UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO APROVECHAMIENTO DE UN SUBPRODUCTO DEL PROCESAMIENTO DEL BANANO PARA LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) MEDIANTE FERMENTACIÓN SUMERGIDA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencia de Alimentos para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencia de Alimentos MÓNICA ARIAS ROBLERO Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2022 ii DEDICATORIA A mis pequeñas Abigail y Olivia, que me motivan para ser mejor A José, cuyo apoyo y amor hizo posible este proceso iii AGRADECIMIENTOS A la MSc. Carmela Velázquez, por su apoyo y guía académica A Vanny Mora, por su amabilidad, su apoyo técnico y su gran involucramiento a lo largo de todo el proyecto A la MSc. María de los Ángeles Mora y a la MSc. Alicia Hernández por sus valiosos aportes para el desarrollo de este trabajo Al personal de los Laboratorios de Química del CITA - UCR y el CINA - UCR, cuya asesoría y soporte técnico fue esencial para conseguir los objetivos de esta Tesis Al Dr. Fabrice Vaillant, por su guía en los aspectos estadísticos del trabajo A Luis Alonso Porras, Iray Mata y José Pablo Quirós por su apoyo profesional para las actividades realizadas en CENIBiot A Eduardo Thompson, Valeria Benavides, Henry Castro y Nathalie Guzmán por su valioso trabajo como parte de este proyecto iv HOJA DE APROBACIÓN v TABLA DE CONTENIDO DEDICATORIA .............................................................................................................. ii AGRADECIMIENTOS ................................................................................................... iii HOJA DE APROBACIÓN ............................................................................................. iv TABLA DE CONTENIDO .............................................................................................. v RESUMEN .................................................................................................................. viii ABSTRACT .................................................................................................................. ix LISTA DE CUADROS ................................................................................................... x LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... xiii 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1 2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 5 2.1. Generalidades de los bioplásticos ................................................................... 5 2.2. Aprovechamiento biotecnológico de subproductos agroindustriales para la producción de PHAs .................................................................................................. 7 2.2.1. Idoneidad de los subproductos agroindustriales como sustratos de fermentación .......................................................................................................... 7 2.2.2. Aprovechamiento de subproductos para la síntesis microbiana de PHAs 9 2.2.3. Potencial de los subproductos de banano como sustrato para la producción de PHAs............................................................................................. 10 2.3. Polihidroxialcanoatos (PHAs): aspectos generales ....................................... 13 2.3.1. Propiedades de los PHAs ...................................................................... 13 2.3.2. Comercialización de los PHAs ............................................................... 15 2.3.3. Síntesis microbiana de los PHAs ........................................................... 16 2.4. Procesos fermentativos para la producción de PHAs .................................... 23 2.5. Extracción y cuantificación de PHB ............................................................... 25 3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 29 3.1. Objetivo General ........................................................................................... 29 3.1.1. Objetivos Específicos ............................................................................. 29 4. METODOLOGÍA .................................................................................................. 30 4.1. Localización del proyecto .............................................................................. 30 4.2. Subproducto de banano ................................................................................ 30 4.3. Microorganismos ........................................................................................... 32 4.3.1. Cepas bacterianas ................................................................................. 32 4.3.2. Conservación de microorganismos ........................................................ 33 vi 4.4. Definición del método de análisis para la cuantificación de polihidroxibutirato (PHB) 34 4.4.1. Equipo y condiciones ............................................................................. 34 4.4.2. Preparación de curvas de calibración..................................................... 35 4.4.3. Determinación de límites de detección y cuantificación .......................... 36 4.4.4. Determinación del porcentaje de recuperación del método .................... 37 4.4.5. Extracción de PHB a partir de caldos de fermentación ........................... 37 4.4.6. Análisis de muestras .............................................................................. 38 4.5. Comparación de la capacidad de producción de PHB de distintas cepas bacterianas .............................................................................................................. 38 4.6. Diseño de un medio suplementado con subproducto de banano para la producción de biomasa de Cupriavidus necator ...................................................... 40 4.6.1. Diseño Experimental .............................................................................. 41 4.6.2. Preparación de medios de cultivo y condiciones de crecimiento ............ 42 4.7. Implementación del proceso de producción de PHB en biorreactor............... 44 4.7.1. Preparación del medio de cultivo ........................................................... 44 4.7.2. Preparación y configuración del biorreactor ........................................... 45 4.7.3. Preparación y adición de inóculos .......................................................... 48 4.7.4. Condiciones de crecimiento ................................................................... 49 4.7.5. Extracción y procesamiento de muestras ............................................... 49 4.7.6. Determinación de biomasa mediante peso seco .................................... 51 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 52 5.1. Definición del método de análisis para detección y cuantificación de PHB .... 52 5.1.1. Condiciones de análisis seleccionadas .................................................. 52 5.1.2. Curvas de calibración ............................................................................. 56 5.1.3. Límites de detección y cuantificación ..................................................... 57 5.1.4. Porcentaje de recuperación ................................................................... 59 5.2. Comparación de la capacidad de producción de PHB de distintas cepas bacterianas .............................................................................................................. 59 5.3. Diseño de un medio de cultivo para la producción de biomasa bacteriana .... 62 5.4. Implementación del proceso de fermentación en biorreactor ........................ 64 5.4.1. Producción de biomasa durante la fase de crecimiento ......................... 66 5.4.2. Producción de PHB ................................................................................ 67 5.4.3. Presencia de ácidos grasos en muestras de fermentación ..................... 79 6. CONCLUSIONES ................................................................................................ 82 vii 6.1. Definición del método de análisis para la detección y cuantificación de polihidroxibutirato (PHB) a partir de biomasa bacteriana ......................................... 82 6.2. Comparación de la capacidad de producción de PHB de distintas cepas bacterianas nativas, así como de una cepa control de Cupriavidus necator ............ 83 6.3. Diseño de un medio de cultivo suplementado con jugo de subproducto de banano para la producción de biomasa bacteriana productora de PHB ................... 83 6.4. Implementación de un proceso fermentativo en biorreactor de 7 L ............... 84 7. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 86 8. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 88 9. ANEXOS ............................................................................................................ 111 Anexo 1. ................................................................................................................ 111 viii RESUMEN El polihidroxibutirato (PHB) corresponde al polihidroxialcanoato (PHA) más común en la naturaleza. Es sintetizado por gran variedad de microorganismos a manera de reserva energética en condiciones de desbalance nutricional, en donde hay disponibilidad de carbono, pero limitación en otros nutrientes como nitrógeno, oxígeno y fósforo. Corresponde a un biopolímero con potencial para sustituir los plásticos derivados del petróleo, con la ventaja de ser completamente biodegradable, produciéndose CO2 y agua en condiciones de degradación aerobia, o bien, metano en condiciones anaerobias. Con este trabajo se buscó definir un método analítico para la cuantificación de PHB de origen bacteriano, comparar la productividad de PHB de 11 cepas costarricenses con respecto a una cepa control de Cupriavidus necator, maximizar la concentración de biomasa productora de PHB mediante la optimización de los componentes del medio de cultivo e implementar un proceso de fermentación de tipo lote alimentado para la producción de PHB. Se desarrolló un proceso de extracción de PHB mediante metanólisis ácida, así como un método de análisis cromatográfico para la cuantificación del polímero. La evaluación de la productividad de PHB (g/L) de las distintas cepas se llevó a cabo mediante fermentación en dos etapas, empleando un medio mineral limitado en nitrógeno. Se optimizaron los niveles de jugo de subproducto de banano y NH4Cl que permitieran maximizar la producción de biomasa de la cepa control. Para la implementación del proceso fermentativo de producción de PHB en biorreactor, se evaluaron suplementaciones de 30, 40 y 50 g/L de fructosa al final de la fase de crecimiento microbiano. En cuanto a la evaluación de la productividad de las cepas nativas, se obtuvo una productividad de 0,5 g/L de PHB para una cepa nativa de C. necator proveniente de suelos de una plantación bananera, en contraposición a la concentración de 2,8 g/L para la cepa control. Mediante el análisis de superficie de respuesta, se determinó que la máxima concentración de biomasa fue obtenida al emplear una concentración de 2 g/L de NH4Cl como fuente de nitrógeno y un 5% de jugo derivado de un subproducto de banano (JSB) como fuente de carbono. A pesar de que para la mayoría de las pruebas de fermentación en biorreactor no se logró una producción detectable de PHB, para la fermentación suplementada con 50 g/L de fructosa se obtuvo una concentración de 1,29 g/L de PHB a las 96 horas de proceso. Gracias a su rica composición nutricional y a su contenido de azúcares fermentables, los subproductos del procesamiento del banano resultan promisorios como sustratos de fermentación para la producción de bioplásticos, sin embargo, es necesario profundizar en su estudio con el fin de desarrollar procesos de producción eficientes, tanto a escala piloto como industrial. ix ABSTRACT Polyhydroxybutyrate (PHB) is the most common naturally found polyhydroxyalcanoate (PHA). This polymer is usually synthesized and accumulated as an energy reservoir by a wide number of microorganisms under nutritional stress conditions, which usually involve carbon availability, but other nutrients (such nitrogen, oxygen, or phosphorus) deprivation. PHB constitutes an attractive potential substitute for petroleum-derived plastics since complete biodegradation of this polymer occurs in short periods of time. Under aerobic conditions, PHB is degraded into CO2 and water, whereas methane is the main product of its anaerobic digestion. The objectives of this study were: to define an analytical method for bacterial PHB quantification, to compare PHB production of 11 autochthonous Costa Rican strains in relation to a Cupriavidus necator control strain, to maximize PHB-producing biomass concentration through culture medium component optimization and to implement a fed-batch fermentation process for PHB production. PHB extraction was achieved by acid methanolysis. A chromatographic method was developed for PHB quantification. PHB productivity (g/L) for the autochthonous strains was assessed through the application of a two-stage fermentation using a nitrogen- limited mineral medium. Banana by-product juice and NH4Cl concentrations were optimized to maximize biomass production. For the implementation of PHB production in lab-scale bioreactors, at the end of the growth phase, carbon supplementation with 30, 40 and 50 g/L fructose was evaluated. Regarding strain productivity assessment, a PHB concentration of 0,5 g/L was obtained for a banana plantation soil-isolated autochthonous C. necator strain. PHB production of 2,8 g/L was determined for control strain. According to response surface analysis, maximum biomass density was observed for culture medium containing 2 g/L NH4Cl as nitrogen source and 5% BBJ as carbon source. Although, for most fermentation assays, a detectable production of PHB was not observed, for a 50 g/L fructose-supplemented fermentation a 1,29 g/L PHB production was obtained at 96 h. Due to their nutritional composition and fermentable sugar content, banana processing by-products constitute suitable fermentation substrates for bioplastic production, nevertheless, plenty of research is still needed to design efficient pilot and industrial-scale production processes. x LISTA DE CUADROS Cuadro 1. Composición nutricional de la pulpa de banano maduro ............................. 12 Cuadro 2. Ejemplos de microorganismos y sustratos agroindustriales reportados en la literatura para la producción de PHB ........................................................................... 19 Cuadro 3. Ejemplos de condiciones de análisis para la cuantificación de PHB por Cromatografía de Gases, reportados en la literatura ................................................... 28 Cuadro 4. Composición del jugo proveniente del subproducto de banano (JSB) ......... 32 Cuadro 5. Cepas bacterianas evaluadas en su capacidad de producción de PHB ...... 33 Cuadro 6. Caldo de cultivo empleado para la evaluación de la producción de PHB por parte de las distintas cepas bacterianas ...................................................................... 39 Cuadro 7. Diseño Experimental Central Compuesto Rotativo para la optimización de las concentraciones de JSB y Cloruro de amonio ............................................................. 42 Cuadro 8. Composición del medio de cultivo para el crecimiento de biomasa productora de PHB ajustado a pH 7,1 con NaOH 1M .................................................................... 42 Cuadro 9. Preparación de las distintas formulaciones de medios de cultivo para optimización de biomasa de Cupriavidus necator ........................................................ 43 Cuadro 10. Composición de sales para las fermentaciones en biorreactor ................ 45 Cuadro 11. Condiciones de análisis para la cuantificación de PHB mediante Cromatografía de gases .............................................................................................. 52 Cuadro 12. Rampa de temperatura para el método de detección de PHB .................. 52 Cuadro 13. Cálculo de los límites de detección y cuantificación para el método de análisis de PHB por CG-FID ........................................................................................ 57 Cuadro 14. Límites de detección y cuantificación para el método de cuantificación de PHB mediante CG-MS. ............................................................................................... 59 Cuadro 15. Promedios de áreas de pico y concentraciones de 3-MHB determinadas mediante CG con detección FID para cada una de las cepas bacterianas evaluadas . 60 Cuadro 16. Densidad Óptica a 425 nm para los cultivos de la cepa CN-2 crecidos en diferentes formulaciones del medio de cultivo para producción de biomasa ................ 62 Cuadro 17. Resultados de las determinaciones de biomasa por peso seco al finalizar la primera etapa de las fermentaciones en biorreactor .................................................... 66 Cuadro 18. Producción de PHB en el caldo de fermentación obtenida en distintos tiempos utilizando C. necator en un biorreactor con un volumen de 3L de medio de cultivo .......................................................................................................................... 68 Cuadro 19. Condiciones de crecimiento y productividades de PHB reportadas en la literatura para distintos procesos fermentativos con C. necator ................................... 70 Cuadro 20. Relaciones carbono/nitrógeno al inicio de la fase de producción de PHB . 76 Cuadro 21. Compuestos presentes en las muestras de fermentación en biorreactor, identificados mediante CG-MS .................................................................................... 79 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estructura química general de los polihidroxialcanoatos (PHAs) ................. 13 Figura 2. Estructura química del polihidroxibutirato (PHB) ........................................... 14 Figura 3. Ruta metabólica para la síntesis de PHB y P(HB-HV) en C necator ............. 22 Figura 4. Proceso de fermentación, recuperación y purificación para la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) ...................................................................................... 23 Figura 5. Diagrama del procedimiento para la obtención del jugo de subproducto de banano (JSB) .............................................................................................................. 31 Figura 6. Consola ez-Control (Applikon® Biotechnology) empleada para las fermentaciones con C. necator .................................................................................... 46 Figura 7. Sistema de venteo acoplado en la salida del sistema de fermentación en biorreactor ................................................................................................................... 47 Figura 8. Configuración general del biorreactor, conteniendo un volumen de 3 L ........ 47 Figura 9. Diagrama de armado del del biorreactor ...................................................... 48 Figura 10. Sistema de toma de muestra acoplado al biorreactor ................................. 49 Figura 11. Procedimientos aplicados a las muestras de fermentación......................... 50 Figura 12. Cromatograma para una disolución de 0,55 g/L del estándar Metil (R)-3 hidroxibutirato en cloroformo ....................................................................................... 53 Figura 13. Cromatograma para una disolución de 5,6 g/L de Ácido benzoico en cloroformo, posterior a la metanólisis .......................................................................... 53 Figura 14. Cromatogramas correspondientes al JSB sometido a metanólisis.............. 54 Figura 15. Cromatograma CG-FID para una muestra de fermentación en medio suplementado con JSB, realizando la extracción a partir de biomasa recuperada ...... 55 Figura 16. Curva de calibración del Metil (R)-3 hidroxibutirato en cloroformo .............. 56 Figura 17. Curva de calibración del Ácido Benzoico ................................................... 57 Figura 18. Ajuste lineal de los promedios de concentraciones altas, medias y bajas de las curvas de calibración de 3-MHB ............................................................................ 58 Figura 19. Morfología de la cepa CR-12 con acumulación de PHB ............................. 61 Figura 20. Gráfico de contorno: Efecto de las concentraciones de JSB y NH4Cl en la concentración celular de C. necator ............................................................................ 63 Figura 21. Comportamiento de la temperatura para las 3 repeticiones de la fermentación con 30 g/L de fructosa ........................................................................... 65 Figura 22. Comportamiento del oxígeno disuelto para las 3 repeticiones de la fermentación con 30 g/L de fructosa ........................................................................... 65 Figura 23. Comportamiento del oxígeno disuelto para los tres niveles de fructosa evaluados ……………………………………………………………………………………...71 xii Figura 24. Comportamiento de la fructosa y el nitrógeno durante la fermentación suplementada con 30 g/L de fructosa a las 25 h de proceso ....................................... 73 Figura 25. Comportamiento de la fructosa y el nitrógeno durante la fermentación suplementada con 40 g/L de fructosa a las 25 h de proceso ....................................... 74 Figura 26. Comportamiento de la fructosa y el nitrógeno durante la fermentación suplementada con 50 g/L de fructosa a las 25 h de proceso ....................................... 75 Figura 27. Cromatograma de las muestras de fermentación en biorreactor, mostrando los distintos compuestos identificados ......................................................................... 79 xiii LISTA DE ABREVIATURAS 3-HBCoA β-hidroxibutiril coenzima A 3-MHB Metil-3-hidroxibutirato AB Ácido benzoico ANDEVA Análisis de Varianza ATC Ácido tricarboxílico C/N Relación Carbono/Nitrógeno CG Cromatografía de gases D.O Densidad Óptica Da Dalton DIA Diseño Irrestricto al Azar FID Detector de ionización de flama HV Hidroxivalerato JSB Jugo de subproducto de banano MS Detección de masas NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NC No cuantificable ND No detectable OD Oxígeno disuelto P (3HB-co HV) Copolímero polihidroxibutirato - hidroxivalerato PBS Polibutileno succinato PE Polietileno PhaPs Proteínas fascinas PHAs Polihidroxialcanoatos PHB Polihidroxibutirato PHV Polihidoxivalerato PLA Ácido poliláctico PSB Peso seco de biomasa rcf Fuerza centrífuga relativa S/N Relación Señal/Ruido TGA Analizador termogravimétrico TSA Agar Tripticasa Soya TSB Caldo Tripticasa Soya vvm Volumen de aire por volumen de medio por minuto Yo, Mónica Arias Roblero, con cédula de identidad 205790452, en mi condición de autor del TFG titulado: “Aprovechamiento de un subproducto del procesamiento del banano para la producción de polihidroxibutirato (PHB) mediante fermentación sumergida”. Autorizo a la Universidad de Costa Rica para digitalizar y hacer divulgación pública de forma gratuita de dicho TFG a través del Repositorio Institucional u otro medio electrónico, para ser puesto a disposición del público según lo que establezca el Sistema de Estudios de Posgrado. *En caso de la negativa favor indicar el tiempo de restricción: ________________ año (s). Este Trabajo Final de Graduación será publicado en formato PDF, o en el formato que en el momento se establezca, de tal forma que el acceso al mismo sea libre, con el fin de permitir la consulta e impresión, pero no su modificación. Manifiesto que mi Trabajo Final de Graduación fue debidamente subido al sistema digital Kerwá y su contenido corresponde al