado de Faraji, A. H.; Wipf, P., 2009. 5 calcio, la electroporación, la inyección directa del ADN desnudo y los liposomas.33 Las principales ventajas de estas técnicas son la simplicidad de los procedimientos, la reproducibilidad en el campo industrial, la ausencia de limitaciones del tamaño del ADN que se puede transferir, la baja toxicidad y la cualidad de no inducir una respuesta inmune específica.34,35 No obstante, estos mecanismos tienen una baja eficacia en la entrega de los genes y algunos de ellos sólo se pueden utilizar en las terapias in vitro. Figura 2 Principales vectores virales (retrovirus, adenovirus y virus asociados a los adenovirus) y no virales (liposomas y ADN desnudo) utilizados en la terapia génica. La selección de estos vectores se basa en el porcentaje obtenido de eficiencia de la transfección.b Figura 3 Mapa genético del vector plasmídico pCMV6-AC-GFP y los puntos de referencia de la secuencia de los nucleótidos que se describen a partir de la flecha roja en el sentido de las manecillas del reloj: el gen para la síntesis de la GFP, una secuencia de poliadenilato, un origen de replicación del Virus del Simio 40, el gen para la resistencia contra la neomicina, el gen para la síntesis de la colicina E1, el gen para la b Adaptado de Formación Continuada para Farmacéuticos de Hospital 3.4 página 117. 6 resistencia contra la ampicilina, un origen de replicación de un bacteriófago F1, el promotor del citomegalovirus, la secuencia Kozak y el sitio de clonación múltiple.c En el grupo de los métodos virales, la transferencia de material genético se realiza a través de la inserción de secuencias de ADN en el genoma del vector. Para esto, se aprovecha la capacidad natural de los virus de infectar y transmitir su material genético a las células hospederas.36 En la actualidad, los virus como los adenovirus, los adeno-asociados, los herpesvirus y los retrovirus, constituyen la forma más eficaz de transfección debido a que han desarrollado mecanismos moleculares para transportar sus genomas al núcleo de las células infectadas; por este motivo, son los vectores más utilizados en la terapia génica.37 En consecuencia, el uso de sistemas virales ha causado preocupación por la posibilidad de efectos secundarios debidos a la activación de un elemento viral endógeno o de un oncogén,38 y a la reacción inmune que el organismo receptor inicia para eliminar la infección viral.39 Aunque la terapia génica se encuentra en la fase de experimentación, en seres humanos se aplica sobre células somáticas desde la década de 1990 para tratar enfermedades de carácter genético. Los resultados han sido en su mayoría satisfactorios y en los últimos años se ha avanzado en el tratamiento de padecimientos como la hemofilia, el cáncer y el HIV,40–42 entre otros. Sin embargo, no siempre es así, situación que conlleva a un serio cuestionamiento sobre la aplicación de determinados procedimientos, tal como sucedió en el caso del tratamiento de los pacientes con la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave, en el cual, cuatro de los nueve pacientes, exitosamente tratados, presentaron leucemia de células T unos meses después de la terapia,43 o como ocurrió en el año 2002 cuando las pruebas clínicas se interrumpieron por un periodo corto debido al reconocimiento público de la muerte de Jesse Gelsinger, por el uso de técnicas de terapia génica con un vector adenoviral para tratar la deficiencia de la enzima ornitina transcarbamilasa, el cual provocó una excesiva respuesta inmune que ocasionó el deceso.44 Con base en lo anterior, se ha dirigido la investigación científica en este campo hacia el desarrollo de sistemas de administración de genes basados en los vectores no virales.45 La coprecipitación del ácido nucleico con fosfato de calcio se ha usado desde hace varias décadas para transfectar células. Este material presenta la característica de ser biocompatible y c Adaptado de OriGene, catálogo No PS100019. En el anexo 1 se muestra el mapa del vector pTZ57R. 7 biodegradable, sin embargo, su aplicación no ha trascendido debido a su baja eficiencia de transfección. Otras alternativas más novedosas en esta línea de investigación como los nanotubos de hidroxiapatita y las nanopartículas de hidroxiapatita ya se encuentran en la fase clínica.46 Estos nanovectores también son biocompatibles y se destacan por su buen desempeño como transportadores de los ácidos nucleicos al interior de las células, sin alterar o desestabilizar la membrana celular. Una de las principales ventajas de este tipo de materiales nanoestructurados con respecto al fosfato de calcio, es que su gran área superficial le confiere una mayor capacidad de adsorción de las moléculas de ADN, además, algunos métodos de síntesis permiten controlar ciertas propiedades fisicoquímicas las cuales aumentan la potencialidad como un vector de transfección.47 8 9 1.3 Generalidades de la hidroxiapatita Los apatitos, Ca5(PO4)3X, se encuentran naturalmente en las rocas sedimentarias y metamórficas a través de los minerales fluoroapatito (X = F), cloroapatito (X = Cl) e hidroxiapatito (X = OH). El último es comúnmente llamado hidroxiapatita (HA) y se describe con la fórmula empírica Ca10(PO4)6(OH)2.48 Este compuesto es además, el principal componente inorgánico del hueso de los animales vertebrados y el más abundante en la composición de la dentina y del esmalte dental.49,50 La HA está conformada mayoritariamente por cristales cuya estructura pertenece a un sistema hexagonal con un grupo espacial P63/m y con las dimensiones de conformación de red a = b = 0,937 nm y c = 0,688 nm (figuras 4 y 5)51. Su carácter iónico la convierte en un material duro y refractario (una cerámica con punto de fusión mayor a 1500 °C) y hace posible la sustitución parcial o completa de los iones de la red por otros de tamaño similar, como es el caso de PO4 3- por HPO4 2-, Ca2+ por K+ o Mg2+ y OH- por F-, Cl-o Br-.52,53 Figura 4 Esquema tridimensional de la conformación hexagonal de la estructural de la hidroxiapatita cristalina.d d Adaptado de Uddin, M. et at., 2008. 10 Figura 5 Representación de la estructura cristalina de la hidroxiapatita en la que se muestra a la izquierda el eje c perpendicular a los tres ejes a los cuales tienen ángulos de 120 ° entre sí. A la derecha se observa una proyección de la estructura química sobre el plano 001.e La HA como materia prima se puede extraer naturalmente de los esqueletos de los vertebrados u obtenerse por medio de las diferentes rutas de síntesis química. Los métodos sintéticos presentan la ventaja sobre los naturales de que es posible preparar un material con características físicas, químicas y morfológicas controladas.54 Además, se pueden obtener productos con una alta pureza, con una composición homogénea y con un tamaño de partícula deseado que inicia en el orden de los nanómetros. Este conjunto de características amplía el ámbito de aplicación de la HA en la investigación científica, tanto en el campo biomédico como fuera de él.55 Existen varios métodos para sintetizar nanopartículas de HA, entre los que se pueden mencionar: el proceso seco, que implica la síntesis utilizando reacciones en el estado sólido; o los procesos húmedos, como el método de la coprecipitación química convencional, el método hidrotérmico, el método sol gel, y el método de la electrólisis de las sales de fosfato de calcio, entre otros.56 e Adaptado de Uskoković, V.; Uskoković, D. P., 2011. 