Rev. Biol. Trop., 31(2): 245-250, 1983 Analisis ultraestructural de membranas de glObulos grasos licteos de calostro y leche humana Francisco Hernandez Institute de Investigaciones en Salud y Unidad de Microscopia Electranica de la Universidad de Costa Rica. Hiroshi Akahori Unidad de Alicroscopia ElectrOnica de Ia Universidad de Costa Rica y Naka Works, Hitachi Ltd., ham. (Recibido pars su publicaci6n el 23 de marzo de 1983) Abstract: Lacteous fat globules with their membranes from human milk and calostrum were studied by scanning and transmission electron microscopy. The first appear as spheroidal structures with some irregu- larities on the surface. Under the transmission electron microscope these irregularities are composed of islets from a material morphologically similar to cytoplasm, and with structures that resemble a fragment of rugose endoplasmic reticulum. The membranes in specimens fixed immediately after secretion are tri-layered, similar in appearance to those of a single membrane, but in samples fixed between two and four hours after secretion the details are unclear. Through freeze-etching, the laminar aspect of the fat globules is observed. La grasa en la leche humane aparece en for- ma de corptisculos de 3 a 8 gm de diametro, de- nominados globulos grasos lacteos (GGL; Bayer, 1972), recubiertos per una membrane (MGGL), que aparentemente es unitaria y que posible- mente proviene del aparato de Golgi, o de la membrana celular de las celulas glandulares ma- marias. Este tiltima posibilidad se apoya en el hallazgo de que ambas membranes tienen una composiciOn quimica similar (Wooding, 1971a; Keenan et at, 1971; Bayer, 1972), y que corn- parten ant fgenos (Mather et al., 1980). Por otra parte, algunos globulos grasos lacteos muestran ensancharnientos constituidos par un material semejante a citoplasma, en el que pueden iden- tificarse restos de reticulo endoplasmitico ru- goso y fragmentos de mitocondrias (Wooding, 1971b; Keenan et al., 1971). En cuanto a la position quimica de estas membranes lacteas, se ha descubierto que con- tienen el 65% de fos fosfolipidos lacteos (Baumiucker y Keenan, 1973), entre los que se encuentran principalmente fosfatidilcolina y esfingomielina, edemas de pequelias canti- dades de esteres de colesterol, monop,liceridos, trigliceridos, carotenoides, glicoproteinas y enzimas come xantina oxidasa, fosfatasa al- ealina, nucIeotidasa y ATPasas (Zittle et al., 1956; Thompson et al., 1961; Keenan et al., 1970; Bracco et al., 1972; Horisberger et al., 1977; Eigel, 1980). No obstante que los com- ponentes lipidos de la membrane son estables hasta per 96 horas, la composition quimica de los globulos grasos se altera durante el al- macenarniento de la leche (Patton et al., 1980). Posiblemente este alteration se debe a Ia per- dida de fragmentos del glaulo, que se despren- den come pequerias vesiculas que modifican el aspecto ultraestructural de su membrane (Wooding, 1971a; 1971b; Pillay et al., 1980a; 1980b; Patton et at, 1980). El desprendimien- to de esas vesiculas angina estructuras que se- mejan retrovirus tipo C; sin embargo, ultraes- tructuralmente esas vesiculas conservan el aspecto de la membrane unitaria y han lido denominadas plasmalemasomas (Wooding, 1972). Debido a las alterations que sufren las membranes de los glObulos grasos lacteos du- rante el almacenamiento, se recomienda proce- sar las muestras de calostro y leche destinadas a estudios ultraestructurales o qulmicos inme- diatamente despues de recogidas. En este tra- bajo se evaldan morfolOgicamente los glObulos lacteos y sus membranes en leche y calostro de origen humano y se correlaciona con el tiempo transcurrido entre la toma de la mues- tra y su fijacion. 245 246 REV ISTA DE BIOLOGIA TROPICAL MATERIAL Y METODOS Se estudiaron doce muestras de calostro human° recogidas durante los primeros cinco dias post partum y tres muestras de leche ma- dura (8 meses post partum). El calostro se guard) a 4 C durante cuatro horas antes de procesarlo y las muestras de leche se fijaron inmediatamente despues de recogidas. Microscopia electrenica de barrido: Tres de las muestras de calostro y las tres mues- tras de leche se procesaron para microscopia electronica de barrido. De cada especimen se separ'O la fracci6n lipidica mediante centrifu- gacien a 2000 XG durante 10 minutos. Se eli- mine la fase acuosa y se fij6 la nata sobrenadan- te (grasa) en una mezcla de aldehiclo glutarico y formalina, cada uno al 1% en solution amorti- guadora de fosfatos a pH 7. Luego la grasa lactea se