documento original que sirvió para la obtención de mi título, y que su información no infringe ni violenta ningún derecho a terceros. El TFG además cuenta con el visto bueno de mi Director (a) de Tesis o Tutor (a) y cumplió con lo establecido en la revisión del Formato por parte del Sistema de Estudios de Posgrado. FIRMA ESTUDIANTE Nota: El presente documento constituye una declaración jurada, cuyos alcances aseguran a la Universidad, que su contenido sea tomado como cierto. Su importancia radica en que permite abreviar procedimientos administrativos, y al mismo tiempo genera una responsabilidad legal para que quien declare contrario a la verdad de lo que manifiesta, puede como consecuencia, enfrentar un proceso penal por delito de perjurio, tipificado en el artículo 318 de nuestro Código Penal. Lo anterior implica que el estudiante se vea forzado a realizar su mayor esfuerzo para que no sólo incluya información veraz en la Licencia de Publicación, sino que también realice diligentemente la gestión de subir el documento correcto en la plataforma digital Kerwá. Autorización para digitalización y comunicación pública de Trabajos Finales de Graduación del Sistema de Estudios de Posgrado en el Repositorio Institucional de la Universidad de Costa Rica. SI NO X https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio 1 1. INTRODUCCIÓN El uso masivo de plásticos sintéticos representa un serio problema ambiental. Estos materiales no son susceptibles a la degradación biológica y en muchas ocasiones se desechan inadecuadamente, acumulándose en los ecosistemas y rellenos sanitarios por períodos muy extensos (Castilho et al., 2009). Se estima que la cantidad de plástico que alcanza los océanos oscila entre 4,8 y 12,7 millones de toneladas anuales y considerando la infraestructura disponible actualmente para el tratamiento de este tipo de desechos se prevé que dicho volumen aumente en un orden de magnitud para el año 2025 (Jambeck et al., 2015). Los plásticos son demandados por un creciente sector industrial, debido a su fuerza, alta durabilidad, bajo costo y resistencia a la degradación. Sin embargo, estas propiedades que otorgan valor en muchas aplicaciones provocan problemas ambientales y de salud, producto de la acumulación y disposición inadecuada de estos materiales. En ocasiones, los tratamientos diseñados para la destrucción o reutilización de los plásticos resultan costosos y consumen mucho tiempo. Incluso, algunos procesos comúnmente aplicados, como la incineración, pueden generar nuevas sustancias tóxicas, tales como el cianuro de hidrógeno y el cloruro de hidrógeno. Otras alternativas de tratamiento, como la fotodegradación, tienen aplicaciones limitadas (Khanna & Srivastava, 2005b; Muralisrinivasan Subramanian, 2016). El reciclaje de plásticos contribuye a mitigar su impacto; sin embargo, se trata de un proceso poco atractivo comercialmente, que requiere la inversión de muchas horas de labor para categorizar adecuadamente cada tipo de material. Además, debido a sus características, algunos tipos de plásticos no pueden ser reciclados. Por otra parte, la limitación de las reservas petroleras y las preocupaciones por el impacto ambiental que 2 2 sus derivados generan, han motivado a los gobiernos, la industria y las comunidades a buscar alternativas para reemplazar esta materia prima por recursos renovables. Así, cada vez más países promueven políticas para reducir el consumo de plásticos sintéticos y sustituirlos por análogos biodegradables (Leong et al., 2014). Entre los plásticos biodegradables existentes, los polihidroxialcanoatos (PHAs) se encuentran entre los más estudiados, ya que pueden ser totalmente degradados por la vía biológica, sin la generación colateral de compuestos tóxicos. Muchos microorganismos presentes en los suelos cuentan con sistemas enzimáticos capaces de romper los enlaces de estos polímeros (Saratale et al., 2019), generando monómeros y oligómeros solubles en agua que luego son metabolizados en dióxido de carbono y agua (Chanprateep, 2010). Los PHAs constituyen una familia de poliésteres con diversas estructuras sintetizados por bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas. Son los únicos bioplásticos cuya síntesis se lleva a cabo en su totalidad por la vía microbiana (G.-Q. Chen, 2010c). Debido a que los PHAs constituyen una reserva de carbono susceptible de ser metabolizada por una amplia gama de microorganismos, estos materiales pueden degradarse en todos los ambientes biológicamente activos, incluyendo suelos, cuerpos de agua, compost y aguas residuales (Somleva et al., 2013). Los PHAs presentan propiedades similares a las de los plásticos convencionales (Naranjo et al., 2014), con la ventaja de que su degradación biológica puede lograrse en períodos menores a un año. Adicionalmente, su producción puede llevarse a cabo a partir de fuentes de energía renovables. Entre los productos que pueden elaborarse a partir de los PHAs pueden mencionarse: botellas, empaques para alimentos, películas a prueba de agua y materiales médicos como hilos de sutura, implantes y matrices para liberación controlada de medicamentos (Suriyamongkol et al., 2007). 3 3 El polihidroxibutirato (PHB) es el PHA más común y mejor caracterizado (Maity et al., 2020). Es sintetizado por una gran variedad de bacterias, siendo Cupriavidus necator uno de los microorganismos productores más estudiados, dada su capacidad de acumular hasta un 80% de PHB, con respecto a su peso celular seco (Franz et al., 2011). Pese al incremento en la popularidad de los plásticos biodegradables, una de las mayores limitaciones para su producción es su elevado costo (T. Li et al., 2017). Gran parte de dicho costo se deriva del medio de cultivo para la producción fermentativa. Por esto, es esencial la búsqueda de sustratos abundantes y económicos que puedan sustituir los medios químicamente definidos para la producción industrial del PHB (Keshavarz & Roy, 2010). Debido a su composición nutricional y bajo costo, los subproductos agroindustriales son una opción atractiva para ser evaluados como materia prima para el diseño de medios de cultivo. La investigación previa ha demostrado la aplicación exitosa de estos subproductos como sustratos de fermentación para la producción de: ácidos orgánicos (Demichelis et al., 2017), enzimas (Melnichuk et al., 2020), biocombustibles (Boulal et al., 2019) y compuestos funcionales como fibra dietética (de la Rosa et al., 2019), antocianinas (Buenrostro-Figueroa et al., 2017) y carotenoides (Clementz et al., 2019). Adicionalmente, el uso de subproductos como sustratos de fermentación ofrece una alternativa para su aprovechamiento. En Costa Rica, la industrialización de productos agrícolas como café, banano y piña genera aproximadamente un 86% del total de desechos del sector industrial (Rojas- Garbanzo et al., 2018). El descarte inadecuado de los desechos agrícolas propicia su degradación anaeróbica y la emisión de metano, con el consecuente impacto de esta práctica en el cambio climático. 4 4 Numerosos sustratos provenientes de la actividad agroindustrial han sido estudiados para la producción fermentativa de PHB, entre ellos: melazas (Albuquerque et al., 2010), suero lácteo (Povolo et al., 2010), jarabe de maíz (Gouda et al., 2001), residuos de vainas de guisantes (Patel et al., 2012) y aceites vegetales (López-Cuellar et al., 2011). En el caso particular de nuestro país, los subproductos del procesamiento del banano, dado su alto contenido de carbono, son promisorios como sustratos de fermentación y se han valorado con éxito en la producción de ácido láctico necesario para la obtención de ácido poliláctico, un bioplástico de uso comercial (López et al., 2008) Este tipo de subproductos se caracteriza por su alto contenido de azúcares como glucosa, sacarosa y fructosa, así como una gran variedad de minerales, vitaminas y aminoácidos (Chan-Blanco et al., 2003; Guylène et al., 2009). Dado que el banano presenta un contenido cercano a los 12 g de azúcares simples por cada 100 g de fruta (Cohen, 2011), su valorización se facilita pues, a diferencia de otros residuos ricos en almidones o celulosas, no es necesaria la implementación de tratamientos de hidrólisis química o enzimática destinados a liberar los azúcares requeridos por los microorganismos en el proceso de fermentación. En este proyecto se evaluó una alternativa para la valorización de los residuos del procesamiento agroindustrial del banano, mediante su uso como materia prima para la producción de PHB en un proceso de fermentación. Los resultados del estudio apoyan la valorización del subproducto, así como la generación de una alternativa de plástico biodegradable y producido en forma íntegra por una cepa comercial. 5 5 2. MARCO TEÓRICO 2.1. Generalidades de los bioplásticos Los bioplásticos comprenden una amplia familia de materiales con propiedades diversas. Para ser considerado como bioplástico, un material plástico debe cumplir con al menos una de las siguientes cualidades: a) ser elaborado a partir de biomasa, es decir, a partir de recursos renovables o b) ser biodegradable (EUBIO, 2019). Los bioplásticos generados a partir de biomasa incluyen materiales cuya base de fabricación se compone de almidones (extraídos de fuentes como maíz, trigo, papa y yuca), proteínas, celulosas (obtenidas de pulpa de madera, algodón o cáñamo) o mezclas de estas materias primas con plásticos convencionales (G.-Q. Chen, 2010b; HGCA, 2009). Se consideran polímeros biodegradables a aquellos plásticos que, gracias a su estructura química, pueden ser degradados naturalmente por acción microbiana, dando lugar a agua y dióxido de carbono en condiciones aerobias o a metano, si la degradación ocurre en anaerobiosis. El término biopolímero es más específico y se refiere a los polímeros biodegradables que son producidos exclusivamente a partir de fuentes renovables. Los biopolímeros, como los PHAs y el ácido poliláctico (PLA) pueden ser generados mediante polimerización de carbohidratos o bien, mediante procesos fermentativos (Rojas- Garbanzo et al., 2018). Entre otros ejemplos de polímeros biodegradables estudiados para distintas aplicaciones pueden citarse las poli(ε-caprolactonas) (PCL), poli(p-dioxanonas) (PPDO), almidones, celulosas, quitina y quitosano (Akaraonye et al., 2010). 6 6 El ácido poliláctico (PLA) es uno de los bioplásticos más conocidos. Su desarrollo tecnológico se sitúa en una etapa avanzada en comparación con el de los PHAs y los procesos para su producción industrial se encuentran bien establecidos. El costo del PLA es ligeramente mayor, y, en algunos casos, comparable al de los plásticos convencionales. Pese a esto, presenta ciertas desventajas como la dificultad de la polimerización necesaria para la elaboración del material, su inestabilidad térmica y un rango limitado de aplicaciones dadas sus propiedades mecánicas (Chen, 2009). Por esto, se ha estimulado la investigación de otros bioplásticos, como los PHAs. El PHB presenta limitaciones como plástico, debido a que constituye un material quebradizo y de alta dureza; sin embargo, las características mecánicas del polímero, tales como dureza, flexibilidad o elasticidad, pueden ser mejoradas mediante su combinación con otros monómeros de PHAs, con plásticos de distinta naturaleza, o con la incorporación de algunos aditivos (Somleva et al., 2013). A pesar de que los bioplásticos representan un 1% del total de 320 millones de toneladas de plástico producidas anualmente, su mercado presenta un crecimiento muy dinámico, producto de diversos factores, entre ellos: una mayor demanda de productos sostenibles por parte de los consumidores, las fluctuaciones en el precio del petróleo y una mayor concientización de la población sobre el cambio climático (European Bioplastics, 2019). Es importante indicar que, a pesar de que muchos bioplásticos son biodegradables, estos deben desecharse correctamente al final de su vida útil, para maximizar sus beneficios ambientales. Existen métodos para disponer de estos materiales como: reciclaje, incineración para la recuperación de energía, compostaje y descarte en rellenos sanitarios. El compostaje industrial es el método predilecto para el descarte de los bioplásticos, pues, a diferencia de los procesos de domésticos, se logran 7 7 temperaturas lo suficientemente altas para la completa degradación del polímero (HGCA, 2009). 