11 Se han descrito algunas ventajas de un método con respecto a otro, según las características del producto que se desea sintetizar. Un aspecto positivo de la mayoría de las rutas sintéticas, es la obtención de cantidades apreciables del material de forma económica y reproducible.57,58 En algunos de estos métodos se requiere un control preciso de algunas condiciones experimentales como el pH, la temperatura, el tiempo de reacción y la relación Ca/P de los reactivos, para impedir la formación de otras fases de composición no deseadas, entre las que predominan los ortofosfatos, principalmente, cuando se requiere sintetizar HA para uso biológico.59,60 No obstante, controlar la composición química no es suficiente, ya que es necesario determinar la presencia de impurezas, la morfología, la cristalinidad y el tamaño de las partículas (figura 6). Cualquier variación en las características anteriores ocasiona una alteración del comportamiento del material en los organismo vivos, tanto en su biocompatibilidad como en su bioactividad.61,62 Figura 6 Imágenes de Microscopia de Transmisión Electrónica (TEM) de dos productos distintos de hidroxiapatita. a) HA obtenida por el método de coprecipitación a pH = 9,0. b) HA obtenida por el método de la electrólisis con una densidad de corriente de 55 mA/cm2 y a pH = 7,0.f La HA presenta interacciones muy fuertes con las sustancias que tienen grupos funcionales de carácter iónico, tales como las proteínas y los ácidos nucleicos (figura 7), por este motivo se utiliza en procesos de separación, extracción y purificación de algunos materiales.63,64 Esta característica de interacción iónica se ha analizado en estudios previos para evaluar la afinidad f TEM por las siglas en inglés de Transmission Electron Microscopy. Fuente: Montero, M. L. et al., 2006. 12 de los péptidos y de los ácidos nucleicos por la superficie de la HA, conocida como la capacidad máxima adsorbente (qm).65,66 Figura 7 Modelo que sugiere un posible mecanismo de interacción entre los ácidos nucleicos y la superficie de la hidroxiapatita para formar una capa unimolecular de recubrimiento con ADN.g La cantidad de las moléculas que se pueden adherir al material inorgánico depende de la temperatura y de la concentración inicial del adsorbato. Si la temperatura se mantiene constante durante el ensayo, el grado de adsorción se puede estudiar como una función de la concentración en el equilibrio como se muestra en la siguiente ecuación de la isoterma de Langmuir: 𝐶" 𝑞" = 𝐶" 𝑞% + 1 𝐾 ∗ 𝑞% (ecuación 1) en la cual Ce corresponde a la concentración del adsorbato en el equilibrio, qe es la cantidad de soluto adsorbido por unidad de masa del adsorbente en el equilibrio, qm es la capacidad máxima de adsorción y K es la constante de equilibrio de Langmuir.67,68 A partir de la recta que se obtiene de la ecuación lineal anterior, se determina a continuación que la qm se define como el inverso de la pendiente: 𝑞% = 1/𝑚 (ecuación 2) g Adaptado de Xu, Z. et al., 2010. 13 donde m corresponde a la pendiente de la curva de ajuste de Langmuir. Este modelo hace varios supuestos sobre el mecanismo de interacción, y con base en estos intenta predecir el grado de adsorción.69 Estos supuestos son: a) el adsorbato forma una capa unimolecular sobre la superficie del adsorbente, b) todos los sitios de la superficie son equivalentes, c) no hay interacción entre las partículas adsorbidas, d) las moléculas adsorbidas no se desplazan sobre la superficie y e) la superficie tiene un número finito de sitios de interacción con el adsorbato.70,71 La forma en la que se manipulan las nanopartículas de HA para las aplicaciones biológicas, implica la preparación de suspensiones acuosas del material inorgánico en una disolución amortiguadora salina de fosfatos (PBS por las siglas en inglés de Phosphate Buffered Saline). Al realizar este procedimiento se debe conocer el comportamiento de la suspensión de las partículas sólidas, pues la formación de agregados ocasiona que después de un período la suspensión se sedimente.72 En cada suspensión química las cargas de las partículas producen fuerzas de repulsión electrostática entre las esferas difusas vecinas. Si las cargas son lo suficientemente elevadas, las sustancias sólidas permanecen dispersas y, por lo tanto, la suspensión es estable.73 En la figura 8 se representa el modelo de la doble capa para visualizar el entorno en la proximidad de una partícula con carga negativa, el cual atrae las partículas con carga positiva para crear una rígida esfera adyacente conocida como la capa Stern. La influencia de la partícula con carga negativa se extiende más allá de la capa Stern y atrae a más cargas positivas que, sin embargo, son repelidas por el aumento de la densidad de carga positiva hasta que se consigue un equilibrio dinámico que resulta en la formación de una capa difusa.74 En contraste, las partículas suspendidas colapsan si la compresión de la doble capa que se forma por la interacción electrostática con las partículas más alejadas, alcanza un tamaño en el que predominan las fuerzas de atracción sobre las fuerzas de repulsión. En este contexto, la estabilidad de las suspensiones acuosas depende del potencial electroforético zeta (ζ) que existe en el traslape entre ambas capas. Por ejemplo, se considera una suspensión química estable aquella que presenta un valor de potencial ζ mayor que +30 mV o uno menor que -30 mV.75 14 Figura 8 Representación de la doble capa de una partícula con carga negativa en suspensión. La primera capa con una densidad de carga positiva muy alta se le conoce como la capa Stern. La siguiente región denominada capa difusa es una esfera iónica con cargas mayoritariamente positivas pero con una baja densidad. El potencial ζ corresponde al potencial eléctrico en la región de traslape entre ambas capas.h h Adaptado de Zetasizer Nano Series, User Manual, página 2.6. 