deshidrate en una serie de alcohol etilico de 70 a 100%. Y despues se resuspendiO en benceno y se deje sedimentar durante dos horas. De cada sediment° se tomaron alicuotas de 0,3 ml y se colocaron sobre bases de alumi- nio, se dejaron secar a temperatura ambience y se recubrieron con oro en un evaporador de metales (EIKO 1B-3). Los especimenes se analizaron en un microscopio electronic° de barrido (Hitachi HHS-2R), bajo un voltaje de aceleracion de 10 KV. Microscopia electrOnica de transmision: De cada. muestra de leche y de seis de los calostros se tomaron alicuotas de 1 ml y se fijaron en aldebido glutarico al 1% durante dos horas y se deshidrataron en una serie de alcohol etlti- co de 30 a 100% . Luego se embebieron en re- sina (Epoxi) y se incubaron a 70 C durante 72 horas. Posteriormente se hicieron cortes ultrafinos y se tifieron con citrato de plomo y acetato de uranilo. Los cortes fueron anali- zados en un microscopio electronic° de trans- mision (Hitachi HU-12A). Ademas, tres de las muestras de calostro se fijaron en aldehido glutarico al 1% y se resus- pendieron en glicerol al 10% en el amortigua- dor de fosfatos. De cada muestra se tome 0,1 ml y se coloco sobre una base de cobre para criofractura, que inmediatamente se congele aproximadamente a -210 C sobre nitrogen° selido. Luego se pas) a un dispositivo de criofractura (sumergido en nitrogen° liquido) y se coloce en un evaporador de metales (Hita- chi HUS-5). Las muestras fueron fracturadas a un vacio de aproximadamente 10-5 Torr e inmediatamente se eleve la temperatura hasta -100 C, para sublimar el hielo y erosionar la superficie fracturada, La que a su vez fue som- breada con platino en un angulo de 45° y luego recubierta por carbon evaporado en un ingulo de 90°. Las replicas de platino-carbon obteni- das de las superficies de fractura se hicieron flo- tar en una solution de hipoclorito de sodio al 5%, para eliminar los restos de materia organica y se recogieron con rejillas de cobre de malla 400 para exarninarlas. RESULTADOS La grasa lactea tanto de calostro como de leche madura, se observe al microscopic) electronic° de barrido como conglomerados esferoides, cuyos diarnetros oscilaron entre 2 y 8 gm, predominando los glebulos de me- nos de 5 pm de diemetro (Fig. la). Con au- mentos mayores de 1000X se puede observar irregularidades en la superficie de estos glebu- los, a manera de abultamientos (Fig. l b). En los cortes ultrafinos los globulos apa- recen cortados transversalmente, observindo- se como anillos formados por una membrana delgada, que a grandes aumentos (100.000X) muestra un aspect° trilaminar, similar al de una membrana unitaria, en la que se aprecian dos capas electrodensas y una central transhi- cida a los electrones (Fig. 2). Algunos de los glebulos grasos presentan ensanchamientos en su superficie, compuestos aparentemente por porciones de citoplasma, atrapados o adheridos a la membrana de los glebulos. En esos ensanchamientos es posible reconocer fragmentos de reticulo endoplasma- tico rugoso. En la figura 3a se observa una de esas porciones de citoplasma cortada transver- salmente, como se senala en el esquema del recuadro de esa figura. La figura 3b correspon- de a un detalle de una portion de citoplasma, en la que se observa un sistema de membranas cortadas transversalmente y que aparece adosa- do a una matriz citoplasmica. En las muestras de calostro procesadas a las cuatro horas post recoleeciOn, no se aprecia cla- ramente el aspecto trilaminar de la membrana. Ademis, en algunas secciones a gran aumento se observan irregularidades en las membranas, a manera de vacuolas o vesiculas (Fig. 4c, d e). HERNANDEZ & AKAHORI: Anilisis estructural de calostro y leche hurnana 247 Fig. 1. Microfotografias electronicas de barrido: A. grupo de gthbulos grasos Licteos (barra = 10 pm). B. a mayor aumento se observan irregularidades en la superficie de los globulos (barra =1 pm). Fig. 2. Microfotografia electronica de transmision: cortex ultrafinos de la membrana de globulos grasos licte-os de leche humans fijada inmediatamente post secretion. Se observa el aspecto trilaminar propio de una membrana unitaria (bans, =100 nm), Fig. 3. Microfotografia electthnica de transmision: A. corte transversal de un ensanchamiento de mate- rial semejante a citoplasma; se observan estructuras similares a fragmentos de reticulo endoplasmitico rugoso. El recuadro superior indica la forma en que se corth el globulo (barra = 500 nm). B. arreglo de membranas en un ensanchamiento de material simi- lar a citoplasma