2.2. Aprovechamiento biotecnológico de subproductos agroindustriales para la producción de PHAs 2.2.1. Idoneidad de los subproductos agroindustriales como sustratos de fermentación La actividad agroindustrial genera desechos con alto contenido de humedad y carga orgánica, lo que propicia su rápido deterioro, dificulta su manejo y acarrea problemas ambientales (Nayak & Bhushan, 2019). Para el caso de las frutas y vegetales tropicales, se estima que el porcentaje de material no aprovechado para el procesamiento oscila entre un 20 y un 60%, dependiendo del tipo de materia prima (Dávila-Aviña et al., 2018) Gracias al desarrollo en investigación, se ha evidenciado el potencial de estos residuos como fuentes de una variedad de productos de interés industrial. Las tecnologías actuales ofrecen alternativas para la recuperación sostenible y la reincorporación de ingredientes de alto valor agregado a las cadenas alimenticias. Por esto, el término “subproducto” ha sido acuñado y se utiliza cada vez con mayor frecuencia dentro de la comunidad científica en sustitución del término “residuo”, para enfatizar que estos constituyen en realidad sustratos valiosos para la recuperación de compuestos funcionales y la obtención de nuevos productos con alto valor de mercado (Galanakis, 2012). El diseño de biorefinerías, entendidas como procesos de reciclaje de subproductos derivados de la industria para la generación de energía y otros productos como biomasa, 8 8 biofertilizantes y compuestos químicos de alto valor, gana cada vez más atractivo como una opción comercial sustentable. La producción de PHAs dentro de este esquema es una posibilidad viable (Nayak & Bhushan, 2009). Se reporta el uso de subproductos agroindustriales para la producción industrial de PHAs por parte de diversas compañías, por ejemplo: remolacha (Bio-On), caña de azúcar (Bio-Cycle) y maíz (Metabolix) (Tsang et al., 2019). Cerca de un 50% de los costos de producción de los PHAs dependen de las materias primas requeridas en el proceso de fermentación. La acumulación de estos polímeros ocurre en condiciones aerobias, lo cual conlleva pérdidas de carbono debido a la respiración celular. Por esto, menos de la mitad de la fuente de carbono es efectivamente utilizada para el crecimiento y la síntesis de PHAs. En estas condiciones, el uso de subproductos adecuados y abundantes regionalmente es una opción viable para el desarrollo de procesos económicamente atractivos (Koller et al., 2010). Pese a que los subproductos agroindustriales son materias primas promisorias para la producción de bioplásticos, estos requieren un tratamiento previo para mejorar sus cualidades biológicas y fisicoquímicas. Estos pretratamientos o procesos de conversión liberan monómeros en forma total o parcial a partir del subproducto específico (usualmente ricos en componentes lignocelulósicos), de modo que se incremente la accesibilidad de las proteínas y polisacáridos para procedimientos posteriores de fermentación (Tsang et al., 2019). Ciertos materiales de descarte como melazas, jarabe de maceración de maíz, fibras de trigo y arroz y suero lácteo son algunos ejemplos de sustratos adecuados para la obtención de PHAs (Pakalapati et al., 2018). Dentro de las fuentes de carbono abundantes en los subproductos agroindustriales y que han sido estudiadas como precursoras de los PHAs se encuentran: azúcares simples (como glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa), ácidos n-alcanoicos (entre ellos 9 9 ácido acético, ácido butírico, ácido valérico, ácido oleico y ácido propiónico) y alcoholes (metanol, etanol y glicerol) (Poli et al., 2011; Santhanam & Sasidharan, 2010). 2.2.2. Aprovechamiento de subproductos para la síntesis microbiana de PHAs Se han reportado experiencias de la conversión de efluentes residuales en ácidos orgánicos, que luego pueden ser utilizados como fuente de carbono para la producción de diversos compuestos con potencial económico, entre los cuales se encuentran los PHAs (Huschner et al., 2015b). Para fermentaciones con un aislamiento de Halomonas sp. a partir de efluentes residuales del procesamiento de leguminosas y frutas, Elain et al (2016) reportaron productividades de PHAs de 1,6 g/L y 1,8 g/L, respectivamente. Los subproductos del procesamiento de aceites vegetales son otro ejemplo de sustratos para la síntesis de PHAs, pues, debido a la variedad de triglicéridos que contienen, dan lugar a una mayor diversidad de polímeros que los azúcares simples. A partir de los subproductos del aceite de palma, por ejemplo, pueden producirse PHAs de cadena corta, media o mixtos. Entre los microorganismos estudiados como productores de PHAs en aceite de palma se encuentran Erwinia sp, Burkholderia cepacia, Chromobacterium sp y Cupriavidus necator (Sudesh et al., 2011). Yustinah et al (2019) reportaron contenidos de PHB de hasta 55% en base seca mediante fermentación con Bacillus cereus, utilizando un hidrolizado obtenido del fruto de la palma aceitera. Los subproductos agroindustriales de frutas son también evaluados como posibles sustratos para la producción de PHAs. Sukruansuwan & Napathorn (2018) estudiaron la producción de PHB por parte de Cupriavidus necator a partir de subproductos derivados del procesamiento de la piña. Vega-Castro et al (2016) reportaron la producción de PHAs 10 10 con Cupriavidus necator a partir de cáscaras de piña hidrolizadas. Además, se ha logrado producir PHAs de cadena media a partir de hidrolizados de pulpas de diversas frutas como cerezas, albaricoques y uvas, obteniéndose las mejores productividades para estas últimas (21,2 g/L de pulpa) mediante fermentación con Pseudomonas resinovorans (Follonier et al., 2014). Otros sustratos como bagazo de caña, cáscaras de naranja y cáscaras de banano han sido estudiados para la producción de PHAs empleando Halomonas campisalis. Aunque el microorganismo fue capaz de utilizar eficientemente todos los subproductos evaluados, la mejor productividad de los polímeros (47%) fue alcanzada al emplear el bagazo de caña (Kulkarni et al., 2015). 2.2.3. Potencial de los subproductos de banano como sustrato para la producción de PHAs El banano es uno de los principales productos agrícolas de Costa Rica, abarcando cerca del 10% del total de exportaciones del país (PROCOMER, 2016). La variedad Grand naine (Musa acuminata) es un cultivar del grupo Cavendish (AAA) y corresponde a la principal especie de banano producida en Costa Rica (Rojas- Garbanzo et al., 2018). Costa Rica se sitúa entre los tres primeros exportadores de esta fruta a nivel mundial. Cerca del 1% del territorio nacional se encuentra dedicado al cultivo de este producto, ubicándose la mayor extensión de plantaciones en la provincia de Limón (CORBANA, 2019). Como consecuencia de los altos volúmenes de producción, existe un importante impacto ambiental producto de los desechos generados durante las diversas etapas de la cosecha y el procesamiento del banano (Steiner, 2006). Los subproductos del procesamiento de frutas se encuentran disponibles en grandes cantidades; sin embargo, generalmente no suelen ser empleados como materias primas en procesos industriales 11 11 pese a la amplia variedad de sustancias biológicamente activas que contienen (Guylène et al., 2009). El encontrar opciones para el aprovechamiento del banano de rechazo y de los subproductos del procesamiento industrial de la fruta fresca es una preocupación nacional (Rojas- Garbanzo et al., 2018). Durante el año 2019 se exportaron 2 188 685 toneladas métricas de banano. Dicho volumen de exportaciones corresponde a cerca de un 85% de la producción total del país (CORBANA, 2019). A partir de este dato se estima que anualmente se generan aproximadamente 328 303 toneladas de banano de rechazo en las plantas empacadoras. Cerca de un 70% del banano de rechazo es aprovechado por industrias alimentarias y convertido en jugos o puré, y el restante 30% se destina a consumo de fruta fresca en el mercado nacional, alimentación animal o se desecha de manera inadecuada (Steiner, 2006). A partir del procesamiento del banano de rechazo de exportación se obtienen dos tipos de residuos: las cáscaras y el desecho de pulpa, que contiene la vena central y las semillas. Suponiendo un aprovechamiento de al menos el 50% del banano rechazado por parte de la agroindustria, el volumen de residuos generados mensualmente podría oscilar entre las 301 y las 559 toneladas (Rojas- Garbanzo et al., 2018). La pulpa de banano maduro constituye una materia prima atractiva como sustrato de fermentación microbiana por su alto contenido de azúcares disponibles como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y arabinosa (G. A. Pereira et al., 2018) . El Cuadro 1 muestra la composición de este producto. 12 12 Cuadro 1. Composición nutricional de la pulpa de banano maduro (M. acuminata Colla) Componente Contenido (en 100g de peso fresco) Carbohidratos (g) 21 - 23 Azúcares totales (g) 12.23 Proteína (g) 1.1 Lípidos (g) 0.3 Minerales Sodio (mg) 1 Potasio (mg) 358-385 Calcio (mg) 5-8 Magnesio (mg) 27-30 Fósforo (mg) 22 Hierro (mg) 0.26-0.42 Cobre (mg) 0.11 Zinc (mg) 0.15-0.18 Manganeso (mg) 0.2 Vitaminas Vitamina E (mg) 0.1-0.2 Vitamina A (μg) 64 Vitamina C (mg) 8.7-11.7 Tiamina (mg) 0.03-0.04 Riboflavina (mg) 0.07 Niacina (mg) 0.61-0.66 Ácido Pantoténico (mg) 0.28 Vitamina B6 (mg) 0.36-0.47 Folatos (µg) 20-23 Biotina (µg) 2.6 Aminoácidos Isoleucina (mg) 34 Leucina (mg) 71 Lisina (mg) 50 Metionina (mg) 14 Cistina (mg) 20 Fenilalanina (mg) 41 Tirosina (mg) 26 Treonina (mg) 36 Triptófano (mg) 13 Valina (mg) 49 Arginina (mg) 57 Histidina (mg) 86 Alanina (mg) 43 Ácido aspártico (mg) 120 Ácido glutámico (mg) 115 Glicina (mg) 41 Prolina (mg) 43 Serina (mg) 49 Fuente: Guylène Aurore et al (2009) y Pareek (2016) 13 13 2.3. Polihidroxialcanoatos (PHAs): aspectos generales 2.3.1. Propiedades de los PHAs Los polihidroxialcanoatos (PHAs) están conformados por monómeros de ácidos grasos hidroxilados, formando un poliéster lineal de masa molecular de entre 2x105 y 3x106 Da. Su peso molecular depende de factores del proceso de producción, como: microorganismo productor, composición del sustrato, estado del inóculo bacteriano, condiciones de cultivo y operaciones de extracción y purificación (Rai et al., 2011). Los PHAs cuentan con un grupo alquilo (R) enlazado al C-3, cuyo número de carbonos varía entre 1 y 14 (Figura 1). La longitud de este grupo da lugar a la clasificación de los PHAs en dos categorías: de cadena corta, con 5 carbonos o menos, y de cadena media, que contienen de 6 a 14 carbonos (Atlić et al., 2011b; Suriyamongkol et al., 2007). Figura 1. Estructura química general de los polihidroxialcanoatos (PHAs) R1 y R2: grupos alquilo. X: 1-4. n: 100-30000 Fuente: Leong et al (2014) Las propiedades físicas de los PHAs como temperatura de transición vítrea, punto de fusión y cristalinidad están determinadas por la longitud de su cadena lateral y el tipo de grupo funcional que presenta. Dentro de la célula, los PHAs se encuentran en un estado fluido y amorfo; sin embargo, las operaciones de recuperación convierten el polímero a un estado cristalino (Akaraonye et al., 2010). 