15 1.4 Aplicaciones biomédicas de las nanopartículas de hidroxiapatita El término nanomaterial engloba a todos aquellos materiales desarrollados, al menos, con una de sus dimensiones, ya sea largo, ancho o alto, en el intervalo de uno a cien nanómetros. A esta escala, los materiales pueden expresar propiedades físicas, químicas y biológicas inusuales o distintivas que difieren, tanto de las propiedades de los materiales convencionales, como de las propiedades de los átomos y de las moléculas aisladas.76 La nanotecnología permite, no solo acceder a estas nuevas propiedades que solo se manifiestan a escala nanométrica,77 sino que permite plasmarlas en el marco de la investigación, de la creación y de la innovación para el desarrollo de nuevos dispositivos con aplicaciones biológicas potenciales,78 tal como la función de atravesar los conductos vasculares y las membranas celulares sin la necesidad de utilizar técnicas invasivas, o suministrar un mecanismo de liberación controlada de las sustancias bioactivas como los fármacos y los ácidos nucleicos.79 Uno de los retos en este proceso reside en el desarrollo de nanoterapias que se puedan dirigir de forma selectiva hacia los tejidos y los órganos enfermos, para disminuir así los efectos secundarios, los cuales son inevitables con los tratamientos actuales. La HA se ha convertido en un material con mucho éxito en la investigación biomédica, pues el grado de afinidad biológica con las células de los diferentes tejidos estudiados es muy alto y la toxicidad es muy baja.73,80 Para estas nanopartículas se han descrito aplicaciones tales como las prótesis y los rellenos óseos, el recubrimiento de superficies metálicas para los implantes, el refuerzo de materiales compuestos y, recientemente, como vehículo liberador de sustancias bioactivas, entre ellas los fármacos, los péptidos y los ácidos nucleicos.81,82 En algunos estudios recientes se propone el uso de las nanopartículas de HA como un vehículo capaz de transportar moléculas a sitios de difícil acceso como el parénquima cerebral, es decir, regiones del organismo protegidas por obstáculos naturales como la barrera hematoencefálica.83,84 El aporte más significativo que se ha reportado para esta aplicación de las nanopartículas, se ha logrado en la entrega de los ácidos nucleicos a células diana, como un vector no viral para los procesos de regulación de la expresión genética. Zhu S. H. y colaboradores, proponen el uso de las nanopartículas de HA como portadores de genes. Esta conclusión la tomaron al comprobar la capacidad máxima adsorbente del material con respecto al ADN, y al demostrar la propiedad de atravesar la membrana celular de las células de cáncer gástrico SGC-7901 por medio de ensayos in vitro e in vivo.85 16 A pesar de los avances que se han reportado aún no se ha logrado una estrategia que permita el transporte específico en estos casos terapéuticos;86 sin embargo, las nanopartículas de HA pueden ser químicamente modificadas con grupos funcionales, ligandos, anticuerpos, proteínas o ácidos nucleicos, para crear una afinidad con cierto tipo de célula, o ser usadas como receptores específicos en el reconocimiento molecular. En el contexto local, se ha acumulado una gran cantidad de experiencia en investigación en este campo: el grupo de investigación NanoFem de la Universidad de Costa Rica, ha trabajado durante diez años con las nanopartículas de HA. Sus trabajos abarcan desde la síntesis y la caracterización, tanto física como química, hasta la funcionalización de la superficie y las aplicaciones biológicas de estos diferentes materiales. Como parte de la investigación que lleva a cabo este grupo y el Laboratorio de Cultivo Celular del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular de la Universidad de Costa Rica, Sánchez, A. y colaboradores reportan en su investigación, el uso de HA para el recubrimiento de superficies de silicio poroso, como una superficie apta para el crecimiento de la línea celular RAW 264.7. Los resultados muestran un aumento de la proliferación celular sobre el silicio poroso recubierto con la HA, en contraste con el silicio sin recubrir, lo cual sugiere la posibilidad de emplear estas nanopartículas como un material de recubrimiento para atenuar el impacto biológico que ocasionan los implantes metálicos en los organismos vivos.87 El dopaje de biomateriales con iones metálicos de los elementos de la serie lantánida, tales como el europio y el terbio, se ha reproducido en distintas partes del mundo con diferentes objetivos. La importancia de este procedimiento radica en la propiedad fluorescente en el ámbito del espectro visible, la cual presentan estos elementos químicos en ciertos estados de oxidación. Esta propiedad permite plantear una aplicación en el marcaje y el rastreo molecular en sistemas biológicos por medio de ensayos in vitro.88 Investigadores del grupo NanoFem realizaron la síntesis electrolítica de HA luminiscente; característica adquirida al dopar el nanomaterial con los iones Eu3+. Los estudios indican, con base en los resultados de la difracción de rayos X, que hubo una sustitución isomórfica de los iones calcio por los iones europio (III). Estos nuevos materiales se utilizan en la investigación biomédica y farmacológica, asociada al transporte de las sustancias bioactivas, entre ellas los ácidos nucleicos, las proteínas y algunos fármacos. No obstante, es importante evaluar correctamente la biocompatibilidad de estos materiales dopados, pues los iones de los metales pesados pueden presentar una toxicidad 17 relevante que impide su uso en estudios preliminares de investigación. Su función se limita únicamente a ser un indicador del avance de las moléculas en los ensayos in vitro, ya que probablemente representan un peligro para la salud del ser humano.89 Miembros del mismo grupo de investigación, realizaron la modificación química de la HA con algunos compuestos químicos que adhieren diferentes grupos funcionales a la superficie del material, como el ácido esteárico, el anhídrido succínico, la succinimida y el 2-aminoetil dihidrogenofosfato, con el objetivo de evaluar las propiedades físicas, químicas y biológicas del nuevo producto. Los resultados muestran que es posible obtener distintos tipos de HA que difieren en el carácter hidrofóbico, lo que refleja cambios en el área superficial de las nanopartículas que se manifiestan en la estabilidad de la suspensión y los valores del potencial ζ. Estos materiales se pueden considerar en investigaciones posteriores, como una herramienta potencial farmacológica para atravesar las barreras presentes en el organismo.90 En otra investigación de este grupo, se analizó el uso de las nanopartículas de HA y fosfato de calcio amorfo como coadyuvante en las vacunas que se aplican en el Instituto Clodomiro Picado para la obtención de los sueros antiofídicos. Un extracto de proteínas obtenido del veneno de la serpiente Bothrops asper, se depositó sobre la HA con el objetivo de que sean adsorbidas por el nanomaterial. El efecto coadyuvante de la mezcla se determinó al medir la producción de los anticuerpos en caballos y ratones que fueron previamente inmunizados. Los resultados demuestran que las nanopartículas de HA modificadas con el ácido esteárico, presentan una capacidad coadyuvante similar a la que se obtiene con el coadyuvante completo de Freund.91 El presente proyecto se ha dirigido en el marco de la investigación anterior, para hallar aplicaciones de estos novedosos materiales en sistemas biológicos. Con base en la experiencia de los laboratorios de NanoFem y del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, se realizó esta propuesta para evaluar la biocompatibilidad de las nanopartículas de HA sintética con macrófagos murinos por medio de ensayos in vitro, y caracterizar la posible interacción entre las moléculas de ADN y la superficie de este material, el cual puede ser evaluado como un vehículo molecular. En este contexto, el uso de las nanopartículas de HA estaría orientado hacia el transporte de las sustancias bioactivas como fármacos, proteínas y ácidos nucleicos en terapias de diagnóstico y tratamiento. En resumen, las posibles aplicaciones de las nanopartículas, descritas anteriormente, revelan que la HA es un biomaterial muy versátil con promisorios usos médicos, los cuales despiertan 18 la curiosidad científica por indagar en rutas, cada vez más específicas y más detalladas, para encontrar soluciones a determinados problemas de salud. 