de un GGL (barras =250 run). En las replicas de criofractura aparecen glo- bulos cortados transversalmente en diferentes pianos, exponiendo superficies de fractura con apariencia laminar al corte (Fig. 5a, b). Ade- mas, algunos globulos se fracturaron muy su- perficiaLmente y muestran un casquete esferoi- de, en el que se aprecia Ia membrana externs (Fig. 5a, c). REVISTA DE BIOLOGIA TROPICAL 248 4B 4A 4D 4C Fig. 4. Microfotograffa electrOnica de transmidan. A., B., C. cortes transversales de los glabulos, en algunos se observan ensanchamientos de citoplasma (barra = 500 nm). D. E. vesiculas que se desprenden de la membrana fijadas 4 horas post secreciOn (barras = 250 nm). D1SCUSION Los globulos grasos licteos y sus membranas observadas en el calostro y la leche de origen humano, son similares a los descritos en leche de otros mamiferos (Bayer, 1972; Wooding, 1971a; Keenan et al., 1971). Se ha postulado que las membranes de los HERNANDEZ & AKAHORI: Analists estructural de calostro y leche humana 249 Fig. 5. Microfotografia electronica de transmision de gl6bulos procesados mediante criofractura. A. globulo cortado superficialmente; se observa la membrana (barra = 200 nm). B. glom° cortado ma's profundamente que el anterior; se observa eI aspect° laminar cristalino de los lipidos congelados (barra = 250 nm). C. cristales de lipidos congelados y parte de la membrana fracturados transversalmente (barra =500 sun). globulos grasos lacteos son unitarias y que po- drian originarse a partir de vacuolas del aparato de Golgi que rodearian las vacuolas grasas en el citoplasma de la cdlula rnamaria (Wooding, 1971b), o que la membrana celular envolverfa al globulo durante la secrecion (Long y Patton, 1978). Ultraestructuralmente estas membranas lac- 250 REVISTA DE BIOLOGIA TROPICAL teas son similares a una membrana unitaria, tal como se observe) en las muestras de leche fija- das inmediatamente despues de secretadas. Sin embargo, esa estructura se perdie en las muestras fijadas 4 horas despues de la secreci6n, ya que aparecian como una sole capa electro- densa con bordes poco definidos. Ademis, en esos especimenes se observe la presencia de ve- siculas, similares a las que habia descrito Woo- ding en 1972, lo que confirma que pars estu- dios ultraestructurales las muestras de leche o calostro deben fijarse inmediatamente des- plies de secretadas. Por otra parte, el posible valor biologic° de estas membranas debe correlacionarse con el periodo de almacenainiento de la leche, ya que esas alteraciones en las membranas lac- teas podrian reflejarse en su funcionalidad. AGRADECIMIENTOS Agradecemos el aporte economic° de la Vi- cerrectoria de Investigacien de la Universidad de Costa Rica y del AID (prestarno 026); al Dr. Leonardo Mata, Director del Institute de Investigaciones en Salud (INISA), por su apoyo a este proyecto; y a las senoras Iris Morera Alvarado y Maria del Carmen Oban- do Jimenez de la Unidad de Microscopia ElectrOnica por la colaboraciOn tecnica. RESUMEN Se describen ultraestructuralmente los glo- bulos grasos lacteos y sus membranas, a partir de leche y calostro de origen humane. Al mi- croscopio electronic° de barrido los globu- los aparecen como estructuras esferoides con algunas irregularidades en su superficie. Al mi- criscopio electronic° de transznision se ye que esas irregularidades estan compuestas por is- lotes de un material morfologicamente simi- lar al citoplasma, en el que aparecen estructu- ras similares a fragmentos de reticulo endoplas- matico rugoso. Las membranas en los especi- menes fijados inmediatamente despues de se- cretados muestran un aspecto trilaminar simi- lar al de una membrana unitaria, aspecto que no es claro en las muestras fijadas entre dos y cuatro horas post secrecion. Mediante criofrac- tura se observa el aspecto laminar del conteni- do de los gl6bulos grasos. REFERENCIAS Baumiucker, D. R., & T.W. Keenan. 1973. Membranes of mammary gland. VII. Staliaf9 of milk fat globule membrane. J. Dairy Sci., 56: 1092-1094. Bayer, H. 1972. Ultrastructure observations on the milk fat globule envelope of cow's milk. J. Daisy Sci., 55: 1375-1387. Bracco, U., J. Hidalgo, & H. Bohren. 1972. Lipid composition of the fat globule membrane of human and bovine milk. J. Dairy Sci., 55: 165- 172. Eigel, W.N. 1980. Characterization of bovine milk fat globule membrane prepared in the presence of chloroquine and kallikrein inhibition. J. Dairy Sci.. 63: 158. Horisberger, M., J. Rosset, & M. Vionlanthen. 1977. 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