14 14 Desde su descubrimiento en 1920, se han identificado más de 150 distintos monómeros que pueden incorporarse en un PHA. Las variaciones en la composición de los monómeros determinan las propiedades del material, originando polímeros aptos para diversas aplicaciones. Por esto, producto de investigación ha sido la identificación de sustratos de la PHA polimerasa y la caracterización de los bioplásticos producidos a partir de los mismos (Agnew & Pfleger, 2013). Dentro de los PHAs de cadena corta, el polihidroxibutirato (PHB), un homopolímero de ácido 3- hidroxibutírico (Figura 2), es uno de los bioplásticos más estudiados. Figura 2. Estructura química del polihidroxibutirato (PHB) Las propiedades mecánicas del PHB son comparables a las de los plásticos convencionales, pudiendo ser extruido, moldeado en fibras o películas o combinado con otros polímeros. Posee, además, otras propiedades deseables como: alta resistencia a la humedad, pureza óptica y baja permeabilidad al oxígeno (Khanna & Srivastava, 2005a). El PHB presenta un punto de fusión cercano a los 180 °C y una temperatura de transición vítrea de 4°C. Constituye un polímero altamente cristalino (55-80%), dando lugar a materiales de alta fragilidad y rigidez. Estas propiedades pueden limitar sus aplicaciones, por lo cual es conveniente incorporar otros tipos de monómeros en la estructura del bioplástico. El hidroxivalerato (HV) resulta muy útil en este sentido, pues 15 15 permite mejorar las propiedades del material y ampliar el rango de temperaturas en las que éste puede ser procesado (Albuquerque et al., 2011). A diferencia de otros plásticos biodegradables, el PHB es completamente degradable por acción microbiana, produciéndose agua y dióxido de carbono en condiciones aerobias, o bien, metano mediante fermentación anaerobia. Las propiedades del polímero, así como las condiciones de humedad, temperatura y pH impactan la velocidad de degradación. En ambientes naturales, los microorganismos degradan el polímero por la acción de las PHA despolimerasas extracelulares (Akaraonye et al., 2010). 2.3.2. Comercialización de los PHAs Las primeras iniciativas de comercialización de los PHAs ocurrieron cerca de 1960 al desarrollarse un proceso de producción bacteriana de poli-3-hidroxibutirato (P(3HB)) por parte de WR Grace & Compañía; sin embargo, su aplicación fue limitada dada la baja eficiencia de producción y extracción del polímero. Posteriormente, la empresa Imperial Chemical Industries Ltd. comercializó el copolímero P(3HB-co-3HV) con el nombre comercial de BiopolTM para luego vender la tecnología a Monsanto y, más tarde, a Metabolix (Laycock et al., 2013). A partir de ese momento, algunas compañías, como BASF (Alemania), ADM, P&G y Meredian (Estados Unidos) y Biocycles (Brasil) implementaron procesos productivos para estos bioplásticos y los comercializaron como materiales crudos o en forma de productos terminados (Chen, 2009). Pese a estas iniciativas, el uso de productos de PHAs no se ha generalizado dado su elevado costo. Al ser un polímero intracelular, se requieren operaciones para la lisis celular y su extracción. Además, la selección de sustratos y las limitadas productividades logradas plantean un reto para el diseño de procesos rentables. Por esto, muchos 16 16 esfuerzos se dirigen a la aplicación de biología sintética a la síntesis de PHAs, a fin de identificar las vías metabólicas involucradas y trasladarlas a microorganismos más manejables que permitan obtener altas productividades y en los que las operaciones de purificación puedan simplificarse (Agnew & Pfleger, 2013). A corto plazo, los usos más promisorios para los PHAs parecen encontrarse en la industria médica, farmacéutica y de biomateriales (Sirohi et al., 2020) debido a que este sector industrial tiene la posibilidad de incorporar el alto costo del polímero en sus productos y a las atractivas características que presentan estos materiales en cuanto a biocompatibilidad, biodegradabilidad, pureza enantiomérica, insolubilidad en agua, baja toxicidad y facilidad de procesamiento (Leong et al., 2014). Se han desarrollado aplicaciones de los PHAs en nichos de mercado donde el consumidor está anuente a asumir un mayor costo por un producto biodegradable. Por ejemplo, la compañía Metabolix ha tenido éxito al incorporar su bioplástico MirelTM en contenedores para jardinería, empaques y juguetes eco amigables, aun cuando el costo del material oscila entre $2.25 y $2.75 por libra, muy por encima del valor de $0.75/lb de un análogo como el polipropileno (Agnew & Pfleger, 2013; Gholami et al., 2016). 2.3.3. Síntesis microbiana de los PHAs Los PHAs son sintetizados intracelularmente por numerosas bacterias, tanto Gram negativas como Gram positivas (Mostafa et al., 2020; Pati et al., 2020). La capacidad de almacenar este tipo de polímero confiere una ventaja ecológica, pues aumenta su probabilidad de supervivencia ante el estrés nutricional, térmico u osmótico (Castro- Sowinski et al., 2010). 17 17 La estructura, propiedades fisicoquímicas y composición de los monómeros de PHA varían de acuerdo con el microorganismo que lo produce. El polímero es almacenado en forma de cuerpos de inclusión lipídicos, con dimensiones entre los 0,2 y 0,5 μm (Suriyamongkol et al., 2007; Urtuvia et al., 2014). Se conocen al menos 75 géneros de bacterias productoras de PHB (Koller et al., 2010), siendo Cupriavidus necator una de las especies más estudiadas (Cavalheiro et al., 2009). Entre los microorganismos reportados como productores están: Bacillus megaterium (Gouda et al., 2001; Kulpreecha et al., 2009), Bacillus cereus (Valappil et al., 2007), Halomonas campisalis (Kulkarni et al., 2015), Rhodobacter sphaeroides (Sangkharak & Prasertsan, 2007), Rhodopseudomonas palustris y Azohydromonas lata (Ugwu et al., 2011). Los PHAs son acumulados intracelularmente a manera de reserva de energía (Cesário et al., 2014; Pakalapati et al., 2018). En la mayoría de los microorganismos, la acumulación es inducida cuando la célula experimenta condiciones de estrés debido a un desbalance nutricional (Amini et al., 2020), típicamente un exceso de fuente de carbono acompañada de limitación en otros elementos como nitrógeno, magnesio, oxígeno, azufre o fósforo (Castro-Sowinski et al., 2010; Getachew & Woldesenbet, 2016; Grousseau et al., 2014c; Salehizadeh & Van Loosdrecht, 2004). Sin embargo, ciertos grupos de microorganismos acumulan PHAs durante su fase de crecimiento exponencial, sin que dicha síntesis dependa de un desbalance nutricional. En este grupo pueden mencionarse: Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas sp y algunas cepas recombinantes de Escherichia coli (Khanna & Srivastava, 2005b; Koller et al., 2010; Leong et al., 2014). Por lo tanto, la estrategia de fermentación seleccionada para el proceso de producción de los PHAs debería considerar los requerimientos particulares del microorganismo a utilizar. 18 18 La bioprospección de microorganismos productores de PHB requiere el muestreo de diversos ambientes, como: suelos, aguas y lodos. El aislamiento se realiza incubando la muestra en un caldo rico en minerales y carbono, pero reducido en nitrógeno. El cultivo es inoculado en agar con una composición similar a la del caldo de enriquecimiento. (Alias & Tan, 2005). Preliminarmente, es posible diferenciar las cepas productoras de PHB adicionando al medio con agar algún colorante fluorescente adecuado para el polímero; por ejemplo, el Rojo Nilo en una concentración de 5 µg/mL. Las colonias productoras son visibles bajo luz ultravioleta. Estas colonias pueden recuperarse para estudiar su productividad cuantitativamente (Amirul et al., 2008). En el Cuadro 2 se resumen algunos de los microorganismos productores de PHB estudiados en diversas investigaciones, ejemplificando también cómo la síntesis de PHAs resulta factible a partir de sustratos agroindustriales variados. 19 19 Cuadro 2. Ejemplos de microorganismos y sustratos agroindustriales reportados en la literatura para la producción de PHB Sustrato Microorganismo Productividad máxima PHB Referencia Algas marinas (Sargassum sp) Cupriavidus necator (PTCC 1615) 74% (Azizi et al., 2017) Trigo (paja) Burkholderia sacchari DSM 17165 72% (Cesário et al., 2014) Suero lácteo Escherichia coli (modificada) 85% (Pais et al., 2009) Melaza fermentada / Ácidos grasos volátiles Cultivo mixto 56% (Albuquerque et al., 2011) Hidrolizado de celulosa Escherichia coli (modificada) 21% (Matsumoto et al., 2011) Hidrolizado de almidón de yuca Cupriavidus necator (KKU38) 61% (Poomipuk et al., 2014) Hidrolizado de aserrín Brevundimonas vesicularis y Sphingopyxis macrogoltabida 64 -72% (Silva et al., 2007) Hidrolizado de bagazo de caña Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha) 57% (Yu & Stahl, 2008) Glicerol crudo Cultivo mixto 67% (Dobroth et al., 2011) El uso de cepas recombinantes de E. coli para la síntesis de PHAs es una línea de investigación importante, gracias a la experiencia acumulada para el cultivo de este microorganismo. Esta bacteria utiliza diversas fuentes de carbono, pudiendo sintetizar una gran variedad de PHAs a partir de las mismas. Además, es un microorganismo de rápido crecimiento y capaz de acumular concentraciones de los polímeros de hasta 80- 90% en base seca. Otras ventajas del uso de E. coli son: la disponibilidad de procedimientos de recuperación y el hecho de que, contrario a lo que ocurre al emplear microorganismos que son productores naturales, no ocurre degradación del producto debido a la ausencia de despolimerasas intracelulares (Leong et al., 2014). 20 20 Otro enfoque relacionado con la producción bacteriana de PHAs es el uso de cultivos microbianos mixtos y sistemas de fermentación abiertos. Este tipo de proceso es una alternativa para desarrollar tecnologías más económicas para la producción de PHAs con respecto a aquellas en los que se emplean cultivos puros (Gumel et al., 2013). 2.3.3.1. Síntesis de PHB en Cupriavidus necator Cupriavidus necator es una bacteria Gram negativa y aerobia estricta, conocida por su capacidad de sintetizar concentraciones de PHB de hasta un 80 -90% de su peso seco, empleando fuentes de carbono simples como glucosa, fructosa, alcoholes y ácidos orgánicos (Jung et al., 2010). Posee cualidades no patogénicas, biocompatibles y tiene resistencia a ciertos compuestos tóxicos presentes en los subproductos agroindustriales. Además, C. necator es capaz de crecer y producir PHAs de manera autotrófica, utilizando CO2, H2 y O2 como sustratos principales (Brigham et al., 2012). Este microorganismo ha sido reclasificado en varias ocasiones, siendo anteriormente conocido como Hydrogenomonas sp, Alcaligenes eutrophus y Ralstonia eutropha. Más recientemente se ha encontrado en la literatura con la denominación Wautersia eutropha y, posteriormente, con la de Cupriavidus necator (Franz et al., 2011). La ruta biosintética del PHB involucra tres diferentes enzimas localizadas en el citosol de la célula, donde ocurre la acumulación de PHB. El acetil-CoA es el primer sustrato del sistema enzimático. En C. necator, la enzima β-cetotiolasa, codificada por el gen phbA, condensa dos moléculas de acetil-coA para formar acetoacil-coA. Una reductasa de acetoacil-co-A, dependiente de NADPH y codificada por el gen phbB, convierte este intermediario en 3-hidroxibutiril-co-A. El paso final de la síntesis es una reacción de polimerización catalizada por la enzima PHB-sintasa, codificada por el gen phbC. La 21 21 PHB-sintasa de C. necator reacciona con un rango limitado de sustratos con cadenas de entre 3 y 5 carbonos, con preferencia por cadenas de 4 carbonos. Por esto, los PHAs obtenidos por esta vía contienen monómeros de cadena corta (Khanna & Srivastava, 2005a; Park et al., 2011; Suriyamongkol et al., 2007). En condiciones nutricionales balanceadas, el acetil-CoA es dirigido al ciclo del ácido tricarboxílico (ATC) y el CoA resultante actúa como inhibidor de la actividad de la β- cetotiolasa, bloqueando la síntesis del PHB. Al ocurrir un desbalance nutricional, la concentración de NADPH aumenta, inhibiendo la actividad de las enzimas citrato sintasa e isocitrato deshidrogenasa, las cuales están involucradas en el ciclo del ATC. Producto de esto, el acetil-CoA no utilizado empieza a acumularse. La biosíntesis del PHB se dispara cuando los niveles de acetil-CoA aumentan hasta el punto en que se logra sobrepasar la inhibición de la β-cetotiolasa (Poomipuk et al., 2014). La ruta biosintética del PHB es una ruta metabólica dedicada, es decir, que no es utilizada para la síntesis de otros metabolitos. Una excepción se da cuando hay presencia de propionato en el sustrato de fermentación, lo cual lleva a la producción de 3- hidroxivalerato. Existen numerosos microorganismos capaces de sintetizar un copolímero de 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato (3HB-co-3HV), con propiedades mecánicas más versátiles y menos quebradizas que las del polímero de PHB (Agnew & Pfleger, 2013; Chanprateep, 2010). La ruta metabólica involucrada en la síntesis del polímero se ilustra en la Figura 3. 