19 2. Hipótesis Las nanopartículas de hidroxiapatita sintética son biocompatibles con las células del sistema inmune y son capaces de transportar moléculas bioactivas como los ácidos nucleicos hasta el interior de dichas células. 3. Objetivos 3.1 Objetivo general Evaluar la biocompatibilidad de las nanopartículas de la hidroxiapatita sintética con los macrófagos murinos RAW 264.7 por medio de ensayos in vitro, y caracterizar la interacción de este nanomaterial con plásmidos de ADN para valorar la factibilidad de su empleo como un vehículo molecular. 3.2 Objetivos específicos § Optimizar los procedimientos requeridos para el desarrollo del proyecto de investigación, tales como: el ensayo de la biocompatibilidad, la amplificación de un plásmido, la medición de isotermas de adsorción y el proceso de la transfección celular. § Determinar la biocompatibilidad de cuatro productos sintéticos de hidroxiapatita con los macrófagos murinos RAW 264.7, por medio de los ensayos de viabilidad celular. § Caracterizar la interacción entre las nanopartículas de hidroxiapatita y las moléculas de ADN plasmídico a través de la medición de isotermas de adsorción. § Transfectar macrófagos murinos RAW 264.7 con un constructo plasmídico que codifica para la síntesis de la proteína verde fluorescente, mediante el uso de las nanopartículas de hidroxiapatita como vector. 20 21 4. Sección experimental En la figura 9 se esquematiza el proceso de la parte experimental del proyecto. Figura 9 Resumen esquematizado del proceso que se llevó a cabo en la parte experimental de este proyecto de investigación. Transfección de las células RAW 264.7 con vectores de HA y Ca3(PO4)2 Ensayos de microscopia fluorescente Ensayos de citometría de flujo Procesamiento digital de los datos Análisis estadístico Caracterización fisicoquímica de los complejos hidroxiapatita y plásmido Cinética de adsorción y desorción Ensayos de adsorción del plásmido sobre la hidroxiapatita Medición de la capacidad adsorbente de la hidroxiapatita Análisis estadístico Preparación de los plásmidos pTZ57R y pCMV-AC-GFP Transformación de las bacterias Escherichia coli Amplificación del plásmido a gran escala Extracción del plásmido Purificación del plásmido Corroboración por electroforesis y PCR Biocompatibilidad de las nanopartículas de hidroxiapatita Mantenimiento del cultivo celular Ensayos de citotoxicidad Análisis estadístico Caracterización de las nanopartículas de hidroxiapatita Caracterización por espectroscopia infrarroja y rayos X Medición del potencial ζ de las nanopartículas en suspensión Medición del tamaño de las nanopartículas en suspensión Síntesis de las nanopartículas de hidroxiapatita Síntesis por el método electroquímico Síntesis por el método de coprecipitación Suspensión de las nanopartículas de hidroxiapatita en PBS 22 23 4.1 Síntesis de hidroxiapatita 4.1.1 Síntesis por el método electroquímico a. Las nanopartículas de HA sintetizadas por el método electroquímico, fueron proporcionadas por el grupo de investigación NanoFem de la Universidad de Costa Rica. Para la preparación de este material se siguió el método descrito por Montero M. L. et al.56 b. El procedimiento general consiste en la electrólisis de una disolución homogénea que contiene EDTA 0,15 mol/L y los iones Ca2+ 0,25 mol/L y PO4 3- 0,15 mol/L; con electrodos de platino, con una densidad de corriente de 137 mA/cm2 y con una agitación constante a 25,0 °C durante 3 h. Los productos inorgánicos se obtienen de tres disoluciones de reacción diferentes con un pH inicial de 5,88; de 7,03 y de 8,52. En adelante, estos tres materiales se denominarán respectivamente, HA-6, HA-7 y HA-8. 4.1.2 Síntesis por el método de coprecipitación Para la síntesis de la HA por este método se sigue el procedimiento descrito por Gonzalez-McQuire, R et al.92 a. Se prepara un disolución de Ca(NO3)2 1,0 mol/L en 100 mL de agua destilada, a partir de 24,6 g del reactivo sólido (Merck, 99,0 % de pureza). El pH de la disolución se ajusta con NH4OH concentrado (EM Science, grado reactivo) hasta un valor aproximado de 9,0. Se afora el volumen de la disolución en 150 mL con agua destilada. b. Se prepara una disolución de (NH4)3PO4 0,33 mol/L al agregar 51 mL de H3PO4 0,98 mol/L (Sigma Aldrich, 99,0 de pureza) en 49 mL de agua destilada y ajustar el pH de la disolución a 9,0 con NH4OH concentrado. Se afora el volumen de la disolución en 150 mL con agua destilada. c. Las dos disoluciones preparadas anteriormente, se mezclan en un balón de fondo redondo. Se ajusta nuevamente el pH de la disolución a 9,0 con NH4OH concentrado. d. El recipiente que contiene la mezcla de las disoluciones, se coloca en un baño con agua a 80 °C durante 16 h. e. Se centrifuga la disolución a 5000 r.p.m. durante 15 min a temperatura ambiente. f. El líquido sobrenadante se filtra al vacío con un embudo Büchner y con un filtro de tamaño de poro de 8,0 µm. g. Se lavan las partículas sólidas con agua desionizada y se recogen en un vidrio reloj. 24 h. Las partículas sólidas se secan en una estufa a 50 °C durante 8 h. i. Para secar completamente la HA se liofiliza durante 12 h en un liofilizador Labconco Freezone 4.5 a -45 °C. j. A las partículas preparadas por este procedimiento se les denominará en este trabajo hidroxiapatita sintetizada por el método de coprecipitación (HA-P). 