22 22 Figura 3. Ruta metabólica para la síntesis de PHB y P(HB-HV) en Cupriavidus necator Fuente: Suriyamongkol et al (2007) Además de las enzimas ya mencionadas, se ha encontrado que un grupo de proteínas fascinas (PhaPs) interviene en la organización de los gránulos de PHAs. Dichas proteínas se asocian con la superficie de los gránulos, siendo indispensables para su coalescencia y su estabilidad, así como para la síntesis de los polímeros (Castro- Sowinski et al., 2010). C. necator suele acumular intracelularmente entre 8 y 13 gránulos de PHAs. Debido a su capacidad de refracción, los gránulos de PHAs pueden observarse en un microscopio con contraste de fases al realizar una tinción con Negro Sudán II. Además, Ácido propiónico ATP+CoASH Acil-CoA sintasa AMP+PA Propionil Co-A Co-ASH 3-cetovaleril Co-A NADPH+H+ NADP+ (R)-3-hidroxivaleril-CoA Co-ASH P(HB-HV) Glucosa Acetil Co-A (2x) Acetoacil Co-A β-cetotiolasa (phaA) Co-ASH 3-cetotiolasa (bktB) (1x) Acetoacil CoA reductasa (phaB) NADPH+H+ NADP+ (R)-3-hidroxibutiril-CoA PHB Co-ASH 23 23 estas inclusiones muestran fluorescencia de color naranja al ser teñidos con Azul Nilo A y observados a una longitud de onda de excitación de 460 nm (Leong et al., 2014). 2.4. Procesos fermentativos para la producción de PHAs El desarrollo de una fermentación para la producción de PHAs incluye la selección de la cepa, el estudio de la fermentación a escala de laboratorio, la optimización del proceso en biorreactores a escala de laboratorio y piloto y, finalmente, el escalamiento industrial. La obtención de una buena productividad de PHAs depende de varios factores como: la densidad de biomasa, el precio y disponibilidad del sustrato y el costo y la conveniencia del método de extracción (Chen, 2009). La Figura 4 presenta un ejemplo de las operaciones comúnmente utilizadas en un proceso de producción de PHAs. Figura 4. Proceso de fermentación, recuperación y purificación para la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) Fuente: G.-Q. Chen (2010) Fermentación (escala laboratorio) Escalamiento Fermentación (escala industrial) Precipitación biomasa Filtración Secado Pulverización Extracción Ultrafiltración Secado Producto final 24 24 Para la producción de PHAs con cultivos puros suelen utilizarse fermentaciones en lote con dos etapas. En la primera, el inóculo es introducido en un medio con una composición tal que promueva la obtención de una alta densidad celular. En la segunda etapa, un nutriente esencial (usualmente N, P u O2) es limitado, generando condiciones de estrés e incentivando la síntesis del polímero (Keshavarz & Roy, 2010; Laycock et al., 2013). Varios autores han reportado mejoras en la producción de PHAs al usar fermentaciones de tipo lote alimentado, con respecto a otros sistemas (M. Li & Wilkins, 2020; Nygaard et al., 2021; Xia et al., 2017). Huschner et al (2015) diseñaron un sistema de fermentación de tipo lote alimentado en tres etapas para C. necator, suministrando ácidos orgánicos derivados del procesamiento de aceite de palma como única fuente de carbono. La etapa de crecimiento de biomasa abarcó 16 h de cultivo y se empleó una relación C/N de 10. Posteriormente, la concentración de los ácidos orgánicos en la solución de alimentación fue modificada para obtener C/N de 90, la cual se mantuvo hasta las 36 h de fermentación, incentivándose en esta etapa una baja tasa de crecimiento de biomasa residual y una activación del metabolismo para mejorar la productividad de PHAs. Finalmente, durante la tercera etapa se suprimió el suministro de nitrógeno con el fin de detener el crecimiento celular y favorecer un aumento en la acumulación del polímero. Mediante fermentación de tipo lote alimentado, Hafuka et al (2011) investigaron el efecto de distintos regímenes de alimentación en la acumulación de biomasa y la síntesis de PHB por parte de C. necator H16 (ATCC 17699) empleando como sustrato un filtrado proveniente de la fermentación de residuos de alimentos preparados. En el primer régimen, la totalidad del sustrato se adicionó al biorreactor al inicio de la 25 25 fermentación. Para el segundo régimen, la alimentación del sustrato se realizó por pulsos. Finalmente, en el tercer régimen, se empleó un sistema de alimentación continuo. La mayor producción de biomasa se obtuvo al alimentar el biorreactor en un único pulso. Sin embargo, las máximas concentraciones de PHB se lograron mediante los regímenes de alimentación en varios pulsos y continuo. Mientras que al emplear procesos fermentativos por lote alimentado suele obtenerse un mayor rendimiento de biomasa y PHB, los procesos continuos pueden resultar ventajosos en algunas ocasiones debido a que los períodos operativos más extensos podrían contribuir a reducir los costos de producción (Franz et al., 2011). 2.5. Extracción y cuantificación de PHB La cromatografía de gases constituye el método de análisis instrumental por excelencia para la determinación de ácidos grasos. Este tipo de análisis no es aplicado directamente sobre dichos ácidos grasos, sino sobre sus ésteres, tales como metil, isopropil y butil ésteres, ya que de este modo se logra mejorar tanto la exactitud como la selectividad del análisis. Los metil ésteres constituyen el derivado lipídico más frecuentemente preparado a partir de muestras biológicas. Esto se debe a que se requieren temperaturas menores para su volatilización, lo cual contribuye a mejorar la forma del pico y la resolución entre señales (Carrapiso & García, 2000). El detector de ionización de flama (FID) es frecuentemente utilizado para este tipo de análisis debido a que permite una cuantificación precisa de los derivados de los ácidos grasos, entre ellos, los metil ésteres. Durante la metilación, los lípidos O-acilo y N-acilo son transesterificados en presencia de un catalizador (usualmente ácido clorhídrico o sulfúrico) y un alcohol de cadena corta, por ejemplo, metanol, etanol o 2- 26 26 propanol. Los metil ésteres de los ácidos grasos pueden ser preparados ya sea a partir de lípidos aislados o directamente a partir de matrices como material vegetal, fluidos o células cultivadas, siendo posible de esta manera combinar el procedimiento de extracción y la transesterificación en un solo paso (Cruz-Hernández & Destaillats, 2012). La extracción de PHAs presentes en caldos de fermentación requiere la cosecha de la biomasa bacteriana mediante centrifugación. En ocasiones, dicha biomasa es desecada o liofilizada previo al procedimiento de extracción. El tratamiento de biomasa mediante metanólisis ácida para la extracción de PHB se encuentra reportado en la literatura (Albuquerque et al., 2010; Dalal et al., 2010; Davis et al., 2013). La hidrólisis ácida permite la ruptura de los enlaces éster, tanto de la cubierta cristalina como del centro amorfo de los gránulos de PHB. Se considera que un tiempo de incubación de 4 h a 100°C resulta suficiente para la extracción del polímero a partir de muestras de biomasa, empleando una relación de alcohol y ácido de 3:1. Los tiempos de hidrólisis del polímero de PHB aumentan conforme disminuye la concentración de ácido (Werker et al., 2008). La ruptura celular, la hidrólisis del polímero y la síntesis de los metil ésteres a partir de los monómeros generados ocurre durante la metanólisis ácida. Experimentalmente, esta metodología implica la adición de una solución de ácido sulfúrico en metanol a las muestras de biomasa, en concentraciones que pueden variar entre 3% y 20% y su incubación en condiciones de agitación y alta temperatura. Las temperaturas reportadas para la metanólisis en la literatura varían entre 90°C y 100 °C, mientras que los tiempos de incubación oscilan entre las 2 y las 3,5 horas (Divyashree et al., 2009; Dobroth et al., 2011; Pieja et al., 2011; Purama et al., 2018; Wu et al., 2012). 27 27 Después de la metanólisis, la extracción de los metil-ésteres se realiza adicionando un solvente, por lo general cloroformo, y agua. Después de la separación de las fases acuosa y orgánica, esta última es extraída para su análisis por CG (Werker et al., 2008). En el Cuadro 3 se resumen algunos estudios en los cuales la cromatografía de gases ha sido aplicada para la cuantificación de PHB y otros polihidroxialcanoatos. Es factible la utilización de estándares distintos a los detallados en el Cuadro 3 para la ejecución de este análisis, entre ellos: PHB (B.-Y. Chen et al., 2012; Divyashree et al., 2009; Johnson et al., 2009), polihidroxibutirato-co-hidroxivalerato P(HB-co-HV) (Albuquerque et al., 2010; Divyashree et al., 2009) y Ácido poli-3 hidroxibutírico (Liu et al., 2011). 28 28 Cuadro 3. Ejemplos de condiciones de análisis para la cuantificación de PHB por Cromatografía de Gases, reportados en la literatura Columna Condiciones Estándar Referencia DB-WAXetr (30 m x 0,35 mm con grosor de 0.1 µm Gas: N2, 3 mL/min T inyección y detección: 250 °C Programa T: 80°C por 4 min e incrementos de 8°C/min a 160 °C Detección FID Metil (R)-3 hidroxi butirato (Wu et al., 2012) INNOWAX 19095N - 123 Gas: Helio 25 mL/min T inyección: 50 ° T detección: 250 °C Programa T: 90 °C por 0,1 min, incremento gradual a 150 °C (5 min) y 210°C (5 min) Detección FID Propil ésteres PHAs (Çığgın et al., 2009) HP-Innowax (30 m x 0,25 mm, 0,5 mm grosor Gas Helio: 1,8 mL/min Programa T: 110 °C (5 min), incrementos de 3 °C/min hasta 130 °C e incrementos de 5°C/min a 250 °C Detección FID y MS Ácidos 3-hidroxi alcanoicos (metilados) (Davis et al., 2013) ZB1 Phenomenex (30 m x 0.25 mm) Gas: Helio 1,2 mL/min Programa T: 40 °C (2 min), aumento de 5 °C/min hasta 200 °C Detección MS No aplica (Dobroth et al., 2011) HP-Innowax Detección FID PHB (propil ésteres) (Moralejo-Gárate et al., 2013) BP21 Gas: N2, 35,5 mL/min T inyección: 170 °C T detección: 190 °C T horno: 90 °C Detección FID Metil ésteres del ácido 3-hidroxi butírico (Kulkarni et al., 2010) HP-5 Detección FID Sal de sodio del ácido DL-β-hidroxi butírico (Pieja et al., 2011) 29 29 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo General Evaluar la idoneidad de un subproducto del procesamiento del banano como suplemento nutricional en la implementación de un proceso fermentativo para la producción de polihidroxibutirato (PHB), empleando al menos una cepa de la bacteria Cupriavidus necator. 3.1.1. Objetivos Específicos 1. Definir un método de análisis para la detección y cuantificación de polihidroxibutirato (PHB) a partir de biomasa bacteriana. 2. Comparar la capacidad de producción de PHB de distintas cepas bacterianas nativas, así como de una cepa control de Cupriavidus necator empleando un medio de cultivo químicamente definido, con el fin de seleccionar aquella cepa que presente el mejor rendimiento de PHB. 3. Diseñar un medio de cultivo para la producción de biomasa bacteriana productora de PHB, suplementando el mismo con cloruro de amonio como fuente de nitrógeno y con un subproducto del procesamiento de banano como fuente de carbono, con el fin de buscar una alternativa para el aprovechamiento de este residuo. 4. Implementar un proceso de fermentación para realizarse en un biorreactor de 5 litros, utilizando el medio de cultivo diseñado previamente y la cepa bacteriana que presente el mejor rendimiento de PHB. 30 30 4. METODOLOGÍA 4.1. Localización del proyecto Las actividades correspondientes a los objetivos 1, 2 y 3 se realizaron en los laboratorios de Microbiología y de Química y en la Planta Piloto del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA) de la Universidad de Costa Rica. Las actividades del objetivo 4 se ejecutaron en las instalaciones del Centro Nacional de Innovaciones Biotecnológicas (CENIBiot). 4.2. Subproducto de banano El residuo que se evaluó en el proyecto fue suministrado por la empresa Mundimar, ubicada en Guápiles, Limón. Luego de las operaciones de pelado, molienda y filtrado del banano durante el proceso de producción de la pulpa, se obtuvo un subproducto que consistió en un puré con un alto contenido de semillas, retenido en el último tamiz del proceso agroindustrial. Para este proyecto, se trabajó con este último retenido del proceso (Thompson, 2015). El residuo de puré de banano y sus semillas fue sometido a un tratamiento de maceración enzimático con el complejo Crystalzyme® PMLX (White Labs) con actividad pectinasa, celulasa y hemicelulasa y, posteriormente, a un prensado con una prensa neumática para obtener un jugo de banano a 20° Brix y pH 3,6, siguiendo el proceso desarrollado por Thompson (2015). El jugo del subproducto de banano (JSB) se utilizó como suplemento para el objetivo 3. Los detalles de rendimiento del jugo obtenido se muestran en la Figura 5. 31 31 Figura 5. Diagrama del procedimiento para la obtención del jugo de subproducto de banano (JSB). Fuente: ( Thompson, 2015) La caracterización química del JSB, realizada por los Laboratorios de Química del CITA y el CINA, se detalla en el Cuadro 4. El jugo se empacó en bolsas y se conservó en congelación a -20°C para su uso posterior en el estudio. Residuo de puré y semillas de banano (100 kg) TRATAMIENTO ENZIMÁTICO PRENSADO Residuo de prensado (24,3 kg) Jugo (75,7 kg) 20 °Brix, pH 3,6 21,5 g sólidos totales/ 100 g jugo 32 32 Cuadro 4. Composición del jugo proveniente del subproducto de banano (JSB) Componente Concentración Método de análisis Laboratorio responsable Sacarosa (g/ 100 g) 1,88 ± 0,04 HPLC, columna Zorbax Carbohydrate CITA-UCR Glucosa (g/ 100 g) 6,97 ± 0,45 CITA-UCR Fructosa (g/ 100 g) 6,75 ± 0,43 CITA-UCR Nitrógeno (g/ 100 g) 0,056 ± 0,001 920.152 AOAC 2012 CITA-UCR Calcio (mg/ 100 g) 11,62 ± 0,39 985.35 AOAC 2012 CITA-UCR Sodio (mg/ 100 g) 0,64 ± 0,04 CITA-UCR Potasio (mg/ 100 g) 214,48 ± 6,3 CITA-UCR Hierro (mg/ 100 g) 0,07 ± 0,002 CITA-UCR Magnesio (mg/ kg) 305,76 ± 2,02 AOAC 975.03, AOAC 985.35 CINA-UCR Fósforo (mg/ kg) 258,85 ± 20,95 AOAC 965.17, AOAC 986.24 CINA-UCR Azufre (g/ 100 g) 1,38 ± 0,01 AOAC 924.06/924.27 CINA-UCR 4.3. Microorganismos 4.3.1. Cepas bacterianas Como microorganismo de referencia para la producción de PHB se utilizó la cepa Cupriavidus necator (ATCC 17699). Las cepas bacterianas nativas evaluadas en el presente estudio fueron proporcionadas por el Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM) a partir de su colección proveniente de diversas localidades costarricenses. Las bacterias evaluadas se cultivaron inicialmente en agar M9 (Na2HPO4 12,8 g/L; K2HPO4 3 g/L; NaCl 0,5 g/L; NH4Cl 1 g/L; Glucosa 20% 20 mL; MgSO4 1M 2 mL; CaCl2 1M 0,1 mL y tiamina 0,5% 0,1 mL). Para la evaluación presuntiva de su capacidad de síntesis de PHB, los aislamientos se sometieron a una tinción con azul de Nilo y se 33 33 observaron al microscopio de fluorescencia (Leong et al., 2014; Ostle & Holt, 1982; Poomipuk et al., 2014). Las cepas que presentaron fluorescencia fueron identificadas mediante secuenciación de los genes ribosomales 16S. Las actividades anteriores fueron realizadas por personal del CIBCM. El Cuadro 5 muestra los códigos asignados a las cepas bacterianas evaluadas en su capacidad de producción de PHB en medio sintético. Cuadro 5. Cepas bacterianas evaluadas en su capacidad de producción de PHB Código Cepa Procedencia Características CR-12 Suelos bananeros Coco bacilos Gram - M1-103B No. 14 Aguas Claras, Upala Coco bacilos Gram - M3-104 BB No. 6B La Verbena, Upala Bacilos Gram - M5-103 NO.17 Guatuso Bacilos Gram - M2-103 NO.8 Aguas Claras, Upala Coco bacilos Gram - M4-103 NO.4 La Verbena, Upala Bacilos Gram - M5-104-A NO.9 Guatuso Bacilos Gram - 52-102-C Origen desconocido Coco bacilos Gram - 52-102-A Origen desconocido Coco bacilos Gram - M2-103-A Aguas Claras, Upala Coco bacilos Gram - M4-103 La Verbena, Upala Bacilos Gram - 4.3.2. Conservación de microorganismos Tanto para su conservación como para contar con inóculos de trabajo, cada cepa se cultivó durante 24 h a 30 °C en 2 placas de Agar Tripticasa Soya (TSA). El crecimiento bacteriano se transfirió a un tubo con 40 mL de Caldo Tripticasa Soya (TSB) y se homogenizó con un agitador vortex, hasta lograr una concentración equivalente al estándar 4 de Mc Farland. La suspensión se distribuyó en porciones de 800 µL en crioviales con 200 µL de glicerol estéril (Tedeschi & De Paoli, 2011). Los crioviales se almacenaron a -20 °C hasta su uso. 34 34 4.4. Definición del método de análisis para la cuantificación de polihidroxibutirato (PHB) Se utilizó cromatografía de gases (CG) como método para la detección y cuantificación de los metil-ésteres del ácido 3-hidroxialcanoico (Cavalheiro et al., 2009; Davis et al., 2013; García et al., 2013; Johnson et al., 2009). 4.4.1. Equipo y condiciones Tanto para la implementación del método de cuantificación de PHB como para el análisis de muestras correspondientes al objetivo específico 2, se utilizó el cromatógrafo de gases GC-2014 (Shimadzu), con un detector de ionización de llama (FID, por sus siglas en inglés) (Albuquerque et al., 2010; Grousseau et al., 2014a; Moralejo-Gárate et al., 2013). La captura de los datos se llevó a cabo empleando el software GC Solution (Shimadzu). Para el análisis de las muestras de fermentación asociadas al objetivo específico 4, la lectura fue realizada en un cromatógrafo 7820A (Agilent Technologies), acoplado a un detector de masas 5977B MSD (Agilent Technologies). Se empleó la columna HP-Innowax, con longitud de 30 m, diámetro interno de 0,25 mm y espesor de 0,25 µm (Ashby et al., 1998; Çığgın et al., 2009; Davis et al., 2013). Inicialmente, se tomó como base las condiciones de análisis propuestas por Davis et al (2013): volumen de inyección: 2 µL, relación “Split”: 20:1, gas acarreador: helio, flujo de gas: 8 mL/ min y temperatura del inyector y del detector: 250 °C. Se ejecutó un incremento de temperatura de la columna de 120 °C a 220 °C, con una velocidad de 3 °C/ min. 35 35 4.4.2. Preparación de curvas de calibración Para la detección y cuantificación del PHB se utilizó como estándar el Metil (R)-3 hidroxibutirato (Sigma®), con una pureza del 99% (Cavalheiro et al., 2009) y como estándar interno el ácido benzoico (Coats et al., 2008) con una pureza de 99,9%. a. Curva de calibración de Metil (R)-3 hidroxibutirato Para cada una de las curvas de calibración, en un balón aforado se prepararon 25 mL de una disolución madre de metil-3-hidroxibutirato (M3-HB) con una concentración aproximada de 8000 mg/L, en cloroformo. A partir de esta disolución, se preparó la curva de calibración de entre 8 y 13 puntos, en un rango de concentraciones de 80 a 6000 mg/L, aproximadamente. Se preparó un volumen de 1 mL de disolución para cada punto de la curva y se encapsuló cada vial rápidamente para evitar la volatilización del cloroformo, Los viales se conservaron a -20ºC cuando no se analizaron inmediatamente. b. Curva de calibración de ácido benzoico Se preparó una curva de calibración del ácido benzoico (Azizi et al., 2017; Coats et al., 2008), incluyendo entre 8 y 13 disoluciones con concentraciones entre 80 y 6000 mg/ L, aproximadamente por triplicado. Para cada uno de estos puntos, se pesó la masa del estándar correspondiente y se disolvió en 6 mL de solución de Metanol: Ácido sulfúrico (85:15). Las disoluciones se colocaron en viales de espacio de cabeza y se sellaron con tapa metálica y septo. Las disoluciones se sometieron a metanólisis ácida mediante el mismo procedimiento aplicado a las muestras de fermentación, detallado en el apartado 4.4.6. Las disoluciones se almacenaron a -20 °C hasta el momento del análisis. 36 36 4.4.3. Determinación de límites de detección y cuantificación Para el análisis de CG con detección FID, los límites de detección y cuantificación para el 3-MHB se calcularon a partir de tres repeticiones de las curvas de calibración elaboradas. Para esto, se seleccionaron los niveles de concentración bajos (0,08 g/L), medios (2,1 g/L) y altos (5,3 g/L) de las curvas de calibración y se calculó la desviación estándar (s) en cada uno de estos niveles. Estos tres puntos se ajustaron mediante un modelo lineal, donde “x” corresponde a la concentración y “y” a la desviación estándar. Se buscó la recta de mejor ajuste y se empleó la misma para hacer una extrapolación de s para una concentración de cero o blanco (s0). Este valor se multiplicó por 3 para obtener el límite de detección y por 10 para calcular el límite de cuantificación (Dejaegher et al., 2012; Eurachem, 2014; Standards Council of Canada, 2003) Para el análisis CG con detección de masas, los límites de detección y cuantificación se calcularon mediante la ejecución de una prueba de extinción (SAC-SINGLAS, 2012). Para esto, se preparó una disolución del estándar de Metil (R)-3 hidroxibutirato en cloroformo con una concentración de 0,098 g/L, correspondiente al punto más bajo de la curva de calibración realizada. Se realizaron diluciones de dicha disolución y se inyectaron en el cromatógrafo hasta obtener un pico con una altura apenas distinguible con respecto a la señal de ruido. Se calculó la relación señal ruido (S/N) empleando las alturas de los picos del estándar y del ruido. Como límite de detección se consideró la concentración correspondiente a la magnitud de la relación S/N multiplicada por 3. El límite de cuantificación se calculó a partir de un valor de 10 veces la relación S/N. 37 37 4.4.4. Determinación del porcentaje de recuperación del método Se emplearon los resultados de la cuantificación de ácido benzoico mediante CG- FID para calcular el porcentaje de recuperación de la metodología de extracción de PHB mediante metanólisis ácida (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) & Organización Mundial de la Salud (OMS), 2017). 4.4.5. Extracción de PHB a partir de caldos de fermentación Para evaluar la factibilidad de extraer PHB directamente a partir del caldo de fermentación (sin separación previa de la biomasa), varias muestras de 2 mL de caldo se sometieron al proceso de extracción por metanólisis. Se analizaron tres tipos de muestra: a) JSB puro; b) JSB con estándar de PHB (Sigma) añadido en una concentración de 5 g/L y c) cultivo de C. necator en medio suplementado con JSB. Para las muestras de fermentación, se optó por aplicar el proceso de extracción de PHB a partir de biomasa recuperada. Para esto, se midieron 2 mL del caldo de cultivo y se centrifugó en porciones de 1 mL en tubos para microcentrífuga a 10600 rcf (fuerza centrífuga relativa, por sus siglas en inglés) durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y se conservaron los botones celulares a -20ºC. Se resuspendieron los botones de cada muestra en 2 mL de agua destilada y se transfirieron a viales de espacio de cabeza. En cada vial con muestra se adicionaron 4 mL de una solución de ácido benzoico 2,4 g/L en metanol: ácido sulfúrico; 85:15 (Dalal et al., 2010). Se agregaron 2 mL adicionales de metanol: ácido sulfúrico a cada muestra. Los viales se sellaron con tapa metálica y septo y se colocaron en un baño termostático con agitación a 90 °C – 95 °C durante 3 h para el proceso de metanólisis (Cavalheiro et al., 2009; Davis et al., 2013; Dobroth et al., 2011; Wu et al., 2012). 