4.1.3 Suspensión de las nanopartículas de hidroxiapatita en PBS a. Se pesan 500 mg de las nanopartículas de HA en polvo y liofilizada, en un frasco de Erlenmeyer de 250 mL. b. Se adicionan 50 mL de PBS enfriado a una temperatura aproximada de 4,0 °C. c. Se coloca el frasco en una mezcla de agua con hielo y se introduce en un baño ultrasónico por 4 h, o hasta que se observe una suspensión lechosa homogénea y que sea visualmente estable, al menos, durante un par de minutos. d. La concentración de esta suspensión de HA es de 10,0 mg/mL. 4.2 Caracterización de las nanopartículas de hidroxiapatita 4.2.1 Espectroscopia infrarroja y difracción de rayos X a. Las nanopartículas de HA sintetizadas por ambos métodos, se caracterizan por la técnica de espectroscopia infrarroja de reflexión total atenuada con transformada de Fourier (ATR-FT- IR) y por la técnica de difracción de los rayos X (DRX). Ambas mediciones fueron realizadas por el M.Sc. Leonardo Rojas Álvarez de la Escuela de Química de la Universidad de Costa Rica. b. Los espectros de infrarrojo se obtienen con un espectrómetro Nicolet 6700 FT-IR con el accesorio Smart iTR con una base de diamante para la Reflexión Total Atenuada (ATR por las siglas en inglés de Attenuated Total Reflectance) y con un detector MCT-A. c. La caracterización por rayos X se realiza con un difractómetro de polvo marca Bruker D8 Advance, el cual utiliza una fuente de Cu kα1/kα2, una configuración Bragg-Brenteno y un detector LynxEye. Se realizan los barridos en 2θ de 8° a 70° con un incremento de 0,019° por paso y con una velocidad por paso equivalente de 200 s. 25 4.2.2 Medición del potencial ζ de las nanopartículas en suspensión a. La medición del potencial ζ se realiza con un instrumento Nano-SZ90 modelo ZEN3690 a 25,0 °C con celdas capilares de vidrio, el cual utiliza las técnicas conjuntas de Electroforesis y de Velocimetría por Láser Doppler. b. Se preparan nuevas suspensiones de cada tipo de HA en agua desionizada, éstas suspensiones acuosas son exclusivas para este análisis y la concentración aproximada es de 10,0 mg/mL. c. A partir de la suspensión original anterior, se preparan las suspensiones intermedias de cada tipo de HA. Se toma 1,0 mL (10,0 mg HA) de la suspensión original y se diluye con agua desionizada hasta un volumen de 10,0 mL en un tubo de tipo falcon para obtener una concentración aproximada de 1,0 mg/mL. d. Se prepara una segunda suspensión intermedia con HA saturada con el plásmido. Se toman 100 µL (100 µg de HA) de la suspensión intermedia anterior y se colocan en un tubo de tipo falcon de 10 mL. Se le agrega una alícuota de 29,0 µL de una disolución del plásmido de 430,0 µg/mL y se diluye a 10,0 mL con agua desionizada. e. Se mide el potencial ζ de las muestras acuosas de HA obtenidas en los dos puntos anteriores. Las condiciones del análisis son: 25,0 °C, 2,00 mm de altura en la celda, corridas de Z = 10 y un atenuador con valor de 5. f. Cada muestra de los cuatro tipos de HA (HA-6, HA-7, HA-8 y HA-P) se analiza por triplicado, primero la muestra con la HA a la que no se añadió plásmido y luego la muestra de HA saturada con el plásmido. 4.2.3 Medición del tamaño de las nanopartículas en suspensión a. La medición del tamaño de las partículas en suspensión se realiza con un instrumento Nano- SZ90 modelo ZEN3690 a 25,0 °C con cubetas de vidrio. b. Cada muestra de HA preparada en la sección anterior para el análisis del potencial ζ, se analiza simultáneamente para determinar el diámetro promedio de las partículas en suspensión. c. Las condiciones del análisis son: 25,0 °C, 4,65 mm de altura de en la celda, corridas de Z = 10 y un atenuador con valor de 9. d. Cada muestra de los cuatro tipos de HA se analiza por triplicado, primero la muestra con la HA a la que no se añadió plásmido y luego la muestra de HA saturada con el plásmido. 26 4.3 Biocompatibilidad de las nanopartículas de hidroxiapatita 4.3.1 Mantenimiento del cultivo celular a. Las células RAW 264.7 se descongelan y se cultivan en los frascos plásticos estériles con áreas superficiales de 25 cm2 o de 75 cm2 (T25 y T75 respectivamente). b. Se utiliza un medio de cultivo fresco Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) suplementado con 0,025 mol/L de HEPES y L-glutamina, 10 % de suero bovino fetal, 1000 U/mL de penicilina y 1,0 mg/mL de estreptomicina. Las células se incuban en el frasco a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2. c. El medio de cultivo se cambia, aproximadamente, cada tres días y los pasajes de las células se realizan cada cuatro días o cuando las células alcancen un estado de confluencia, es decir cuando el área de crecimiento se encuentra completamente cubierta de células. d. Para llevar a cabo los pasajes, las células adherentes se separan del frasco de manera manual utilizando un agitador de vidrio en forma de L, esterilizado primero con agua hirviendo y luego flameado con una lámpara de alcohol en una capilla estéril de flujo laminar. e. Las células se centrifugan durante 5,0 min en una centrífuga IEC Centra MP4 a 1200 r.p.m. y se resuspenden en medio de cultivo fresco. f. Se realiza un conteo general de las células totales en una cámara de Neubauer y con un microscopio óptico Zeiss ID 03. Se realiza otro conteo sobre una muestra a la que se le añade azul de tripán para contabilizar las células muertas, que son las que se tiñeron con el tinte. Basados en ambos conteos se determina el porcentaje de viabilidad celular. g. Se coloca una alícuota de las células suspendidas en un nuevo frasco y se adiciona el medio de cultivo fresco hasta que cubra ligeramente el área superficial. Generalmente, si es un frasco T25 se siembran un total de 2,5x105 células y si el frasco es un T75 se siembran 1,0x106 células. 4.3.2 Ensayos de citotoxicidad a. En cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos, se añaden 200 µL del medio de cultivo con aproximadamente 1,0x105 células. b. En cada ensayo se prueban por triplicado seis concentraciones de cada material. El experimento completo se repite dos veces más en días diferentes. 27 c. Se incuba la placa por 24 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2 para que las células se adhieran al frasco. d. A cada pocillo se le adiciona una alícuota de la suspensión de HA cuyas concentraciones se indican en el cuadro 2 de la sección 5.3. Se utilizan células a las que no se añadió HA como un control positivo. e. Se incuban las células con las nanopartículas de HA durante 24 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2. f. Se colocan 25 µL de una disolución de bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H- tetrazolio (reactivo de MTT Sigma-Aldrich, 98,0 % de pureza) con una concentración de 0,012 mol/L a cada pocillo. Se incuban las células a 37,0 °C con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2 por 4 h para que se lleve a cabo la reacción de reducción del MTT. g. Se extrae todo el líquido del pocillo y se disuelven las partículas sólidas del formazán con 200 µL de dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich, 99,5 % de pureza). h. Se centrifuga la placa durante 5 min a 5000 r.p.m. y a temperatura ambiente en una centrífuga Forma Scientific. Esto se realiza para sedimentar las nanopartículas y cualquier residuo celular que esté en suspensión. i. Del líquido sobrenadante se toman alícuotas de 100 µL y se depositan en una nueva placa de 96 pocillos. j. Se mide la absorbancia del formazán disuelto a 570 nm por medio de un lector de placas Dynex Technologies Revelation 4.25. 4.3.3 Análisis estadístico a. El conjunto de los datos obtenidos de los ensayos de la citotoxicidad se somete a un análisis de la varianza de un factor (ANOVA por las siglas en inglés de Analysis of Variance) para determinar, si existe o no, una diferencia significativa entre los grupos de los datos con un valor p menor que 0,05. b. El análisis se lleva a cabo con el programa de cálculo Excel. 4.4 Preparación de los plásmidos pTZ57R y pCMV-AC-GFP Para preparar los plásmidos y obtener el producto puro se sigue el procedimiento descrito por Sambrook, J. et al.93 28 4.4.1 Transformación de bacterias Escherichia coli competentes de la cepa DH5α a. Se descongelan las bacterias que están preservadas a -70 °C y se depositan en un tubo estéril tipo falcon de 15 mL. Se adiciona a este tubo 10 mL de una disolución estéril de CaCl2 0,10 mol/L (J.T. Baker, 99,0 % de pureza) enfriada en un baño de agua con hielo. Este procedimiento se utiliza para producir células bacterianas competentes, es decir, células que tienen la capacidad de incorporar los ácidos nucleicos con mayor facilidad. Estas células se almacenan a 4,0 °C durante tres días. b. Para preservar las células competentes, se mezclan 500 µL de la suspensión de las células con glicerol al 12 % en tubos criogénicos. Estos se almacenan a una temperatura de - 70,0 °C hasta que se requieran para realizar la transformación genética. c. La transformación se realiza por la inoculación de las bacterias Escherichia coli de la cepa DH5α con los plásmidos correspondientes. Se utilizaron dos tipos de plásmidos, el vector pTZ57R (anexo 1) diseñado para la clonación y generación de la deleción de la enzima exonucleasa III y el vector pCMV-AC-GFP (OriGene, catálogo No PS100019, figura 3) que es un plásmido de expresión eucariota que contiene el gen que codifica para la síntesis de la proteína verde fluorescente (GFP por las siglas en inglés de Green Fluorescent Protein). d. Se añaden 10 µL de una disolución del plásmido 1,0 ng/µL a cada tubo de microcentrifugación con 500 µL de la suspensión de las células competentes. Se transfieren los tubos a un baño con agua a 42,0 °C y se incuba por 90 s. e. Se introducen los tubos en un baño de agua con hielo y se dejan enfriar por 2 min. f. Se prepara el medio de cultivo Luria-Bertani (LB, Sigma-Aldrich, reactivos para biología molecular) a una concentración de 20 g/L. Se esteriliza en un autoclave Tamin a 120 °C y al enfriarse a temperatura ambiente, se le adiciona la ampicilina hasta obtener una concentración final de 50 µg/mL. g. Se le agregan 800 µL del medio de cultivo LB a los tubos que contienen las células. Se incuban los cultivos por 45 min en un baño con agua a 37,0 °C. h. En condiciones estériles se preparan las placas de Petri para el cultivo celular con agar al 1,5 % (Sigma Aldrich, grado para microbiología) en LB y suplementado con X-Gal 0,1 µg/mL, IPTG 1,0 mmol/L y el antibiótico ampicilina 2,0 µg/mL, (Sigma-Aldrich, reactivos para biología molecular). 29 i. Con un asa de platino se rayan las placas gelificadas para cultivar las bacterias de Escherichia coli. Se incuban las placas durante 20 h a 37,0 °C y se determina si hubo crecimiento de colonias. j. La aparición de colonias es un indicativo de que estas bacterias fueron transformadas, ya que el plásmido insertado es el que aporta en las bacterias los genes de resistencia para los antibióticos utilizados en la preparación de las placas de Petri. 4.4.2 Amplificación del plásmido a gran escala a. En un frasco de Erlenmeyer de 100 mL se inoculan 30 mL del medio de cultivo LB con una colonia de las bacterias Escherichia coli transformada con el plásmido. b. Se agita en un baño de agua a 37,0 °C para propiciar el crecimiento bacteriano en fase logarítmica, hasta que la suspensión bacteriana alcance una densidad óptica de aproximadamente 0,6 a una longitud de onda de 600 nm, determinada con un espectrofotómetro ultravioleta visible de la marca Spectronic Helios Gamma con cubetas de vidrios de 1,0 cm de ancho c. En un frasco de dos litros se adicionan 500 mL del medio de cultivo LB a 37,0 °C. d. La disolución anterior se inocula con 25 mL del cultivo bacteriano del punto b. e. Se incuba por un período de 12 h a 16 h en un baño con agua en agitación a 37,0 °C hasta que alcance una densidad óptica de 0,6 a una longitud de onda de 600 nm a una longitud de onda de 600 nm. f. Se centrifuga el volumen total del cultivo bacteriano a 4000 r.p.m. durante 15 min en una centrífuga Sorvall Superspeed RC2-B. Se descarta el líquido sobrenadante y se colocan los frascos boca abajo para secar el sedimento bacteriano. g. Se dispersan las bacterias en 100 mL de una disolución de NaCl 0,10 mol/L, de EDTA 1,0 mmol/L y de Tris·Cl 10 mmol/L a un pH de 8,0 y a 4,0 °C (Sigma-Aldrich, grado ACS reactivo). h. Se recuperan las bacterias por centrifugación, como se indica en el punto f de esta sección. 4.4.3 Extracción del plásmido por lisis alcalina a. Se dispersan las bacterias en 18 mL de una disolución con glucosa 50 mmol/L, Tris·Cl 25 mmol/L y EDTA 10 mmol/L a un pH de 8,0 en una botella de centrifugación de 250 mL (Sigma-Aldrich, grado ACS reactivo). 30 b. Se agregan 0,4 mL de una disolución fresca de lisozima 50 mg/mL (Sigma-Aldrich, reactivos para biología molecular) en Tris·Cl a un pH de 8,0. c. Se agregan 40 mL de una disolución recién preparada de NaOH 0,2 mol/L y dodecilsulfato de sodio al 1,0 % (J.T. Baker, grado ACS reactivo). d. Se tapa la botella y se agita ligeramente el contenido. Se deja reposar a temperatura ambiente durante un período de 5 min a 10 min. e. Se adicionan 20 mL de una disolución a 4,0 °C preparada con 60 mL de acetato de potasio 5,0 mol/L, con 12 mL de ácido acético glacial y con 28 mL de agua (J.T. Baker, grado ACS reactivo). f. Se tapa la botella y se agita ligeramente el contenido. Se deja reposar la botella en un baño con hielo por 10 min. g. Se centrifuga el lisado bacteriano a 4000 r.p.m. durante 15 min a temperatura ambiente. h. Se filtra el líquido sobrenadante hacia otra botella de centrifugación de 250 mL, con un filtro cuyo tamaño de poro es de 0,45 µm. i. Se agregan 48 mL de isopropanol y se agita vigorosamente el contenido. Se deja reposar por 10 min a temperatura ambiente. j. Se recupera el plásmido precipitado por el método de centrifugación a 5000 r.p.m. por 15 min a temperatura ambiente. k. Se decanta el líquido sobrenadante cuidadosamente y se invierte la botella para que el precipitado se seque por gravedad. l. Se enjuaga el plásmido con etanol y se deja la botella abierta a temperatura ambiente hasta que se evapore todo el líquido. m. Se disuelve el plásmido recuperado en 0,5 mL de la disolución amortiguadora de TE a un pH de 8,0 (Tris 10 mmol/L y EDTA 1,0 mmol/L, Sigma-Aldrich, grado ACS reactivo). 