38 38 Los viales se enfriaron completamente en un baño con hielo, para luego introducir con jeringa en cada uno 1,5 mL de agua destilada y 3 mL de cloroformo. Se agitaron vigorosamente y se colocaron boca abajo hasta observar una separación de fases. Con la ayuda de una jeringa con aguja, se pinchó el vial y se extrajo la fase orgánica (inferior). Se desecó el extracto sobre sulfato de sodio anhidro en un tubo para microcentrífuga (Coats et al., 2008) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 µm. Se encapsuló el filtrado en viales para CG con insertos. Las muestras se conservaron a -20°C en posición vertical hasta el momento del análisis. 4.4.6. Análisis de muestras Se realizó una inyección de tolueno para limpiar la columna antes de iniciar cada lote de análisis de muestras y como rutina de limpieza después de cada 5 inyecciones. Se llevó a cabo un ajuste de cero para lograr la estabilización de la línea base y se utilizó la función de inyección automática del equipo. Se corrieron las muestras de la curva de calibración durante 11 minutos dada la pureza de la disolución. Las muestras de fermentación se corrieron por 18,3 minutos para asegurar la salida de posibles residuos. 4.5. Comparación de la capacidad de producción de PHB de distintas cepas bacterianas La producción de PHB, tanto para la cepa de referencia como para las cepas nativas, se evaluó en un medio químicamente definido basado en la composición propuesta por Khanna & Srivastava (2005b), con la modificación de que como fuente de nitrógeno se 39 39 empleó NH4Cl a una concentración de 5 g/L. La composición de este caldo se detalla en el Cuadro 6. Cuadro 6. Caldo de cultivo empleado para la evaluación de la producción de PHB por parte de las distintas cepas bacterianas Componente Concentración Fructosa 40 g/L NH4Cl 5 g/L KH2PO4 1,5 g/L NaH2PO4 4 g/L MgSO4 * 7H2O 0,51 g/L CaCl2 0,02 g/L Solución trazas 1 mL/L Composición sol trazas ZnSO4* 7H2O: 13 mg/L, FeSO4* 7 H2O: 2 mg/L, (NH4)6Mo7O24 * 4H2O: 6 mg/L, H3BO3: 6 mg/L Las fermentaciones se llevaron a cabo en dos etapas: la primera para la producción de biomasa en un caldo nutritivo, y la segunda para inducir la producción de PHB en un caldo rico en carbono y con cierta limitación de nitrógeno (Amirul et al., 2008; El-Sayed et al., 2009; Garcia-Gonzalez et al., 2015; Khanna & Srivastava, 2005b; Yang et al., 2010). Para la primera etapa de la fermentación, se inoculó 1 mL del cultivo previamente congelado en crioviales en 50 mL de Caldo Tripticasa Soya (TSB, por sus siglas en inglés). Se incubaron los cultivos durante 24 h a 30 °C y 150 rpm. Después de la incubación, se verificó la pureza de cada cultivo mediante tinción de Gram. Se realizó un recuento de células viables de acuerdo con los lineamientos proporcionados por FDA 40 40 (Maturin & Peeler, 2001) para determinar la concentración de biomasa al final de la primera etapa de fermentación. El cultivo en TSB se transfirió asépticamente a tubos y se centrifugó a 3320 rcf durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y cada botón de biomasa se suspendió en 50 mL del medio de producción de PHB detallado en el Cuadro 6 y se transfirió a un matraz estéril. El cultivo se incubó nuevamente a 30 °C, con agitación a 150 rpm durante 48 h. Se centrifugaron porciones de 1 mL del caldo fermentado y los botones de biomasa se conservaron congelados a -20 °C hasta el momento de la extracción de PHB. La fermentación para cada una de las cepas se efectuó por triplicado. Para el análisis de los resultados se aplicó un Diseño Irrestricto al Azar (DIA) donde los tratamientos corresponden a las distintas cepas evaluadas. El análisis de los resultados de producción de PHB determinada mediante CG se llevó a cabo mediante un Análisis de Varianza (ANDEVA) de un factor empleando Microsoft Excel. 4.6. Diseño de un medio suplementado con subproducto de banano para la producción de biomasa de Cupriavidus necator Una vez definida la cepa con el mejor rendimiento de PHB, se diseñó un nuevo medio de cultivo suplementado con cloruro de amonio y el subproducto de banano, considerando la concentración de nitrógeno y azúcares para fomentar la multiplicación celular. Se utilizó el cloruro de amonio como fuente de nitrógeno (Budde et al., 2011; Yang et al., 2010) y el jugo de banano como fuente de carbono considerando que se ha reportado que Cupriavidus necator puede metabolizar la glucosa o la fructuosa para producir PHB (Cavalheiro et al., 2013; El-Sayed et al., 2009; Franz et al., 2011; Mozumder et al., 2015; Volova & Kalacheva, 2005) 41 41 Dado que la realización de la fermentación en dos etapas a nivel de biorreactor de laboratorio, piloto e industrial resulta laboriosa y suelen presentarse problemas de contaminación debido a los procedimientos de recuperación de biomasa, se sustituyó este esquema por uno de fermentación tipo lote alimentado. Se procuró realizar ambas fases de fermentación en el mismo medio de cultivo, reemplazando las fuentes de carbono y nitrógeno del medio de producción de biomasa por jugo de banano y cloruro de amonio, respectivamente. Debido a que una alta concentración de biomasa es indispensable para lograr adecuados rendimientos de PHB, se buscó optimizar las concentraciones de las fuentes de carbono y nitrógeno en términos de concentración celular. 4.6.1. Diseño Experimental Para la optimización de las concentraciones de JSB y cloruro de amonio, se aplicó un diseño experimental Central Compuesto Rotativo con dos factores y dos niveles. Para ejecutar el mismo, se realizaron 4 repeticiones en los puntos centrales. Los factores y niveles evaluados se resumen en el Cuadro 7. La variable de respuesta consistió en la densidad óptica del cultivo, medida a 425 nm. El análisis de Superficie de Respuesta se realizó empleando el programa SAS JMP 8 (SAS Institute Inc.). 42 42 Cuadro 7. Diseño Experimental Central Compuesto Rotativo para la optimización de las concentraciones de JSB y Cloruro de amonio Corrida Puntos % Jugo NH4Cl (g/L) 1 0 12,5 3,5 2 −+ 5 5 3 A0 23 3,5 4 0a 12,5 1,4 5 −− 5 2 6 a0 1,9 3,5 7 0A 12,5 5,6 8 +− 20 2 9 0 12,5 3,5 10 ++ 20 5 11 0 12,5 3,5 12 0 12,5 3,5 4.6.2. Preparación de medios de cultivo y condiciones de crecimiento Se prepararon 50 mL de cada una de las variantes del medio de cultivo (Cuadro 8) definidas según el diseño experimental (Cuadro 7) y se colocaron en matraces de 250 mL. Cuadro 8. Composición del medio de cultivo para el crecimiento de biomasa productora de PHB ajustado a pH 7,1 con NaOH 1M Componente Concentración (g/L) NaCl 5 g KH2PO4 2,5 g Jugo de banano 50 a 200* NH4Cl 2 a 5 g *5-20% 43 43 Para la elaboración de los medios de cultivo, se prepararon soluciones concentradas de NH4Cl (100 g/L) y de las sales (10X). Para cada formulación, se mezclaron las correspondientes proporciones de JSB, solución de sales y agua, de acuerdo con lo detallado en el Cuadro 9. Se ajustó el pH a 7 con NaOH 1M. Los medios y la solución de NH4Cl fueron autoclavados por separado y la adición de esta solución se realizó de manera aséptica. Cuadro 9. Preparación de las distintas formulaciones de medios de cultivo para optimización de biomasa de Cupriavidus necator Punto % JSB NH4Cl (g/L) JSB (mL) NH4Cl 100 g/L (mL) Sales 10X (mL) Agua (mL) 0 12,5 3,5 6,25 1,75 5 37 −+ 5 5 2,5 2,5 5 40 A0 23 3,5 11,5 1,75 5 31,75 0a 12,5 1,4 6,25 0,7 5 38,05 −− 5 2 2,5 1 5 41,5 a0 1,9 3,5 0,95 1,75 5 42,3 0A 12,5 5,6 6,25 2,8 5 35,95 +− 20 2 10 1 5 34 0 12,5 3,5 6,25 1,75 5 37 ++ 20 5 10 2,5 5 32,5 0 12,5 3,5 6,25 1,75 5 37 0 12,5 3,5 6,25 1,75 5 37 Cada Erlenmeyer se inoculó con 1 mL de suspensión bacteriana criopreservada y se incubó a 30 °C y 150 rpm por 24 h. Se determinó la densidad óptica del cultivo a 425 nm. Para cada muestra, se utilizó como blanco la misma formulación del medio que estaba siendo evaluada. 44 44 4.7. Implementación del proceso de producción de PHB en biorreactor A partir de la composición seleccionada de acuerdo con la optimización del medio de cultivo, se preparó un proceso en biorreactor con volumen de trabajo de 3 L. En pruebas preliminares se intentó realizar las fermentaciones en dos etapas, sin embargo, se presentaron dificultades para el drenado de los biorreactores, para la recuperación de la biomasa por centrifugación y para su re-inoculación dentro del biorreactor en condiciones asépticas. Debido a estos procedimientos, se presentó contaminación para las fermentaciones en dos etapas, por lo tanto, se definió un proceso en una sola etapa. Se ajustó el medio de cultivo para contar con las sales necesarias durante todo el proceso de fermentación y, una vez finalizada la etapa de producción de biomasa, se alimentó una solución de fructuosa concentrada en un esquema de fermentación de tipo lote alimentado (fed-batch) con el fin de generar el desbalance C/N y estimular la síntesis del PHB. Se realizaron fermentaciones por triplicado, en las cuales se evaluaron 3 distintas concentraciones iniciales de fructosa para la fase de producción de PHB: 30, 40 y 50 g/L. Se aplicó un Diseño Irrestricto al Azar y un análisis de varianza con el fin de comparar las concentraciones de fructosa y determinar cuál de ellas permitiría obtener una mayor productividad de PHB. El análisis estadístico se realizó empleando el programa JMP 8 (SAS Institute Inc.). 4.7.1. Preparación del medio de cultivo Las sales necesarias para el volumen total de 3 L se autoclavaron dentro del biorreactor a 121 °C durante 65 minutos. El Cuadro 10 detalla la composición de sales empleada para las fermentaciones. 45 45 Cuadro 10. Composición de sales para las fermentaciones en biorreactor Componente Concentración (g/L) NaCl 5 KH2PO4 4 NH4Cl 2 Na2HPO4*2H2O 4.5 MgSO4 *7H2O 0.51 CaCl2 0.02 Solución de trazas* 1 *Composición de solución de trazas 10X (mL/L): ZnSO4* 7H2O: 130 mg/L, FeSO4* 7 H2O: 20 mg/L, (NH4)6Mo7O24 * 4H2O: 60 mg/L, H3BO3: 60 mg/L Para cada biorreactor, se colocaron y esterilizaron 150 mL del JSB en una botella de adición. Para alimentar las fermentaciones, se utilizó una solución concentrada de fructosa (500 g/L). El volumen de fructosa requerido para el ajuste de cada concentración en un volumen de 3 L se depositó y esterilizó en una botella de adición. Tanto el JSB como las soluciones de fructosa fueron autoclavados a 121 °C durante 15 minutos empleando una autoclave marca Tuttnauer, modelo 3870 EHS. 4.7.2. Preparación y configuración del biorreactor Las 3 fermentaciones para cada uno de los tratamientos se llevaron a cabo en 3 biorreactores de tanque agitado. Se emplearon biorreactores marca Applikon® Biotechnology con capacidad de 5 L. Los parámetros de la fermentación se monitorearon y controlaron mediante la consola ez-Control (Applikon® Biotechnology), ilustrada en la Figura 6. Se registraron los datos de pH, temperatura y oxígeno disuelto (OD) con el software BioXpert ® XP (Applikon® Biotechnology). 46 46 Figura 6. Consola ez-Control (Applikon® Biotechnology) empleada para las fermentaciones con C. necator Para el control de pH se prepararon botellas de adición con 300 mL de solución de H2SO4 2 M y NaOH 2 M. Para el control de espuma se usó Antiespumante C (Sigma®). Las botellas de adición se autoclavaron a 121 °C por 15 minutos. Se utilizaron sensores de pH y oxígeno disuelto AppliSens (Applikon® Biotechnology). Se realizó una calibración para los sensores de pH, empleando soluciones buffer con pH 4 y 7. Una vez establecidas las condiciones del proceso, se dejó estabilizar la lectura de OD y se tomó este valor como un 100% para calibrar el sensor de OD. Para proveer agitación, se emplearon una propela marina y un impulsor axial, ambos con un diámetro externo de 45 mm. La propela marina se colocó en el extremo del eje de agitación y el impulsor axial se ajustó 3 cm por encima de la propela. Se preparó un sistema de venteo con una botella de polipropileno conectada al condensador del equipo, a manera de t