4.4.4 Purificación del plásmido por precipitación con polietilenglicol a. Se adiciona 1,0 µL de RNAsa pancreática 10 mg/mL libre de DNAsa. Se transfiere la disolución a un tubo para microcentrifugación de 1,0 mL y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min. b. Se agregan 500 µL de una disolución de NaCl 1,6 mol/L y de polietilenglicol al 13 % masa sobre volumen (Sigma-Aldrich, grado ACS reactivo). Se mezcla bien y se recupera el 31 plásmido precipitado por microcentrifugación a 12000 gravedades por 5 min a temperatura ambiente. Se utiliza una microcentrífuga de la marca Eppendorf 5415D. c. Se remueve el líquido sobrenadante por aspiración y se disuelve el precipitado del plásmido en 400 µL de TE. d. Se realiza una extracción con 400 µL de fenol, una extracción con 400 µL de fenol y cloroformo con una proporción 1:1 y otra extracción con 400 µL de cloroformo (Sigma- Aldrich, grado ACS reactivo). e. Se transfiere la fase acuosa a un tubo para microcentrifugación. Se le añaden 100 µL de acetato de amonio 10 mol/L (J.T. Baker, grado ACS reactivo) y se mezcla bien. Se le adiciona 1,0 mL de etanol y se deja reposar a temperatura ambiente por 10 min. f. Se recupera el plásmido por microcentrifugación a 12000 gravedades por 5 min a temperatura ambiente. g. Se remueve el líquido sobrenadante por aspiración. Se agregan 200 µL de etanol en agua al 70 % en volumen. Se mezcla en un agitador de vórtice y se microcentrífuga a 12000 gravedades por 5 min a temperatura ambiente. Se remueve el líquido sobrenadante por aspiración y se deja el tubo abierto hasta que se haya evaporado todo el etanol. h. Se disuelve el precipitado en 500 µL de TE y se mide la densidad óptica a 260 nm de una dilución con una proporción de 1:100 en TE. Se emplea un espectrofotómetro ultravioleta visible de la marca Spectronic Helios Gamma con cubetas de cuarzo de 1,0 cm de ancho. i. Se calcula la concentración del plásmido disuelto por medio de la siguiente ecuación: 𝐶𝑛 = 𝐴𝑏𝑠012 ∗ 50 ∗ 𝑓𝑑 (ecuación 3) 𝐶𝑛 = concentración del plásmido en la disolución. 𝐴𝑏𝑠012 = absorbancia ultravioleta a 260 nm. 50 = Concentración en ng/mL de una disolución de ADN de doble hebra con una densidad óptica de 1. 𝑓𝑑 = factor de dilución. 4.4.5 Corroboración del plásmido por electroforesis y PCR Para estimar la calidad del plásmido obtenido en el procedimiento anterior, se mide la amplificación en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) y la pureza por medio de ensayos de electroforesis en gel. 32 La técnica de PCR permite corroborar la amplificación de un plásmido debido a que es un proceso específico, en el cual, unas cadenas cortas de oligonucleótidos conocidas como iniciadores, se unen selectivamente, a una secuencia complementaria en la plantilla de ADN para replicar el fragmento delimitado. La amplificación de la cadena deseada ocurrirá, únicamente, cuando los iniciadores reconocen las secuencias complementarias en la plantilla de ADN que se desea verificar. Además, esta técnica es una forma de evaluar la pureza del producto; algunos contaminantes como las enzimas nucleasas inhiben la reacción en cadena de la polimerasa e impiden que se lleve a cabo la amplificación del ADN. La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas, bajo la influencia de un campo eléctrico. Esta técnica permite determinar la pureza del producto y comprobar el tamaño y la conformación de los amplicones por la comparación directa con los marcadores. a. Los ensayos de PCR se realizan con el kit DreamTaqTM PCR Master Mix (2X) que contiene agua libre de las enzimas nucleasas y una disolución con los cuatro sustratos (desoxirribonucleótidos trifosfato) para sintetizar el nuevo ADN, MgCl2, el buffer y la enzima polimerasa. Además, se utiliza 1,0 µL de un iniciador 5' VP1.5 a una concentración de 2,5 µmol/L, 1,0 µL de un iniciador XL39 3' a una concentración de 2,5 µmol/L, y 3,0 µL de una disolución 365 ng/mL del plásmido (el PCR se realizó únicamente con el vector pCMV-AC- GFP) como la plantilla de ADN. b. El procedimiento para el análisis de PCR se toma del protocolo sugerido por el fabricante (Fermentas, catálogo No K1071). Se utiliza un termociclador programable de la marca Applied Biosystem GeneAmp PCR System 9700. c. La electroforesis horizontal para los productos amplificados de los dos tipos de plásmido (pTZ57R y pCMV-AC-GFP), se lleva a cabo en un gel de agarosa al 1,0 % en una disolución amortiguadora 1X de tris-borato-EDTA con un pH de 8,0 (Sigma-Aldrich, reactivos para biología molecular). Se utiliza bromuro de etidio a una concentración de 0,50 µg/mL (Sigma- Aldrich, reactivos para biología molecular) como revelador fluorescente ante la excitación de la luz ultravioleta, el plásmido puro como marcador molecular y un transiluminador Ultraviolet Products Inc. con un sistema de captura de imágenes Kodak Edas 290.i i En el anexo 2 se muestra una fotografía resultante de la electroforesis horizontal en gel de una muestra del plásmido pCMV-AC-GFP amplificado. 33 4.5 Caracterización fisicoquímica de los complejos hidroxiapatita y plásmido 4.5.1 Cinética de adsorción y desorción a. Se prepara una suspensión intermedia de cada uno de los tipos de HA a partir de la suspensión madre de 10,0 mg/mL. Para esto se colocan 250 µL de la suspensión madre en un tubo para centrifugación de 10 mL y se lleva a un volumen de 5,0 mL con PBS para obtener una concentración final de HA de 500 µg/mL. b. Se colocan 500 µL de la suspensión intermedia de las nanopartículas (250 µg de las nanopartículas) en siete tubos tipo eppendorf de 1,5 mL. c. Se adiciona a cada tubo una alícuota de 10 µL de la disolución del plásmido a una concentración de 450 µg/mL (4,5 µg de plásmido). Se deja reposar en un baño con agua a 25,0 ˚C. d. Se centrifuga el tubo a 5000 r.p.m. y se toma una muestra del líquido sobrenadante, el cual contiene los restos de plásmido que no se adhirieron a la HA. e. Se mide la absorbancia de la muestra a 260 nm con un espectrofotómetro ultravioleta visible. f. Las muestras se analizan después de los siguientes minutos de reposo: 5, 10, 15, 30, 45, 60 y 75. g. Con estos datos se construye la curva de saturación del material y se determina el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio entre la adsorción y la desorción del plásmido. 4.5.2 Ensayos de adsorción del plásmido sobre la hidroxiapatita a. Se colocan 50 µL de la suspensión intermedia de las nanopartículas de HA (50 µg de HA) en cinco tubos tipo eppendorf de 1,5 mL. Se le adiciona a cada tubo una alícuota diferente de la disolución del plásmido para obtener un rango de concentraciones de 5,0 µg/mL a 50 µg/mL. Se diluye el contenido de cada tubo a un volumen de 500 µL con PBS y se deja reposar en un baño con agua a 25,0 ˚C durante 30 min. b. El ensayo anterior se realiza por triplicado a 25,0 °C y a 37,0 °C y se lleva a cabo para los cuatro tipos de HA estudiados. c. Para tomar la muestra del análisis primero se debe microcentrifugar el tubo tipo eppendorf a 5000 r.p.m., lo cual permite eliminar por sedimentación la HA junto con el ADN que se adsorbió al mineral. 34 d. Se trasvasa todo el sobrenadante a la cubeta de cuarzo, se mide la absorbancia ultravioleta a 260 nm y se calcula la concentración del plásmido disuelto (no adsorbido por la HA) en las unidades de µg/mL. e. Con base en esta información se construyen las isotermas de Langmuir. Para esto se grafica en el programa de cálculo Excel, la relación de la cantidad del plásmido adsorbido sobre la cantidad de HA adsorbente contra la concentración del plásmido en el equilibrio. 4.5.3 Medición de la capacidad máxima adsorbente de la hidroxiapatita a. Se grafica la concentración del plásmido en el equilibrio en las unidades de µg/mL divido por el cociente de la cantidad de µg del plásmido adsorbido entre la cantidad de mg del adsorbente en función de la concentración del plásmido en el equilibrio en las unidades de µg/mL. b. Se aplica un modelo de regresión lineal por mínimos cuadrados para obtener la ecuación de la recta de mejor ajuste que se representa por medio de la ecuación 1. c. El valor de la pendiente de la recta de mejor ajuste corresponde, con base en el modelo de ajuste de Langmuir que se muestra en la ecuación 1 de la sección 1.3, al inverso de la capacidad máxima adsorbente, variable que se calcula como se indica en la ecuación 2 de la misma sección. d. La incertidumbre de la pendiente y del intercepto de la recta de mejor ajuste se calcula por medio de la hoja de cálculo Datos y Estadísticos de la Regresión Lineal de Jorge Chacón Solano, versión 8.0. 4.5.4 Análisis estadístico a. El conjunto de los datos obtenidos de los ensayos de capacidad máxima adsorbente se someten a una prueba de t de Student para valores relacionados con el fin de determinar, si existe o no, una diferencia significativa causada por la temperatura del ensayo con un valor p menor que 0,05. b. El análisis se lleva a cabo con la siguiente ecuación: 𝑡 = �̅�: 𝑠: ∗ √𝑛 (ecuación 4) en la cual, 35 𝑡 = t de Student. �̅�: = promedio de las diferencias entre los datos pareados. 𝑠: = desviación estándar de las diferencias. 𝑛 = tamaño muestral. 4.6 Transfección de las células RAW 264.7 con vectores de HA y Ca3(PO4)2 4.6.1 Ensayos de microscopia fluorescente a. En cada ensayo se utilizan los cuatro tipos de HA sintética y el kit comercial de transfección por la precipitación de fosfato de calcio Plasmid Maxiprep Kit (Sigma-Aldrich, catálogo No NA0400S). Se prueba cada material por triplicado. El ensayo general se repite dos veces más en días diferentes. b. En 22 pocillos de una placa estéril de 96 pocillos, se depositan 200 µL de medio de cultivo RPMI-1640 con aproximadamente 1,0x105 células. La matriz principal formada en la placa de cultivo tiene una dimensión de 3 filas por 6 columnas que representan cuatro tratamientos, un control positivo y un blanco, cada uno por triplicado. Además, se incluyen cuatro pocillos más como control negativo, uno para cada tipo de HA. c. Se incuba la placa por 24 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2 para que las células se adhieran al fondo. d. Se cambia el medio de cultivo de las células 2 h antes de la transfección. e. En los tubos estériles para microcentrifugación de 1,5 mL, se preparan ocho muestras con 100 µg de cada tipo de HA en 105 µL de PBS a una temperatura ambiente (dos tubos por cada tipo de HA). A cuatro de las muestras se le adiciona una alícuota de 15 µL de una disolución del plásmido 365 µg/mL (5,5 µg del plásmido) y a las otras cuatro muestras se les agregan 15 µL de PBS. Todas las muestras anteriores se dejan reposar por media hora. Las muestras de HA sin el plásmido se utilizan como control negativo. f. Se prepara otra muestra como un control positivo a partir del kit de transfección como lo describe el punto B del boletín técnico de Sigma-Aldrich No. MB-315. El procedimiento consiste en mezclar una disolución de CaCl2, agua y plásmido con una disolución salina amortiguadora que contiene HEPES, NaCl, KCl, Na2HPO4 y dextrosa, para formar Ca3PO4 al que se le adhieren las moléculas plasmídicas. 36 g. Cada muestra de las anteriores se distribuye entre los pocillos correspondientes a un tratamiento, al kit o al control negativo (aproximadamente 40 µL por pocillo), a la sexta columna, equivalente al blanco, se le agrega el mismo volumen pero de PBS. h. Se incuban las células con el complejo de transfección durante 6 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2. i. Las células se lavan en condiciones estériles con PBS para remover las partículas de HA en exceso, se les adiciona medio de cultivo fresco RPMI-1640 y se incuban durante 24 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2. j. Se elimina el medio de cultivo de cada pocillo de la placa y se observan las células con el microscopio óptico Olympus BX41 acoplado a un sistema de fluorescencia Olympus U-LH100HGAPO con una cámara DP72. Se utiliza un filtro verde U-MWIB3 Olympus con una longitud de onda de excitación de 460 nm a 495 nm y una longitud de onda de emisión de 510 nm. k. Se toman las fotos de cada pocillo en las condiciones anteriores. Se utiliza el programa DP2-BSW versión 2.2 para procesar las fotografías. 4.6.2 Ensayos de citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica de análisis multiparamétrico cuyo fundamento se basa en pasar una suspensión de partículas alineadas por delante de un haz de láser focalizado, para medir de manera individual, múltiples características físicas de los elementos analizados, en este caso las células.94 El objetivo de emplear esta técnica analítica en este estudio, es cuantificar la emisión fluorescente que se observa en las fotografías de microscopia fluorescente para determinar la proporción de células que contiene el fluorocromo GFP como marcador. a. Se depositan 500 µL de medio de cultivo con aproximadamente 2,5x105 células en 19 pocillos de una placa estéril de 24 pocillos. La matriz formada en la placa de cultivo tiene una dimensión de 4x2 (cuatro materiales a dos concentraciones distintas cada uno) para un total de ocho tratamientos con sus respectivos controles negativos, se incluyen dos pocillos como control positivo (transfección con el kit comercial de precipitación con fosfato de calcio) y un pocillo como blanco. b. Se incuba la placa por 24 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2 para que las células se adhieran al fondo de la placa. 37 c. Se cambia el medio de cultivo 2 h antes de la transfección de las células. d. En unos tubos estériles para microcentrifugación de 1,5 mL, se preparan cuatro muestras que contengan 100 µg de cada tipo de HA y 34 µg/mL del plásmido (2,5 µg) en un volumen total de 75 µL de PBS a una temperatura ambiente. Se preparan otras cuatro muestras en las mismas condiciones pero con 25 µg de cada tipo de HA. Para los controles negativos se utilizan muestras de cada uno de los tipos de HA sin el plásmido y para el blanco solo se utiliza PBS. e. Se añaden a las células, según corresponda, los 75 µL de las muestras preparadas en el punto anterior y se incuban por 4 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2. f. Luego de la inoculación, las células se lavan en condiciones estériles con PBS para remover las partículas de HA en exceso. Se adiciona el medio de cultivo fresco RPMI-1640 y se incuban durante 24 h a 37,0 °C y con una atmósfera húmeda al 5 % de CO2. g. Se elimina el medio de cultivo de cada pocillo de la placa y se corrobora la fluorescencia con el microscopio óptico. h. Se separan las células de la placa de cultivo manualmente con un agitador de vidrio